Summary
Här beskriver vi ex vivo- och in vivo-metoder för att bedöma bakteriell spridning från en sårinfektion hos möss. Detta protokoll kan användas för att testa effekten av aktuella antimikrobiella och antibiofilmsbehandlingar, eller för att bedöma spridningskapaciteten hos olika bakteriestammar eller arter.
Abstract
Biofilm-relaterade infektioner är inblandade i ett brett spektrum av kroniska tillstånd såsom icke-helande diabetiker fotsår, kronisk bihåleinflammation, återkommande öroninflammationer media, och många fler. Mikrobiella celler i dessa infektioner skyddas av en extracellulär polymera substans (EPS), som kan förhindra antibiotika och vara värd för immunceller från att rensa infektionen. För att övervinna detta hinder har utredarna börjat utveckla spridningsmedel som potentiella terapier. Dessa medel riktar sig till olika komponenter inom biofilmen EPS, försvagar strukturen och initierar spridning av bakterierna, vilket teoretiskt kan förbättra antibiotikapotens och immunfrihet. För att bestämma effekten av spridningsmedel för sårinfektioner har vi utvecklat protokoll som mäter biofilmsspridning både ex vivo och in vivo. Vi använder en mus kirurgiska excision modell som har beskrivits väl för att skapa biofilm-associerade kroniska sår infektioner. För att övervaka spridning in vivoinfekterar vi såren med bakteriestammar som uttrycker luciferas. När mogna infektioner har etablerats bevattnar vi såren med en lösning som innehåller enzymer som försämrar komponenter i biofilmen EPS. Vi övervakar sedan platsen och intensiteten hos den självlysande signalen i såret och filtreringsorganen för att ge information om den spridningsnivå som uppnåtts. För ex vivo-analys av biofilmsdispersion är infekterad sårvävnad nedsänkt i biofilmsnedbrytande enzymlösning, varefter bakteriebelastningen som finns kvar i vävnaden, jämfört med bakteriebelastningen i lösningen, bedöms. Båda protokollen har styrkor och svagheter och kan optimeras för att noggrant bestämma effekten av spridningsbehandlingar.
Introduction
Ökningen av antibiotikaresistens över hela världen leder till brist på antibiotikaalternativ för att behandla en mängd bakteriella infektioner1. Förutom antibiotikaresistens kan bakterier få antibiotikatolerans genom att anta en biofilmsrelaterade livsstil2. En biofilm är en gemenskap av mikroorganismer som skyddas av en matris av polysackarider, extracellulärt DNA, lipider ochproteiner 3, kollektivt kallad den extracellulära polymera substansen (EPS). När antibiotikaresistenskrisen fortsätter behövs det i hög kvalitet nya strategier som förlänger användningen av eller förstärker effekten av antibiotika. Antibiofilmsmedel är en lovande lösning4.
Bland de olika antibiofilmsstrategier som har föreslagits ligger användningen av spridningsmedel, som riktar sig till olika komponenter i biofilmen EPS, i framkant av terapeutisk utveckling5. Glykosidhydrolaser (GH) är en sådan klass av spridningsmedel. GH är en stor klass av enzymer som katalyserar klyvningen av olika bindningar inom polysackariderna som ger eps strukturell integritet. Vår grupp, liksom andra, har visat att GH effektivt kan bryta ner biofilmer, inducera spridning och förbättra antibiotikaeffekten för ett antal olika bakteriearter, både in vitro och in vivo6,7,8,9,10,11.
Med ett växande intresse för biofilmsspridning är det viktigt att utveckla effektiva metoder som bedömer spridningseffektiviteten. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för behandling av biofilm-associerade sårinfektioner med ett spridningsmedel hos möss, och bedömning av dispersiv effekt, in vivo och ex vivo. Det övergripande målet är att tillhandahålla effektiva metoder som kan användas med prekliniska modeller för att mäta biofilmsspridning effektivt och effektivt.
En murin kirurgiska excision infektion modell användes i dessa studier för att fastställa en biofilm-associerade infektion. Vi har använt denna modell i över 15 år och publicerat våra observationer omfattande7,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. I allmänhet är detta en icke-dödlig infektionsmodell där bakterier förblir lokaliserade till sårbädden och är biofilmsrelaterade (bakterier som ses i aggregat omgivna av EPS), vilket sätter upp en kronisk infektion som varar upp till 3 veckor. Men om möss är immunkomprometterade (med typ 1-diabetes till exempel) kan de bli mer mottagliga för att utveckla en dödlig systemisk infektion i denna modell.
I denna rapport tillhandahåller vi protokoll för att bedöma spridningen av bakterier från ett sår, både in vivo och ex vivo. Båda protokollen kan användas för att undersöka effekten av ett spridningsmedel och ha sina egna styrkor och svagheter. Att bedöma spridning in vivo kan till exempel ge viktig realtidsinformation om spridningen av bakterier till andra delar av kroppen efter spridning och hur värden svarar. Å andra sidan kan bedömning av dispersion ex vivo vara mer önskvärt för screening av flera medel, doser eller formuleringar, eftersom vävnaden kan delas in i flera sektioner som kan testas separat, vilket minskar antalet möss som krävs. Vid bedömning av flera agenter mäter vi vanligtvis spridning första in vitro som tidigare beskrivits 6,9,22. Vi testar sedan de mest effektiva ex vivo- och reservtestningen in vivo för ett begränsat antal mycket lovande agenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta djurprotokoll granskades och godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee of Texas Tech University Health Sciences Center (protokollnummer 07044). Denna studie genomfördes i strikt överensstämmelse med rekommendationerna i Vägledningen för vård och användning av laboratoriedjur vid De nationella hälsoinstituten.
1. Förbereda bakterier för musinfektioner
OBS: Här beskriver vi att infektera möss endast med Pseudomonas aeruginosa. Andra bakteriearter kan dock användas för att orsaka infektion. Bakteriestammar och material beskrivs i materialförteckningen.
- Använd Pseudomonas aeruginosa wild-type stam PAO1 som bär luminescence plasmid pQF50-lux23 för dessa experiment som tidigare beskrivits7.
- Odla P. aeruginosastammar i förbryllade Erlenmeyer-flaskor, med skakningar vid 200 varv/min, i Luria-Bertani (LB) buljong vid 37 °C i 16 till 20 timmar. Tillsätt en slutlig koncentration på 100 μg/ml ampicillin till PAO1(pQF50-lux) över natten för underhåll av plasmiden.
- Subkultur P. aeruginosa genom att tillsätta 100 μL av nattkulturen till en Erlenmeyerkolv som innehåller 10 ml LB-buljong med en slutlig koncentration på 100 μg/ml ampicillin. Odla sedan i 2-2,5 h vid 37 °C med skakningar, till en OD600 nm på 0,4 och sedan seriespädd (1:10) tre gånger för en infekterande dos på cirka 104 celler.
2. Beredning av biofilmsdispersionsenzym
OBS: För denna studie använder vi en 10% lösning av lika delar amylas och cellulosa (5% av varje), som kommer att kallas "GH", för dispersion behandling.
- Använd en 10% GH-lösning (w/v) amylas (från Bacillus subtilis)och svampcellulosa (från Aspergillus niger)utspädd i 1x fosfatbuffert saltlösning (PBS). Använd PBS som fordonskontrollbehandling.
- Värm alla behandlingar till 37 °C i 30 min för enzymaktivering.
3. Försöksdjur och preoperativ inställning
- Husmöss, 5 kullkamrater per bur, i miljöstyrda förhållanden, med 12 h ljusa/mörka cykler och korrekt tillgång till mat och vatten.
- Använd helst kvinnliga schweiziska Webster möss, mellan 8 och 10 veckor gamla.
- Väg möss för att bestämma rätt mängd anestesi att administrera.
- Administrera anestesi genom intraperitoneal injektion av 100 mg/kg ketamin 10 mg/kg xyzin.
- Applicera ögonkräm (t.ex. Uppdatera P.M.) försiktigt på ögat med en bomullspinne för att minska torrheten.
- Övervaka fysiologiska parametrar inklusive andningshastighet, hudfärgning och kroppstemperatur under hela operationen.
4. Dorsal full tjocklek excision kirurgi
- Bedöma kirurgiska planet av anestesi genom tå nypa och övervakning av luftvägarna hastighet och ansträngning. Raka dorsalytan och applicera en depilatory cream i 10 min (eller enligt produktens instruktioner), varefter försiktigt ta bort, se till att huden var torr.
- För smärtlindring, administrera 0, 05 ml lidokain subkutant i det område som ska strukits och injicera 0, 02 ml buprenorfin subkutant i halsens scruff. Vänta 10 minuter för att säkerställa smärtlindring nåddes.
- Före excision, desinficera ryggytan med en alkoholpinne och dra en cirkel med diametern 1,5 cm mot den bakre delen av ryggen. Underhåll ett sterilt kirurgiskt fält under hela proceduren och använd autoklaverade instrument och sterila handskar. För att begränsa kontamineringen, utför operationen med en tänd Bunsen-brännare och använd rena verktyg för varje djur.
- Administrera ett fullt tjocklek, excisional huden sår till nivån av panniculus muskel med kirurgiska sax.
- Efter excision, täck omedelbart sår med en halvpermeabel polyuretandressing.
- Injicera cirka 104 CFU bakterier i 100 μL PBS under förbandet, på sårbädden, för att fastställa en infektion.
OBS: Sår kan också infekteras med flera arter av bakterier och/eller svampar samtidigt, eller genom att placera förformade biofilmer12, eller till och med debridementvävnad extraherad från patienter19, på sårbädden. - Efter infektion, placera möss i bur med värmekuddar och övervaka tills de återfick sin högerreflex.
OBS: Se till att möss inte blir kalla eftersom detta kan leda till döden. - Upprätta sårinfektioner i 48 timmar.
- Inspektera limförband dagligen för tårar och områden med icke-vidhäftning och byt vid behov.
5. Spridningsbehandling in vivo
OBS: Här beskriver vi administrering av spridningsagenterna genom att tillämpa en serie av 3 aktuella sårbevattningslösningar (Figur 1). Protokollet kan dock anpassas för andra typer av leverans, såsom applicering av geler, krämer eller förband.
- Placera möss under isofluranbedövning (vid 3% och 1 L per minut syre) medan du administrerar behandlingarna.
- Förbered tre 1 ml sprutor, med 25 G nålar, som innehåller 200 μL behandling för varje mus.
- Injicera 200 μL enzymlösning eller PBS-kontroll på såret genom att försiktigt lyfta och nypa huden med tång, något ovanför såret mot djurets huvud. Genomborra försiktigt sprutan genom den upplyfta huden och injicera långsamt lösningen mellan förbandet och sårbädden. Förbandet som används i denna studie följer ofta både sårbädden och den omgivande vävnaden.
- För att säkerställa att hela sårbädden är täckt av lösning, höj försiktigt förbandet med tång, dra bort det från sårbädden medan du långsamt injicerar lösningen.
- Efter behandlingen, placera möss tillbaka i sina burar i 30 min.
- Efter 30 minuters exponering för behandlingen, bedöva mössen igen med isofluran och aspirera lösningen med en spruta och se till att punktera i samma område som tidigare.
OBS: Denna insugna lösning innehåller spridda bakterieceller, som kan sparas för olika nedströmsanalyser. - Administrera den andra och tredje bevattningsbehandlingen som den första, med en ny spruta varje gång.
6. Spridningsavbildning och analys in vivo
OBS: Om en självlysande bakteriestam används för att initiera infektion kan ett In Vivo Imaging System (IVIS) användas för att visualisera spridning från sårbädden.
- Bildmöss omedelbart före och efter behandlingen och vid 10 och 20 timmar efter behandlingen (figur 2 och kompletterande figur 1).
- Utför avbildning medan möss är under anestesi genom att placera dem individuellt i IVIS och avbilda var och en i 5 s vid en våglängd på 560 nm. Spara bilder för vidare analys.
OBS: Optimal våglängd och exponeringstid beror på vilken reporter som används och IVIS-instrumentet och bildframställningsprogramvaran. - För analys öppnar du bilder i IVIS-programvaran och väljer det område som ska analyseras i verktygspaletten.
- För att ta hänsyn till bakgrunden placerar du en cirkel på bakgrunden av ett foto och placerar sedan samma storlekscirkel ovanpå sårbädden för varje mus.
- Om du vill ladda upp mätvärden väljer du Visa > roi-mått (Region of Interest) och överför måtttabellen till ett kalkylblad. Subtrahera bakgrundscirkelavläsningen från var och en av sårbäddsmätningarna för att beräkna luminescence för varje prov. Beräkna procent luminescence ändras av:
ROI förbehandling-ROI efter behandling/ ROI förbehandling) x 100.
OBS: Kontroll och behandlade möss bör analyseras samtidigt för att normalisera för variabler som kan påverka bildförvärv eller utstrålning.
7. Bedömning av spridning genom att bestämma CFU
- Avliva möss humant genom intraperitoneal injektion av 0, 2 ml pentobarbitalt natrium (t.ex. Fatal Plus) under anestesi med 100 mg/kg ketamin 10 mg/kg xyazin.
- Skörda sårbäddsvävnad genom att först försiktigt ta bort förbandet med sterila tångar och skär sedan runt sårbäddens omkrets med steril kirurgisk sax. Lyft försiktigt ena änden av sårbädden med tång medan du använder sax för att skära /reta bort provet från muskelskiktet.
- Placera vävnaden från sårbädden i förmärkt och förvägd 2 ml homogeniseringsrör som innehåller 1 ml PBS. Väg rören igen efter att proverna har förts in och vänd sedan försiktigt 3-5 gånger för att skölja bort alla spridda eller löst vidhäftade bakterier och ta bort PBS. Tillsätt 1 ml färsk PBS.
- För att skörda mjälten, placera möss i en supin anatomisk position och säkra genom att fästa sina extremiteter på en dissekeringsyta. Blötlägg det område som ska dissekeras med 70% etanol för att desinficera området och hindra pälsen från att förorena provet.
- Gör försiktigt ett litet snitt vinkelrätt mot mittlinjen med kirurgisk sax i nedre bukens dermis och se till att dra huden upp och bort från de inre organen. Fortsätt snittet invändigt, längs mittlinjen, tills bröstbenet nåddes. När peritoneal håligheten exponerades och de inre organen var synliga, separera försiktigt mjälte från bindväven och placera i ett separat homogeniseringsrör.
- Väg mjälte och skölj med PBS, enligt beskrivningen för sårbäddsvävnaden.
OBS: Andra organ av intresse kan skördas på samma sätt.- När du gör det första snittet, var noga med att undvika att punktera tarmarna eller andra organ.
- Homogenisera proverna i 2 ml förfyllda pärlverksrör med en bänk homogenisator på 5 m/s i 60 s, två gånger.
- För att räkna upp CFU, seriespädda prover och punktplatta på selektiv agar. För seriell utspädning, pipett 100 μL av provet i 900 μL PBS i ett 1,5 ml rör, virvel och upprepa 5 gånger. Pipett 10 μL av varje utspädning på en agarplatta enligt figur 3.
OBS: Om mer exakt CFU-kvantifiering krävs, sprid 100 μL av varje utspädning av provet över separata agarplattor.
8. Ex vivo-bedömning av spridning(figur 4)
- Linda möss och infektera med cirka 104 PAO1 enligt beskrivningen ovan och avliva sedan 48 h efter infektion.
- Ta försiktigt bort förbandet med tång, använd steril teknik och utan att störa sårbädden.
- Använd steril kirurgisk sax för att skära bort sårbäddens omkrets från den oinfekterade huden genom att använda tång för att lyfta ena änden av sårbädden och saxen för att ta bort infekterad sårvävnad från muskelskiktet under och omgivande oinfekterad vävnad. Dela upp sårbäddsprover i lika delar eller använd hela.
- Placera sårvävnaden i tomma, förvägda 2 ml pärlkvarn homogeniserande rör. Väg sedan rören igen efter att ha tillssats av provet. Beräkna provets vikt med:
vikt efter tillsats av prov - vikt innan du lägger till prov. - Tillsätt 1 ml PBS och vänd försiktigt röret 3-5 gånger för att skölja provet och ta bort eventuella planktoniska celler. Ta bort och kassera PBS.
- Tillsätt 1 ml GH-behandling (eller PBS som negativ kontroll) i provet och inkubera i 2 timmar vid 37 °C med skakningar vid 80 varv/min.
- Ta bort biofilmsdispersionslösningen och placera den i ett separat 1,5 ml-rör. Detta innehåller de spridda cellerna.
- Tillsätt 1 ml PBS till det återstående vävnadsprovet och vänd försiktigt 3-5 gånger för att skölja bort eventuella återstående spridda celler. Ta bort och kassera PBS.
- Tillsätt 1 ml PBS till den återstående vävnaden och homogenisera vid 5 m/s i 60 s med hjälp av en bänk homogenisator.
- Späd lösningen av dispergerade celler och det homogeniserade vävnadsprovet genom att placera 100 μL prov i 900 μL PBS i ett 1,5 ml-rör och upprepa fem gånger för totalt 6 utspädningar.
- Punktplatta 10 μL av varje utspädning på mediaselektiv agar (t.ex. Pseudomonas Isolation Agar för P. aeruginosa)och inkubera plattorna vid 37 °C över natten.
- Räkna CFU och beräkna "procentspridningen" som (CFU i supernatant/ (CFU i supernatant+ CFU i biofilmvävnad)) x 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I detta experiment smittades 8-10 veckor gamla kvinnliga schweiziska Webster möss med 104 CFU av PAO1 som bär luminiscensen plasmid pQF50-lux. Som beskrivits ovan tilläts en infektion att etablera 48 h innan 3 x 30 min behandlingar av antingen PBS (fordonskontroll) eller 10% GH (behandling) för att smälta biofilmen EPS. Mössen avbildades före behandlingen, direkt efter behandling (0 h) och vid 10 h och 20 h efter behandlingen. Figur 2A och kompletterande figur 1 visar en etablerad infektion i sårbädden som genererar en ljus bioluminescerande signal. Spridningen av bakterier ur sårbädden kan visualiseras omedelbart efter GH-behandlingen (0 h), men inte efter PBS-behandling. Det bör noteras att vi i tidigare studier upptäckte bakterier i blodet och mjälten så tidigt som 5 timmar efter GH-behandling7. Bakteriell spridning till organen kan också ses genom att placera musen på sidan för avbildning, vilket visas i den nedre panelen i figur 2A.
Bilder från både PBS- och GH- behandlade möss visade en ökning av luminescent signal vid 20 h efterbehandling jämfört med förbehandling (figur 2B). Vi antar att detta beror på den mekaniska störningen av biofilmen som orsakas av bevattning av lösning. Vid 20 h efterbehandling avlivades mössen och sårbäddarna och mjältarna samlades in för att räkna upp CFU/gram vävnad. Medan bakteriebelastningarna i sårbäddarna var likartade (figur 2C), upptäcktes bakterier endast i mjälten hos GH-behandlade möss (Figur 2D), vilket tyder på spridd spridning av de spridda bakterierna.
Tidigare har vi visat att GH-behandling kan bryta upp aggregat av bakterier, förbättra CFU räknas21. Detta kan förklara den lilla ökningen av bakteriebelastningen i sårbäddarna hos de GH-behandlade mössen. Slutligen, även om GH-behandlade sårbäddar hade något högre CFU/gram, var det en lägre procent bioluminescerande förändring. Dessa resultat tyder på vikten av att bekräfta luminescence med CFU räknas. Dessa representativa resultat ger ett exempel på data som kan samlas in genom att använda de protokoll som beskrivs ovan.
Figur 1. Upprätta biofilmsrelaterade sårinfektioner och bedöma dispergeringsmedelseffekt in vivo. Förband kontrollerades för tårar eller förlust av vidhäftning till musens hud före behandling. Komprometterade förband byttes ut. Möss placerades under anestesi omedelbart före behandlingsbehandling. 200 μL enzymlösning, eller en fordonskontroll, injicerades i utrymmet mellan sårbädden och förbandet. Förbandet höjdes försiktigt med tång för att säkerställa att hela såret var mättat i lösning. Behandlingen lämnades på sårbädden i 30 min. Efter 30 min insugades behandlingen med en spruta och ytterligare 200 μL behandling lades till. Detta upprepades för totalt 3 behandlingar. För att mäta spridning i realtid avbildades möss med IVIS före behandling, omedelbart efter behandling (0 h), 10 h och 20 h efter behandling. Vid 20 h efterbehandling avlivades mössen och sårbäddarna och mjältarna samlades in. Proverna sköljdes i PBS och homogeniserades sedan i färsk PBS två gånger vid 5 m/s i 60-talet. Proverna späddes sedan seriellt och fläckpläterades. CFU räknades upp och CFU/gram beräknades. Graden av spridning av bakterier från såret kan antingen bedömas av IVIS eller genom att bestämma antalet CFU som sprids systemiskt till mjälten. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2. Representativa uppgifter visar hur man bedömer spridning in vivo. Sår infekterade med 104 PAO1(pQF50-lux) i 48 h behandlades med antingen PBS eller 10% GH (biofilm dispersal enzymlösning). PBS-behandling användes som fordonskontroll. Sårbäddarna behandlades med 3 x 30 min behandlingar. Möss avbildades med IVIS före behandling, omedelbart efter behandling, 10 h efterbehandling och 20 h efter behandling. Det bör noteras att sidobilderna kommer från olika PBS- och GH-behandlade möss än de som visas i overhead-view-bilderna (A). Rois för varje förbehandling sår säng och varje 20 h efter behandling sår säng registrerades. Procentförändringen från förbehandling beräknades som (ROI före behandling-ROI efter behandling/ ROI- förbehandling) x 100 (B). Vid 20 h efterbehandling avlivades möss. Sårbäddarna och mjälten samlades in och vägdes för att bestämma CFU/gram (C respektive D). N=3. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 3. Seriell utspädning och punktplätering. Homogeniserat prov virvelades och 100 μL överfördes till ett 1,5 ml Eppendorfrör som innehöll 900 μL PBS. Provet virvlades och 100 μL överfördes till ett annat 1,5 ml Eppendorfrör med 900 μL PBS. Denna process upprepades 5 gånger. Från och med det sista utspädningsröret var 10 μL prov fläckpläterat på agarplattan på plats10-8. Detta fortsattes upp till utspädning 10-3. Vanligtvis resulterar utspädningen10-3 i en gräsmatta av bakterier på platsen. Vissa organ, som har låg bakteriebelastning, kan kräva spotplätering upp till utspädningen10-1. Upprepa för varje vävnadsprov. Placera agarplattan i en inkubator vid 37 °C i 24-48 timmar, eller odla under förhållanden som är optimala för de bakteriella arter som är av intresse. För att räkna upp CFU, räkna enskilda kolonier vid lägsta möjliga utspädning och multiplicera med lämplig utspädningsfaktor för att bestämma CFU/ ml eller använda vävnadsvikt för att beräkna CFU/ g vävnad. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4. Mätning av spridning från infekterad vävnad ex vivo. Möss avlivades och den infekterade sårvävnaden avlägsnades aseptiskt. Den infekterade vävnaden placerades i en 2 mL pärla kvarn homogeniserande rör och sköljs kort med PBS. 1 ml spridningsmedel tillsattes och provet inkuberades i 2 timmar vid 37 °C med skakningar vid 80 varv/min. Efter inkubation avlägsnades lösningen som innehåller de dispergerade cellerna och placerades i ett separat 1,5 ml-rör. Den återstående vävnaden sköljdes med 1 ml PBS. 1 ml färsk PBS tillsattes till vävnaden och homogeniserades vid 5 m/s i 60 s. Enzymlösningen och homogeniserade vävnaden späddes sedan seriellt och spotpläterades på selektiv agar. CFU räknades upp och dispersion beräknades som: CFU från enzymlösning/ (CFU från enzymlösning + CFU från vävnad) x 100. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Kompletterande figur 1. Mätning av in vivo-spridning. Sår smittades med 104 PAO1(pQF50-lux) i 48 h och behandlades sedan med antingen PBS eller 10% GH (biofilm dispersal enzymlösning). PBS-behandling användes som fordonskontroll. Sårbäddarna behandlades med 3 x 30 min bevattningsbehandlingar. Möss avbildades med IVIS före behandling, omedelbart efter behandling, 10 h efterbehandling och 20 h efterbehandling (A). Vid 20 h efterbehandling avlivades möss. Sårbäddarna och mjälten samlades in och vägdes för att bestämma CFU/gram (B respektive C). N=3. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi protokoll som kan användas för att studera effekten av biofilmsdispersionsmedel. Dessa protokoll kan enkelt anpassas för användning med olika typer av dispergeringsmedel, bakteriearter eller ex vivo-prover, inklusive kliniska debridementprover. Detta protokoll ger också en kliniskt relevant modell för att samla in och studera spridda bakterieceller. Fenotyperna av spridda bakterieceller har visat sig vara åtskilda från de av antingen planktoniska eller biofilmsceller 5,24,25,26; Fenotyperna av bakterier spridda in vivo har dock ännu inte beskrivits. Om spridningsmedel ska användas terapeutiskt, är det viktigt att bestämma deras effektivitet, samt förstå fenotypen som dessa celler antar. Dessutom kan detta protokoll användas för att studera hur variationer i EPS struktur eller förändring av signalvägar påverkar spridning. Till exempel kan spridning av P. aeruginosastammar med mutationer i olika exopolysackaridkomponenter (t.ex. Pel, Psl, Alginate) jämföras med vilda stammar.
