Summary
Здесь мы описываем методы ex vivo и in vivo для оценки распространения бактерий от раневой инфекции у мышей. Этот протокол может быть использован для проверки эффективности местной антимикробной и антибиопленковой терапии или для оценки рассеивательной способности различных бактериальных штаммов или видов.
Abstract
Инфекции, связанные с биопленкой, связаны с широким спектром хронических состояний, таких как незаживающие диабетические язвы стопы, хронический синусит, повторяющийся средний отит и многие другие. Микробные клетки в этих инфекциях защищены внеклеточным полимерным веществом (EPS), которое может предотвратить антибиотики и иммунные клетки хозяина от очистки инфекции. Чтобы преодолеть это препятствие, исследователи начали разрабатывать диспергирующие агенты в качестве потенциальных терапевтических средств. Эти агенты нацелены на различные компоненты в биопленке EPS, ослабляя структуру и инициируя рассеивание бактерий, что теоретически может улучшить эффективность антибиотиков и иммунный клиренс. Чтобы определить эффективность диспергаторов при раневых инфекциях, мы разработали протоколы, которые измеряют рассеивание биопленки как ex vivo, так и in vivo. Мы используем модель хирургического иссечения мыши, которая была хорошо описана для создания хронических раневых инфекций, связанных с биопленкой. Чтобы контролировать рассеивание in vivo,мы заражаем раны бактериальными штаммами, которые экспрессируют люциферазу. Как только зрелые инфекции установлены, мы орошаем раны раствором, содержащим ферменты, которые разлагают компоненты биопленки EPS. Затем мы отслеживаем местоположение и интенсивность люминесцентного сигнала в ране и фильтрующих органах, чтобы предоставить информацию о достигнутом уровне рассеивания. Для анализа рассеивания биопленки ex vivo инфицированную раневую ткань погружают в раствор фермента, разлагающего биопленку, после чего оценивается бактериальная нагрузка, остающиеся в ткани, по сравнению с бактериальной нагрузкой в растворе. Оба протокола имеют сильные и слабые стороны и могут быть оптимизированы, чтобы помочь точно определить эффективность дисперсных методов лечения.
Introduction
Рост устойчивости к антибиотикам во всем мире приводит к отсутствию вариантов антибиотиков для лечения различных бактериальных инфекций1. В дополнение к устойчивости к антибиотикам, бактерии могут получить толерантность к антибиотикам, приняв образ жизни, связанный с биопленкой2. Биопленка представляет собой сообщество микроорганизмов, которые защищены матрицей полисахаридов, внеклеточной ДНК, липидов и белков3,в совокупности называемых внеклеточным полимерным веществом (EPS). Поскольку кризис устойчивости к антибиотикам продолжается, крайне необходимы новые стратегии, которые продлевают использование антибиотиков или потенцируют эффективность. Антибиопленоополяторы являются одним из перспективных растворов4.
Среди различных стратегий антибиопленки, которые были предложены, использование диспергаторов, которые нацелены на различные компоненты биопленки EPS, находятся на переднем крае терапевтической разработки5. Гликозидгидролазы (ГР) являются одним из таких классов диспергаторов. GH представляют собой большой класс ферментов, которые катализируют расщепление различных связей внутри полисахаридов, которые обеспечивают структурную целостность EPS. Наша группа, как и другие, показала, что ГР может эффективно разлагать биопленки, индуцировать рассеивание и улучшать эффективность антибиотиков для ряда различных видов бактерий, как in vitro, так и in vivo6,7,8,9,10,11.
С растущим интересом к рассеиванию биопленки важно разработать эффективные методы, которые оценивают эффективность рассеивания. Здесь мы представляем подробный протокол лечения биопленочно-ассоциированных раневых инфекций рассеивателем у мышей, а также оценку эффективности рассеивания in vivo и ex vivo. Общая цель состоит в том, чтобы обеспечить эффективные методы, которые могут быть использованы с доклиническими моделями для эффективного и действенного измерения рассеивания биопленки.
Модель хирургической иссеченной инфекции мышей была использована в этих исследованиях для установления инфекции, связанной с биопленкой. Мы использовали эту модель более 15 лет и опубликовали наши наблюдения широко7,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. В целом, это модель нелетальной инфекции, где бактерии остаются локализованными в раневом ложе и связаны с биопленкой (бактерии, наблюдаемые в агрегатах, окруженных EPS), создавая хроническую инфекцию, которая длится до 3 недель. Однако, если у мышей ослаблен иммунитет (например, с диабетом 1 типа), они могут стать более восприимчивыми к развитию смертельной системной инфекции в этой модели.
В этом отчете мы предоставляем протоколы для оценки рассеивания бактерий из раны, как in vivo, так и ex vivo. Оба протокола могут быть использованы для изучения эффективности рассеивателя и имеют свои сильные и слабые стороны. Например, оценка рассеивания in vivo может предоставить важную информацию в режиме реального времени о распространении бактерий в другие части тела после рассеивания и о том, как реагирует хозяин. С другой стороны, оценка диспергирования ex vivo может быть более желательной для скрининга нескольких агентов, доз или составов, поскольку ткань может быть разделена на несколько секций, которые могут быть протестированы отдельно, тем самым уменьшая количество требуемых мышей. При оценке нескольких агентов мы обычно измеряем рассеивание сначала in vitro, как описано ранее 6,9,22. Затем мы тестируем наиболее эффективное тестирование ex vivo и резервное тестирование in vivo для ограниченного числа очень перспективных агентов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот протокол для животных был рассмотрен и одобрен Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Центром медицинских наук Техасского технического университета (протокол No 07044). Данное исследование проводилось в строгом соответствии с рекомендациями Руководства по уходу за лабораторными животными и их использованию Национальными институтами здравоохранения.
