Summary
Burada, farelerdeki bir yara enfeksiyonundan bakteriyel dağılımı değerlendirmek için ex vivo ve in vivo yöntemlerini açıklıyoruz. Bu protokol, topikal antimikrobiyal ve anti-biyofilm tedavilerinin etkinliğini test etmek veya farklı bakteri suşlarının veya türlerinin dağılım kapasitesini değerlendirmek için kullanılabilir.
Abstract
Biyofilme bağlı enfeksiyonlar, iyileşmeyen diyabetik ayak ülserleri, kronik sinüzit, tekrarlayan otitis media ve daha fazlası gibi çok çeşitli kronik durumlara bulaşmıştır. Bu enfeksiyonların içindeki mikrobiyal hücreler, antibiyotiklerin ve konak bağışıklık hücrelerinin enfeksiyonu temizlemesini önleyebilen hücre dışı polimerik bir madde (EPS) ile korunmaktadır. Bu engeli aşmak için, araştırmacılar potansiyel terapötikler olarak dispersiyon ajanları geliştirmeye başladılar. Bu ajanlar biyofilm EPS içindeki çeşitli bileşenleri hedef alarak yapıyı zayıflatır ve teorik olarak antibiyotik gücünü ve bağışıklık açıklığını artırabilen bakterilerin dağılmasını başlatır. Dispersiyon ajanlarının yara enfeksiyonları için etkinliğini belirlemek için, biyofilm dispersiyonunu ölçen protokoller geliştirdik hem ex vivo hem de in vivo . Biyofilm ile ilişkili kronik yara enfeksiyonları oluşturmak için iyi tanımlanmış bir fare cerrahi eksizyon modeli kullanıyoruz. Dispersiyon in vivoizlemek için, yaralara luciferaz eksprese bakteriyel suşları bulaştırırız. Olgun enfeksiyonlar ortaya çıktıktan sonra, yaraları biyofilm EPS bileşenlerini bozan enzimler içeren bir çözelti ile sularız. Daha sonra elde edilen dağılım seviyesi hakkında bilgi sağlamak için yara ve filtreleme organlarındaki parlaklık sinyalinin yerini ve yoğunluğunu izliyoruz. Biyofilm dispersiyonunun ex vivo analizi için, enfekte yara dokusu biyofilm bozan enzim çözeltisi içine batırılır, daha sonra dokuda kalan bakteri yükü ile çözeltideki bakteri yükü değerlendirilir. Her iki protokol de güçlü ve zayıf yönleri vardır ve dağılım tedavilerinin etkinliğini doğru bir şekilde belirlemeye yardımcı olmak için optimize edilebilir.
Introduction
Dünya çapında antibiyotik direncinin artması, çeşitli bakteriyel enfeksiyonları tedavi etmek için antibiyotik seçeneklerinin eksikliğine yol açar1. Antibiyotik direncine ek olarak, bakteriler biyofilm ile ilişkili bir yaşam tarzı benimseyerek antibiyotik toleransı kazanabilir2. Biyofilm, toplu olarak hücre dışı polimerik madde (EPS) olarak adlandırılan polisakkaritler, hücre dışı DNA, lipitler veproteinler 3matrisi ile korunan bir mikroorganizma topluluğudur. Antibiyotik direnci krizi devam ettikçe, antibiyotiklerin kullanımını uzatan veya etkinliğini etkileyen yeni stratejilere şiddetle ihtiyaç vardır. Anti-biyofilm ajanları umut verici bir çözümdür4.
Önerilen farklı anti-biyofilm stratejileri arasında, biyofilm EPS'nin farklı bileşenlerini hedefleyen dispersal ajanların kullanımı terapötik gelişimin ön saflarında yer almaktadır5. Glikozit hidrolazları (GH) bu tür bir dispersiyon maddesi sınıfıdır. GH, EPS'ye yapısal bütünlük sağlayan polisakkaritler içindeki farklı bağların bölünmesini katalİze eden büyük bir enzim sınıfıdır. Grubumuz ve diğerleri, GH'nin biyofilmleri etkili bir şekilde bozabileceğini, dağılmayı teşvik edebildiği ve hem in vitro hem de in vivo6 , 7 ,8,9,10,11gibi bir dizi farklı bakteri türü için antibiyotik etkinliğini artırabileceğini göstermiştir.
Biyofilm dispersiyona artan bir ilgi ile, dispersiyon etkinliğini değerlendiren etkili yöntemler geliştirmek önemlidir. Burada, farelerde bir dispersiyon ajanı ile biyofilm ilişkili yara enfeksiyonlarının tedavisi ve dağılım etkinliğinin değerlendirilmesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz, in vivo ve ex vivo. Genel amaç, biyofilm dağılımını etkili ve verimli bir şekilde ölçmek için preklinik modellerle kullanılabilecek etkili yöntemler sağlamaktır.
Bu çalışmalarda biyofilm ilişkili bir enfeksiyon oluşturmak için bir murine cerrahi eksizyon enfeksiyon modeli kullanılmıştır. Biz 15 yılı aşkın bir süredir bu modeli kullandık ve gözlemlerimizi kapsamlı bir şekilde yayınladık7,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. Genel olarak, bu, bakterilerin yara yatağına lokalize kaldığı ve biyofilm ile ilişkili olduğu (EPS ile çevrili agregalarda görülen bakteriler), 3 haftaya kadar süren kronik bir enfeksiyon oluşturan ölümcül olmayan bir enfeksiyon modelidir. Bununla birlikte, fareler bağışıklık sistemik olarak (örneğin Tip 1 diyabet ile) bağışıklık kazanırsa, bu modelde ölümcül bir sistemik enfeksiyon geliştirmeye daha duyarlı hale gelebilirler.