Sammantaget kan detta protokoll delas upp i fyra huvudavsnitt: (1) fastställa en infektion (2) administrera behandling eller (3) samla infekterad vävnad för ex vivo behandling och (4) bestämma dispersiv effekt. Den kritiska delen av avsnitt 1 är den framgångsrika etableringen av infektionen i sårbädden. Om självlysande stammar, som kräver antibiotika för att upprätthålla plasmidstabilitet, används är det absolut nödvändigt att tillsätta lämpliga antibiotika när man odlar stammarna som förberedelse för infektion. Det bör också anses att plasmiderna inte får bibehållas under infektion hos djuret (utan antibiotikatryck), vilket innebär att bedömningen av bakteriebelastningen inte helt bör förlita sig på IVIS-avbildning, utan bekräftas av CFU. Den inokulerande dosen är också ett kritiskt steg för att initiera infektion. För P. aeruginosa och S. aureus används vanligtvis en sinfekterande dos på 104-5 CFU, men den optimala dosen kan variera beroende på vilka bakterie- och musarter som används.
Den kritiska delen av avsnitt 2 är att se till att sårbädden täcks av förbandet under hela utvecklingen av infektion och behandling. Om förbandet inte följs ordentligt kan behandlingen läcka från sårbädden och kan vara ineffektiv. Förbandet är också viktigt för att hålla sårbädden skyddad från potentiella föroreningar och försämra kontraktil läkning av musen, vilket är viktigt för att efterlikna mänsklig sårläkning. Slutligen är den kritiska delen av avsnitt 3 att hantera de insamlade proverna på rätt sätt. För att räkna upp CFU ska den infekterade vävnaden sköljas med 1 ml PBS innan ytterligare 1 ml PBS tills tillförs för homogenisering. Mer fibrösa organ, såsom lungorna, kan kräva mer noggrann homogenisering.
De primära begränsningarna i dessa protokoll inkluderar den nödvändiga noggranna övervakningen av förbandet och användningen av IVIS för att bildspridning och göra antaganden om spridningseffektivitet. För långtidsstudier kan återväxten av päls vara problematisk eftersom det kan hindra dressing vidhäftning till sårplatsen. Förband kräver ofta ersättning, och deras avlägsnande kan leda till oavsiktlig debridement av såret och möjlighet till förorening. För att visualisera spridning från sårbädden måste en bioluminescerande bakteriestam användas. Om bakteriearterna av intresse saknar en bioluminescerande reporter är detta alternativ inte genomförbart. En annan begränsning är potentialen hos spridningsbehandlingen för att inducera bakteriemi, vilket kan leda till musens död. Vi har dock sett att spridda celler effektivt kan dödas av antibiotika in vivo7.
De representativa resultat som beskrivs i figur 2 illustrerar en begränsning av IVIS för mätning av dispersiv effekt. För det första måste en självlysande stam av bakteriearterna av intresse utnyttjas. Stammen måste producera en självlysande signal som är tillräckligt ljus för att upptäcka genom flera lager av vävnad för att visualisera spridning från sårbädden till andra delar av kroppen. Det har föreslagits att minst cirka 106 bakterier krävs för att producera en självlysande signal som är tillräckligt stark för att upptäckas av IVIS27. En minskning av luminescent signal har också beskrivits när bakterier går in i stationär fas28. Detta kan orsaka en koppling mellan uppmätta ROM-värden och CFU uppräknat29. Denna begränsning kan leda till falska antaganden när det inte finns en signal som är tillräckligt stark för detektion, men bakterier finns fortfarande. Som visas i figur 2Bresulterade PBS- och 10% GH- behandlingarna i ökad luminescence efter behandlingen. Detta är en nyfiken och konsekvent observation, som också har setts efter att ha spridit celler in vitro (Cláudia Marques, Binghamton University, personlig kommunikation). Det är möjligt att biofilmens fysiska störning från att administrera behandlingen helt enkelt sprider ut celler som var tätt packade, vilket resulterar i ökad ljussignal. Alternativt kan spridningsbehandling "väcka" biofilmsceller som tidigare var metaboliskt inaktiva, vilket resulterade i ökad bioluminescens. Hur som helst är det viktigt att bekräfta resultaten av IVIS-avbildning med CFU-data. Slutligen finns det en heterogen fördelning av bakterier inom infekterad sårvävnad30,31. Om vävnaden är uppdelad ex vivo för att ge fler prover, bör det därför inte antas att bakteriebelastningen i varje sårsektion är identisk.
Det finns ändringar och felsökningar som kan utföras för att övervinna begränsningarna för dessa modeller. För det första kan den tid som avsatts för exponering av den depilatoriska krämen behöva justeras beroende på vilken musart som används. Till exempel används 7 min vanligtvis för schweiziska Webster-möss, medan C57BL / 6 möss kan behöva upp till 10 minuters exponering för att framgångsrikt ta bort pälsen. Detta beror naturligtvis också på vilken produkt som används, och exponeringstiderna får aldrig överstiga tillverkarens instruktioner. Om en lång studie (4+ dagar) utförs kan depilatorisk grädde behöva appliceras igen för att ta bort återvuxen päls och säkerställa en korrekt tätning av förbandet. Om en självlysande signal är svår att upptäcka kan exponeringstiden ökas under IVIS-avbildningen. Den inokulerande dosen och infektionstiden kan också justeras. Det är viktigt att använda en infekterande dos som inte är för hög att den överväldigar musen, men är inte heller för låg att bakterierna omedelbart rensas av immunsvaret.
I detta protokoll beskriver vi behandling av 48 h-gamla sårinfektioner med spridningsmedel, eftersom detta är en tidpunkt vi har visat infektioner orsakade av P. aeruginosa och/eller S. aureus är etablerade och biofilm-associerade 12,15,16. Men beroende på bakteriearterna kan andra tidpunkter vara mer optimala. Helst bör bakteriebelastningen i såret platå när en infektion har fastställts. Till exempel har vi sett att med både P. aeruginosa och S. aureus når bakteriebelastningen i såret cirka 108 CFU/g vävnad med 48 h postinfektion och förblir på den nivån tills sårstängningen. Figur 1 illustrerar behandling med en lösning som kräver 3 x 30 min tvättar. Men om spridningsmedlet var i en annan form skulle tvättarna inte vara nödvändiga. Till exempel kan en kräm, gel eller konstruerad dressing helt enkelt placeras ovanpå sårbädden. Slutligen kan såret infekteras på olika sätt, inklusive inokulering av planktoniska bakterieceller, förformade biofilmer12, eller till och med infekterad debridementvävnad från ett annat djur eller människa19,32. Vi har sett att transplantation av ett förformat biofilms- eller debridementprov på sårbädden resulterar i mer framgångsrika polymikrobiella infektioner än när flera arter vaccinerars i sin planktoniska form12.
Sammantaget beskriver dessa protokoll metoder för att studera biofilm spridning och utvärdering av terapeutiska biofilm spridningsmedel. Dessa modeller möjliggör utveckling av komplexa poly-mikrobiella biofilm-associerade infektioner som efterliknar kliniskt relevanta mänskliga infektioner. Vår förhoppning är att dessa protokoll kommer att användas och förfinas för att främja utvecklingen av antibiofilmsdispersionsmedel för terapeutisk användning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag från National Institutes of Health (R21 AI137462-01A1), Ted Nash Long Life Foundation, Jasper L. och Jack Denton Wilson Foundation och Department of Defense (DoD MIDRP W0318_19_NM_PP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisher | 14823434 | Use to complete serial dilutions of samples |
| 25G 58 in needle | Fisher | 14823434 | Attaches to 1 mL syringe |
| Ampicillin Sodium Salt | Fisher | BP1760-5 | Make a 50 mg/ mL stock solution and add 100 µL to 10 mL of LB broth for both overnight and subculture |
| Amylase | MP Biomedicals | 2100447 | Make a 5% w/v solution, vortex- other dispersal agents can be used |
| Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL) | ZooPharm | RX216118 | Use as pain mainagement- may use other options |
| Cellulase | MP Biomedicals | 2150583 | Add 5% w/v to the 5% w/v amylase solution, vortex, activate at 37 °C for 30 min- other dispersal agents can be used |
| Depilatory cream | Walmart | 287746 | Use a small amount to massage into the hair follicles on the back of the animal and allot 10 min to remove hair |
| Dressing Forceps, Serrated Tips | Fisher | 12-460-536 | Can use other forms of forceps |
| Erlenmeyer flasks baffled 125 mL | Fisher | 101406 | Use to grow overnights and sub-cultures of bacteria |
| FastPrep-24 Benchtop Homogenizer | MP Biomedicals | 6VFV9 | Use 5 m/s for 60 s two times to homogenize tissue |
| Fatal Plus | Vortech Pharmaceuticals | 0298-9373-68 | Inject 0.2 mL intraperitaneal for each mouse |
| Homogenizing tubes (Bead Tube 2 mL 2.4 mm Metal) | Fisher | 15340151 | Used to homogenize samples for plating |
| Isoflurane | Diamond Back Drugs | ||
| Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution C-IIIN | Sigma Aldrich | K4138 | Use as anasethia- other options can also be utilized to gain a surgical field of anasethia |
| LB broth, Miller | Fisher | BP1426-2 | Add 25 g/L and autoclave |
| Lidocaine 2% Injectable | Diamond Back Drugs | 2468 | Inject 0.05 mL through the side of the marked wound bed area so it is deposited in the center of the mark. Allot 10 min prior to cutting |
| Meropenem | Sigma Aldrich | PHR1772-500MG | Make 5 mg/mL to add to the GH solution to apply topically and a 15 mg/mL solution to inject intraperitaneal 4 h prior and 6 h post-treatment |
| Non-sterile cotton gauze sponges | Fisher | 13-761-52 | Use to remove the depilatory cream |
| PAO1 pQF50-lux bacterial strain | Ref [13] | N/A | PAO1 pgF50-lux was used as the P. aeruginosa strain of interest in this paper's representative results |
| Petri dishes | Fisher | PHR1772-500MG | |
| Phosphate Buffer Saline 10x | Fisher | BP3991 | Dilute 10x to 1x prior to use |
| Polyurethane dressing | Mckesson | 66024007 | Cut the rounded edge off and cut the remaining square into 4 equal sections |
| Pseudomonas isolation agar | VWR | 90004-394 | Add 20 mL/L of glycerol and 45 g/mL to water, autoclave, and pour 20 mL into petri dishes |
| Refresh P.M. | Walmart | Use on eyes to reduce dryness during procedure. | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisher | 22-363-750 | Use to clean the skin immediately prior to wounding to disinfect the area |
| Straight Delicate Scissors | Fisher | 89515 | Can also use curved scissors |
| Swiss Webster mice | Charles River | 551NCISWWEB | Other mice strains can be used |
| Syring Slip Tip 1 mL | Fisher | 14823434 | Used to administer drugs and enzyme treatment |
References
- Rossolini, G. M., Arena, F., Pecile, P., Pollini, S. Update on the antibiotic resistance crisis. Current Opinion in Pharmacology. 18, 56-60 (2014).
- Stewart, P. S.
- Flemming, H. C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).
- Rumbaugh, K. P. How well are we translating biofilm research from bench-side to bedside. Biofilm. 2 (100028), (2020).
- Rumbaugh, K. P., Sauer, K.
- Fleming, D., Chahin, L., Rumbaugh, K. Glycoside Hydrolases Degrade Polymicrobial Bacterial Biofilms in Wounds. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (2), (2017).
- Fleming, D., Rumbaugh, K. The Consequences of Biofilm Dispersal on the Host. Scientific Reports. 8 (1), 10738 (2018).
- Baker, P., et al. Exopolysaccharide biosynthetic glycoside hydrolases can be utilized to disrupt and prevent Pseudomonas aeruginosa biofilms. Science Advances. 2 (5), 1501632 (2016).
- Redman, W. K., Welch, G. S., Rumbaugh, K. P. Differential Efficacy of Glycoside Hydrolases to Disperse Biofilms. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 379 (2020).
- Zhu, L., et al. Glycoside hydrolase DisH from Desulfovibrio vulgaris degrades the N-acetylgalactosamine component of diverse biofilms. Environmental Microbiology. 20 (6), 2026-2037 (2018).
- Fell, C. F., Rumbaugh, K. P. Antibacterial Drug Discovery to Combat MDR. , 527-546 (2019).
- Dalton, T., et al. An in vivo polymicrobial biofilm wound infection model to study interspecies interactions. PLoS One. 6 (11), 27317 (2011).
- Wolcott, R. D., et al. Biofilm maturity studies indicate sharp debridement opens a time- dependent therapeutic window. Journal of Wound Care. 19 (8), 320-328 (2010).
- Korgaonkar, A., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. Community surveillance enhances Pseudomonas aeruginosa virulence during polymicrobial infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (3), 1059-1064 (2013).
- Watters, C., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilms perturb wound resolution and antibiotic tolerance in diabetic mice. Medical Microbiology and Immunology. 202 (2), 131-141 (2013).
- Watters, C., Everett, J. A., Haley, C., Clinton, A., Rumbaugh, K. P. Insulin treatment modulates the host immune system to enhance Pseudomonas aeruginosa wound biofilms. Infection and Immunity. 82 (1), 92-100 (2014).
- Turner, K. H., Everett, J., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. Requirements for Pseudomonas aeruginosa acute burn and chronic surgical wound infection. PLOS Genetics. 10 (7), 1004518 (2014).
- Harrison, F., et al. A 1,000-Year-Old Antimicrobial Remedy with Antistaphylococcal Activity. mBio. 6 (4), 01129 (2015).
- Wolcott, R., et al. Microbiota is a primary cause of pathogenesis of chronic wounds. Journal of Wound Care. 25, Sup10 33-43 (2016).
- Ibberson, C. B., et al. Co-infecting microorganisms dramatically alter pathogen gene essentiality during polymicrobial infection. Nature Microbiology. 2, 17079 (2017).
- Fleming, D., et al. Utilizing Glycoside Hydrolases to Improve the Quantification and Visualization of Biofilm Bacteria. Biofilm. 2, (2020).
- DeLeon, S., et al. Synergistic interactions of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in an in vitro wound model. Infection and Immunity. 82 (11), 4718-4728 (2014).
- Darch, S. E., et al. Phage Inhibit Pathogen Dissemination by Targeting Bacterial Migrants in a Chronic Infection Model. mBio. 8 (2), (2017).
- Chua, S. L., et al. Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles. Nature Communications. 5, 4462 (2014).
- Beitelshees, M., Hill, A., Jones, C. H., Pfeifer, B. A. Phenotypic Variation during Biofilm Formation: Implications for Anti-Biofilm Therapeutic Design. Materials (Basel). 11 (7), (2018).
- Sauer, K., et al. Characterization of nutrient-induced dispersion in Pseudomonas aeruginosa PAO1 biofilm. J Bacteriol. 186 (21), 7312-7326 (2004).
- Kuklin, N. A., et al. Real-time monitoring of bacterial infection in vivo: development of bioluminescent staphylococcal foreign-body and deep-thigh-wound mouse infection models. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (9), 2740-2748 (2003).
- Francis, K. P., et al. Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon. Infection and Immunity. 69 (5), 3350-3358 (2001).
- Kadurugamuwa, J. L., et al. Noninvasive optical imaging method to evaluate postantibiotic effects on biofilm infection in vivo. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (6), 2283-2287 (2004).
- Wimpenny, J., Manz, W., Szewzyk, U.
- Stewart, P. S., Franklin, M. J.
- Tipton, C. D., et al. Chronic wound microbiome colonization on mouse model following cryogenic preservation. PLoS One. 14 (8), 0221656 (2019).
