Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Vurderer biofilmspredning i murine sår

Published: August 7, 2021 doi: 10.3791/62136
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1,2,3
1Department of Surgery, Texas Tech University Health Sciences Center, 2Immunology and Molecular Microbiology, Texas Tech University Health Sciences Center, 3TTUHSC Surgery Burn Center of Research Excellence, Texas Tech University Health Sciences Center
* These authors contributed equally

Summary

Her beskriver vi ex vivo og in vivo metoder for å vurdere bakteriell spredning fra en sårinfeksjon hos mus. Denne protokollen kan brukes til å teste effekten av aktuelle antimikrobielle og antibiofilmbehandlinger, eller for å vurdere spredningskapasiteten til forskjellige bakteriestammer eller arter.

Abstract

Biofilmrelaterte infeksjoner er involvert i et bredt spekter av kroniske tilstander som ikke-helbredende diabetiske fotsår, kronisk bihulebetennelse, tilbakevendende otitis media og mange flere. Mikrobielle celler i disse infeksjonene er beskyttet av et ekstracellulært polymerstoff (EPS), som kan forhindre antibiotika og være vert for immunceller fra å fjerne infeksjonen. For å overvinne dette hinderet har etterforskere begynt å utvikle spredningsmidler som potensielle terapeutiske midler. Disse midlene retter seg mot ulike komponenter i biofilm-EPS, svekker strukturen og initierer spredning av bakteriene, noe som teoretisk kan forbedre antibiotikastyrken og immunclearance. For å bestemme effekten av dispergeringsmidler for sårinfeksjoner, har vi utviklet protokoller som måler biofilm dispergering både ex vivo og in vivo. Vi bruker en musekirurgisk eksisjonsmodell som er godt beskrevet for å skape biofilmrelaterte kroniske sårinfeksjoner. For å overvåke sprednings in vivo, smitter vi sårene med bakteriestammer som uttrykker luciferase. Når modne infeksjoner har etablert seg, irrigerer vi sårene med en løsning som inneholder enzymer som forringer komponenter i biofilm EPS. Vi overvåker deretter plasseringen og intensiteten av lystetthetssignalet i sår- og filtreringsorganene for å gi informasjon om nivået av spredning oppnådd. For ex vivo-analyse av biofilmspredning er infisert sårvev nedsenket i biofilmnedbrytende enzymoppløsning, hvorpå bakteriebelastningen som gjenstår i vevet, kontra bakteriebelastningen i løsningen, vurderes. Begge protokollene har styrker og svakheter og kan optimaliseres for å bidra til å nøyaktig bestemme effekten av spredningsbehandlinger.

Introduction

Fremveksten av antibiotikaresistens over hele verden fører til mangel på antibiotikaalternativer for å behandle en rekke bakterielle infeksjoner1. I tillegg til antibiotikaresistens kan bakterier få antibiotikatoleranse ved å vedta en biofilm-assosiert livsstil2. En biofilm er et fellesskap av mikroorganismer som er beskyttet av en matrise av polysakkarider, ekstracellulært DNA, lipider og proteiner3, samlet kalt det ekstracellulære polymere stoffet (EPS). Etter hvert som antibiotikaresistenskrisen fortsetter, er det sårt behov for nye strategier som forlenger bruken av, eller forsterker effekten av antibiotika. Antibiofilmmidler er en lovende løsning4.

Blant de forskjellige antibiofilmstrategiene som er foreslått, er bruken av dispergeringsmidler, som retter seg mot forskjellige komponenter i biofilm-EPS, i forkant av terapeutisk utvikling5. Glykosidhydrolaser (GH) er en slik klasse av dispergeringsmiddel. GH er en stor klasse enzymer som katalyserer spaltingen av forskjellige bindinger i polysakkaridene som gir strukturell integritet til EPS. Vår gruppe, så vel som andre, har vist at GH effektivt kan forringe biofilmer, indusere spredning og forbedre antibiotikaeffekten for en rekke forskjellige bakteriearter, både in vitro og in vivo6,7,8,9,10,11.

Med en økende interesse for biofilmspredning er det viktig å utvikle effektive metoder som vurderer spredningseffekt. Her presenterer vi en detaljert protokoll for behandling av biofilm-assosierte sårinfeksjoner med et dispergeringsmiddel hos mus, og vurdering av spredningseffekt, in vivo og ex vivo. Det overordnede målet er å gi effektive metoder som kan brukes med prekliniske modeller for å måle biofilmspredning effektivt og effektivt.

En murin kirurgisk eksisjonsinfeksjonsmodell ble brukt i disse studiene for å etablere en biofilm-assosiert infeksjon. Vi har brukt denne modellen i over 15 år og publisert våre observasjoner mye7,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. Generelt er dette en ikke-dødelig infeksjonsmodell der bakterier forblir lokalisert til sårsengen og er biofilmrelaterte (bakterier sett i aggregater omgitt av EPS), og setter opp en kronisk infeksjon som varer opptil 3 uker. Men hvis mus er immunkompromittert (med type 1 diabetes for eksempel), kan de bli mer utsatt for å utvikle en dødelig systemisk infeksjon i denne modellen.

I denne rapporten gir vi protokoller for å vurdere spredning av bakterier fra et sår, både in vivo og ex vivo. Begge protokollene kan brukes til å undersøke effekten av et dispergeringsmiddel og ha sine egne styrker og svakheter. For eksempel kan vurdering av dispergering in vivo gi viktig sanntidsinformasjon om spredning av bakterier til andre deler av kroppen etter spredning, og hvordan verten reagerer. På den annen side kan det være mer ønskelig å vurdere spredning ex vivo for screening av flere midler, doser eller formuleringer, da vevet kan deles inn i flere seksjoner som kan testes separat, og dermed redusere antall mus som kreves. Når vi vurderer flere agenter, måler vi vanligvis spredning første in vitro som tidligere beskrevet 6,9,22. Vi tester deretter den mest effektive ex vivo og reserverer in vivo-testing for et begrenset antall svært lovende midler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne dyreprotokollen ble gjennomgått og godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee of Texas Tech University Health Sciences Center (protokollnummer 07044). Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene i Veiledningen for pleie og bruk av laboratoriedyr ved National Institutes of Health.

1. Forbereder bakterier for museinfeksjoner

MERK: Her beskriver vi smittende mus bare med Pseudomonas aeruginosa. Imidlertid kan andre bakteriearter brukes til å forårsake infeksjon. Bakteriestammer og materialer er beskrevet i materialtabellen.

  1. Bruk Pseudomonas aeruginosa wild-type stamme PAO1 bærer luminescens plasmid pQF50-lux23 for disse forsøkene som tidligere beskrevet7.
  2. Vokse P. aeruginosa stammer i forbløffet Erlenmeyer kolber, med risting ved 200 rpm, i Luria-Bertani (LB) buljong ved 37 °C i 16 til 20 timer. Tilsett en endelig konsentrasjon på 100 μg/ml ampicillin til nattkulturen til PAO1 (pQF50-lux) for vedlikehold av plasmidet.
  3. Subkultur P. aeruginosa ved å legge 100 μL av nattkulturen til en Erlenmeyer kolbe som inneholder 10 ml LB buljong med en endelig konsentrasjon på 100 μg / ml ampicillin. Deretter vokser i 2-2,5 h ved 37 °C med risting, til en OD600 nm på 0,4, og deretter serielt fortynnes (1:10) tre ganger for en infeksjonsdose på ca. 104 celler.

2. Fremstilling av biofilm dispergeringsenzym

MERK: For denne studien bruker vi en 10% løsning av like deler amylase og cellulase (5% av hver), som vil bli referert til som "GH", for spredningsbehandling.

  1. Bruk en 10% GH-løsning (m/v) amylase (fra Bacillus subtilis) og soppcellulase (fra Aspergillus niger) fortynnet i 1x fosfatbuffer saltvann (PBS). Bruk PBS som behandling av kjøretøykontroll.
  2. Varm alle behandlinger til 37 °C i 30 min for enzymaktivering.

3. Eksperimentelle dyr og preoperativt oppsett

  1. Husmus, 5 kullkamerater per bur, under miljøkontrollerte forhold, med 12 timers lyse / mørke sykluser og riktig tilgang til mat og vann.
  2. Bruk fortrinnsvis kvinnelige sveitsiske Webster-mus, mellom 8 og 10 uker gamle.
  3. Veie mus for å bestemme riktig mengde anestesi å administrere.
  4. Administrer anestesi ved intraperitoneal injeksjon av 100 mg/kg ketamin 10 mg/kg xylazin.
  5. Påfør øyekrem (f.eks. oppdater P.M.) forsiktig på øyet ved hjelp av en bomullspinne for å redusere tørrhet.
  6. Overvåk fysiologiske parametere, inkludert respirasjonsfrekvens, hudfarge og kroppstemperatur gjennom hele operasjonen.

4. Dorsal full tykkelse eksisjon kirurgi

  1. Vurder kirurgisk plan av anestesi ved tå klemme og overvåking av respiratorisk hastighet og innsats. Barber dorsaloverflaten og påfør en depilatorisk krem i 10 min (eller i henhold til produktets instruksjoner), hvorpå forsiktig fjerne, og sørg for at huden var tørr.
  2. For smertebehandling, administrer 0,05 ml lidokain subkutant inn i området som skal utskilles, og injiser 0,02 ml buprenorfin subkutant i nakken. Vent i 10 min for å sikre at smertebehandlingen ble nådd.
  3. Før eksisjon desinfiserer du dorsaloverflaten ved hjelp av en alkoholpinne og tegner en sirkel med en diameter på 1,5 cm mot den bakre delen av ryggen. Oppretthold et sterilt kirurgisk felt gjennom hele prosedyren og bruk autoklavede instrumenter og sterile hansker. For å begrense forurensning, utfør operasjonen av en tent Bunsen brenner og bruk rene verktøy for hvert dyr.
  4. Administrer en full tykkelse, eksisjonell hud sår til nivået av panniculus muskel med kirurgisk saks.
  5. Etter eksisjon, umiddelbart dekke sår med en semipermeable polyuretan dressing.
  6. Injiser ca. 104 CFU bakterier i 100 μL PBS under bandasjen, på sårsengen, for å etablere en infeksjon.
    MERK: Sår kan også smittes med flere arter av bakterier og/eller sopp samtidig, eller ved å plassere ferdigformede biofilmer12, eller til og med debridementvev ekstrahert fra pasient19, på sårsengen.
  7. Etter infeksjon, plasser mus i bur med varmeputer og overvåk til de gjenvunnet sin rette refleks.
    MERK: Pass på at mus ikke blir kalde, da dette kan føre til døden.
  8. Etabler sårinfeksjoner i 48 timer.
  9. Inspiser klebende bandasjer daglig for tårer og områder uten overholdelse og erstattet om nødvendig.