1. Подготовка бактерий к мышиным инфекциям
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы описываем заражение мышей только Pseudomonas aeruginosa. Тем не менее, другие виды бактерий могут быть использованы для возникновения инфекции. Бактериальные штаммы и материалы подробно описаны в Таблице материалов.
- Используйте Pseudomonas aeruginosa штамм дикого типа PAO1, несущий люминесцентную плазмиду pQF50-lux23 для этих экспериментов, как описаноранее 7.
- Выращивайте штаммы P. aeruginosa в сбитых с толку колбах Эрленмейера, с встряхиванием при 200 об/мин, в бульоне Лурия-Бертани (LB) при 37 °C в течение 16-20 ч. Добавьте конечную концентрацию 100 мкг/мл ампициллина в ночную культуру PAO1 (pQF50-lux) для поддержания плазмиды.
- Субкультура P. aeruginosa путем добавления 100 мкл ночной культуры в колбу Эрленмейера, содержащую 10 мл бульона LB с конечной концентрацией 100 мкг/мл ампициллина. Затем растут в течение 2-2,5 ч при 37 °C с встряхиванием, до OD600 нм 0,4, а затем последовательно разбавляют (1:10) три раза для инфектирования дозы примерно 104 клеток.
2. Получение фермента диспергирования биопленки
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого исследования мы используем 10% раствор равных частей амилазы и целлюлазы (по 5% от каждого), который будет называться «GH», для дисперсной обработки.
- Используйте 10% раствор ГР (мас./об.) амилазы (из Bacillus subtilis)и грибковой целлюлазы (из Aspergillus niger),разбавленный в 1x фосфатном буферном физиологическом растворе (PBS). Используйте PBS в качестве средства управления транспортным средством.
- Согреть все процедуры до 37 °C в течение 30 минут для активации ферментов.
3. Экспериментальные животные и предоперационная установка
- Домашние мыши, 5 пометных товарищей в клетке, в условиях, контролируемых окружающей средой, с 12-ч светлым / темным циклами и надлежащим доступом к пище и воде.
- Предпочтительно использовать самок швейцарских мышей Вебстера в возрасте от 8 до 10 недель.
- Взвесьте мышей, чтобы определить правильное количество анестезии для введения.
- Вводят анестезию путем внутрибрюшинной инъекции 100 мг/кг кетамина 10 мг/кг ксилазина.
- Осторожно нанесите крем для глаз (например, Refresh P.M.) на глаза с помощью ватного тампона, чтобы уменьшить сухость.
- Контролируйте физиологические параметры, включая частоту дыхания, цвет кожи и температуру тела на протяжении всей операции.
4. Операция иссечения дорсальной полной толщины
- Оценить хирургическую плоскость анестезии путем защемления носа и мониторинга частоты дыхания и усилий. Побрейте дорсальную поверхность и нанесите крем для депиляции на 10 минут (или в соответствии с инструкцией продукта), после чего аккуратно удалите, убедившись, что кожа была сухой.
- Для лечения боли вводят 0,05 мл лидокаина подкожно в область, которая должна быть исся, и вводят 0,02 мл бупренорфина подкожно в шею. Подождите 10 минут, чтобы убедиться, что лечение боли достигнуто.
- Перед иссечением продезинфицируйте дорсальную поверхность спиртовым тампоном и проведите круг диаметром 1,5 см к задней части спины. Поддерживайте стерильное хирургическое поле на протяжении всей процедуры и ими и ими пользуются автоклавные инструменты и стерильные перчатки. Чтобы ограничить загрязнение, проведите операцию с помощью зажженной горелки Бунзена и используйте чистые инструменты для каждого животного.
- Ввести полную толщину, эксцизионную рану кожи до уровня мышцы панникулуса хирургическими ножницами.
- После иссечения немедленно накройте раны полупроницаемой полиуретановой повязкой.
- Вводят примерно 104 КОЕ бактерий в 100 мкл PBS под повязку, на раневое ложе, чтобы установить инфекцию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Раны также могут быть инфицированы несколькими видами бактерий и/или грибков одновременно или путем размещения предварительно сформированных биопленок12или даже санированной ткани, извлеченной из пациентов19,на раневое ложе. - После заражения поместите мышей в клетку с грелками и контролируйте, пока они не восстановят свой правый рефлекс.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что мыши не замерзают, так как это может привести к смерти. - Устанавливают раневые инфекции в течение 48 ч.
- Ежедневно осматривайте адгезивные повязки на наличие разрывов и участков несцепление и при необходимости заменяйте их.
5. Дисперсная обработка in vivo
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы описываем введение диспергаторов путем применения серии из 3 местных растворов для орошения ран(рисунок 1). Тем не менее, протокол может быть адаптирован для других видов доставки, таких как нанесение гелей, кремов или повязок.
- Поместите мышей под изофлурановую анестезию (при 3% и 1 л в минуту кислорода) во время лечения.
- Приготовьте три шприца по 1 мл с иглами по 25 г, содержащими 200 мкл обработки для каждой мыши.
- Вводят 200 мкл раствора фермента или контроля PBS в рану, осторожно поднимая и зажимая кожу щипцами, немного выше раны по направлению к голове животного. Осторожно проткните шприц через приподнятую кожу и медленно вводят раствор между повязкой и раневым ложем. Повязка, используемая в этом исследовании, часто прилипает как к раневому слою, так и к окружающим тканям.
- Чтобы убедиться, что все раневое ложе покрыто раствором, осторожно поднимите повязку щипцами, оттягивая ее от раневого ложа, при этом медленно вводя раствор.
- После обработки поместите мышей обратно в клетки на 30 минут.
- После 30 мин воздействия обработки повторно обезболивают мышей изофлураном и аспирируют раствор шприцем, убедившись, что прокол в том же месте, что и раньше.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот аспирированный раствор содержит дисперсные бактериальные клетки, которые могут быть сохранены для различных последующих анализов. - Вводите вторую и третью оросительную обработку в качестве первой, используя каждый раз новый шприц.
6. Визуализация и анализ дисперга in vivo
ПРИМЕЧАНИЕ: Если люминесцентный штамм бактерий используется для инициирования инфекции, для визуализации рассеивания из раневого дна может использоваться система визуализации In Vivo (IVIS).
- Изображение мышей непосредственно до и после лечения и через 10 и 20 ч после обработки(рисунок 2 и дополнительный рисунок 1).
- Выполняйте визуализацию, пока мыши находятся под наркозом, помещая их индивидуально в IVIS и визуализируя каждую из них в течение 5 с на длине волны 560 нм. Сохраните изображения для дальнейшего анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная длина волны и время экспозиции будут зависеть от используемого репортера, а также от прибора IVIS и программного обеспечения для визуализации. - Для анализа откройте изображения в программном обеспечении IVIS и выберите область для анализа в палитре инструментов.
- Чтобы учесть фон, поместите круг на фон фотографии, а затем поместите круг одинакового размера поверх раневого ложа для каждой мыши.
- Чтобы загрузить значения измерений, выберите Просмотреть измерения > области интереса (ROI) и загрузите таблицу измерений в электронную таблицу. Вычтите показания фонового круга из каждого измерения раневого ложа, чтобы рассчитать люминесценцию для каждого образца. Рассчитать процент люминесценции, измененный на:
ROI до лечения -ROI после лечения / ROI до лечения) x 100.
ПРИМЕЧАНИЕ: Контрольные и обработанные мыши должны быть проанализированы одновременно для нормализации переменных, которые могут повлиять на получение изображения или сияние.
7. Оценка рассредоточения путем определения КОЕ
- Гуманный усыплять мышей путем внутрибрюшинной инъекции 0,2 мл пентобарбитала натрия (например, Fatal Plus) под наркозом со 100 мг/кг кетамина 10 мг/кг ксилазина.
- Заготовьте ткань раневого ложа, сначала аккуратно сняв повязку стерильными щипцами, а затем разрезав по периметру раневого ложа стерильными хирургическими ножницами. Осторожно поднимите один конец раневого ложа щипцами, используя ножницы, чтобы отрезать / дразнить образец от мышечного слоя.
- Поместите ткань из раневого ложа в предварительно маркированную и предварительно взвешенную гомогенизационную трубку 2 мл, содержащую 1 мл PBS. Снова взвесьте трубки после введения образцов, а затем осторожно переверните 3-5 раз, чтобы смыть любые дисперсные или слабо прилипшие бактерии, и удалите PBS. Добавьте 1 мл свежего PBS.
- Чтобы собрать селезенку, поместите мышей в анатомическое положение лежа на спине и закрепите, прикрепив их конечности к поверхности рассечения. Замочите область, которая будет рассечена, 70% этанолом, чтобы дезинфицировать область и предотвратить заражение образца мехом.
- Аккуратно сделайте небольшой разрез перпендикулярно средней линии хирургическими ножницами в дерме нижней части живота, убедившись, что кожа подтягивается вверх и подальше от внутренних органов. Продолжайте разрез внутрь, вдоль средней линии, пока не будет достигнута грудина. После того, как брюшинная полость была обнажена и внутренние органы были видны, осторожно отделите селезенку от соединительной ткани и поместите в отдельную гомогенизационную трубку.
- Взвесьте селезенку и промойте PBS, как описано для ткани раневого ложа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Другие органы, представляющие интерес, могут быть извлечены аналогичным образом.- При проведении начального разреза позаботьтесь о том, чтобы избежать проколов кишечника или других органов.
- Гомогенизируйте образцы в предварительно заполненных шариковых мельничных трубах по 2 мл с использованием настольного гомогенизатора со скоростью 5 м/с в течение 60 с, дважды.
- Чтобы перечислить КОЕ, последовательно разбавляйте образцы и точечные пластины на селективном агаре. Для последовательного разбавления пипетку 100 мкл образца на 900 мкл PBS в пробирке 1,5 мл, вихрь и повторите 5 раз. Пипетка 10 мкл каждого разведения на агартовую пластину, как показано на рисунке 3.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуется более точное количественное уточнение КОЕ, распределите 100 мкл каждого разбавления образца по отдельным пластинам агара.
8. Оценка рассеивания ex vivo (рисунок 4)
- Раните мышей и заражайте примерно 104 PAO1, как описано выше, а затем усыпляйте через 48 ч после заражения.
- Аккуратно снимите повязку щипцами, используя стерильную технику и не нарушая раневого ложа.
- Используйте стерильные хирургические ножницы, чтобы отрезать периметр раневого ложа от неинфицированной кожи, используя щипцы, чтобы поднять один конец раневого ложа и ножницы, чтобы иссечь инфицированную раневую ткань из мышечного слоя под ней и окружающей неинфицированной ткани. Разделите образцы раневого ложа на равные части или используйте целиком.
- Поместите раневую ткань в пустые, предварительно взвешенные 2 мл шариковой мельницы гомогенизирующие трубки. Затем снова взвесьте пробирки после добавления образца. Рассчитайте вес образца по:
вес после добавления образца - вес перед добавлением образца. - Добавьте 1 мл PBS и осторожно переверните трубку 3-5 раз, чтобы промыть образец и удалить любые планктонные клетки. Удалите и удалите PBS.
- Добавьте 1 мл обработки ГР (или PBS в качестве отрицательного контроля) к образцу и инкубируйте в течение 2 ч при 37 °C с встряхиванием при 80 об/мин.
- Удалите раствор для рассеивания биопленки и поместите в отдельную пробирку 1,5 мл. Он содержит дисперсные клетки.
- Добавьте 1 мл PBS к оставшемуся образцу ткани и осторожно инвертируйте 3-5 раз, чтобы смыть оставшиеся дисперсные клетки. Удалите и удалите PBS.
- Добавьте 1 мл PBS к оставшейся ткани и гомогенизируйте со скоростью 5 м/с в течение 60 с с использованием настоального гомогенизатора.
- Последовательно разбавляют раствор дисперсных клеток и гомогенизированный образец ткани, помещая 100 мкл образца в 900 мкл PBS в пробирке объемом 1,5 мл и повторяя пять раз в общей сложности 6 разведений.
- Пятнистая пластина 10 мкл каждого разведения на селективный агар среды (например, Pseudomonas Isolation Agar для P. aeruginosa)и инкубируют пластины при 37 °C в течение ночи.
- Подсчитайте КОЕ и рассчитайте «процент дисперсного» как (КОЕ в супернатанте/ (КОЕ в супернатанте + КОЕ в ткани биопленки)) x 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом эксперименте 8-10-недельные самки швейцарских мышей Вебстера были инфицированы 104 КОЕ PAO1, несущих люминесцентную плазмиду pQF50-lux. Как описано выше, инфекцию разрешалось устанавливать в течение 48 ч до введения 3 х 30 мин обработки либо PBS (контроль транспортного средства), либо 10% GH (лечение) для переваривания биопленки EPS. Мышей визуали до лечения, непосредственно после обработки (0 ч) и через 10 ч и 20 ч после лечения. Рисунок 2А и дополнительный рисунок 1 показывают установленную инфекцию в раневом ложе, генерирующую яркий биолюминесцентный сигнал. Рассеивание бактерий из раневого ложа может быть визуализировано сразу после лечения ГР (0 ч), но не после лечения PBS. Следует отметить, что в предыдущих исследованиях мы обнаружили бактерии в крови и селезенке уже через 5 ч послелечения СТГ 7. Распространение бактерий в органы также можно увидеть, поместив мышь на бок для визуализации, как показано на нижней панели рисунка 2А.
Изображения, полученные как с мышей, обработанных PBS, так и с GH, продемонстрировали увеличение люминесцентного сигнала через 20 ч после обработки по сравнению с предварительной обработкой(рисунок 2B). Мы предполагаем, что это связано с механическим разрушением биопленки, вызванным орошением раствора. Через 20 ч после лечения мышей усыпляли, а раневые ложа и селезенку собирали для перечисления КОЕ/грамм ткани. В то время как бактериальные нагрузки в раневых слоях были сходными(рисунок 2C),бактерии были обнаружены только в селезенке мышей, обработанныхГР (рисунок 2D),что свидетельствует о диссеминированном распространении дисперсных бактерий.
Ранее мы показали, что лечение ГР может разрушать агрегаты бактерий, улучшая количество КОЕ21. Это может объяснить небольшое увеличение бактериальной нагрузки в раневых слоях мышей, обработанных ГР. Наконец, хотя раневые пласты, обработанные ГР, имели немного более высокий КОЕ/ грамм, наблюдалось более низкое процентное биолюминесцентное изменение. Эти результаты свидетельствуют о важности подтверждения люминесценции с количеством КОЕ. Эти репрезентативные результаты дают пример данных, которые могут быть собраны с использованием протоколов, описанных выше.
Рисунок 1. Установление раневых инфекций, связанных с биопленкой, и оценка эффективности диспергаторного агента in vivo. Повязки проверяли на разрывы или потерю адгезии к коже мыши перед лечением. Скомпрометированная повязка была заменена. Мышей помещали под наркоз непосредственно перед назначением лечения. 200 мкл раствора фермента, или управления транспортным средством, вводили в пространство между раневым ложем и повязкой. Повязку осторожно поднимали с помощью щипцов, чтобы гарантировать, что вся рана была насыщена раствором. Лечение оставляли на раневом ложе на 30 минут. Через 30 мин лечение аспирировали шприцем, и добавляли еще 200 мкл лечения. Это повторялось в общей сложности 3 процедуры. Для измерения диспергирования в режиме реального времени мышей визуалировали с помощью IVIS до начала лечения, сразу после обработки (0 ч), через 10 ч и через 20 ч после лечения. Через 20 ч после обработки мышей усыпляли, а раневые ложа и селезенку собирали. Образцы промывали в PBS, а затем гомогенизировали в свежем PBS два раза со скоростью 5 м/с в течение 60 с. Затем образцы последовательно разбавляли и покрыли пятном. Были перечислены КОЕ и рассчитаны КОЕ/грамм. Уровень рассеивания бактерий из раны может быть либо оценен IVIS, либо путем определения количества КОЕ, которые систематически распространяются на селезенку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2. Репрезентативные данные демонстрируют, как оценивать рассеивание in vivo. Раны, инфицированные 104 PAO1 (pQF50-lux) в течение 48 ч, обрабатывали либо PBS, либо 10% GH (раствор фермента рассеивания биопленки). Обработка PBS использовалась в качестве управления транспортным средством. Раневые ложа обрабатывались 3х 30 мин. Мыши были сфотобированы с использованием IVIS до лечения, сразу после лечения, через 10 ч после лечения и через 20 ч после лечения. Следует отметить, что изображения сбоку получены от мышей, обработанных PBS и GH, чем те, которые показаны на изображениях сверху (A). Были зарегистрированы ROI для каждого раневого ложа до обработки и каждые 20-е часовое раневое ложе после обработки. Процентное изменение по сравнению с предварительным лечением было рассчитано как (ROI до лечения - ROI после лечения / ROI до лечения) x 100 (B). Через 20 ч после обработки мышей усыпляли. Раневые ложа и селезенки были собраны и взвешены для определения КОЕ/грамм (C и D соответственно). N=3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3. Серийное разбавление и точечное покрытие. Гомогенизированный образец вихря и 100 мкл переносили в 1,5 мл трубки Эппендорфа, содержащей 900 мкл PBS. Образец вихрево и 100 мкл переносили в другую 1,5 мл трубку Эппендорфа с 900 мкл PBS. Этот процесс повторялся 5 раз. Начиная с последней разбавляемой трубки, 10 мкл образца наносили на агаровую пластину в пятно 10-8. Это продолжалось вплоть до разбавления 10-3. Как правило, разбавление 10-3 приводит к газону бактерий в пятне. Некоторые органы, которые имеют низкую бактериальную нагрузку, могут потребовать точечного покрытия до 10-1 разведения. Повторите для каждого образца ткани. Поместите агаровую пластину в инкубатор при 37 °C в течение 24-48 ч или выращивайте в условиях, оптимальных для интересующих видов бактерий. Чтобы перечислить КОЕ, подсчитайте отдельные колонии при минимально возможном разведении и умножьте на соответствующий коэффициент разбавления для определения КОЕ/мл или используйте массу ткани для расчета КОЕ/г ткани. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4. Измерение дисперсии из инфицированной ткани ex vivo. Мышей усыпали, а инфицированную раневую ткань удаляли асептически. Инфицированную ткань помещали в гомогенизирующую трубку из бисера 2 мл и ненадолго промывали PBS. Добавляли 1 мл диспергатора и инкубировали образец в течение 2 ч при 37°С с встряхиванием при 80 об/мин. После инкубации раствор, содержащий дисперсные клетки, удаляли и помещали в отдельную трубку 1,5 мл. Оставшуюся ткань промывали 1 мл PBS. 1 мл свежего PBS добавляли в ткань и гомогенизировали при 5 м/с в течение 60 с. Затем раствор фермента и гомогенизированную ткань последовательно разбавляли и накладывали пятно на селективный агар. КОЕ были перечислены и рассеивание было рассчитано следующим образом: КОЕ из раствора фермента/ (КОЕ из раствора фермента + КОЕ из ткани) х 100. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1. Измерение рассеивания in vivo. Раны заражали 104 PAO1 (pQF50-люкс) в течение 48 ч, а затем обрабатывали либо PBS, либо 10% GH (раствор фермента рассеивания биопленки). Обработка PBS использовалась в качестве управления транспортным средством. Раневые ложа обрабатывались орошением 3 х 30 минут. Мыши были сфотобированы с использованием IVIS до лечения, сразу после лечения, через 10 ч после лечения и через 20 ч после лечения (A). Через 20 ч после обработки мышей усыпляли. Раневые ложа и селезенки были собраны и взвешены для определения КОЕ/грамм (В и С соответственно). N=3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы описываем протоколы, которые могут быть использованы для изучения эффективности агентов диспергирования биопленки. Эти протоколы могут быть легко адаптированы для использования с различными типами диспергирующих агентов, видами бактерий или образцами ex vivo, включая образцы клинической саниртуализации. Этот протокол также предоставляет клинически релевантную модель для сбора и изучения дисперсных бактериальных клеток. Было показано, что фенотипы дисперсных бактериальных клеток отличаются от фенотипов планктонных или биопленопленочных клеток 5,24,25,26; однако фенотипы бактерий, дисперсных in vivo, еще предстоит описать. Если диспергирующие агенты должны использоваться терапевтически, важно определить их эффективность, а также понять фенотип, который принимают эти клетки. Кроме того, этот протокол может быть использован для изучения того, как изменения в структуре EPS или изменение сигнальных путей влияют на рассеивание. Например, рассеивание штаммов P. aeruginosa с мутациями в различных экзополисахаридных компонентах (например, Pel, Psl, Alginate) можно сравнить с дисперсией штаммов дикого типа.
В целом, этот протокол можно разбить на четыре основных раздела: (1) установление инфекции (2) введение лечения или (3) сбор инфицированной ткани для лечения ex vivo и (4) определение эффективности рассеивания. Важнейшей частью раздела 1 является успешное установление инфекции в раневом ложе. Если используются люминесцентные штаммы, которые требуют антибиотиков для поддержания стабильности плазмиды, необходимо добавить соответствующие антибиотики при культивировании штаммов при подготовке к инфекции. Следует также учитывать, что плазмиды могут не поддерживаться во время заражения у животного (без давления антибиотика), поэтому оценка бактериальной нагрузки не должна полностью полагаться на визуализацию IVIS, а должна быть подтверждена КОЕ. Инокуляционная доза также является критическим шагом для инициирования инфекции. Для P. aeruginosa и S. aureus обычно используется инфицирующая доза 104-5 КОЕ, но оптимальная доза может отличаться в зависимости от используемых видов бактерий и мышей.
Важнейшей частью раздела 2 является обеспечение того, чтобы раневое ложе было покрыто повязкой на протяжении всего развития инфекции и лечения. Если повязка не приклеивается должным образом, лечение может вытекать из раневого ложа и может быть неэффективным. Повязка также важна для защиты раневого ложа от потенциальных загрязнений и нарушения сократительного заживления мышью, что необходимо для имитации заживления ран человека. Наконец, важнейшей частью раздела 3 является надлежащая обработка собранных образцов. Чтобы перечислить КОЕ, инфицированную ткань следует промыть 1 мл PBS перед добавлением еще 1 мл PBS для гомогенизации. Более волокнистые органы, такие как легкие, могут потребовать более тщательной гомогенизации.
Основные ограничения этих протоколов включают в себя необходимый тщательный мониторинг повязки и использование IVIS для диспергирования изображений и создания предположений об эффективности диспергирования. Для долгосрочных исследований повторный рост меха может быть проблематичным, потому что он может препятствовать прилипанию повязки к месту раны. Повязки часто требуют замены, а их удаление может привести к случайной санации раны и возможности заражения. Для визуализации рассеивания из раневого ложа необходимо использовать биолюминесцентный бактериальный штамм. Если интересующих бактериальных видов отсутствует биолюминесцентный репортер, этот вариант неосуществим. Другим ограничением является потенциал дисперсного лечения, чтобы вызвать бактериемию, которая может привести к смерти мыши. Тем не менее, мы видели, что дисперсные клетки могут быть эффективно убиты антибиотиками in vivo7.
Репрезентативные результаты, показанные на рисунке 2, иллюстрируют ограничение IVIS для измерения эффективности рассеивания. Во-первых, должен быть использован люминесцентный штамм интересующих видов бактерий. Штамм должен производить люминесцентный сигнал, который достаточно яркий, чтобы его можно было обнаружить через несколько слоев ткани, чтобы визуализировать рассеивание от раневого ложа к другим частям тела. Было высказано предположение, что для получения люминесцентного сигнала, достаточно сильного для обнаружения IVIS27,требуется минимум10 6 бактерий. Снижение люминесцентного сигнала также было описано, когда бактерии входят в стационарную фазу28. Это может привести к разрыву между измеренными ROI и КОЕ, перечисленными29. Это ограничение может привести к ложным предположениям, когда нет сигнала, достаточно сильного для обнаружения, но бактерии все еще присутствуют. Как показано на рисунке 2B,лечение PBS и 10% GH приводило к увеличению люминесценции после обработки. Это любопытное и последовательное наблюдение, которое также наблюдалось после рассеивания клеток in vitro (Клаудия Маркес, Бингемтонский университет, личное общение). Возможно, что физическое нарушение биопленки от введения лечения просто распространяет клетки, которые были плотно упакованы, что приводит к увеличению светового сигнала. В качестве альтернативы, дисперсное лечение может «пробудить» клетки биопленки, которые ранее были метаболически неактивными, что приводит к увеличению биолюминесценции. В любом случае, крайне важно подтвердить результаты визуализации IVIS данными КОЕ. Наконец, происходит гетерогенное распределение бактерий внутри инфицированной раневойткани 30,31. Поэтому, если ткань разделена ex vivo для предоставления большего количества образцов, не следует предполагать, что бактериальная нагрузка в каждом раневом участке одинакова.
Существуют модификации и устранение неполадок, которые могут быть проведены для преодоления ограничений этих моделей. Во-первых, количество времени, отведенного для воздействия крема для депиляции, возможно, потребуется скорректировать в зависимости от используемого вида мышей. Например, 7 мин обычно используется для швейцарских мышей Вебстера, в то время как мышам C57BL/6 может потребоваться до 10 минут воздействия, чтобы успешно удалить мех. Это, конечно, также зависит от используемого продукта, и время воздействия никогда не должно превышать инструкции производителя. Если проводится длительное исследование (более 4 дней), возможно, потребуется повторное нанесение крема для депиляции, чтобы удалить повторно отращенный мех и обеспечить надлежащую герметизацию повязки. Далее, если люминесцентный сигнал трудно обнаружить, время экспозиции может быть увеличено во время визуализации IVIS. Инокуляционная доза и время заражения также могут быть скорректированы. Важно использовать заразительную дозу, которая не слишком высока, чтобы она подавляла мышь, но также не слишком низка, чтобы бактерии немедленно очищались иммунным ответом.
В этом протоколе мы описываем лечение раневых инфекций 48-часовой давности диспергирующими агентами, так как это временная точка, в которую мы показали, что инфекции, вызванные P. aeruginosa и / или S. aureus, установлены и биоплено-ассоциированные 12,15,16. Однако, в зависимости от вида бактерий, другие временные точки могут быть более оптимальными. В идеале бактериальная нагрузка в ране должна быть плато после установления инфекции. Например, мы видели, что как при P. aeruginosa, так и при S. aureus бактериальная нагрузка в ране достигает примерно 108 КОЕ/г ткани к 48 ч после заражения и остается на этом уровне до закрытия раны. На рисунке 1 показана обработка раствором, требующим промывки 3 х 30 мин. Однако, если бы рассеивающий агент был в другой форме, промывки не были бы необходимы. Например, крем, гель или инженерная повязка могут быть просто помещены поверх раневого ложа. Наконец, рана может быть инфицирована различными способами, включая инокуляцию планктонных бактериальных клеток, предварительно сформированных биопленок12или даже инфицированную санированную ткань другого животного или человека19,32. Мы видели, что пересадка предварительно сформированной биопленки или образца санировки на раневое дно приводит к более успешным полимикробным инфекциям, чем когда несколько видов инокулируются в их планктонной форме12.
В целом, эти протоколы описывают методы изучения рассеивания биопленки и оценки терапевтических агентов рассеивания биопленки. Эти модели позволяют развить сложные полимикробные биопленоацеплетоацепленные инфекции, которые имитируют клинически значимые инфекции человека. Мы надеемся, что эти протоколы будут использоваться и совершенствоваться для дальнейшей разработки антибиопленочных диспергаторов для терапевтического использования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения (R21 AI137462-01A1), Фонда Теда Нэша Long Life, Фонда Джаспера Л. и Джека Дентона Уилсона и Министерства обороны (DoD MIDRP W0318_19_NM_PP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisher | 14823434 | Use to complete serial dilutions of samples |
| 25G 58 in needle | Fisher | 14823434 | Attaches to 1 mL syringe |
| Ampicillin Sodium Salt | Fisher | BP1760-5 | Make a 50 mg/ mL stock solution and add 100 µL to 10 mL of LB broth for both overnight and subculture |
| Amylase | MP Biomedicals | 2100447 | Make a 5% w/v solution, vortex- other dispersal agents can be used |
| Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL) | ZooPharm | RX216118 | Use as pain mainagement- may use other options |
| Cellulase | MP Biomedicals | 2150583 | Add 5% w/v to the 5% w/v amylase solution, vortex, activate at 37 °C for 30 min- other dispersal agents can be used |
| Depilatory cream | Walmart | 287746 | Use a small amount to massage into the hair follicles on the back of the animal and allot 10 min to remove hair |
| Dressing Forceps, Serrated Tips | Fisher | 12-460-536 | Can use other forms of forceps |
| Erlenmeyer flasks baffled 125 mL | Fisher | 101406 | Use to grow overnights and sub-cultures of bacteria |
| FastPrep-24 Benchtop Homogenizer | MP Biomedicals | 6VFV9 | Use 5 m/s for 60 s two times to homogenize tissue |
| Fatal Plus | Vortech Pharmaceuticals | 0298-9373-68 | Inject 0.2 mL intraperitaneal for each mouse |
| Homogenizing tubes (Bead Tube 2 mL 2.4 mm Metal) | Fisher | 15340151 | Used to homogenize samples for plating |
| Isoflurane | Diamond Back Drugs | ||
| Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution C-IIIN | Sigma Aldrich | K4138 | Use as anasethia- other options can also be utilized to gain a surgical field of anasethia |
| LB broth, Miller | Fisher | BP1426-2 | Add 25 g/L and autoclave |
| Lidocaine 2% Injectable | Diamond Back Drugs | 2468 | Inject 0.05 mL through the side of the marked wound bed area so it is deposited in the center of the mark. Allot 10 min prior to cutting |
| Meropenem | Sigma Aldrich | PHR1772-500MG | Make 5 mg/mL to add to the GH solution to apply topically and a 15 mg/mL solution to inject intraperitaneal 4 h prior and 6 h post-treatment |
| Non-sterile cotton gauze sponges | Fisher | 13-761-52 | Use to remove the depilatory cream |
| PAO1 pQF50-lux bacterial strain | Ref [13] | N/A | PAO1 pgF50-lux was used as the P. aeruginosa strain of interest in this paper's representative results |
| Petri dishes | Fisher | PHR1772-500MG | |
| Phosphate Buffer Saline 10x | Fisher | BP3991 | Dilute 10x to 1x prior to use |
| Polyurethane dressing | Mckesson | 66024007 | Cut the rounded edge off and cut the remaining square into 4 equal sections |
| Pseudomonas isolation agar | VWR | 90004-394 | Add 20 mL/L of glycerol and 45 g/mL to water, autoclave, and pour 20 mL into petri dishes |
| Refresh P.M. | Walmart | Use on eyes to reduce dryness during procedure. | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisher | 22-363-750 | Use to clean the skin immediately prior to wounding to disinfect the area |
| Straight Delicate Scissors | Fisher | 89515 | Can also use curved scissors |
| Swiss Webster mice | Charles River | 551NCISWWEB | Other mice strains can be used |
| Syring Slip Tip 1 mL | Fisher | 14823434 | Used to administer drugs and enzyme treatment |
References
- Rossolini, G. M., Arena, F., Pecile, P., Pollini, S. Update on the antibiotic resistance crisis. Current Opinion in Pharmacology. 18, 56-60 (2014).
- Stewart, P. S. Antimicrobial Tolerance in Biofilms. Microbiology Spectrum. 3 (3), (2015).
- Flemming, H. C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).
- Rumbaugh, K. P. How well are we translating biofilm research from bench-side to bedside. Biofilm. 2 (100028), (2020).
- Rumbaugh, K. P., Sauer, K. Biofilm dispersion. Nature Reviews Microbiology. 18 (10), 571-586 (2020).
- Fleming, D., Chahin, L., Rumbaugh, K. Glycoside Hydrolases Degrade Polymicrobial Bacterial Biofilms in Wounds. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (2), (2017).
- Fleming, D., Rumbaugh, K. The Consequences of Biofilm Dispersal on the Host. Scientific Reports. 8 (1), 10738 (2018).
- Baker, P., et al. Exopolysaccharide biosynthetic glycoside hydrolases can be utilized to disrupt and prevent Pseudomonas aeruginosa biofilms. Science Advances. 2 (5), 1501632 (2016).
- Redman, W. K., Welch, G. S., Rumbaugh, K. P. Differential Efficacy of Glycoside Hydrolases to Disperse Biofilms. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 379 (2020).
- Zhu, L., et al. Glycoside hydrolase DisH from Desulfovibrio vulgaris degrades the N-acetylgalactosamine component of diverse biofilms. Environmental Microbiology. 20 (6), 2026-2037 (2018).
- Fell, C. F., Rumbaugh, K. P. Antibacterial Drug Discovery to Combat MDR. , 527-546 (2019).
- Dalton, T., et al. An in vivo polymicrobial biofilm wound infection model to study interspecies interactions. PLoS One. 6 (11), 27317 (2011).
- Wolcott, R. D., et al. Biofilm maturity studies indicate sharp debridement opens a time- dependent therapeutic window. Journal of Wound Care. 19 (8), 320-328 (2010).
- Korgaonkar, A., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. Community surveillance enhances Pseudomonas aeruginosa virulence during polymicrobial infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (3), 1059-1064 (2013).
- Watters, C., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilms perturb wound resolution and antibiotic tolerance in diabetic mice. Medical Microbiology and Immunology. 202 (2), 131-141 (2013).
- Watters, C., Everett, J. A., Haley, C., Clinton, A., Rumbaugh, K. P. Insulin treatment modulates the host immune system to enhance Pseudomonas aeruginosa wound biofilms. Infection and Immunity. 82 (1), 92-100 (2014).
- Turner, K. H., Everett, J., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. Requirements for Pseudomonas aeruginosa acute burn and chronic surgical wound infection. PLOS Genetics. 10 (7), 1004518 (2014).
- Harrison, F., et al. A 1,000-Year-Old Antimicrobial Remedy with Antistaphylococcal Activity. mBio. 6 (4), 01129 (2015).
- Wolcott, R., et al. Microbiota is a primary cause of pathogenesis of chronic wounds. Journal of Wound Care. 25, Sup10 33-43 (2016).
- Ibberson, C. B., et al. Co-infecting microorganisms dramatically alter pathogen gene essentiality during polymicrobial infection. Nature Microbiology. 2, 17079 (2017).
- Fleming, D., et al. Utilizing Glycoside Hydrolases to Improve the Quantification and Visualization of Biofilm Bacteria. Biofilm. 2, (2020).
- DeLeon, S., et al. Synergistic interactions of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in an in vitro wound model. Infection and Immunity. 82 (11), 4718-4728 (2014).
- Darch, S. E., et al. Phage Inhibit Pathogen Dissemination by Targeting Bacterial Migrants in a Chronic Infection Model. mBio. 8 (2), (2017).
- Chua, S. L., et al. Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles. Nature Communications. 5, 4462 (2014).
- Beitelshees, M., Hill, A., Jones, C. H., Pfeifer, B. A. Phenotypic Variation during Biofilm Formation: Implications for Anti-Biofilm Therapeutic Design. Materials (Basel). 11 (7), (2018).
- Sauer, K., et al. Characterization of nutrient-induced dispersion in Pseudomonas aeruginosa PAO1 biofilm. J Bacteriol. 186 (21), 7312-7326 (2004).
- Kuklin, N. A., et al. Real-time monitoring of bacterial infection in vivo: development of bioluminescent staphylococcal foreign-body and deep-thigh-wound mouse infection models. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (9), 2740-2748 (2003).
- Francis, K. P., et al. Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon. Infection and Immunity. 69 (5), 3350-3358 (2001).
- Kadurugamuwa, J. L., et al. Noninvasive optical imaging method to evaluate postantibiotic effects on biofilm infection in vivo. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (6), 2283-2287 (2004).
- Wimpenny, J., Manz, W., Szewzyk, U. Heterogeneity in biofilms. FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 661-671 (2000).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).
- Tipton, C. D., et al. Chronic wound microbiome colonization on mouse model following cryogenic preservation. PLoS One. 14 (8), 0221656 (2019).