Bu raporda, hem in vivo hem de ex vivo bir yaradan bakterilerin dağılımını değerlendirmek için protokoller sunuyoruz. Her iki protokol de bir dağılım ajanının etkinliğini incelemek ve kendi güçlü ve zayıf yönlerine sahip olmak için kullanılabilir. Örneğin, dağılım in vivo'nun değerlendirilmesi, bakterilerin dağıldıktan sonra vücudun diğer bölgelerine yayılması ve konağın nasıl tepki verdiği hakkında önemli, gerçek zamanlı bilgiler sağlayabilir. Öte yandan, dispersiyon ex vivo'nun değerlendirilmesi, doku ayrı ayrı test edilebilen birden fazla bölüme ayrılabileceğinden, gerekli fare sayısını azaltabileceğinden, birden fazla ajanın, dozun veya formülasyonun taranması için daha arzu edilebilir. Birden fazla ajanı değerlendirirken, genellikle daha önce açıklandığı gibi dispersiyon ilk in vitro ölçüldü 6,9,22. Daha sonra en etkili ex vivo'yu test ediyoruz ve sınırlı sayıda çok umut verici ajan için in vivo testini ayırıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu hayvan protokolü Texas Tech Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (protokol numarası 07044) tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'ndaki önerilere uygun olarak gerçekleştirildi.
1. Fare enfeksiyonlarına bakteri hazırlama
NOT: Burada fareleri sadece Pseudomonas aeruginosaile enfekte etmeyi açıklıyoruz. Bununla birlikte, enfeksiyona neden olmak için diğer bakteri türleri kullanılabilir. Bakteriyel suşlar ve malzemeler Malzeme Tablosunda ayrıntılı olarak yer almaktadır.
- Daha önce açıklandığı gibi bu deneyler için lüminesans plazmid pQF50-lux23 taşıyan Pseudomonas aeruginosa vahşi tip suşu PAO1 kullanın7.
- 16 ila 20 saat boyunca 37 °C'de Luria-Bertani (LB) suyunda, 200 rpm'de sallanarak, şaşkın Erlenmeyer şişelerinde P. aeruginosa suşlarını yetiştirin. Plazmid'in bakımı için PAO1(pQF50-lux) geceleme kültürüne 100 μg/mL ampisilin son konsantrasyonu ekleyin.
- Alt kültür P. aeruginosa, 100 μg/mL ampisilin konsantrasyonuna sahip 10 mL LB suyu içeren bir Erlenmeyer şişesine 100 μL geceleme kültürü ekleyerek. Daha sonra sallama ile 37 ° C'de 2-2.5 saat boyuncabüyüyün, 0.4'ün 600 nm'si bir OD'ye ve ardından yaklaşık 10 4 hücreli bir enfekte doz için üç kez seri olarak seyreltin (1:10).
2. Biyofilm dispersiyon enziminin hazırlanması
NOT: Bu çalışma için dispersiyon tedavisi için "GH" olarak adlandırılacak eşit parça amilaz ve selüloz (her birinin% 5'i) %10'luk bir çözelti kullanıyoruz.
- 1x fosfat tampon salin (PBS) ile seyreltilmiş% 10 GH çözeltisi (bacillus altyazısından)ve mantar selülalü (Aspergillus nijer'den)kullanın. Araç kontrol tedavisi olarak PBS kullanın.
- Enzim aktivasyonu için tüm tedavileri 30 dakika boyunca 37 °C'ye ısıtın.
3. Deneysel hayvanlar ve ameliyat öncesi kurulum
- Ev fareleri, kafes başına 5 çöp arkadaşı, çevre kontrollü koşullarda, 12 saat açık / karanlık döngüler ve yiyecek ve suya uygun erişim.
- Tercihen, 8 ila 10 haftalık dişi İsviçre Webster fareleri kullanın.
- Uygulanacak uygun anestezi miktarını belirlemek için fareleri tartın.
- 100 mg/kg ketamin 10 mg/kg ksilazinin intraperitoneal enjeksiyonu ile anestezi uygulayın.
- Kuruluğu azaltmak için pamuklu çubuk kullanarak göze dikkatlice göz kremi (örneğin, Tazele P.M.) uygulayın.
- Ameliyat boyunca solunum hızı, cilt renklendirmesi ve vücut ısısı dahil olmak üzere fizyolojik parametreleri izleyin.
4. Dorsal tam kalınlık eksizyon cerrahisi
- Anestezinin cerrahi düzlemini parmak sıkışması ve solunum hızı ve çabasının izlenmesi ile değerlendirin. Sırt yüzeyini tıraş edin ve cildin kurumasını sağlamak için 10 dakika (veya ürünün talimatlarına göre) bir depilatör krem uygulayın, ardından hafifçe çıkarın.
- Ağrı yönetimi için, eksize edilecek bölgeye 0,05 mL lidokin deri altı uygular ve boynun scruff'ına deri altından 0,02 mL buprenorfin enjekte edin. Ağrı yönetimine ulaşıldığından emin olmak için 10 dakika bekleyin.
- Eksizyondan önce, dorsal yüzeyi bir alkol çubuğu kullanarak dezenfekte edin ve sırtın arka kısmına doğru 1,5 cm çapında bir daire çizin. İşlem boyunca steril bir cerrahi alan sağlayın ve otoklavlı aletler ve steril eldivenler kullanın. Kontaminasyonu sınırlamak için, ameliyatı aydınlatılmış bir Bunsen brülörü ile yapın ve her hayvan için temiz aletler kullanın.
- Cerrahi makasla panniculus kas seviyesine tam kalınlıklı, eksizyonel bir cilt yarası sürün.
- Eksizyondan sonra, yaraları hemen yarı geçirgen bir poliüretan pansuman ile örtün.
- Bir enfeksiyon oluşturmak için pansumanın altındaki 100 μL PBS'de yaklaşık 104 CFU bakteriyi yara yatağına enjekte edin.
NOT: Yaralar aynı anda birden fazla bakteri ve/veya mantar türüyle veya19yaşındaki hastalardan çıkarılan önceden oluşturulmuş biyofilmler12veya hatta debridman dokusunu yara yatağına yerleştirerek de enfekte olabilir. - Enfeksiyondan sonra, fareleri ısıtma pedleri ile kafese yerleştirin ve sağ reflekslerini geri kazanana kadar izleyin.
NOT: Farelerin üşümediğine emin olun, çünkü bu ölüme yol açabilir. - 48 saat boyunca yara enfeksiyonları oluşturun.
- Yapışkan pansumanları her gün gözyaşı ve yapışmama alanları için inceleyin ve gerekirse değiştirin.
5. In vivo dispersal tedavi
NOT: Burada 3 topikal yara sulama solüsyöyleri serisi uygulayarak dispersiyon maddelerinin yönetimini açıklıyoruz (Şekil 1). Bununla birlikte, protokol jellerin, kremlerin veya pansumanların uygulanması gibi diğer teslimat türleri için uyarlanabilir.
- Tedavileri uygularken fareleri izofluran anestezisi altına (% 3 ve dakikada 1 L oksijen) yerleştirin.
- Her fare için 200 μL tedavi içeren 25 G iğneli üç adet 1 mL şırınga hazırlayın.
- Cildi dikkatlice kaldırarak ve forsepsle sıkıştırarak, yaranın biraz üzerinde hayvanın başına doğru 200 μL enzim çözeltisi veya PBS kontrolü enjekte edin. Şırınnayı kaldırılan deriden dikkatlice delin ve çözeltiyi pansuman ile yara yatağı arasına yavaşça enjekte edin. Bu çalışmada kullanılan pansuman genellikle hem yara yatağına hem de çevre dokuya yapışır.
- Tüm yara yatağının çözelti ile kap olduğundan emin olmak için, çözeltiyi yavaşça enjekte ederken, pansumanı forsepsle hafifçe kaldırın, yara yatağından çekin.
- Tedaviden sonra, fareleri 30 dakika boyunca kafeslerine geri yerleştirin.
- Tedaviye 30 dakika maruz kaldıktan sonra, fareleri izofluran ile yeniden uyuşturun ve çözeltiyi bir şırınna ile epire edin, daha önce olduğu gibi aynı bölgede delinmeyi unutmayın.
NOT: Bu aspire edilmiş çözelti, çeşitli aşağı akış analizleri için kaydedilebilecek dağınık bakteri hücreleri içerir. - her seferinde yeni bir şırıng kullanarak ikinci ve üçüncü sulama arıtmalarını birinci olarak uygulayın.
6. In vivo dispersiyon görüntüleme ve analizi
NOT: Enfeksiyonu başlatmak için parlak bir bakteri türü kullanılırsa, yara yatağından dağılımı görselleştirmek için bir In Vivo Görüntüleme Sistemi (IVIS) kullanılabilir.
- Görüntü fareleri tedaviden hemen önce ve sonra ve tedavi sonrası 10 ve 20 saat(Şekil 2 ve Ek Şekil 1).
- Fareler anestezi altındayken IVIS'e ayrı ayrı yerleştirerek ve her birini 560 nm dalga boyunda 5 sn boyunca görüntüleyerek görüntülemeyi gerçekleştirin. Daha fazla analiz için görüntüleri kaydedin.
NOT: Optimum dalga boyu ve pozlama süresi, kullanılan muhabire ve IVIS cihazına ve görüntüleme yazılımına bağlı olacaktır. - Analiz için, görüntüleri IVIS yazılımında açın ve Araç Paleti'nde analiz edilecek alanı seçin.
- Arka planı hesaba katmak için, bir fotoğrafın arka planına bir daire yerleştirin ve ardından her fare için yara yatağının üzerine aynı büyüklükteki daireyi yerleştirin.
- Ölçüm değerlerini karşıya yüklemek için İlgi Alanı (> ROI) ölçümlerini görüntüle'yi seçin ve ölçüm tablosunu bir elektronik tabloya yükleyin. Her numune için lüminesansı hesaplamak için yara yatağı ölçümlerinin her birinden arka plan dairesi okumasını çıkarın. Değişen yüzde lüminesansı hesapla:
Yatırım getirisi ön tedavi-ROI tedavi sonrası/ YATıRıM GETIRISI ön tedavi) x 100.
NOT: Görüntü alımını veya parlaklığı etkileyebilecek değişkenler için normalleştirmek için kontrol ve tedavi edilen fareler aynı anda analiz edilmelidir.
7. CFU'yu belirleyerek dağılımın değerlendirilmesi
- 100 mg/kg ketamin 10 mg/kg ksilazin ile anestezi altında 0.2 mL pentobarbital sodyum (örneğin Fatal Plus) intraperitoneal enjeksiyon ile fareleri insanca ötenazi.
- Önce pansumanı steril önps ile nazikçe çıkararak yara yatağı dokusunu hasat edin ve ardından steril cerrahi makasla yara yatağının çevresini kesin. Örneği kas tabakasından kesmek /alay etmek için makas kullanırken yara yatağının bir ucunun bir ucunun önps ile hafifçe kaldırın.
- Yara yatağındaki dokuyu 1 mL PBS içeren önceden etiketlenmiş ve önceden tartılmış 2 mL homojenizasyon tüpüne yerleştirin. Numuneleri yerleştirdikten sonra tüpleri tekrar tartın ve dağınık veya gevşek yapışmış bakterileri durulamak için 3-5 kez hafifçe ters çevirin ve PBS'yi çıkarın. 1 mL taze PBS ekleyin.
- Dalakları hasat etmek için, fareleri arka anatomik bir konuma yerleştirin ve ekstremitelerini bir diseksiyon yüzeyine sabitleyerek sabitleyin. Bölgeyi dezenfekte etmek ve kürkün numuneyi kirletmemesi için% 70 etanol ile parçalanacak alanı ıslatın.
- Alt karın derminde cerrahi makasla orta çizgiye dik küçük bir kesi yaparak cildi yukarı ve iç organlardan uzaklaştırdığından emin olun. Sternuma ulaşılana kadar kesiği iç kısım boyunca, orta hat boyunca devam ettir. Periton boşluğu açığa çıktıktan ve iç organlar görünür olduğunda, dalağını bağ dokusundan hafifçe ayırın ve ayrı bir homojenizasyon tüpüne yerleştirin.
- Dalağını tartın ve yara yatağı dokusu için açıklandığı gibi PBS ile durulayın.
NOT: Diğer ilgi organları da benzer şekilde hasat edilebilir.- İlk kesiği yaparken, bağırsakların veya diğer organların delinmemesine dikkat edin.
- Örnekleri 2 mL önceden doldurulmuş boncuk değirmeni tüplerinde 60 sn boyunca 5 m/s'de tezgah üstü homojenizatör kullanarak iki kez homojenize edin.
- CFU'yu numaralandırmak için, seçici agar üzerinde örnekleri ve spot plakayı seri olarak seyreltin. Seri seyreltme için, numunenin pipeti 100 μL'yi 1,5 mL'lik bir tüpte 900 μL PBS'ye, girdap ve 5 kez tekrarlayın. Pipet 10 μL her seyreltme şekil 3'tegösterildiği gibi bir agar plakası üzerine.
NOT: Daha hassas CFU nicelasyonu gerekiyorsa, numunenin her seyreltilmesinden 100 μL'yi ayrı agar plakalara yayın.
8. Dağılım ex vivo değerlendirmesi (Şekil 4)
- Fareleri yarala ve yukarıda açıklandığı gibi yaklaşık10 4 PAO1 ile enfekte et ve enfeksiyondan sonra 48 saat ötenazi.
- Pansumanı steril teknik kullanarak ve yara yatağını bozmadan, asalarla dikkatlice çıkarın.
- Yara yatağının bir ucunun kaldırılması için önseçimler kullanarak yara yatağının çevresini enfekte edilmemiş deriden kesmek için steril cerrahi makas ve enfekte olmayan dokunun altındaki kas tabakasından enfekte yara dokusunu çıkarmak için makas kullanın. Yara yatağı örneklerini eşit parçalara bölün veya bütün kullanın.
- Yara dokusunu boş, önceden tartılmış 2 mL boncuk değirmeni homojenizasyon tüplerine yerleştirin. Daha sonra numuneyi ekledikten sonra tüpleri tekrar tartın. Örneğin ağırlığını şu şekilde hesaplayın:
örnek ekledikten sonra ağırlık - örnek eklemeden önce ağırlık. - 1 mL PBS ekleyin ve numuneyi durulamak ve planktonik hücreleri çıkarmak için tüpü 3-5 kez hafifçe ters çevirin. PBS'yi çıkarın ve atın.
- Numuneye 1 mL GH tedavisi (veya negatif kontrol olarak PBS) ekleyin ve 80 rpm'de sallanarak 37 °C'de 2 saat kuluçkaya yatırın.
- Biyofilm dispersiyon çözeltisini çıkarın ve ayrı bir 1,5 mL tüpe yerleştirin. Bu dağınık hücreleri içerir.
- Kalan doku örneğine 1 mL PBS ekleyin ve kalan dağınık hücreleri durulamak için 3-5 kez hafifçe ters çevirin. PBS'yi çıkarın ve atın.
- Kalan dokuya 1 mL PBS ekleyin ve tezgah üstü homojenizatör kullanarak 60 sn boyunca 5 m/s'de homojenize edin.
- 1,5 mL'lik bir tüpe 900 μL PBS'ye 100 μL numune yerleştirerek ve toplam 6 seyreltme için beş kez tekrarlayarak dağınık hücrelerin ve homojenize doku örneğinin çözeltisini seri olarak seyreltin.
- Spot plaka 10 μL her seyreltme media seçici agar üzerine (örneğin, P. aeruginosaiçin Pseudomonas İzolasyon Agar) ve plakaları bir gecede 37 ° C'de kuluçkaya yatır.
- CFU'ları sayın ve 'dağılan yüzdeyi' (süpernatantta CFU/ (biyofilm dokusunda süpernatant+ CFU'da CFU)) x 100 olarak hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu deneyde, 8-10 haftalık dişi İsviçre Webster farelerine lüminesans plazmid pQF50-lux taşıyan10 4 CFU PAO1 ile enfekte edildi. Yukarıda açıklandığı gibi, biyofilm EPS'yi sindirmek için PBS (araç kontrolü) veya% 10 GH (tedavi) 3 x 30 dakikalık tedavileri uygulamadan önce 48 saat boyunca bir enfeksiyon kurulmasına izin verildi. Fareler tedaviden hemen sonra (0 h) ve tedavi sonrası 10 saat 20 saat olarak görüntülendi. Şekil 2A ve Ek Şekil 1, yara yatağı içinde parlak bir biyolüminesans sinyali üreten yerleşik bir enfeksiyon göstermektedir. Bakterilerin yara yatağından dağılımı GH tedavisinden hemen sonra (0 h) görselleştirilebilir, ancak PBS tedavisinden sonra değil. Daha önceki çalışmalarda, kan ve dalakta 5 saat sonrası GH tedavisi7kadar erken bir bakteri tespit ettiğimiz belirtilmelidir. Organlara bakteri yayılım, Şekil 2A'nınalt panelinde gösterildiği gibi, fareyi görüntüleme için yanına yerleştirerek de görülebilir.
Hem PBS hem de GH ile tedavi edilen farelerden gelen görüntüler, ön işleme kıyasla tedavi sonrası 20 saatte lüminesan sinyalde bir artış olduğunu göstermiştir (Şekil 2B). Bunun, çözeltinin sulanmasından kaynaklanan biyofilmin mekanik bozulmasından kaynaklandığını vardır. Tedavi sonrası 20 saat sonra fareler ötenaziye tabi tedavüle alındı ve yara yatakları ve dalaklar CFU/gram doku numaralandırmak için toplandı. Yara yataklarındaki bakteri yükleri benzer olsa da (Şekil 2C), bakteriler sadece GH ile tedavi edilen farelerin dalaklarında tespit edildi (Şekil 2D), dağınık bakterilerin yayılmasını düşündürdü.
Daha önce, GH tedavisinin bakteri agregalarını parçalayarak CFU sayılarını iyileştirebileceğini gösterdik21. Bu, GH ile tedavi edilen farelerin yara yataklarındaki bakteri yükünün hafifçe artmasını açıklayabilir. Son olarak, GH ile tedavi edilen yara yatakları biraz daha yüksek CFU / gram olmasına rağmen, yüzde daha düşük bir biyolüminesans değişimi vardı. Bu sonuçlar, lüminesansı CFU sayımları ile doğrulamanın önemini göstermektedir. Bu temsili sonuçlar, yukarıda açıklanan protokollerden yararlanılarak toplanabilecek verilere bir örnek verir.
Şekil 1. Biyofilm ile ilişkili yara enfeksiyonlarının oluşturulması ve dağılım ajanı etkinliğinin vivo olarak değerlendirilmesi. Pansumanlar tedaviden önce farenin cildinde yırtık veya yapışıklık kaybı olup yoklamaları açısından kontrol edildi. Uzlaşılmış pansumanlar değiştirildi. Fareler tedavi yönetiminden hemen önce anestezi altına alındı. Yara yatağı ile pansuman arasındaki boşluğa 200 μL enzim çözeltisi veya bir araç kontrolü enjekte edildi. Pansuman, yaranın tamamının çözeltiye doyduğından emin olmak için forseps kullanılarak hafifçe yükseltildi. Tedavi 30 dakika boyunca yara yatağında bırakıldı. 30 dakika sonra, tedavi bir şırınna ile aspire edildi ve 200 μL daha tedavi eklendi. Bu toplam 3 tedavi için tekrarlandı. Dispersiyonları gerçek zamanlı olarak ölçmek için, fareler tedaviden önce IVIS kullanılarak, tedavi sonrası hemen (0 h), 10 h ve 20 saat tedavi sonrası görüntülendi. Tedaviden sonra 20 saat sonra fareler ötenaziye tabi tökezlendi ve yara yatakları ve dalaklar toplandı. Numuneler PBS'de durulandı ve daha sonra taze PBS'de 60 sn boyunca 5 m/s'de iki kez homojenize edildi. Numuneler daha sonra seri olarak seyreltildi ve nokta kaplaması yapıldı. CFU numaralandırıldı ve CFU/gram hesaplandı. Bakterilerin yaradan dağılma seviyesi IVIS tarafından değerlendirilerek veya dalağa sistemik olarak yayılan CFU sayısını belirleyerek olabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. Temsili veriler, dağılım in vivo'nun nasıl değerlendirileceğini gösterir. 48 saat boyunca 104 PAO1 (pQF50-lux) ile enfekte olan yaralar PBS veya% 10 GH (biyofilm dispersal enzim çözeltisi) ile tedavi edildi. PBS tedavisi araç kontrolü olarak kullanılmıştır. Yara yatakları 3 x 30 dk tedavi ile tedavi edildi. Fareler tedaviden önce IVIS kullanılarak, tedaviden hemen sonra, tedavi sonrası 10 saat ve tedavi sonrası 20 saat görüntülenmişti. Yan görünüm görüntülerinin, genel bakış görüntülerinde (A)gösterilenlerden farklı PBS ve GH işlem görmüş farelerden olduğu belirtilmelidir. Her tedavi öncesi yara yatağı ve her 20 saat tedavi sonrası yara yatağı için ROI'ler kaydedildi. Ön tedaviden kaynaklanan yüzde değişim (YP ön tedavi-ROI tedavi sonrası/ YATıRıM GETIRISi ön tedavi) x 100 (B)olarak hesaplanmıştır. Tedavi sonrası 20 saat sonra fareler ötenaziye tabi tedavân edildi. Yara yatakları ve dalaklar toplanmış ve CFU/gram (sırasıyla C ve D)belirlemek için tartılmıştır. N=3. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. Seri seyreltme ve nokta kaplama. Homojenize örneklem girdaplandı ve 100 μL, 900 μL PBS içeren 1,5 mL Eppendorf tüpüne aktarıldı. Örnek girdaplandı ve 100 μL, 900 μL PBS ile başka bir 1,5 mL Eppendorf tüpüne aktarıldı. Bu işlem 5 kez tekrarlandı. Son seyreltme tüpünden başlayarak, 10-8noktasındaki agar plakasına 10 μL numune yerleştirildi. Bu seyreltme 10-3kadar devam etti. Tipik olarak, 10-3 seyreltme, nokta içinde bir çim bakteri ile sonuçlanır. Düşük bakteri yüklerine sahip bazı organlar, 10-1 seyreltmeye kadar nokta kaplaması gerektirebilir. Her doku örneği için tekrarlayın. Agar plakasını 24-48 saat boyunca 37 °C'de bir inkübatöre yerleştirin veya bakteri türleri için en uygun koşullar altında büyüyün. CFU'nun numaralandırılması için, tek tek kolonileri mümkün olan en düşük seyreltmede sayın ve CFU/mL'yi belirlemek için uygun seyreltme faktörüyle çarpın veya doku ağırlığını kullanarak CFU/g dokuyu hesaplayın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4. Enfekte doku ex vivo'dandağılımın ölçülmesi . Fareler ötenaziye tabi edildi ve enfekte yara dokusu aseptik olarak çıkarıldı. Enfekte doku 2 mL boncuk değirmeni homojenizasyon tüpüne yerleştirildi ve PBS ile kısa bir süre durulandı. 1 mL dispersiyon maddesi eklendi ve numune 37 °C'de 2 saat boyunca 80 rpm'de sallanarak inkübe edildi. Kuluçkadan sonra, dağınık hücreleri içeren çözelti çıkarıldı ve ayrı bir 1,5 mL tüpe yerleştirildi. Kalan doku 1 mL PBS ile durulandı. Dokuya 1 mL taze PBS eklendi ve 60 sn boyunca 5 m/s'de homojenize edildi. Enzim çözeltisi ve homojenize doku daha sonra seri olarak seyreltildi ve seçici agar üzerine nokta kaplama yapıldı. CFU numaralandırıldı ve dağılım şu şekilde hesaplandı: Enzim çözeltisinden CFU/ (Enzim çözeltisinden CFU + dokudan CFU) x 100. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1. Vivo dağılım ölçülüyor. Yaralar48 saat boyunca 10 4 PAO1 (pQF50-lux) ile enfekte edildi ve daha sonra PBS veya% 10 GH (biyofilm dispersal enzim çözeltisi) ile tedavi edildi. PBS tedavisi araç kontrolü olarak kullanılmıştır. Yara yatakları 3 x 30 dk sulama tedavileri ile tedavi edildi. Fareler tedaviden önce IVIS kullanılarak, hemen tedavi sonrası, 10 h tedavi sonrası ve 20 saat tedavi sonrası (A)kullanılarak görüntülenmiştir. Tedavi sonrası 20 saat sonra fareler ötenaziye tabi tedavân edildi. Yara yatakları ve dalaklar toplanmış ve CFU/gram (sırasıyla B ve C)belirlemek için tartılmıştır. N=3. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada biyofilm dispersiyon ajanlarının etkinliğini incelemek için kullanılabilecek protokolleri açıklıyoruz. Bu protokoller, klinik debridman örnekleri de dahil olmak üzere farklı dispersiyon ajanları, bakteri türleri veya ex vivo örnekleri ile kullanıma kolayca uyarlanabilir. Bu protokol ayrıca dağınık bakteri hücrelerini toplamak ve incelemek için klinik olarak ilgili bir model sağlar. Dağınık bakteri hücrelerinin fenotiplerinin planktonik veya biyofilm hücrelerinden farklıolduğu gösterilmiştir 5,24,25,26; bununla birlikte, in vivo olarak dağılmış bakterilerin fenotipleri henüz tanımlanmamıştır. Dispersiyon ajanları terapötik olarak kullanılacaksa, etkinliklerini belirlemek ve bu hücrelerin benimsediği fenotipi anlamak önemlidir. Ek olarak, bu protokol EPS yapısındaki değişimlerin veya sinyal yollarının değiştirilmesinin dağılımı nasıl etkilediğini incelemek için kullanılabilir. Örneğin, P. aeruginosa suşlarının farklı eksopolisakkarit bileşenlerindeki mutasyonlarla dağılımı (örneğin, Pel, Psl, Alginate) vahşi tip suşlarla karşılaştırılabilir.
Genel olarak, bu protokol dört ana bölüme ayrılabilir: (1) bir enfeksiyon oluşturmak (2) tedavi uygulamak veya (3) ex vivo tedavisi için enfekte doku toplamak ve (4) dağılım etkinliğini belirlemek. Bölüm 1'in kritik kısmı, enfeksiyonun yara yatağında başarılı bir şekilde kurulmasıdır. Plazmid stabilitesini korumak için antibiyotik gerektiren lüminesan suşlar kullanılıyorsa, enfeksiyona hazırlık için suşları kültlendirirken uygun antibiyotiklerin eklenmesi zorunludur. Ayrıca, plazmidlerin hayvandaki enfeksiyon sırasında (antibiyotik basıncı olmadan) korunmayabileceği düşünülmelidir, bu nedenle bakteri yükünün değerlendirilmesi tamamen IVIS görüntülemeye dayanmamalı, ancak CFU tarafından onaylanmalıdır. Aşı dozu da enfeksiyonu başlatmak için kritik bir adımdır. P. aeruginosa ve S. aureus için tipik olarak 104-5 CFU'luk bir enfekte edici doz kullanılır, ancak en uygun doz kullanılan bakteriyel ve fare türlere bağlı olarak değişebilir.
Bölüm 2'nin kritik kısmı, enfeksiyon ve tedavi gelişimi boyunca yara yatağının pansumanla kaplanmasını sağlamaktır. Pansuman düzgün yapışmazsa, tedavi yara yatağından sızabilir ve etkisiz olabilir. Pansuman ayrıca yara yatağını potansiyel kirleticilerden korumak ve insan yara iyileşmesini taklit etmek için gerekli olan fare tarafından kontrenyen iyileşmeyi bozmak için de önemlidir. Son olarak, bölüm 3'ün kritik kısmı toplanan örnekleri düzgün bir şekilde işlemektir. CFU'nun numaralandırılması için, enfekte doku homojenizasyon için 1 mL daha PBS eklenmeden önce 1 mL PBS ile durulanmalıdır. Akciğerler gibi daha lifli organlar daha kapsamlı homojenizasyon gerektirebilir.
Bu protokollerin birincil sınırlamaları, pansumanın gerekli yakın izlenmesini ve IVIS'in görüntü dağılımına ve dağılım etkinliği hakkında varsayımlarda bulunmaya kullanılmasını içerir. Uzun süreli çalışmalar için, kürkün yeniden büyümesi sorunlu olabilir, çünkü pansumanın yara bölgesine yapışmasını önleyebilir. Pansumanlar genellikle değiştirme gerektirir ve çıkarılması yaranın yanlışlıkla debridmanlanmasına ve kirlenme fırsatına yol açabilir. Yara yatağından dağılımı görselleştirmek için biyolüminesan bakteri suşu kullanılmalıdır. Bakteriyel ilgi türleri biyolüminesan bir muhabirden yoksunsa, bu seçenek mümkün değildir. Başka bir sınırlama, farenin ölümüne yol açabilecek bakteriyemiyi teşvik etmek için dispersiyon tedavisinin potansiyelidir. Bununla birlikte, dağınık hücrelerin antibiyotikler tarafından etkili bir şekilde öldürülebileceğini gördük vivo7.
Şekil 2'de gösterilen temsili sonuçlar, dağılım etkinliğini ölçmek için IVIS'in bir sınırlamasını göstermektedir. İlk olarak, bakteri türlerinin parlak bir suşundan yararlanılmalıdır. Suş, yara yatağından vücudun diğer bölgelerine dağılımı görselleştirmek için birden fazla doku katmanından algılanabilecek kadar parlak bir parlak sinyal üretmelidir. IVIS27tarafından tespit edecek kadar güçlü bir parlaklık sinyali üretmek için en az10 6 bakterinin gerekli olduğu ileri sürlenmiştir. Bakteriler sabit faz28'egirdiğinde lüminesan sinyalde bir azalma da tanımlanmıştır. Bu, ölçülen ROI'ler ile29numaralandırılmış CFU arasında bir bağlantı kesilmesine neden olabilir. Bu sınırlama, algılama için yeterince güçlü bir sinyal olmadığında yanlış varsayımlara yol açabilir, ancak bakteriler hala mevcuttur. Şekil 2B'degösterildiği gibi PBS ve %10 GH tedavileri tedavi sonrası lüminesans artışına neden oldu. Bu, in vitro (Cláudia Marques, Binghamton Üniversitesi, kişisel iletişim) hücrelerini dağıttıktan sonra da görülen meraklı ve tutarlı bir gözlemdir. Biyofilm'in tedaviyi uygulamaktan kaynaklanan fiziksel bozulmasının, sıkıca paketlenmiş hücreleri yayması ve bunun sonucunda ışık sinyalinin artması mümkündür. Alternatif olarak, dispersiyon tedavisi daha önce metabolik olarak aktif olmayan biyofilm hücrelerini 'uyandırabilir' ve bu da biyolüminesansın artmasına neden olabilir. Her iki durumda da, IVIS görüntüleme sonuçlarını CFU verileriyle doğrulamak çok önemlidir. Son olarak, enfekte yara dokusu içinde bakterilerin heterojen dağılımı vardır30,31. Bu nedenle, doku daha fazla örnek sağlamak için ex vivo bölünürse, her yara bölümündeki bakteri yükünün aynı olduğu varsayılmamalıdır.
Bu modellerin sınırlamalarını aşmak için gerçekleştirilebilecek değişiklikler ve sorun giderme vardır. İlk olarak, depilatör kremin maruz kalması için ayrılan sürenin, kullanılan fare türlerine bağlı olarak ayarlanması gerekebilir. Örneğin, İsviçre Webster fareleri için tipik olarak 7 dakika kullanılırken, C57BL/ 6 farelerin kürkü başarıyla çıkarmak için 10 dakikaya kadar maruz kalması gerekebilir. Bu elbette kullanılan ürüne de bağlıdır ve maruz kalma süreleri asla üreticinin talimatlarını aşmamalıdır. Uzun bir çalışma (4+ gün) yapılıyorsa, yeniden yetiştirilen kürkü çıkarmak ve pansumanın uygun bir mührünü sağlamak için depilatory kremin yeniden yapılması gerekebilir. Daha sonra, bir lüminesan sinyali tespit etmek zorsa, IVIS görüntüleme sırasında maruz kalma süresi artırılabilir. Aşılama dozu ve enfeksiyon süresi de ayarlanabilir. Fareyi bunaltacak kadar yüksek olmayan, aynı zamanda bakterilerin bağışıklık tepkisi tarafından hemen temizlendiğini çok düşük olmayan bir enfekte edici doz kullanmak önemlidir.
Bu protokolde, 48 h-old yara enfeksiyonlarının dispersiyon ajanları ile tedavisini açıklıyoruz, çünkü bu P. aeruginosa ve / veya S. aureus'un neden olduğu enfeksiyonların tespit edildiğini ve biyofilm ilişkili 12 , 15,16. Bununla birlikte, bakteri türlere bağlı olarak, diğer zaman noktaları daha uygun olabilir. İdeal olarak, yaradaki bakteri yükü bir enfeksiyon kurulduktan sonra plato yapmalıdır. Örneğin, hem P. aeruginosa hem de S. aureus ile yaradaki bakteri yükünün enfeksiyon sonrası 48 saat ile yaklaşık 108 CFU/g dokuya ulaştığını ve yara kapanıncaya kadar bu seviyede kaldığını gördük. Şekil 1, 3 x 30 dk yıkama gerektiren bir çözelti ile tedaviyi göstermektedir. Ancak, dispersiyon maddesi başka bir formda olsaydı, yıkamalar gerekli olmazdı. Örneğin, yara yatağının üzerine bir krem, jel veya tasarlanmış pansuman yer verilebilir. Son olarak, yara planktonik bakteri hücrelerinin aşılanması, önceden biçimlendirilmiş biyofilmler12veya hatta başka bir hayvandan veya insandan enfekte debridman dokusu dahil olmak üzere çeşitli şekillerde enfekte olabilir19,32. Yara yatağına önceden biçimlendirilmiş bir biyofilm veya debridman örneğinin nakledilmesinin, planktonik formlarında birden fazla türün aşılandığından daha başarılı poli-mikrobiyal enfeksiyonlarla sonuçlendiğini gördük12.
Genel olarak, bu protokoller biyofilm dispersiyonunun incelenmesi için yöntemleri ve terapötik biyofilm dispersiyon ajanlarının değerlendirilmesini açıklar. Bu modeller, klinik olarak ilgili insan enfeksiyonlarını taklit eden karmaşık poli-mikrobiyal biyofilm ilişkili enfeksiyonların geliştirilmesine izin verir. Umudumuz, bu protokollerin terapötik kullanım için anti-biyofilm dispersiyon ajanlarının geliştirilmesi için kullanılması ve rafine edilmesidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (R21 AI137462-01A1), Ted Nash Long Life Foundation, Jasper L. ve Jack Denton Wilson Vakfı ve Savunma Bakanlığı'nın (DoD MIDRP W0318_19_NM_PP) hibeleriyle desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisher | 14823434 | Use to complete serial dilutions of samples |
| 25G 58 in needle | Fisher | 14823434 | Attaches to 1 mL syringe |
| Ampicillin Sodium Salt | Fisher | BP1760-5 | Make a 50 mg/ mL stock solution and add 100 µL to 10 mL of LB broth for both overnight and subculture |
| Amylase | MP Biomedicals | 2100447 | Make a 5% w/v solution, vortex- other dispersal agents can be used |
| Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL) | ZooPharm | RX216118 | Use as pain mainagement- may use other options |
| Cellulase | MP Biomedicals | 2150583 | Add 5% w/v to the 5% w/v amylase solution, vortex, activate at 37 °C for 30 min- other dispersal agents can be used |
| Depilatory cream | Walmart | 287746 | Use a small amount to massage into the hair follicles on the back of the animal and allot 10 min to remove hair |
| Dressing Forceps, Serrated Tips | Fisher | 12-460-536 | Can use other forms of forceps |
| Erlenmeyer flasks baffled 125 mL | Fisher | 101406 | Use to grow overnights and sub-cultures of bacteria |
| FastPrep-24 Benchtop Homogenizer | MP Biomedicals | 6VFV9 | Use 5 m/s for 60 s two times to homogenize tissue |
| Fatal Plus | Vortech Pharmaceuticals | 0298-9373-68 | Inject 0.2 mL intraperitaneal for each mouse |
| Homogenizing tubes (Bead Tube 2 mL 2.4 mm Metal) | Fisher | 15340151 | Used to homogenize samples for plating |
| Isoflurane | Diamond Back Drugs | ||
| Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution C-IIIN | Sigma Aldrich | K4138 | Use as anasethia- other options can also be utilized to gain a surgical field of anasethia |
| LB broth, Miller | Fisher | BP1426-2 | Add 25 g/L and autoclave |
| Lidocaine 2% Injectable | Diamond Back Drugs | 2468 | Inject 0.05 mL through the side of the marked wound bed area so it is deposited in the center of the mark. Allot 10 min prior to cutting |
| Meropenem | Sigma Aldrich | PHR1772-500MG | Make 5 mg/mL to add to the GH solution to apply topically and a 15 mg/mL solution to inject intraperitaneal 4 h prior and 6 h post-treatment |
| Non-sterile cotton gauze sponges | Fisher | 13-761-52 | Use to remove the depilatory cream |
| PAO1 pQF50-lux bacterial strain | Ref [13] | N/A | PAO1 pgF50-lux was used as the P. aeruginosa strain of interest in this paper's representative results |
| Petri dishes | Fisher | PHR1772-500MG | |
| Phosphate Buffer Saline 10x | Fisher | BP3991 | Dilute 10x to 1x prior to use |
| Polyurethane dressing | Mckesson | 66024007 | Cut the rounded edge off and cut the remaining square into 4 equal sections |
| Pseudomonas isolation agar | VWR | 90004-394 | Add 20 mL/L of glycerol and 45 g/mL to water, autoclave, and pour 20 mL into petri dishes |
| Refresh P.M. | Walmart | Use on eyes to reduce dryness during procedure. | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisher | 22-363-750 | Use to clean the skin immediately prior to wounding to disinfect the area |
| Straight Delicate Scissors | Fisher | 89515 | Can also use curved scissors |
| Swiss Webster mice | Charles River | 551NCISWWEB | Other mice strains can be used |
| Syring Slip Tip 1 mL | Fisher | 14823434 | Used to administer drugs and enzyme treatment |
References
- Rossolini, G. M., Arena, F., Pecile, P., Pollini, S. Update on the antibiotic resistance crisis. Current Opinion in Pharmacology. 18, 56-60 (2014).
- Stewart, P. S.
- Flemming, H. C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).
- Rumbaugh, K. P. How well are we translating biofilm research from bench-side to bedside. Biofilm. 2 (100028), (2020).
- Rumbaugh, K. P., Sauer, K.
- Fleming, D., Chahin, L., Rumbaugh, K. Glycoside Hydrolases Degrade Polymicrobial Bacterial Biofilms in Wounds. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (2), (2017).
- Fleming, D., Rumbaugh, K. The Consequences of Biofilm Dispersal on the Host. Scientific Reports. 8 (1), 10738 (2018).
- Baker, P., et al. Exopolysaccharide biosynthetic glycoside hydrolases can be utilized to disrupt and prevent Pseudomonas aeruginosa biofilms. Science Advances. 2 (5), 1501632 (2016).
- Redman, W. K., Welch, G. S., Rumbaugh, K. P. Differential Efficacy of Glycoside Hydrolases to Disperse Biofilms. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 379 (2020).
- Zhu, L., et al. Glycoside hydrolase DisH from Desulfovibrio vulgaris degrades the N-acetylgalactosamine component of diverse biofilms. Environmental Microbiology. 20 (6), 2026-2037 (2018).
- Fell, C. F., Rumbaugh, K. P. Antibacterial Drug Discovery to Combat MDR. , 527-546 (2019).
- Dalton, T., et al. An in vivo polymicrobial biofilm wound infection model to study interspecies interactions. PLoS One. 6 (11), 27317 (2011).
- Wolcott, R. D., et al. Biofilm maturity studies indicate sharp debridement opens a time- dependent therapeutic window. Journal of Wound Care. 19 (8), 320-328 (2010).
- Korgaonkar, A., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. Community surveillance enhances Pseudomonas aeruginosa virulence during polymicrobial infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (3), 1059-1064 (2013).
- Watters, C., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilms perturb wound resolution and antibiotic tolerance in diabetic mice. Medical Microbiology and Immunology. 202 (2), 131-141 (2013).
- Watters, C., Everett, J. A., Haley, C., Clinton, A., Rumbaugh, K. P. Insulin treatment modulates the host immune system to enhance Pseudomonas aeruginosa wound biofilms. Infection and Immunity. 82 (1), 92-100 (2014).
- Turner, K. H., Everett, J., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. Requirements for Pseudomonas aeruginosa acute burn and chronic surgical wound infection. PLOS Genetics. 10 (7), 1004518 (2014).
- Harrison, F., et al. A 1,000-Year-Old Antimicrobial Remedy with Antistaphylococcal Activity. mBio. 6 (4), 01129 (2015).
- Wolcott, R., et al. Microbiota is a primary cause of pathogenesis of chronic wounds. Journal of Wound Care. 25, Sup10 33-43 (2016).
- Ibberson, C. B., et al. Co-infecting microorganisms dramatically alter pathogen gene essentiality during polymicrobial infection. Nature Microbiology. 2, 17079 (2017).
- Fleming, D., et al. Utilizing Glycoside Hydrolases to Improve the Quantification and Visualization of Biofilm Bacteria. Biofilm. 2, (2020).
- DeLeon, S., et al. Synergistic interactions of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in an in vitro wound model. Infection and Immunity. 82 (11), 4718-4728 (2014).
- Darch, S. E., et al. Phage Inhibit Pathogen Dissemination by Targeting Bacterial Migrants in a Chronic Infection Model. mBio. 8 (2), (2017).
- Chua, S. L., et al. Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles. Nature Communications. 5, 4462 (2014).
- Beitelshees, M., Hill, A., Jones, C. H., Pfeifer, B. A. Phenotypic Variation during Biofilm Formation: Implications for Anti-Biofilm Therapeutic Design. Materials (Basel). 11 (7), (2018).
- Sauer, K., et al. Characterization of nutrient-induced dispersion in Pseudomonas aeruginosa PAO1 biofilm. J Bacteriol. 186 (21), 7312-7326 (2004).
- Kuklin, N. A., et al. Real-time monitoring of bacterial infection in vivo: development of bioluminescent staphylococcal foreign-body and deep-thigh-wound mouse infection models. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (9), 2740-2748 (2003).
- Francis, K. P., et al. Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon. Infection and Immunity. 69 (5), 3350-3358 (2001).
- Kadurugamuwa, J. L., et al. Noninvasive optical imaging method to evaluate postantibiotic effects on biofilm infection in vivo. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (6), 2283-2287 (2004).
- Wimpenny, J., Manz, W., Szewzyk, U.
- Stewart, P. S., Franklin, M. J.
- Tipton, C. D., et al. Chronic wound microbiome colonization on mouse model following cryogenic preservation. PLoS One. 14 (8), 0221656 (2019).