5. In vivo dispersal behandling

MERK: Her beskriver vi administrering av dispergeringsmidlene ved å bruke en serie på 3 aktuelle sårvanningsløsninger (Figur 1). Protokollen kan imidlertid tilpasses andre typer levering som påføring av geler, kremer eller dressinger.

  1. Plasser mus under isofluranbedøvelse (ved 3% og 1 l per minutt oksygen) mens du administrerer behandlingene.
  2. Forbered tre 1 ml sprøyter, med 25 G nåler, som inneholder 200 μL behandling for hver mus.
  3. Injiser 200 μL enzymoppløsning eller PBS-kontroll på såret ved å løfte og klemme huden forsiktig med tang, litt over såret mot dyrets hode. Pierce sprøyten forsiktig gjennom den løftede huden og injiser sakte løsningen mellom bandasjen og sårsengen. Bandasjen som brukes i denne studien holder seg ofte til både sårsengen og det omkringliggende vevet.
    1. For å sikre at hele sårsengen er dekket av løsning, løft forsiktig dressingen med tang, trekk den bort fra sårsengen, mens du sakte injiserer løsningen.
  4. Etter behandling, plasser mus tilbake i burene sine i 30 min.
  5. Etter 30 min eksponering for behandlingen, bedøv musene med isofluran og aspirer oppløsningen med en sprøyte, sørg for å punktere i samme område som før.
    MERK: Denne aspirerte løsningen inneholder dispergerte bakterieceller, som kan lagres for ulike nedstrømsanalyser.
  6. Administrer andre og tredje vanningsbehandling som den første, ved hjelp av en ny sprøyte hver gang.

6. In vivo dispersal avbildning og analyse

MERK: Hvis en lysende bakteriestamme brukes til å initiere infeksjon, kan et In Vivo Imaging System (IVIS) brukes til å visualisere spredning fra sårsengen.

  1. Bildemus umiddelbart før og etter behandling og ved 10 og 20 timers etterbehandling (Figur 2 og Supplerende figur 1).
  2. Utfør avbildning mens mus er under anestesi ved å plassere dem individuelt i IVIS og bilde hver enkelt i 5 s ved en bølgelengde på 560 nm. Lagre bilder for videre analyse.
    MERK: Optimal bølgelengde og eksponeringstid vil avhenge av reporteren som brukes og IVIS-instrumentet og bildebehandlingsprogramvaren.
  3. For analyse åpner du bilder i IVIS-programvaren og velger området som skal analyseres i verktøypaletten.
  4. For å ta hensyn til bakgrunnen, plasser en sirkel på bakgrunnen av et bilde og legg deretter den samme størrelsen sirkelen på toppen av sårsengen for hver mus.
  5. Hvis du vil laste opp målverdier, velger du Vis -> målinger av interesseområde (ROI) og laster opp måltabellen til et regneark. Trekk bakgrunnssirkelavlesningen fra hver av sårsengmålingene for å beregne luminescens for hver prøve. Beregn prosent luminescens endret av:
    ROI pre-treatment-ROI etter behandling/ ROI forbehandling) x 100.
    MERK: Kontroll og behandlede mus bør analyseres samtidig for å normalisere for variabler som kan påvirke bildeanskaffelse eller utstråling.

7. Vurdering av spredning ved å bestemme CFU

  1. Humant euthanize mus ved intraperitoneal injeksjon av 0,2 ml pentobarbital natrium (f.eks. dødelig pluss) under anestesi med 100 mg/kg ketamin 10 mg/kg xylazin.
  2. Høst sårsengvev ved først å forsiktig fjerne bandasjen med sterile tang, og kutt deretter rundt omkretsen av sårsengen med steril kirurgisk saks. Løft forsiktig den ene enden av sårsengen med tang mens du bruker saks til å kutte / erte prøven bort fra muskellaget.
  3. Plasser vev fra sårsengen i forhåndsmerket og forhåndsveid 2 ml homogeniseringsrør som inneholder 1 ml PBS. Vei rørene igjen etter at du har satt inn prøvene, og snu deretter forsiktig 3-5 ganger for å skylle av dispergerte eller løst tilkoblede bakterier, og fjern deretter PBS. Tilsett 1 ml fersk PBS.
  4. For å høste miltene, plasser mus i en supine anatomisk posisjon og sikre ved å feste ekstremitetene til en disseksjonsoverflate. Bløtlegg området som skal dissekeres med 70% etanol for å desinfisere området og hindre pelsen i å forurense prøven.
  5. Lag forsiktig et lite snitt vinkelrett på midtlinjen med kirurgisk saks i underlivets dermis, sørg for å trekke huden opp og bort fra de indre organene. Fortsett snittet innvendig, langs midtlinjen, til brystbenet ble nådd. Når bukhulen ble utsatt og de indre organene var synlige, skilles milten forsiktig fra bindevevet og plasseres i et eget homogeniseringsrør.
  6. Vei milten og skyll med PBS, som beskrevet for sårsengvevet.
    MERK: Andre organer av interesse kan høstes på samme måte.
    1. Når du gjør det første snittet, må du passe på å unngå å punktere tarmene eller andre organer.
  7. Homogeniser prøver i 2 ml ferdigfylte perlefabrikkrør ved hjelp av en benkeplate homogenisator ved 5 m/s i 60 s, to ganger.
  8. For å liste opp CFU, fortynn serielt prøver og spotplate på selektiv agar. For seriell fortynning, pipette 100 μL av prøven i 900 μL PBS i et 1,5 ml rør, virvel og gjenta 5 ganger. Pipette 10 μL av hver fortynning på en agarplate som vist i figur 3.
    MERK: Hvis det er behov for mer presis CFU-kvantasjon, spres 100 μL av hver fortynning av prøven over separate agarplater.

8. Ex vivo vurdering av spredning (Figur 4)

  1. Sårmus og smitter med ca. 104 PAO1 som beskrevet ovenfor, og euthanize deretter 48 timer etter infeksjon.
  2. Fjern forsiktig dressingen med tang, bruk steril teknikk og uten å forstyrre sårsengen.
  3. Bruk steril kirurgisk saks for å kutte omkretsen av sårsengen bort fra den uinfiserte huden ved å bruke tang til å løfte den ene enden av sårsengen og saksen for å skille infisert sårvev fra muskellaget under og omkringliggende uinfisert vev. Del sårsengprøver i like deler eller bruk hele.
  4. Plasser sårvev i tomme, forhåndsveide 2 ml perlemølle homogeniserende rør. Vei deretter rørene igjen etter at du har lagt til prøven. Beregn vekten av prøven ved å:
    vekt etter å ha lagt til prøvetykkelse - vekt før du legger til prøve.
  5. Tilsett 1 ml PBS, og inverter forsiktig røret 3-5 ganger for å skylle prøven og fjerne eventuelle planktoniske celler. Fjern og kast PBS.
  6. Tilsett 1 ml GH-behandling (eller PBS som en negativ kontroll) i prøven og inkuber i 2 timer ved 37 °C ved risting ved 80 o/min.
  7. Fjern biofilmspredningsløsningen og legg den i et separat 1,5 ml rør. Denne inneholder de spredte cellene.
  8. Tilsett 1 ml PBS i den gjenværende vevsprøven og inverter forsiktig 3-5 ganger for å skylle av eventuelle gjenværende dispergerte celler. Fjern og kast PBS.
  9. Tilsett 1 ml PBS til det gjenværende vevet og homogeniser ved 5 m/s i 60 s ved hjelp av en benktop homogenisator.
  10. Fortynn oppløsningen av dispergerte celler og den homogeniserte vevsprøven ved å plassere 100 μL prøve i 900 μL PBS i et 1,5 ml rør, og gjenta fem ganger for totalt 6 fortynninger.
  11. Spotplate 10 μL av hver fortynning på media selektiv agar (f.eks. Pseudomonas Isolation Agar for P. aeruginosa) og inkuber platene ved 37 °C over natten.
  12. Tell CFU og beregn 'prosent spredt' som (CFU i supernatant/ (CFU i supernatant+ CFU i biofilmvev)) x 100.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I dette eksperimentet ble 8-10 uker gamle kvinnelige sveitsiske Webster-mus smittet med 104 CFU av PAO1 som bærer luminescensplasmid pQF50-lux. Som beskrevet ovenfor fikk en infeksjon lov til å etablere i 48 timer før administrering av 3 x 30 min behandlinger av enten PBS (kjøretøykontroll) eller 10% GH (behandling) for å fordøye biofilm EPS. Mus ble avbildet forbehandling, rett etter behandling (0 h) og ved 10 timer og 20 timer etter behandling. Figur 2A og supplerende figur 1 viser en etablert infeksjon i sårsengen som genererer et sterkt bioluminescerende signal. Spredningen av bakterier ut av sårsengen kan visualiseres umiddelbart etter GH-behandlingen (0 h), men ikke etter PBS-behandling. Det skal bemerkes at i tidligere studier oppdaget vi bakterier i blodet og milten så tidlig som 5 timer etter GH-behandling7. Bakteriell formidling i organene kan også ses ved å plassere musen på siden for avbildning, som vist i det nedre panelet i figur 2A.

Bilder fra både PBS- og GH-behandlede mus viste en økning i luminescerende signal ved 20 timers etterbehandling sammenlignet med forbehandling (figur 2B). Vi hypoteser dette skyldes den mekaniske forstyrrelsen av biofilmen forårsaket av vanning av løsning. Ved 20 timers etterbehandling ble musene euthanized, og sårsenger og milt ble samlet inn for å liste opp CFU / gram vev. Mens bakteriebelastningene i sårsengene var like (figur 2C), ble det bare påvist bakterier i miltene til GH-behandlede mus (figur 2D), noe som tyder på spredning av de spredte bakteriene.

Tidligere har vi vist at GH-behandling kan bryte opp aggregater av bakterier, forbedre CFU teller21. Dette kan forklare den lille økningen av bakteriell belastning i sårsengene til de GH-behandlede musene. Til slutt, selv om de GH-behandlede sårsengene hadde litt høyere CFU / gram, var det en lavere prosent bioluminescent endring. Disse resultatene antyder viktigheten av å bekrefte luminescens med CFU-tellinger. Disse representative resultatene gir et eksempel på data som kan samles inn ved å bruke protokollene beskrevet ovenfor.

Figure 1
Figur 1. Etablering av biofilm-assosierte sårinfeksjoner og vurdering av spredningsmiddeleffekt in vivo. Dressinger ble sjekket for tårer eller tap av vedheft til musens hud før behandling. Kompromitterte dressinger ble erstattet. Mus ble plassert under anestesi umiddelbart før administrering av behandlingen. 200 μL enzymoppløsning, eller en kjøretøykontroll, ble injisert i rommet mellom sårsengen og bandasjen. Bandasjen ble forsiktig hevet ved hjelp av tang for å sikre at hele såret var mettet i løsningen. Behandlingen ble liggende på sårsengen i 30 minutter. Etter 30 min ble behandlingen aspirert med en sprøyte, og ytterligere 200 μL behandling ble tilsatt. Dette ble gjentatt for totalt 3 behandlinger. For å måle spredning i sanntid ble mus avbildet ved hjelp av IVIS før behandling, umiddelbart etter behandling (0 t), 10 timer og 20 timer etter behandling. Ved 20 timers etterbehandling ble musene euthanized, og sårsenger og milt ble samlet inn. Prøvene ble skyllet i PBS og deretter homogenisert i fersk PBS to ganger ved 5 m/s i 60 s. Prøvene ble deretter seriefortynnet og flekkbelagt. CFU ble nummerert og CFU/gram ble beregnet. Spredningsnivået av bakterier fra såret kan enten vurderes av IVIS eller ved å bestemme antall CFU som sprer seg systemisk til milten. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2. Representative data viser hvordan man vurderer spredning in vivo. Sår smittet med 104 PAO1 (pQF50-lux) i 48 timer ble behandlet med enten PBS eller 10% GH (biofilm dispergeringsenzymoppløsning). PBS-behandling ble brukt som kjøretøykontroll. Sårsengene ble behandlet med 3 x 30 min behandlinger. Mus ble avbildet ved hjelp av IVIS før behandling, umiddelbart etter behandling, 10 timer etter behandling og 20 timers etterbehandling. Det skal bemerkes at sidevisningsbildene er fra forskjellige PBS- og GH-behandlede mus enn de som vises i overhead-visningsbildene (A). ROIene for hver sårseng før behandling og hver 20 timers sårseng etter behandling ble registrert. Prosentvis endring fra forbehandling ble beregnet som (ROI pre-treatment-ROI post-treatment/ ROI pre-treatment) x 100 (B). Ved 20 timers etterbehandling ble mus euthanized. Sårsengene og miltene ble samlet inn og veid for å bestemme henholdsvis CFU/gram (C og D). N=3. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3. Seriell fortynning og flekkbelegg. Homogenisert prøve ble virvelert og 100 μL ble overført til et 1,5 ml Eppendorf-rør som inneholder 900 μL PBS. Prøven ble virvelert og 100 μL ble overført til et annet 1,5 ml Eppendorf-rør med 900 μL PBS. Denne prosessen ble gjentatt 5 ganger. Fra og med det siste fortynningsrøret ble 10 μL prøven flekkbelagt på agarplaten i punkt 10-8. Dette ble videreført opp til fortynning 10-3. Vanligvis resulterer10-3 fortynning i en plen av bakterier på stedet. Noen organer, som har lav bakteriebelastning, kan kreve spotbelegg opp til10-1 fortynning. Gjenta for hver vevsprøve. Plasser agarplaten i en inkubator ved 37 °C i 24-48 timer, eller vokse under forhold som er optimale for bakterielle arter av interesse. For å liste opp CFU, telle individuelle kolonier på lavest mulig fortynning, og formere seg med riktig fortynningsfaktor for å bestemme CFU / ml eller bruke vevsvekt for å beregne CFU / g vev. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4. Måling av spredning fra infisert vev ex vivo. Mus ble euthanized og det infiserte sårvevet ble aseptisk fjernet. Det infiserte vevet ble plassert i et 2 ml perlemølle homogeniserende rør og skyllet kort med PBS. 1 ml dispergeringsmiddel ble tilsatt og prøven ble inkubert i 2 timer ved 37 °C med risting ved 80 o/min. Etter inkubasjon ble løsningen som inneholder de dispergerte cellene fjernet og plassert i et eget 1,5 ml rør. Det gjenværende vevet ble skyllet med 1 ml PBS. 1 ml fersk PBS ble tilsatt vevet og homogenisert ved 5 m/s i 60 s. Enzymoppløsningen og homogenisert vev ble deretter serielt fortynnet og flekkbelagt på selektiv agar. CFU ble listet opp og spredning ble beregnet som: CFU fra enzymoppløsning/ (CFU fra enzymoppløsning + CFU fra vev) x 100. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Supplerende figur 1. Måling i vivo spredning. Sår ble smittet med 104 PAO1 (pQF50-lux) i 48 timer og deretter behandlet med enten PBS eller 10% GH (biofilm dispergeringsenzymløsning). PBS-behandling ble brukt som kjøretøykontroll. Sårsengene ble behandlet med 3 x 30 min vanningsbehandlinger. Mus ble avbildet ved hjelp av IVIS før behandling, umiddelbart etter behandling, 10 timer etter behandling og 20 timers etterbehandling (A). Ved 20 timers etterbehandling ble mus euthanized. Sårsengene og miltene ble samlet inn og veid for å bestemme henholdsvis CFU/gram (B og C). N=3. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her beskriver vi protokoller som kan brukes til å studere effekten av biofilmdispergeringsmidler. Disse protokollene kan enkelt tilpasses for bruk med ulike typer dispergeringsmidler, bakteriearter eller ex vivo-prøver, inkludert kliniske debrideringsprøver. Denne protokollen gir også en klinisk relevant modell for å samle og studere dispergerte bakterieceller. Fenotypene av dispergerte bakterieceller har vist seg å være forskjellige fra de av enten planktoniske eller biofilmceller 5,24,25,26; Fenotypene av bakterier spredt in vivo har imidlertid ennå ikke blitt beskrevet. Hvis dispergeringsmidler skal brukes terapeutisk, er det viktig å bestemme effekten, samt forstå fenotypen som disse cellene vedtar. I tillegg kan denne protokollen brukes til å studere hvordan variasjoner i EPS-struktur eller endring av signalveier påvirker spredning. For eksempel kan spredning av P. aeruginosa-stammer med mutasjoner i forskjellige eksopolysakkaridkomponenter (f.eks. Pel, Psl, Alginate) sammenlignes med den av ville stammer.

Samlet sett kan denne protokollen deles inn i fire hoveddeler: (1) etablere en infeksjon (2) administrere behandling eller (3) samle infisert vev for ex vivo-behandling og (4) bestemme spredningseffekt. Den kritiske delen av § 1 er vellykket etablering av infeksjonen i sårsengen. Hvis luminescerende stammer, som krever antibiotika for å opprettholde plasmidstabilitet, brukes, er det viktig å legge til passende antibiotika når man dyrker stammene som forberedelse til infeksjon. Det bør også vurderes at plasmidene ikke kan opprettholdes under infeksjon i dyret (uten antibiotikatrykk), og dermed bør vurdering av bakteriell belastning ikke helt stole på IVIS-avbildning, men bekreftes av CFU. Den inokulerende dosen er også et kritisk skritt for å initiere infeksjon. For P. aeruginosa og S. aureus brukes vanligvis en infeksjonsdose på 104-5 CFU, men den optimale dosen kan variere avhengig av bakterie- og musearter som brukes.

Den kritiske delen av § 2 er å sikre at sårsengen er dekket av bandasjen gjennom utviklingen av infeksjon og behandling. Hvis bandasjen ikke festes riktig, kan behandlingen lekke fra sårsengen og kan være ineffektiv. Bandasjen er også viktig for å holde sårsengen beskyttet mot potensielle forurensninger, og svekke kontraktil helbredelse av musen, noe som er viktig for å etterligne menneskelig sårheling. Til slutt er den kritiske delen av § 3 å håndtere de innsamlede prøvene på riktig måte. For å liste opp CFU, bør det infiserte vevet skylle med 1 ml PBS før tilsetning av ytterligere 1 ml PBS for homogenisering. Mer fibrøse organer, som lungene, kan kreve mer grundig homogenisering.

De viktigste begrensningene i disse protokollene inkluderer den nødvendige nøye overvåkingen av bandasjen og bruken av IVIS til bildespredning og gjøre antagelser om spredningseffekt. For langsiktige studier kan re-vekst av pels være problematisk fordi det kan hindre bandasjetilslutning til sårstedet. Bandasjer krever ofte utskifting, og fjerning kan føre til utilsiktet debridering av såret og mulighet for forurensning. For å visualisere spredning fra sårsengen, må en bioluminescent bakteriestamme brukes. Hvis bakteriearter av interesse mangler en bioluminescent reporter, er dette alternativet ikke mulig. En annen begrensning er potensialet i spredningsbehandlingen for å indusere bakterieemi, noe som kan føre til musens død. Vi har imidlertid sett at spredte celler effektivt kan drepes av antibiotika in vivo7.

De representative resultatene som er avbildet i figur 2 illustrerer en begrensning av IVIS for måling av spredningseffekt. For det første må en lysende stamme av bakterielle arter av interesse brukes. Stammen må produsere et lysende signal som er lyst nok til å oppdage gjennom flere lag med vev for å visualisere spredning fra sårsengen til andre deler av kroppen. Det har blitt antydet at minst 106 bakterier er pålagt å produsere et lysende signal sterkt nok til å oppdage av IVIS27. Det er også beskrevet en reduksjon i lystetthetssignalet når bakterier går inn i stasjonær fase28. Dette kan føre til en frakobling mellom ROIer målt og CFU-nummerert29. Denne begrensningen kan føre til falske antagelser når det ikke er et signal sterkt nok til deteksjon, men bakterier er fortsatt til stede. Som vist i figur 2Bresulterte PBS og 10% GH-behandlinger i økt luminescens etter behandling. Dette er en nysgjerrig og konsekvent observasjon, som også har blitt sett etter spredning av celler in vitro (Cláudia Marques, Binghamton University, personlig kommunikasjon). Det er mulig at den fysiske forstyrrelsen av biofilmen fra administrering av behandlingen bare sprer ut celler som var tett pakket, noe som resulterer i økt lyssignal. Alternativt kan dispersal behandling "vekke" biofilmceller som tidligere var metabolsk inaktive, noe som resulterte i økt bioluminescens. Uansett er det avgjørende å bekrefte resultatene av IVIS-avbildning med CFU-data. Til slutt er det en heterogen fordeling av bakterier i infisert sårvev30,31. Derfor, hvis vevet er delt ex vivo for å gi flere prøver, bør det ikke antas at bakteriebelastningen i hver sårseksjon er identisk.

Det er modifikasjoner og feilsøking som kan utføres for å overvinne begrensningene til disse modellene. For det første kan det hende at tiden som er tildelt for eksponering av depilatorisk krem, må justeres avhengig av museartene som brukes. For eksempel brukes 7 min vanligvis for sveitsiske Webster-mus, mens C57BL / 6 mus kan trenge opptil 10 min eksponering for å fjerne pelsen. Dette avhenger selvfølgelig også av produktet som brukes, og eksponeringstidene må aldri overstige produsentens instruksjoner. Hvis en lang studie (4+ dager) utføres, kan det hende at depilatorisk krem må påføres på nytt for å fjerne re-dyrket pels og sikre en riktig forsegling av bandasjen. Deretter, hvis et lysende signal er vanskelig å oppdage, kan eksponeringstiden økes under IVIS-avbildning. Den inokulerende dosen og infeksjonstiden kan også justeres. Det er viktig å bruke en infeksjonsdose som ikke er for høy at den overvelder musen, men er heller ikke for lav at bakteriene umiddelbart blir ryddet av immunresponsen.

I denne protokollen beskriver vi behandling av 48 h-gamle sårinfeksjoner med dispergeringsmidler, da dette er et tidspunkt vi har vist infeksjoner forårsaket av P. aeruginosa og / eller S. aureus er etablert og biofilm-assosiert 12,15,16. Men avhengig av bakteriearter, kan andre tidspunkter være mer optimale. Ideelt sett bør bakteriebelastningen i såret platå når en infeksjon er etablert. For eksempel har vi sett at med både P. aeruginosa og S. aureus når bakteriebelastningen i såret ca. 108 CFU / g vev med 48 timer etter infeksjon og forblir på det nivået til sårlukking. Figur 1 illustrerer behandling med en oppløsning som krever 3 x 30 min vask. Men hvis dispergeringsmiddelet var i en annen form, ville vaskene ikke være nødvendige. For eksempel kan en krem, gel eller konstruert dressing ganske enkelt plasseres på toppen av sårsengen. Til slutt kan såret bli smittet på en rekke måter, inkludert inokulering av planktoniske bakterieceller, preformede biofilmer12, eller til og med infisert debridementvev fra et annet dyr eller menneske19,32. Vi har sett at transplantasjon av en forhåndsformet biofilm- eller debrideringsprøve på sårsengen resulterer i mer vellykkede polymikrobielle infeksjoner enn når flere arter er inokulert i deres planktoniske form12.

Samlet sett beskriver disse protokollene metoder for å studere biofilmspredning og evaluering av terapeutiske biofilmspredningsmidler. Disse modellene tillater utvikling av komplekse polymikrobielle biofilmrelaterte infeksjoner som etterligner klinisk relevante menneskelige infeksjoner. Vårt håp er at disse protokollene vil bli brukt og raffinert for å fremme utviklingen av antibiofilm dispergeringsmidler for terapeutisk bruk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Institutes of Health (R21 AI137462-01A1), Ted Nash Long Life Foundation, Jasper L. og Jack Denton Wilson Foundation og Department of Defense (DoD MIDRP W0318_19_NM_PP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Fisher 14823434 Use to complete serial dilutions of samples
25G 58 in needle Fisher 14823434 Attaches to 1 mL syringe
Ampicillin Sodium Salt Fisher BP1760-5 Make a 50 mg/ mL stock solution and add 100 µL to 10 mL of LB broth for both overnight and subculture
Amylase MP Biomedicals 2100447 Make a 5% w/v solution, vortex- other dispersal agents can be used
Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL) ZooPharm RX216118 Use as pain mainagement- may use other options
Cellulase MP Biomedicals 2150583 Add 5% w/v to the 5% w/v amylase solution, vortex, activate at 37 °C for 30 min- other dispersal agents can be used
Depilatory cream Walmart 287746 Use a small amount to massage into the hair follicles on the back of the animal and allot 10 min to remove hair
Dressing Forceps, Serrated Tips Fisher 12-460-536 Can use other forms of forceps
Erlenmeyer flasks baffled 125 mL Fisher 101406 Use to grow overnights and sub-cultures of bacteria
FastPrep-24 Benchtop Homogenizer MP Biomedicals 6VFV9 Use 5 m/s for 60 s two times to homogenize tissue
Fatal Plus Vortech Pharmaceuticals 0298-9373-68 Inject 0.2 mL intraperitaneal for each mouse
Homogenizing tubes (Bead Tube 2 mL 2.4 mm Metal) Fisher 15340151 Used to homogenize samples for plating
Isoflurane Diamond Back Drugs
Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution C-IIIN Sigma Aldrich K4138 Use as anasethia- other options can also be utilized to gain a surgical field of anasethia
LB broth, Miller Fisher BP1426-2 Add 25 g/L and autoclave
Lidocaine 2% Injectable Diamond Back Drugs 2468 Inject 0.05 mL through the side of the marked wound bed area so it is deposited in the center of the mark. Allot 10 min prior to cutting
Meropenem Sigma Aldrich PHR1772-500MG Make 5 mg/mL to add to the GH solution to apply topically and a 15 mg/mL solution to inject intraperitaneal 4 h prior and 6 h post-treatment
Non-sterile cotton gauze sponges Fisher 13-761-52 Use to remove the depilatory cream
PAO1 pQF50-lux bacterial strain Ref [13] N/A PAO1 pgF50-lux was used as the P. aeruginosa strain of interest in this paper's representative results
Petri dishes Fisher PHR1772-500MG
Phosphate Buffer Saline 10x Fisher BP3991 Dilute 10x to 1x prior to use
Polyurethane dressing Mckesson 66024007 Cut the rounded edge off and cut the remaining square into 4 equal sections
Pseudomonas isolation agar VWR 90004-394 Add 20 mL/L of glycerol and 45 g/mL to water, autoclave, and pour 20 mL into petri dishes
Refresh P.M. Walmart Use on eyes to reduce dryness during procedure.
Sterile Alcohol Prep Pads Fisher 22-363-750 Use to clean the skin immediately prior to wounding to disinfect the area
Straight Delicate Scissors Fisher 89515 Can also use curved scissors
Swiss Webster mice Charles River 551NCISWWEB Other mice strains can be used
Syring Slip Tip 1 mL Fisher 14823434 Used to administer drugs and enzyme treatment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rossolini, G. M., Arena, F., Pecile, P., Pollini, S. Update on the antibiotic resistance crisis. Current Opinion in Pharmacology. 18, 56-60 (2014).
  2. Stewart, P. S. Antimicrobial Tolerance in Biofilms. Microbiology Spectrum. 3 (3), (2015).
  3. Flemming, H. C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).
  4. Rumbaugh, K. P. How well are we translating biofilm research from bench-side to bedside. Biofilm. 2 (100028), (2020).
  5. Rumbaugh, K. P., Sauer, K. Biofilm dispersion. Nature Reviews Microbiology. 18 (10), 571-586 (2020).
  6. Fleming, D., Chahin, L., Rumbaugh, K. Glycoside Hydrolases Degrade Polymicrobial Bacterial Biofilms in Wounds. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (2), (2017).
  7. Fleming, D., Rumbaugh, K. The Consequences of Biofilm Dispersal on the Host. Scientific Reports. 8 (1), 10738 (2018).
  8. Baker, P., et al. Exopolysaccharide biosynthetic glycoside hydrolases can be utilized to disrupt and prevent Pseudomonas aeruginosa biofilms. Science Advances. 2 (5), 1501632 (2016).
  9. Redman, W. K., Welch, G. S., Rumbaugh, K. P. Differential Efficacy of Glycoside Hydrolases to Disperse Biofilms. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 379 (2020).
  10. Zhu, L., et al. Glycoside hydrolase DisH from Desulfovibrio vulgaris degrades the N-acetylgalactosamine component of diverse biofilms. Environmental Microbiology. 20 (6), 2026-2037 (2018).
  11. Fell, C. F., Rumbaugh, K. P. Antibacterial Drug Discovery to Combat MDR. , 527-546 (2019).
  12. Dalton, T., et al. An in vivo polymicrobial biofilm wound infection model to study interspecies interactions. PLoS One. 6 (11), 27317 (2011).
  13. Wolcott, R. D., et al. Biofilm maturity studies indicate sharp debridement opens a time- dependent therapeutic window. Journal of Wound Care. 19 (8), 320-328 (2010).
  14. Korgaonkar, A., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. Community surveillance enhances Pseudomonas aeruginosa virulence during polymicrobial infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (3), 1059-1064 (2013).
  15. Watters, C., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilms perturb wound resolution and antibiotic tolerance in diabetic mice. Medical Microbiology and Immunology. 202 (2), 131-141 (2013).
  16. Watters, C., Everett, J. A., Haley, C., Clinton, A., Rumbaugh, K. P. Insulin treatment modulates the host immune system to enhance Pseudomonas aeruginosa wound biofilms. Infection and Immunity. 82 (1), 92-100 (2014).
  17. Turner, K. H., Everett, J., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. Requirements for Pseudomonas aeruginosa acute burn and chronic surgical wound infection. PLOS Genetics. 10 (7), 1004518 (2014).
  18. Harrison, F., et al. A 1,000-Year-Old Antimicrobial Remedy with Antistaphylococcal Activity. mBio. 6 (4), 01129 (2015).
  19. Wolcott, R., et al. Microbiota is a primary cause of pathogenesis of chronic wounds. Journal of Wound Care. 25, Sup10 33-43 (2016).
  20. Ibberson, C. B., et al. Co-infecting microorganisms dramatically alter pathogen gene essentiality during polymicrobial infection. Nature Microbiology. 2, 17079 (2017).
  21. Fleming, D., et al. Utilizing Glycoside Hydrolases to Improve the Quantification and Visualization of Biofilm Bacteria. Biofilm. 2, (2020).
  22. DeLeon, S., et al. Synergistic interactions of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in an in vitro wound model. Infection and Immunity. 82 (11), 4718-4728 (2014).
  23. Darch, S. E., et al. Phage Inhibit Pathogen Dissemination by Targeting Bacterial Migrants in a Chronic Infection Model. mBio. 8 (2), (2017).
  24. Chua, S. L., et al. Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles. Nature Communications. 5, 4462 (2014).
  25. Beitelshees, M., Hill, A., Jones, C. H., Pfeifer, B. A. Phenotypic Variation during Biofilm Formation: Implications for Anti-Biofilm Therapeutic Design. Materials (Basel). 11 (7), (2018).
  26. Sauer, K., et al. Characterization of nutrient-induced dispersion in Pseudomonas aeruginosa PAO1 biofilm. J Bacteriol. 186 (21), 7312-7326 (2004).
  27. Kuklin, N. A., et al. Real-time monitoring of bacterial infection in vivo: development of bioluminescent staphylococcal foreign-body and deep-thigh-wound mouse infection models. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (9), 2740-2748 (2003).
  28. Francis, K. P., et al. Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon. Infection and Immunity. 69 (5), 3350-3358 (2001).
  29. Kadurugamuwa, J. L., et al. Noninvasive optical imaging method to evaluate postantibiotic effects on biofilm infection in vivo. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (6), 2283-2287 (2004).
  30. Wimpenny, J., Manz, W., Szewzyk, U. Heterogeneity in biofilms. FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 661-671 (2000).
  31. Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).
  32. Tipton, C. D., et al. Chronic wound microbiome colonization on mouse model following cryogenic preservation. PLoS One. 14 (8), 0221656 (2019).

Tags

Immunologi og infeksjon utgave 174 Ex vivo In vivo biofilm spredning sårinfeksjon antibiofilmmiddel Pseudomonas aeruginosa
Vurderer biofilmspredning i murine sår
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Redman, W. K., Welch, G. S.,… More

Redman, W. K., Welch, G. S., Rumbaugh, K. P. Assessing Biofilm Dispersal in Murine Wounds. J. Vis. Exp. (174), e62136, doi:10.3791/62136 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter