Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Avaliação da dispersão de biofilme em feridas de Murine

Published: August 7, 2021 doi: 10.3791/62136
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1,2,3
1Department of Surgery, Texas Tech University Health Sciences Center, 2Immunology and Molecular Microbiology, Texas Tech University Health Sciences Center, 3TTUHSC Surgery Burn Center of Research Excellence, Texas Tech University Health Sciences Center
* These authors contributed equally

Summary

Aqui, descrevemos métodos ex vivo e in vivo para avaliar a dispersão bacteriana de uma infecção por ferida em camundongos. Este protocolo pode ser utilizado para testar a eficácia de terapias antimicrobianas e anti-biofilme tópicas, ou para avaliar a capacidade de dispersão de diferentes cepas bacterianas ou espécies.

Abstract

As infecções relacionadas ao biofilm estão implicadas em uma ampla gama de condições crônicas, como úlceras diabéticas não curativas, sinusite crônica, otite média recorrente e muito mais. As células microbianas dentro dessas infecções são protegidas por uma substância polimérica extracelular (EPS), que pode impedir que antibióticos e células imunes hospedeiras limpem a infecção. Para superar esse obstáculo, os investigadores começaram a desenvolver agentes dispersos como potenciais terapêuticos. Esses agentes têm como alvo vários componentes dentro do EPS biofilme, enfraquecendo a estrutura e iniciando a dispersão das bactérias, o que pode teoricamente melhorar a potência dos antibióticos e o despejo imunológico. Para determinar a eficácia dos agentes de dispersão para infecções por feridas, desenvolvemos protocolos que medem a dispersão de biofilmes tanto ex vivo quanto in vivo. Usamos um modelo de excisão cirúrgica de camundongos que foi bem descrito para criar infecções de feridas crônicas associadas a biofilmes. Para monitorar a dispersão in vivo,infectamos as feridas com cepas bacterianas que expressam luciferase. Uma vez estabelecidas infecções maduras, irrigamos as feridas com uma solução contendo enzimas que degradam componentes do EPS biofilme. Em seguida, monitoramos a localização e intensidade do sinal luminescente na ferida e órgãos filtrantes para fornecer informações sobre o nível de dispersão alcançado. Para análise ex vivo da dispersão de biofilmes, o tecido da ferida infectada está submerso em solução enzimética degradante de biofilme, após a qual a carga bacteriana restante no tecido, versus a carga bacteriana em solução, é avaliada. Ambos os protocolos têm pontos fortes e fracos e podem ser otimizados para ajudar a determinar com precisão a eficácia dos tratamentos de dispersão.

Introduction

O aumento da resistência a antibióticos em todo o mundo está levando à falta de opções de antibióticos para tratar uma variedade de infecções bacterianas1. Além da resistência a antibióticos, as bactérias podem ganhar tolerância a antibióticos adotando um estilo de vida associado ao biofilme2. Um biofilme é uma comunidade de microrganismos que são protegidos por uma matriz de polissacarídeos, DNA extracelular, lipídios e proteínas3, coletivamente chamada de substância polimérica extracelular (EPS). À medida que a crise de resistência a antibióticos continua, novas estratégias que prolongam o uso ou potencializam a eficácia de antibióticos são extremamente necessárias. Os agentes anti-biofilme são uma solução promissora4.

Entre as diferentes estratégias anti-biofilmes que foram propostas, a utilização de agentes dispersos, que visam diferentes componentes do EPS biofilme, estão na vanguarda do desenvolvimento terapêutico5. As hidrolases glicóvias (GH) são uma dessas classes de agente disperso. GH são uma grande classe de enzimas que catalisam o decote de diferentes laços dentro dos polissacarídeos que fornecem integridade estrutural ao EPS. Nosso grupo, assim como outros, têm demonstrado que o GH pode efetivamente degradar biofilmes, induzir dispersão e melhorar a eficácia de antibióticos para uma série de espécies bacterianas diferentes, tanto in vitro quanto in vivo6,7,8,9,10,11.

Com um crescente interesse pela dispersão de biofilmes, é importante desenvolver métodos eficazes que avaliem a eficácia dispersa. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para o tratamento de infecções de feridas associadas a biofilmes com um agente dispersivo em camundongos, e a avaliação da eficácia dispersão, in vivo e ex vivo. O objetivo geral é fornecer métodos eficazes que possam ser usados com modelos pré-clínicos para medir a dispersão de biofilmes de forma eficaz e eficiente.

Um modelo de infecção por excisão cirúrgica de murina foi utilizado nesses estudos para estabelecer uma infecção associada a biofilmes. Utilizamos esse modelo há mais de 15 anos e publicamos nossas observações extensivamente7,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. Em geral, este é um modelo de infecção não letal onde as bactérias permanecem localizadas no leito da ferida e são associadas ao biofilme (bactérias vistas em agregados cercados por EPS), configurando uma infecção crônica que dura até 3 semanas. No entanto, se os camundongos são imunocomprometidos (com diabetes tipo 1, por exemplo), eles podem se tornar mais suscetíveis ao desenvolvimento de uma infecção sistêmica fatal neste modelo.

Neste relatório, fornecemos protocolos para avaliar a dispersão de bactérias de uma ferida, tanto in vivo quanto ex vivo. Ambos os protocolos podem ser usados para examinar a eficácia de um agente disperso e ter suas próprias forças e fraquezas. Por exemplo, avaliar a dispersão in vivo pode fornecer informações importantes e em tempo real sobre a disseminação de bactérias para outras partes do corpo após a dispersão, e como o host responde. Por outro lado, avaliar a dispersão ex vivo pode ser mais desejável para a triagem de múltiplos agentes, doses ou formulações, pois o tecido pode ser dividido em múltiplas seções que podem ser testadas separadamente, reduzindo assim o número de camundongos necessários. Ao avaliar vários agentes, normalmente medimos a dispersão primeiro in vitro como descrito anteriormente 6,9,22. Testamos então o teste ex vivo e reserva mais eficaz para um número limitado de agentes muito promissores.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Este protocolo animal foi revisado e aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Texas Tech University Health Sciences Center (protocolo número 07044). Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde.

1. Preparação de bactérias para infecções de camundongos

NOTA: Aqui descrevemos ratos infectantes apenas com Pseudomonas aeruginosa. No entanto, outras espécies bacterianas podem ser usadas para causar infecção. Cepas e materiais bacterianos estão detalhados na Tabela de Materiais.

  1. Use pseudomonas aeruginosa cepa selvagem PAO1 carregando a luminescência plasmid pQF50-lux23 para esses experimentos como descrito anteriormente7.
  2. Grow P. aeruginosa esfoja em frascos de Erlenmeyer perplexos, com agitação a 200 rpm, no caldo luria-bertani (LB) a 37 °C por 16 a 20 h. Adicione uma concentração final de 100 μg/mL de ampicillina à cultura noturna de PAO1(pQF50-lux) para manutenção do plasmídeo.
  3. Subcultura P. aeruginosa adicionando 100 μL da cultura da noite para o dia a um frasco de Erlenmeyer contendo 10 mL de caldo LB com uma concentração final de 100 μg/mL ampicillin. Em seguida, cresça por 2-2,5 h a 37 °C com agitação, para um OD600 nm de 0,4, e depois diluído em série (1:10) três vezes para uma dose infectante de aproximadamente 104 células.

2. Preparação da enzima dispersão de biofilm

NOTA: Para este estudo utilizamos uma solução de 10% de amilase e celulase de partes iguais (5% de cada), que será referida como "GH", para o tratamento de dispersão.

  1. Use uma solução de 10% GH (c/v) de amilase (de Bacillus subtilis) e cellulase fúngica (de Aspergillus niger) diluída em 1x salina tampão fosfato (PBS). Use PBS como tratamento de controle do veículo.
  2. Aqueça todos os tratamentos a 37 °C por 30 minutos para ativação da enzima.

3. Animais experimentais e configuração pré-operatória

  1. Ratos domésticos, 5 companheiros de lixo por gaiola, em condições controladas pelo meio ambiente, com ciclos claros/escuros de 12h e acesso adequado a alimentos e água.
  2. De preferência, use camundongos suíços webster, entre 8 e 10 semanas de idade.
  3. Pesar camundongos para determinar a quantidade adequada de anestesia para administrar.
  4. Administre anestesia pela injeção intraperitoneal de 100 mg/kg de cetamina 10 mg/kg de xilazina.
  5. Aplique creme para os olhos (por exemplo, Atualize P.M.) cuidadosamente no olho usando um cotonete para reduzir o ressecamento.
  6. Monitore parâmetros fisiológicos, incluindo taxa respiratória, coloração da pele e temperatura corporal durante toda a cirurgia.

4. Cirurgia de excisão de espessura total dorsal

  1. Avalie o plano cirúrgico da anestesia por aperto de dedo do pé e monitoramento da taxa respiratória e esforço. Raspe a superfície dorsal e aplique um creme depilatório por 10 minutos (ou conforme instruções do produto), após a qual retire suavemente, garantindo que a pele esteja seca.
  2. Para o tratamento da dor, administre 0,05 mL de lidocaína subcutânea na área a ser extirpada, e injete 0,02 mL de buprenorfina subcutânea no escroto do pescoço. Espere 10 minutos para garantir que o tratamento da dor seja alcançado.
  3. Antes da excisão, desinfete a superfície dorsal usando um cotonete de álcool e desenhe um círculo de 1,5 cm de diâmetro em direção à porção posterior da parte posterior da parte traseira. Mantenha um campo cirúrgico estéril durante todo o procedimento e use instrumentos autoclaved e luvas estéreis. Para limitar a contaminação, realize a cirurgia por um queimador Bunsen aceso e use ferramentas limpas para cada animal.
  4. Administre uma ferida de pele excisional e de espessura total ao nível do músculo panniculus com uma tesoura cirúrgica.
  5. Após a excisão, cubra imediatamente as feridas com um curativo de poliuretano semipermeável.
  6. Injete aproximadamente10 4 UFC de bactérias em 100 μL PBS sob o curativo, no leito da ferida, para estabelecer uma infecção.
    NOTA: As feridas também podem ser infectadas com várias espécies de bactérias e/ou fungos simultaneamente, ou colocando biofilmes pré-formados12, ou mesmo tecido desbridamento extraído de pacientes19, no leito da ferida.
  7. Após a infecção, coloque os ratos na gaiola com almofadas de aquecimento e monitore até que recuperem o reflexo de direita.
    NOTA: Certifique-se de que os ratos não esfriam, pois isso pode levar à morte.
  8. Estabeleça infecções por 48 h.
  9. Inspecione os curativos adesivos diariamente para lágrimas e áreas de não adesão e substituídos, se necessário.

5. Tratamento de dispersão in vivo

NOTA: Aqui descrevemos a administração dos agentes de dispersão aplicando uma série de 3 soluções de irrigação de feridas tópicas(Figura 1). No entanto, o protocolo pode ser adaptado para outros tipos de entrega, como a aplicação de géis, cremes ou curativos.

  1. Coloque camundongos sob anestesia isoflurane (a 3% e 1 L por minuto de oxigênio) enquanto administra os tratamentos.
  2. Prepare três seringas de 1 mL, com agulhas de 25 G, contendo 200 μL de tratamento para cada rato.
  3. Injete 200 μL de solução enzimápica ou controle de PBS sobre a ferida, levantando cuidadosamente e beliscando a pele com fórceps, ligeiramente acima da ferida em direção à cabeça do animal. Fure cuidadosamente a seringa através da pele levantada e injete lentamente a solução entre o curativo e a cama da ferida. O curativo utilizado neste estudo muitas vezes adere tanto ao leito da ferida quanto ao tecido circundante.
    1. Para garantir que toda a cama da ferida esteja coberta por solução, levante suavemente o curativo com fórceps, afastando-o lentamente da cama da ferida, enquanto injeta lentamente a solução.
  4. Após o tratamento, coloque os ratos de volta em suas gaiolas por 30 minutos.
  5. Após 30 minutos de exposição ao tratamento, re-anestesiar os camundongos com isofânure e aspirar a solução com uma seringa, certificando-se de perfurar na mesma área de antes.
    NOTA: Esta solução aspirada contém células bacterianas dispersas, que podem ser salvas para várias análises a jusante.
  6. Administre o segundo e o terceiro tratamentos de irrigação como o primeiro, usando uma nova seringa cada vez.

6. Imagens e análises dispersas in vivo

NOTA: Se uma cepa luminescente de bactérias for utilizada para iniciar a infecção, um Sistema de Imagem In Vivo (IVIS) pode ser usado para visualizar a dispersão do leito da ferida.

  1. Camundongos de imagem imediatamente antes e depois do tratamento e às 10 e 20h pós-tratamento (Figura 2 e Figura Suplementar 1).
  2. Realize imagens enquanto os camundongos estão sob anestesia, colocando-os individualmente no IVIS e imagens cada uma por 5 s em um comprimento de onda de 560 nm. Salve imagens para análises posteriores.
    NOTA: O comprimento de onda ideal e o tempo de exposição dependerão do repórter usado e do instrumento IVIS e do software de imagem.
  3. Para análise, abra imagens no software IVIS e selecione a área a ser analisada na Paleta de Ferramentas.
  4. Para explicar o fundo, coloque um círculo no fundo de uma foto e, em seguida, coloque o mesmo círculo de tamanho em cima da cama de ferida para cada rato.
  5. Para carregar valores de medição, selecione Medições de Região de Interesse > (ROI) e carregue a tabela de medições em uma planilha. Subtraia a leitura do círculo de fundo de cada uma das medidas do leito da ferida para calcular a luminescência de cada amostra. Calcule por cento de luminescência alterada por:
    PRÉ-tratamento do ROI pós-tratamento/ pré-tratamento do ROI) x 100.
    NOTA: O controle e os camundongos tratados devem ser analisados simultaneamente para normalizar variáveis que possam afetar a aquisição ou brilho da imagem.

7. Avaliar a dispersão determinando a UFC

  1. Eutanize humanamente camundongos pela injeção intraperitoneal de 0,2 mL de sódio pentobarbital (por exemplo, Fatal Plus) sob anestesia com 100 mg/kg de cetamina 10 mg/kg de xilazina.
  2. Colher tecido de cama de ferida primeiro removendo suavemente o curativo com fórceps estéreis, e depois cortar ao redor do perímetro do leito da ferida com uma tesoura cirúrgica estéril. Levante suavemente uma extremidade da cama da ferida com fórceps enquanto usa uma tesoura para cortar/provocar a amostra para longe da camada muscular.
  3. Coloque tecido do leito da ferida em tubo de homogeneização pré-rotulado e pré-pesado de 2 mL contendo 1 mL de PBS. Pesar os tubos novamente depois de inserir as amostras e, em seguida, inverter suavemente 3-5 vezes para enxaguar qualquer bactéria dispersa ou frouxamente aderida, e remover o PBS. Adicione 1 mL de PBS fresco.
  4. Para colher os baços, coloque os ratos em uma posição anatômica supina e fixe fixando suas extremidades em uma superfície de dissecção. Mergulhe a área a ser dissecada com 70% de etanol para desinfetar a área e evitar que a pele contamine a amostra.
  5. Faça cuidadosamente uma pequena incisão perpendicular à linha média com uma tesoura cirúrgica na dermis inferior do abdômen inferior, certificando-se de puxar a pele para cima e para longe dos órgãos internos. Continue a incisão interiormente, ao longo da linha média, até que o esterno foi atingido. Uma vez exposta a cavidade peritoneal e os órgãos internos visíveis, separe suavemente o baço do tecido conjuntivo e coloque em um tubo de homogeneização separado.
  6. Pesar baço e enxaguar com PBS, como descrito para o tecido do leito da ferida.
    NOTA: Outros órgãos de interesse podem ser colhidos da mesma forma.
    1. Ao fazer a incisão inicial, tome cuidado para evitar perfurar os intestinos ou outros órgãos.
  7. Homogeneize amostras em tubos pré-preenchidos de 2 mL do moinho de contas usando um homogeneizador de bancada a 5 m/s para 60 s, duas vezes.
  8. Para enumerar a UFC, diluir em série amostras e placa spot em ágar seletivo. Para diluição serial, pipeta 100 μL da amostra em 900 μL de PBS em um tubo de 1,5 mL, vórtice e repetição 5 vezes. Pipeta 10 μL de cada diluição em uma placa de ágar, como mostrado na Figura 3.
    NOTA: Se for necessária uma quantitação mais precisa da UFC, espalhe 100 μL de cada diluição da amostra através de placas de ágar separadas.

8. Avaliação ex vivo de dispersão ( Figura4)

  1. Ferir camundongos e infectar com aproximadamente 104 PAO1 como descrito acima, e depois eutanásia 48 h após a infecção.
  2. Remova cuidadosamente o curativo com fórceps, utilizando técnica estéril e sem perturbar o leito da ferida.
  3. Use uma tesoura cirúrgica estéril para cortar o perímetro do leito da ferida longe da pele não infectada usando fórceps para levantar uma extremidade do leito da ferida e tesoura para extirir tecido infectado da camada muscular por baixo e ao redor do tecido não infectado. Divida amostras de cama de ferida em partes iguais ou use inteiro.
  4. Coloque o tecido da ferida em tubos vazios e pré-pesados de 2 mL homogeneizadores do moinho de contas. Em seguida, pese os tubos novamente depois de adicionar a amostra. Calcule o peso da amostra por:
    peso após adicionar amostra - peso antes de adicionar amostra.
  5. Adicione 1 mL de PBS e inverta suavemente o tubo 3-5 vezes para enxaguar a amostra e remover quaisquer células planctônicas. Remova e descarte o PBS.
  6. Adicione 1 mL de tratamento GH (ou PBS como controle negativo) à amostra e incubar por 2h a 37 °C com agitação a 80 rpm.
  7. Remova a solução de dispersão de biofilmes e coloque em um tubo separado de 1,5 mL. Isto contém as células dispersas.
  8. Adicione 1 mL de PBS à amostra de tecido restante e inverta suavemente 3-5 vezes para enxaguar todas as células dispersas restantes. Remova e descarte o PBS.
  9. Adicione 1 mL de PBS ao tecido restante e homogeneize a 5 m/s por 60 s usando um homogeneizador de bancada.
  10. Diluir em série a solução de células dispersas e a amostra de tecido homogeneizado colocando 100 μL de amostra em 900 μL de PBS em um tubo de 1,5 mL, e repetindo cinco vezes para um total de 6 diluições.
  11. Placa spot 10 μL de cada diluição em ágar seletivo de mídia (por exemplo, Pseudomonas Isolation Agar for P. aeruginosa) e incubar as placas a 37 °C durante a noite.
  12. Conte a UFC e calcule o 'percentual disperso' como (CFU em supernasal/ (CFU em CFU supernante+ em tecido biofilme)) x 100.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Neste experimento, camundongos webster suíços de 8 a 10 semanas foram infectados com 104 UFC de PAO1 carregando a luminescence plasmid pQF50-lux. Como descrito acima, foi permitida uma infecção estabelecer-se por 48 horas antes de administrar tratamentos de 3 x 30 min de PBS (controle de veículo) ou 10% GH (tratamento) para digerir o EPS biofilme. Os camundongos foram retratados antes do tratamento, logo após o tratamento (0h) e às 10h e 20h após o tratamento. Figura 2A e Figura Suplementar 1 mostram uma infecção estabelecida dentro do leito da ferida gerando um sinal bioluminescente brilhante. A dispersão de bactérias para fora do leito da ferida pode ser visualizada imediatamente após o tratamento de GH (0h), mas não após o tratamento da PBS. Deve-se notar que, em estudos anteriores, detectamos bactérias no sangue e no baço já em 5h pós tratamento GH7. A disseminação bacteriana nos órgãos também pode ser vista colocando o rato de lado para a imagem, como mostrado no painel inferior da Figura 2A.

Imagens dos camundongos tratados com PBS e GH demonstraram um aumento no sinal luminescente em 20 h após o tratamento em comparação com o pré-tratamento(Figura 2B). Nós hipótesemos que isso se deve à interrupção mecânica do biofilme causada pela irrigação da solução. Às 20h após o tratamento, os camundongos foram eutanizados, e os leitos e baços foram coletados para enumerar CFU/grama de tecido. Enquanto as cargas bacterianas nos leitos de ferida eram semelhantes(Figura 2C),as bactérias só foram detectadas nos baços de camundongos tratados com GH(Figura 2D),sugerindo disseminação disseminada das bactérias dispersas.

Anteriormente, mostramos que o tratamento gh pode quebrar agregados de bactérias, melhorando a contagem deUFC 21. Isso pode explicar o ligeiro aumento da carga bacteriana nos leitos de feridas dos camundongos tratados com GH. Por fim, embora os leitos de feridas tratados com GH tivessem uma FREQ$ /grama ligeiramente maior, houve uma variação bioluminescente menor. Esses resultados sugerem a importância de confirmar a luminescência com as contagens da UFC. Esses resultados representativos dão um exemplo de dados que podem ser coletados utilizando os protocolos descritos acima.

Figure 1
Figura 1. Estabelecendo infecções de feridas associadas a biofilmes e avaliando a eficácia do agente dispersivo in vivo. Os curativos foram verificados quanto a lágrimas ou perda de adesão à pele do camundongo antes do tratamento. Curativos comprometidos foram substituídos. Os camundongos foram colocados sob anestesia imediatamente antes da administração do tratamento. 200 μL de solução enzimápica, ou controle de veículo, foi injetado no espaço entre a cama da ferida e o curativo. O curativo foi gentilmente levantado usando fórceps para garantir que toda a ferida estivesse saturada de solução. O tratamento foi deixado na cama da ferida por 30 minutos. Após 30 min, o tratamento foi aspirado com uma seringa, e outros 200 μL de tratamento foram adicionados. Isso se repetiu para um total de 3 tratamentos. Para medir a dispersão em tempo real, os camundongos foram imagens utilizando IVIS antes do tratamento, imediatamente pós-tratamento (0h), 10h e 20h pós-tratamento. Às 20h após o tratamento, os camundongos foram eutanizados, e os leitos e baços foram coletados. As amostras foram lavadas em PBS e homogeneizadas em PBS fresca duas vezes a 5 m/s para 60 s. As amostras foram então diluídas em série e banhadas no local. A UFC foi enumerada e a UFC/grama foi calculada. O nível de dispersão das bactérias da ferida pode ser avaliado pelo IVIS ou determinando o número de UFC que se espalham sistemicamente para o baço. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2. Dados representativos demonstram como avaliar a dispersão in vivo. As feridas infectadas com 104 PAO1(pQF50-lux) por 48 h foram tratadas com PBS, ou 10% GH (solução de enzima dispersão de biofilm). O tratamento pbs foi utilizado como controle de veículos. Os leitos de ferida foram tratados com tratamentos de 3 x 30 min. Os camundongos foram imagens usando IVIS antes do tratamento, imediatamente pós-tratamento, 10h pós-tratamento e 20h após o tratamento. Deve-se notar que as imagens de visão lateral são de diferentes ratos tratados com PBS e GH do que as mostradas nas imagens de visão geral (A). Foram registrados os ROIs para cada leito de ferida pré-tratamento e cada cama de ferida pós-tratamento de 20 horas. A variação percentual do pré-tratamento foi calculada como (pré-tratamento-ROI pós-tratamento/ pré-tratamento do ROI) x 100 (B). Às 20h após o tratamento, os camundongos foram eutanizados. Os leitos e baços foram coletados e pesados para determinar a UFC/grama (C e D, respectivamente). N=3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3. Diluição em série e revestimento de manchas. A amostra homogeneizada foi vórtice e 100 μL foi transferida para um tubo Eppendorf de 1,5 mL contendo 900 μL de PBS. A amostra foi vórtice e 100 μL foi transferida para outro tubo Eppendorf de 1,5 mL com 900 μL de PBS. Esse processo foi repetido 5 vezes. Começando com o último tubo de diluição, 10 μL de amostra foram colocados na placa de ágar no ponto 10-8. Isso foi continuado até a diluição10-3. Normalmente, a diluiçãode 10-3 resulta em um gramado de bactérias dentro do local. Alguns órgãos, que possuem baixas cargas bacterianas, podem exigir revestimento de manchas até a diluição de 10-1. Repita para cada amostra de tecido. Coloque a placa de ágar em uma incubadora a 37 °C por 24-48 h, ou cresça em condições ideais para as espécies bacterianas de interesse. Para enumerar a UFC, conte colônias individuais na menor diluição possível e multiplique pelo fator de diluição apropriado para determinar a UFC/mL ou use peso tecidual para calcular CFU/g de tecido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4. Medindo dispersão de tecido infectado ex vivo. Os camundongos foram eutanizados e o tecido da ferida infectada foi aseptamente removido. O tecido infectado foi colocado em um tubo homogeneizador de 2 mL e enxaguado brevemente com PBS. Foi adicionado 1 mL de agente de dispersão e a amostra foi incubada por 2h a 37 °C com agitação a 80 rpm. Após a incubação, a solução contendo as células dispersas foi removida e colocada em um tubo separado de 1,5 mL. O restante do tecido foi enxaguado com 1 mL de PBS. 1 mL de PBS fresco foi adicionado ao tecido e homogeneizado a 5 m/s para 60 s. A solução enzimátima e o tecido homogeneizado foram então diluídos em série e atolados em ágar seletivo. A UFC foi enumerada e a dispersão foi calculada como: CFU a partir da solução enzimática/ (CFU da solução enzimática + UFC a partir do tecido) x 100. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura Suplementar 1. Medindo dispersão in vivo. As feridas foram infectadas com 104 PAO1(pQF50-lux) por 48 h e depois tratadas com PBS, ou 10% GH (solução de enzima dispersão de biofilm). O tratamento pbs foi utilizado como controle de veículos. Os leitos de ferida foram tratados com tratamentos de irrigação de 3 x 30 min. Os camundongos foram retratados usando IVIS antes do tratamento, imediatamente pós-tratamento, 10h pós-tratamento e 20h pós-tratamento (A). Às 20h após o tratamento, os camundongos foram eutanizados. Os leitos e baços foram coletados e pesados para determinar a UFC/grama (B e C, respectivamente). N=3. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Aqui descrevemos protocolos que podem ser utilizados para estudar a eficácia dos agentes de dispersão de biofilmes. Esses protocolos podem ser facilmente adaptados para uso com diferentes tipos de agentes dispersivos, espécies bacterianas ou amostras ex vivo, incluindo amostras de debridamento clínico. Este protocolo também fornece um modelo clinicamente relevante para coletar e estudar células bacterianas dispersas. Os fenótipos de células bacterianas dispersas têm se mostrado distintos dos das células planctônicas ou biofilmes 5,24,25,26; no entanto, os fenótipos de bactérias dispersas in vivo ainda não foramdescritos. Se os agentes dispersivos devem ser utilizados terapeuticamente, determinar sua eficácia, bem como entender o fenótipo que essas células adotam, é importante. Além disso, este protocolo poderia ser usado para estudar como variações na estrutura do EPS ou alteração de vias de sinalização afetam a dispersão. Por exemplo, a dispersão de cepas de P. aeruginosa com mutações em diferentes componentes de exopolysacarídeo (por exemplo, Pel, PSL, Alginate) poderia ser comparada com a de cepas do tipo selvagem.

No geral, este protocolo pode ser dividido em quatro seções principais: (1) estabelecer uma infecção (2) administrar o tratamento ou (3) coletar tecido infectado para tratamento ex vivo e (4) determinar a eficácia dispersa. A parte crítica da seção 1 é o estabelecimento bem sucedido da infecção no leito da ferida. Se as cepas luminescentes, que requerem antibióticos para manter a estabilidade plasmida, estão sendo utilizadas, é imperativo adicionar os antibióticos apropriados ao esculpir as cepas na preparação para a infecção. Deve-se considerar também que os plasmídeos podem não ser mantidos durante a infecção no animal (sem pressão antibiótica), portanto, a avaliação da carga bacteriana não deve depender completamente da imagem IVIS, mas ser confirmada pela UFC. A dose inoculante também é um passo crítico para iniciar a infecção. Para P. aeruginosa e S. aureus, uma dose infectante de 104-5 UFC é tipicamente usada, mas a dose ideal pode diferir dependendo das espécies bacterianas e de camundongos utilizadas.

A parte crítica da seção 2 é garantir que o leito da ferida seja coberto pelo curativo durante todo o desenvolvimento de infecção e tratamento. Se o curativo não for aderido corretamente, o tratamento pode vazar da cama da ferida e pode ser ineficaz. O curativo também é importante para manter o leito da ferida protegido de potenciais contaminantes, e prejudicar a cicatrização condátil pelo camundongo, que é essencial para imitar a cicatrização da ferida humana. Por último, a parte crítica da seção 3 é manusear adequadamente as amostras coletadas. Para enumerar a UFC, o tecido infectado deve ser enxaguado com 1 mL de PBS antes da adição de outros 1 mL de PBS para homogeneização. Órgãos mais fibrosos, como os pulmões, podem exigir homogeneização mais completa.

As limitações primárias desses protocolos incluem o monitoramento próximo necessário do curativo e a utilização do IVIS para dispersão de imagens e fazer suposições sobre a eficácia dispersão. Para estudos de longo prazo, o re-crescimento da pele pode ser problemático porque pode impedir a adesão ao local da ferida. Curativos muitas vezes requerem substituição, e sua remoção pode levar ao desbridamento acidental da ferida e oportunidade de contaminação. Para visualizar a dispersão do leito da ferida, deve-se utilizar uma cepa bacteriana bioluminescente. Se a espécie bacteriana de interesse não tem um repórter bioluminescente, essa opção não é viável. Outra limitação é o potencial do tratamento de dispersão para induzir a bacteremia, que pode levar à morte do camundongo. No entanto, vimos que as células dispersas podem ser efetivamente mortas por antibióticos in vivo7.

Os resultados representativos retratados na Figura 2 ilustram uma limitação do IVIS para medir a eficácia dispersa. Em primeiro lugar, deve-se utilizar uma cepa luminescente das espécies bacterianas de interesse. A cepa deve produzir um sinal luminescente que é brilhante o suficiente para detectar através de múltiplas camadas de tecido, a fim de visualizar a dispersão do leito da ferida para outras partes do corpo. Foi sugerido que um mínimo de cerca de 106 bactérias são necessárias para produzir um sinal luminescente forte o suficiente para detectar pelo IVIS27. Uma diminuição no sinal luminescente também foi descrita quando as bactérias entram na fase estacionária28. Isso pode causar uma desconexão entre ROIs medidos e CFU enumerados29. Essa limitação pode levar a falsas suposições quando não há um sinal forte o suficiente para detecção, mas as bactérias ainda estão presentes. Como mostrado na Figura 2B,os tratamentos PBS e 10% GH resultaram em aumento da luminescência pós-tratamento. Trata-se de uma observação curiosa e consistente, que também foi vista após dispersão de células in vitro (Cláudia Marques, Universidade de Binghamton, comunicação pessoal). É possível que a interrupção física do biofilme da administração do tratamento simplesmente espalhe células que estavam bem embaladas, resultando em aumento do sinal de luz. Alternativamente, o tratamento disperso poderia 'despertar' células de biofilme que antes eram metabolicamente inativas, resultando em aumento da bioluminescência. De qualquer forma, é crucial confirmar os resultados da imagem IVIS com dados da CFU. Por fim, há uma distribuição heterogênea de bactérias dentro do tecido infectado30,31. Portanto, se o tecido for dividido ex vivo para fornecer mais amostras, não se deve presumir que a carga bacteriana em cada seção da ferida é idêntica.

Existem modificações e solucionamento de problemas que podem ser realizadas para superar as limitações desses modelos. Em primeiro lugar, a quantidade de tempo atribuída para exposição do creme depilatório pode precisar ser ajustada dependendo da espécie de camundongo utilizada. Por exemplo, 7 min é normalmente usado para ratos webster suíços, enquanto os ratos C57BL/6 podem precisar de até 10 minutos de exposição para remover com sucesso a pele. Isso, é claro, também depende do produto utilizado, e os tempos de exposição nunca devem exceder as instruções do fabricante. Se um longo estudo (mais de 4 dias) estiver sendo realizado, o creme depilatório pode precisar ser reaplicado para remover a pele re-cultivada e garantir um selo adequado do curativo. Em seguida, se um sinal luminescente for difícil de detectar, o tempo de exposição pode ser aumentado durante a imagem IVIS. A dose inoculante e o tempo de infecção também podem ser ajustados. É importante usar uma dose infectante que não é muito alta que sobrecarrega o camundongo, mas também não é muito baixa que as bactérias sejam imediatamente limpas pela resposta imune.

Neste protocolo, descrevemos o tratamento de infecções de feridas de 48 h com agentes dispersos, pois este é um ponto de tempo que temos mostrado infecções causadas por P. aeruginosa e/ou S. aureus são estabelecidas e biofilmes associadas 12,15,16. No entanto, dependendo das espécies bacterianas, outros pontos de tempo podem ser mais ideais. Idealmente, a carga bacteriana na ferida deve planar uma vez que uma infecção é estabelecida. Por exemplo, vimos que, tanto com P. aeruginosa quanto com S. aureus, a carga bacteriana na ferida atinge aproximadamente 108 UFC/g de tecido por 48h após a infecção e permanece nesse nível até o fechamento da ferida. A Figura 1 ilustra o tratamento com uma solução que requer lavagens de 3 x 30 min. No entanto, se o agente de dispersão estivesse de outra forma, as lavagens não seriam necessárias. Por exemplo, um creme, gel ou molho projetado poderia simplesmente ser colocado em cima da cama da ferida. Por fim, a ferida pode ser infectada de várias maneiras, incluindo a inoculação de células bacterianas plantônicas, biofilmes pré-formados12, ou mesmo tecido desbridamento infectado de outro animal ou humano19,32. Vimos que o transplante de uma amostra de biofilme ou debridamento pré-formado no leito da ferida resulta em infecções polimicrobárias mais bem sucedidas do que quando várias espécies são inoculadas em sua forma planctônica12.

No geral, esses protocolos descrevem métodos para estudar a dispersão de biofilmes e a avaliação de agentes de dispersão de biofilmes terapêuticos. Esses modelos permitem o desenvolvimento de infecções complexas associadas a biofilmes polimicrobários que imitam infecções humanas clinicamente relevantes. Nossa esperança é que esses protocolos sejam utilizados e refinados para promover o desenvolvimento de agentes de dispersão anti-biofilme para uso terapêutico.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado por subsídios dos Institutos Nacionais de Saúde (R21 AI137462-01A1), da Fundação Ted Nash Long Life, da Fundação Jasper L. e Jack Denton Wilson e do Departamento de Defesa (DoD MIDRP W0318_19_NM_PP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Fisher 14823434 Use to complete serial dilutions of samples
25G 58 in needle Fisher 14823434 Attaches to 1 mL syringe
Ampicillin Sodium Salt Fisher BP1760-5 Make a 50 mg/ mL stock solution and add 100 µL to 10 mL of LB broth for both overnight and subculture
Amylase MP Biomedicals 2100447 Make a 5% w/v solution, vortex- other dispersal agents can be used
Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL) ZooPharm RX216118 Use as pain mainagement- may use other options
Cellulase MP Biomedicals 2150583 Add 5% w/v to the 5% w/v amylase solution, vortex, activate at 37 °C for 30 min- other dispersal agents can be used
Depilatory cream Walmart 287746 Use a small amount to massage into the hair follicles on the back of the animal and allot 10 min to remove hair
Dressing Forceps, Serrated Tips Fisher 12-460-536 Can use other forms of forceps
Erlenmeyer flasks baffled 125 mL Fisher 101406 Use to grow overnights and sub-cultures of bacteria
FastPrep-24 Benchtop Homogenizer MP Biomedicals 6VFV9 Use 5 m/s for 60 s two times to homogenize tissue
Fatal Plus Vortech Pharmaceuticals 0298-9373-68 Inject 0.2 mL intraperitaneal for each mouse
Homogenizing tubes (Bead Tube 2 mL 2.4 mm Metal) Fisher 15340151 Used to homogenize samples for plating
Isoflurane Diamond Back Drugs
Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution C-IIIN Sigma Aldrich K4138 Use as anasethia- other options can also be utilized to gain a surgical field of anasethia
LB broth, Miller Fisher BP1426-2 Add 25 g/L and autoclave
Lidocaine 2% Injectable Diamond Back Drugs 2468 Inject 0.05 mL through the side of the marked wound bed area so it is deposited in the center of the mark. Allot 10 min prior to cutting
Meropenem Sigma Aldrich PHR1772-500MG Make 5 mg/mL to add to the GH solution to apply topically and a 15 mg/mL solution to inject intraperitaneal 4 h prior and 6 h post-treatment
Non-sterile cotton gauze sponges Fisher 13-761-52 Use to remove the depilatory cream
PAO1 pQF50-lux bacterial strain Ref [13] N/A PAO1 pgF50-lux was used as the P. aeruginosa strain of interest in this paper's representative results
Petri dishes Fisher PHR1772-500MG
Phosphate Buffer Saline 10x Fisher BP3991 Dilute 10x to 1x prior to use
Polyurethane dressing Mckesson 66024007 Cut the rounded edge off and cut the remaining square into 4 equal sections
Pseudomonas isolation agar VWR 90004-394 Add 20 mL/L of glycerol and 45 g/mL to water, autoclave, and pour 20 mL into petri dishes
Refresh P.M. Walmart Use on eyes to reduce dryness during procedure.
Sterile Alcohol Prep Pads Fisher 22-363-750 Use to clean the skin immediately prior to wounding to disinfect the area
Straight Delicate Scissors Fisher 89515 Can also use curved scissors
Swiss Webster mice Charles River 551NCISWWEB Other mice strains can be used
Syring Slip Tip 1 mL Fisher 14823434 Used to administer drugs and enzyme treatment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rossolini, G. M., Arena, F., Pecile, P., Pollini, S. Update on the antibiotic resistance crisis. Current Opinion in Pharmacology. 18, 56-60 (2014).
  2. Stewart, P. S. Antimicrobial Tolerance in Biofilms. Microbiology Spectrum. 3 (3), (2015).
  3. Flemming, H. C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).
  4. Rumbaugh, K. P. How well are we translating biofilm research from bench-side to bedside. Biofilm. 2 (100028), (2020).
  5. Rumbaugh, K. P., Sauer, K. Biofilm dispersion. Nature Reviews Microbiology. 18 (10), 571-586 (2020).
  6. Fleming, D., Chahin, L., Rumbaugh, K. Glycoside Hydrolases Degrade Polymicrobial Bacterial Biofilms in Wounds. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (2), (2017).
  7. Fleming, D., Rumbaugh, K. The Consequences of Biofilm Dispersal on the Host. Scientific Reports. 8 (1), 10738 (2018).
  8. Baker, P., et al. Exopolysaccharide biosynthetic glycoside hydrolases can be utilized to disrupt and prevent Pseudomonas aeruginosa biofilms. Science Advances. 2 (5), 1501632 (2016).
  9. Redman, W. K., Welch, G. S., Rumbaugh, K. P. Differential Efficacy of Glycoside Hydrolases to Disperse Biofilms. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 379 (2020).
  10. Zhu, L., et al. Glycoside hydrolase DisH from Desulfovibrio vulgaris degrades the N-acetylgalactosamine component of diverse biofilms. Environmental Microbiology. 20 (6), 2026-2037 (2018).
  11. Fell, C. F., Rumbaugh, K. P. Antibacterial Drug Discovery to Combat MDR. , 527-546 (2019).
  12. Dalton, T., et al. An in vivo polymicrobial biofilm wound infection model to study interspecies interactions. PLoS One. 6 (11), 27317 (2011).
  13. Wolcott, R. D., et al. Biofilm maturity studies indicate sharp debridement opens a time- dependent therapeutic window. Journal of Wound Care. 19 (8), 320-328 (2010).
  14. Korgaonkar, A., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. Community surveillance enhances Pseudomonas aeruginosa virulence during polymicrobial infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (3), 1059-1064 (2013).
  15. Watters, C., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilms perturb wound resolution and antibiotic tolerance in diabetic mice. Medical Microbiology and Immunology. 202 (2), 131-141 (2013).
  16. Watters, C., Everett, J. A., Haley, C., Clinton, A., Rumbaugh, K. P. Insulin treatment modulates the host immune system to enhance Pseudomonas aeruginosa wound biofilms. Infection and Immunity. 82 (1), 92-100 (2014).
  17. Turner, K. H., Everett, J., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. Requirements for Pseudomonas aeruginosa acute burn and chronic surgical wound infection. PLOS Genetics. 10 (7), 1004518 (2014).
  18. Harrison, F., et al. A 1,000-Year-Old Antimicrobial Remedy with Antistaphylococcal Activity. mBio. 6 (4), 01129 (2015).
  19. Wolcott, R., et al. Microbiota is a primary cause of pathogenesis of chronic wounds. Journal of Wound Care. 25, Sup10 33-43 (2016).
  20. Ibberson, C. B., et al. Co-infecting microorganisms dramatically alter pathogen gene essentiality during polymicrobial infection. Nature Microbiology. 2, 17079 (2017).
  21. Fleming, D., et al. Utilizing Glycoside Hydrolases to Improve the Quantification and Visualization of Biofilm Bacteria. Biofilm. 2, (2020).
  22. DeLeon, S., et al. Synergistic interactions of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in an in vitro wound model. Infection and Immunity. 82 (11), 4718-4728 (2014).
  23. Darch, S. E., et al. Phage Inhibit Pathogen Dissemination by Targeting Bacterial Migrants in a Chronic Infection Model. mBio. 8 (2), (2017).
  24. Chua, S. L., et al. Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles. Nature Communications. 5, 4462 (2014).
  25. Beitelshees, M., Hill, A., Jones, C. H., Pfeifer, B. A. Phenotypic Variation during Biofilm Formation: Implications for Anti-Biofilm Therapeutic Design. Materials (Basel). 11 (7), (2018).
  26. Sauer, K., et al. Characterization of nutrient-induced dispersion in Pseudomonas aeruginosa PAO1 biofilm. J Bacteriol. 186 (21), 7312-7326 (2004).
  27. Kuklin, N. A., et al. Real-time monitoring of bacterial infection in vivo: development of bioluminescent staphylococcal foreign-body and deep-thigh-wound mouse infection models. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (9), 2740-2748 (2003).
  28. Francis, K. P., et al. Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon. Infection and Immunity. 69 (5), 3350-3358 (2001).
  29. Kadurugamuwa, J. L., et al. Noninvasive optical imaging method to evaluate postantibiotic effects on biofilm infection in vivo. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (6), 2283-2287 (2004).
  30. Wimpenny, J., Manz, W., Szewzyk, U. Heterogeneity in biofilms. FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 661-671 (2000).
  31. Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).
  32. Tipton, C. D., et al. Chronic wound microbiome colonization on mouse model following cryogenic preservation. PLoS One. 14 (8), 0221656 (2019).

Tags

Imunologia e Infecção Edição 174 Ex vivo, In vivo,biofilme dispersão infecção por feridas agente anti-biofilme Pseudomonas aeruginosa
Avaliação da dispersão de biofilme em feridas de Murine
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Redman, W. K., Welch, G. S.,… More

Redman, W. K., Welch, G. S., Rumbaugh, K. P. Assessing Biofilm Dispersal in Murine Wounds. J. Vis. Exp. (174), e62136, doi:10.3791/62136 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter