Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Vurdering biofilm spredning i Murine Sår

Published: August 7, 2021 doi: 10.3791/62136
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1,2,3
1Department of Surgery, Texas Tech University Health Sciences Center, 2Immunology and Molecular Microbiology, Texas Tech University Health Sciences Center, 3TTUHSC Surgery Burn Center of Research Excellence, Texas Tech University Health Sciences Center
* These authors contributed equally

Summary

Her beskriver vi ex vivo- og in vivo-metoder til vurdering af bakteriespredning fra en sårinfektion hos mus. Denne protokol kan anvendes til at teste effekten af aktuelle antimikrobielle og antibiofilmbehandlinger eller til at vurdere spredningskapaciteten af forskellige bakteriestammer eller arter.

Abstract

Biofilm-relaterede infektioner er impliceret i en bred vifte af kroniske tilstande såsom ikke-helbredende diabetisk fodsår, kronisk bihulebetændelse, tilbagevendende otitis medier, og mange flere. Mikrobielle celler i disse infektioner er beskyttet af et ekstracellulært polymerstof (EPS), som kan forhindre antibiotika og vært immunceller i at rydde infektionen. For at overvinde denne hindring, efterforskere er begyndt at udvikle spredningsmidler som potentielle terapeutiske. Disse midler målrette forskellige komponenter i biofilm EPS, svække strukturen, og indlede spredning af bakterier, som teoretisk kan forbedre antibiotika potens og immun clearance. For at bestemme effekten af spredningsmidler til sårinfektioner har vi udviklet protokoller, der måler biofilmspredning både ex vivo og in vivo. Vi bruger en musekirurgisk excision model, der er blevet godt beskrevet til at skabe biofilm-associerede kroniske sårinfektioner. For at overvåge spredning in vivoinficerer vi sårene med bakteriestammer, der udtrykker luciferase. Når modne infektioner er etableret, overrisler vi sårene med en opløsning, der indeholder enzymer, der nedbryder komponenter i biofilmen EPS. Vi overvåger derefter placeringen og intensiteten af det selvlysende signal i såret og filtreringsorganerne for at give oplysninger om det opnåede spredningsniveau. Til ex vivo-analyse af biofilmspredning nedsænkes inficeret sårvæv i biofilmnedbrydende enzymopløsning, hvorefter den bakterielle belastning, der er tilbage i vævet, i forhold til bakteriebelastningen i opløsning vurderes. Begge protokoller har styrker og svagheder og kan optimeres til at hjælpe præcist med at bestemme effekten af spredningsbehandlinger.

Introduction

Stigningen i antibiotikaresistens på verdensplan fører til mangel på antibiotika muligheder for at behandle en række bakterielle infektioner1. Ud over antibiotikaresistens kan bakterier få antibiotikatolerance ved at vedtage en biofilm-associeret livsstil2. En biofilm er et fællesskab af mikroorganismer, der er beskyttet af en matrix af polysaccharider, ekstracellulært DNA, lipider og proteiner3, kollektivt kaldet det ekstracellulære polymere stof (EPS). Som antibiotikaresistens krisen fortsætter, nye strategier, der forlænger brugen af, eller forstærke effekten af antibiotika er hårdt tiltrængt. Antibiofilmmidler er en lovende løsning4.

Blandt de forskellige antibiofilmstrategier, der er blevet foreslået, er udnyttelsen af spredningsmidler, der er målrettet mod forskellige komponenter i biofilmEN EPS, på forkant med terapeutisk udvikling5. Glycoside hydrolaser (GH) er en sådan klasse af spredningsmiddel. GH er en stor klasse af enzymer, der katalyserer kavalergangen af forskellige bindinger inden for polysaccharider, der giver strukturel integritet til EPS. Vores gruppe, såvel som andre, har vist, at GH effektivt kan nedbryde biofilm, fremkalde spredning og forbedre antibiotikaeffektiviteten for en række forskellige bakteriearter, både in vitro og in vivo6,7,8,9,10,11.

Med en stigende interesse for spredning af biofilm er det vigtigt at udvikle effektive metoder, der vurderer spredningseffektiviteten. Her præsenterer vi en detaljeret protokol til behandling af biofilmrelaterede sårinfektioner med et spredningsmiddel hos mus og vurdering af spredningseffektivitet, in vivo og ex vivo. Det overordnede mål er at levere effektive metoder, der kan bruges med prækliniske modeller til at måle biofilmspredning effektivt.

En murin kirurgisk excision infektion model blev brugt i disse undersøgelser for at etablere en biofilm-associeret infektion. Vi har brugt denne model i over 15 år og offentliggjort vores observationer i vid udstrækning7,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. Generelt er dette en ikke-dødelig infektion model, hvor bakterier forbliver lokaliseret til sårbunden og er biofilm-associeret (bakterier ses i aggregater omgivet af EPS), oprettelse af en kronisk infektion, der varer op til 3 uger. Men hvis mus er immunkompromitterede (f.eks. med type 1-diabetes), kan de blive mere modtagelige for at udvikle en dødelig systemisk infektion i denne model.

I denne rapport giver vi protokoller til vurdering af spredningen af bakterier fra et sår, både in vivo og ex vivo. Begge protokoller kan bruges til at undersøge effekten af et spredningsmiddel og have deres egne styrker og svagheder. For eksempel kan vurdering af spredning in vivo give vigtige realtidsoplysninger om spredning af bakterier til andre dele af kroppen efter spredning, og hvordan værten reagerer. På den anden side kan det være mere ønskeligt at vurdere spredningsudsnit til screening af flere agenser, doser eller formuleringer, da vævet kan opdeles i flere sektioner, der kan testes separat, hvilket reducerer antallet af mus, der kræves. Ved vurdering af flere agenter måler vi typisk spredning først in vitro som tidligere beskrevet 6,9,22. Derefter tester vi den mest effektive ex vivo- og reserve in vivo-testning for et begrænset antal meget lovende stoffer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne dyreprotokol blev gennemgået og godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee of Texas Tech University Health Sciences Center (protokolnummer 07044). Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i vejledningen for pleje og brug af forsøgsdyr fra National Institutes of Health.

1. Forberedelse af bakterier til museinfektioner

BEMÆRK: Her beskriver vi kun inficere mus med Pseudomonas aeruginosa. Andre bakteriearter kan dog anvendes til at forårsage infektion. Bakteriestammer og materialer er beskrevet i materialeoversigten.

  1. Brug Pseudomonas aeruginosa wild-type stamme PAO1 transporterer luminescens plasmid pQF50-lux23 for disse eksperimenter som tidligere beskrevet7.
  2. Der dyrkes P. aeruginosa-stammer i forvirrede Erlenmeyer-kolber med rysten ved 200 omdrejninger i rpm i Luria-Bertani (LB) bouillon ved 37 °C i 16 til 20 timer. Der tilsættes en endelig koncentration på 100 μg/mL ampicillin til dag-til-dag-kulturen i PAO1(pQF50-lux) til vedligeholdelse af plasmidet.
  3. Subkultur P. aeruginosa ved at tilsætte 100 μL af nattens kultur til en Erlenmeyer kolbe indeholdende 10 mL LB bouillon med en endelig koncentration på 100 μg/mL ampicillin. Derefter vokses i 2-2,5 timer ved 37 °C med rysten, til en OD600 nm på 0,4, og derefter serielt fortyndes (1:10) tre gange for en inficerende dosis på ca. 104 celler.

2. Fremstilling af biofilm dispergerede enzym

BEMÆRK: Til denne undersøgelse bruger vi en 10% opløsning af lige dele amylase og cellulase (5% af hver), som vil blive omtalt som "GH", til spredningsbehandling.

  1. Brug en 10% GH opløsning (w/v) af amylase (fra Bacillus subtilis)og svampecelleulase (fra Aspergillus niger)fortyndet i 1x fosfat buffer saltvand (PBS). Brug PBS som køretøjets kontrolbehandling.
  2. Varm alle behandlinger til 37 °C i 30 minutter for enzymaktivering.

3. Forsøgsdyr og præoperativ opsætning

  1. Husmus, 5 kuldkammerater pr. bur, under miljøkontrollerede forhold, med 12 timers lys/mørke cyklusser og ordentlig adgang til mad og vand.
  2. Brug helst kvindelige schweiziske Webster-mus, mellem 8 og 10 uger gamle.
  3. Veje mus for at bestemme den korrekte mængde anæstesi til at administrere.
  4. Anæstesi gives ved intraperitoneal injektion på 100 mg/kg ketamin 10 mg/kg xylazin.
  5. Påfør øjencreme (f.eks. Opdater P.M.) forsigtigt på øjet ved hjælp af en vatpind for at reducere tørhed.
  6. Overvåg fysiologiske parametre, herunder åndedrætsfrekvens, hudfarve og kropstemperatur under hele operationen.

4. Dorsal fuld tykkelse excision kirurgi

  1. Vurder kirurgisk plan af anæstesi ved tå knivspids og overvågning af åndedrætsfrekvens og indsats. Barber dorsaloverfladen og påfør en depilatory creme i 10 minutter (eller som pr. produktvejledning), hvorefter den forsigtigt fjernes, hvilket sikrer, at huden var tør.
  2. Til smertebehandling skal der gives 0,05 mL lidocain subkutant ind i det område, der skal afspørppes, og der tilføres 0,02 mL buprenorphin subkutant i halsen. Vent 10 minutter for at sikre, at smertebehandling blev nået.
  3. Før udskæring desinficeres rygoverfladen ved hjælp af en alkoholpind og tegnes en cirkel med en diameter på 1,5 cm mod den bageste del af ryggen. Opretholde et sterilt kirurgisk felt under hele proceduren og brugte autoklaveret instrumenter og sterile handsker. For at begrænse kontaminering skal du udføre operationen af en tændt Bunsen-brænder og bruge rent værktøj til hvert dyr.
  4. Administrere en fuld-tykkelse, excisional hud sår til niveauet af panniculus muskel med kirurgisk saks.
  5. Efter udskæring skal du straks dække sår med en semipermeable polyurethandressing.
  6. Der injiceres ca.10 4 CFU bakterier i 100 μL PBS under bandagen på sårbunden for at fastslå en infektion.
    BEMÆRK: Sår kan også være inficeret med flere arter af bakterier og/eller svampe samtidigt eller ved at placere forformede biofilm12eller endda debridementvæv udvundet fra patienter19på sårbunden.
  7. Efter infektion skal du placere mus i bur med varmepuder og overvåge, indtil de genvandt deres retsrefleks.
    BEMÆRK: Sørg for, at mus ikke bliver kolde, da dette kan føre til døden.
  8. Fastslå sårinfektioner i 48 timer.
  9. Undersøg klæbende forbindinger dagligt for tårer og områder med manglende overholdelse og udskiftes om nødvendigt.

5. Spredning af vivo-spredning

BEMÆRK: Her beskriver vi administrationen af spredningsmidlerne ved at anvende en række 3 aktuelle sårvandingsløsninger (Figur 1). Protokollen kan dog tilpasses til andre typer levering, såsom anvendelse af geler, cremer eller dressinger.

  1. Placer mus under isoflurane anæstesi (ved 3% og 1 L per minut af ilt), mens administrere behandlingerne.
  2. Tre 1 mL sprøjter fremstilles med 25 G nåle, der indeholder 200 μL behandling for hver mus.
  3. Der injiceres 200 μL enzymopløsning eller PBS-kontrol på såret ved forsigtigt at løfte og klemme huden med pincet, lidt over såret mod dyrets hoved. Gennembor forsigtigt sprøjten gennem den løftede hud og injicerer langsomt opløsningen mellem dressingen og sårsengen. Den dressing, der anvendes i denne undersøgelse, klæber ofte til både sårbunden og det omgivende væv.
    1. For at sikre, at hele sårbunden er dækket af opløsning, skal du forsigtigt hæve bandagen med pincet og trække den væk fra sårbunden, mens du langsomt injicerer opløsningen.
  4. Efter behandling skal du placere mus tilbage i deres bur i 30 minutter.
  5. Efter 30 minutters udsættelse for behandlingen bedøves musene med isoflurane igen, og opløsningen aspireres med en sprøjte, og sørg for at punktere i samme område som før.
    BEMÆRK: Denne indsugningsopløsning indeholder spredte bakterieceller, som kan gemmes til forskellige downstream-analyser.
  6. Administrere den anden og tredje vanding behandlinger som den første, ved hjælp af en ny sprøjte hver gang.

6. In vivo spredning billeddannelse og analyse

BEMÆRK: Hvis en selvlysende stamme af bakterier udnyttes til at indlede infektion, kan et In Vivo Imaging System (IVIS) bruges til at visualisere spredning fra sårbunden.

  1. Billede mus umiddelbart før og efter behandlingen og ved 10 og 20 timer efter behandling (figur 2 og supplerende figur 1).
  2. Udfør billeddannelse, mens mus er under anæstesi, ved at placere dem individuelt i IVIS og billeddannelse hver for 5 s ved en bølgelængde på 560 nm. Gem billeder til yderligere analyse.
    BEMÆRK: Optimal bølgelængde og eksponeringstid afhænger af den anvendte reporter og IVIS-instrumentet og billedbehandlingssoftwaren.
  3. Til analyse skal du åbne billeder i IVIS-softwaren og vælge det område, der skal analyseres i værktøjspaletten.
  4. For at tage højde for baggrunden skal du placere en cirkel på baggrunden af et foto og derefter placere cirklen i samme størrelse oven på sårets seng for hver mus.
  5. Hvis du vil overføre måleværdier, skal du vælge Vis -> ROI-målinger (Region of Interest) og overføre måletabellen til et regneark. Træk baggrundscirklen fra hver af målingerne af sårbunden for at beregne luminescensen for hver prøve. Beregn procent luminescens ændret af:
    ROI pre-behandling-ROI efterbehandling / ROI forbehandling) x 100.
    BEMÆRK: Kontrol og behandlede mus bør analyseres samtidigt for at normalisere for variabler, der kan påvirke billedopsamling eller udstråling.

7. Vurdering af spredning ved at bestemme CFU

  1. Humant aflive mus ved intraperitoneal injektion af 0,2 mL pentobarbital natrium (f.eks Fatal Plus) under anæstesi med 100 mg/kg ketamin 10 mg/kg xylazin.
  2. Høst sårsengvæv ved først forsigtigt at fjerne dressingen med sterile pincet og derefter skære rundt om sårbundens omkreds med steril kirurgisk saks. Løft forsigtigt den ene ende af sårsengen med tang, mens du bruger en saks til at skære/drille prøven væk fra muskellaget.
  3. Væv anbringes fra sårbunden i formærket og forvejet 2 mL homogeniseringsrør, der indeholder 1 mL PBS. Afveje rørene igen efter indsættelse af prøverne, og derefter forsigtigt invertere 3-5 gange for at skylle eventuelle spredte eller løst klæbede bakterier, og fjern PBS. Tilsæt 1 mL frisk PBS.
  4. For at høste milterne skal du placere mus i en liggende anatomisk position og fastgøre ved at fastgøre deres ekstremiteter til en dissektionsoverflade. Det område, der skal dissekeres med 70 % ethanol, sættes i blød for at desinficere området og forhindre pelsen i at forurene prøven.
  5. Lav forsigtigt et lille snit vinkelret på midterlinjen med kirurgisk saks i underlivets dermis, og sørg for at trække huden op og væk fra de indre organer. Fortsæt snittet indvendigt langs midterlinjen, indtil brystbenet blev nået. Når peritoneal hulrum blev udsat, og de indre organer var synlige, forsigtigt adskille milten fra bindevæv og sted i en separat homogenisering rør.
  6. Vej milt og skyl med PBS, som beskrevet for sårsengsvævet.
    BEMÆRK: Andre organer af interesse kan ligeledes høstes.
    1. Når du foretager det første snit, skal du sørge for at undgå at punktere tarmene eller andre organer.
  7. Der homogeniseres prøver i 2 mL forfyldte perlemøllerør ved hjælp af en benchtop homogenisator ved 5 m/s i 60 s, to gange.
  8. For at opregne CFU fortyndes prøver og spotplade på selektiv agar. Til seriel fortynding pipettes 100 μL af prøven til 900 μL PBS i et 1,5 mL rør, vortex og gentages 5 gange. Pipetter 10 μL af hver fortynding på en agarplade som vist i figur 3.
    BEMÆRK: Hvis der kræves mere præcis CFU-kvantantitation, spredes 100 μL af hver fortynding af prøven over separate agarplader.

8. Ex vivo-vurdering af spredning (figur 4)

  1. Sårmus og inficere med ca 104 PAO1 som beskrevet ovenfor, og derefter aflive 48 timer efter infektion.
  2. Fjern forsigtigt dressingen med pincet, ved hjælp af steril teknik og uden at forstyrre sårbunden.
  3. Brug steril kirurgisk saks til at skære omkredsen af sårsengen væk fra den uinficerede hud ved at bruge pincet til at løfte den ene ende af sårbunden og saks til punktafgift inficeret sårvæv fra muskellaget nedenunder og omkringliggende uinficeret væv. Del sårsengsprøver op i lige store dele, eller brug hele.
  4. Sårvæv anbringes i tomme, forvægtede 2 mL perlemølle homogeniseringsrør. Derefter vejes rørene igen efter tilsætning af prøven. Vægten af stikprøven beregnes ved at:
    vægt efter tilsætning af prøve - vægt, før du tilføjer prøve.
  5. Tilsæt 1 mL PBS, og vend forsigtigt røret 3-5 gange for at skylle prøven og fjerne eventuelle planktoniske celler. Fjern og kassér PBS.
  6. Der tilsættes 1 mL GH-behandling (eller PBS som negativ kontrol) til prøven, og der inkuberes i 2 timer ved 37 °C med omrystning ved 80 omdrejninger i minuttet.
  7. Biofilmens dispergøringsopløsning fjernes og anbringes i et separat 1,5 ml rør. Dette indeholder de spredte celler.
  8. Der tilsættes 1 mL PBS til den resterende vævsprøve, og vend forsigtigt 3-5 gange for at skylle eventuelle resterende spredte celler af. Fjern og kassér PBS.
  9. Der tilsættes 1 mL PBS til det resterende væv og homogeniseres ved 5 m/s i 60 s ved hjælp af en benchtop homogenisator.
  10. Opløsningen af de spredte celler og den homogeniserede vævsprøve fortyndes serielt ved at anbringe 100 μL prøve i 900 μL PBS i et 1,5 ml rør og gentage fem gange for i alt 6 fortyndinger.
  11. Punktplade 10 μL af hver fortynding på medieselektiv agar (f.eks. Pseudomonas Isolation Agar for P. aeruginosa)og inkuber pladerne ved 37 °C natten over.
  12. Tæl CFU og beregn 'procent spredt' som (CFU i supernatant / (CFU i supernatant + CFU i biofilmvæv)) x 100.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I dette eksperiment blev 8-10 uger gamle kvindelige schweiziske Webster mus smittet med 104 CFU af PAO1 transporterer luminescens plasmid pQF50-lux. Som beskrevet ovenfor fik en infektion lov til at fastslå for 48 timer før administration af 3 x 30 min behandlinger af enten PBS (køretøjskontrol) eller 10% GH (behandling) for at fordøje biofilm EPS. Mus blev afbildet forbehandling, direkte efter behandling (0 h) og ved 10 timer og 20 timer efter behandlingen. Figur 2A og supplerende figur 1 viser en etableret infektion i sårbunden, der genererer et lyst bioluminescerende signal. Spredningen af bakterier ud af sårbunden kan visualiseres umiddelbart efter GH-behandlingen (0 timer), men ikke efter PBS-behandling. Det skal bemærkes, at vi i tidligere undersøgelser opdagede bakterier i blodet og milten så tidligt som 5 timer efter GH-behandling7. Bakteriel spredning i organerne kan også ses ved at placere musen på sin side til billeddannelse, som vist i det nederste panel af Figur 2A.

Billeder fra både PBS- og GH-behandlede mus viste en stigning i selvlysende signal ved 20 timers efterbehandling sammenlignet med forbehandling (Figur 2B). Vi hypotese dette skyldes den mekaniske forstyrrelse af biofilm forårsaget af kunstvanding af opløsning. Ved 20 timers efterbehandling blev musene aflivet, og sårbed og milt blev indsamlet for at opregne CFU / gram væv. Mens bakteriebelastningerne i sårbedene var ens (Figur 2C), blev bakterier kun påvist i milten hos GH-behandlede mus (Figur 2D), hvilket tyder på spredt spredning af de spredte bakterier.

Tidligere har vi vist, at GH-behandling kan bryde op aggregater af bakterier, forbedre CFU tæller21. Dette kan forklare den lille stigning i bakteriebelastningen i sårbedene hos de GH-behandlede mus. Endelig, selv om GH-behandlede sår senge havde lidt højere CFU / gram, der var en lavere procent bioluminescerende forandring. Disse resultater tyder på vigtigheden af at bekræfte luminescens med CFU tæller. Disse repræsentative resultater giver et eksempel på data, der kan indsamles ved hjælp af de protokoller, der er beskrevet ovenfor.

Figure 1
Figur 1. Etablering af biofilmrelaterede sårinfektioner og vurdering af spredningsmidlers effekt in vivo. Forbindinger blev kontrolleret for tårer eller tab af vedhæftning til musens hud før behandling. Kompromitterede forbindinger blev erstattet. Mus blev placeret under anæstesi umiddelbart før behandlingsadministrationen. 200 μL enzymopløsning eller en køretøjskontrol blev sprøjtet ind i rummet mellem sårbunden og forbindingen. Forbindingen blev forsigtigt hævet ved hjælp af pincet for at sikre, at hele såret var mættet i opløsning. Behandlingen blev efterladt på sårbunden i 30 minutter. Efter 30 minutter blev behandlingen indsuget med en sprøjte, og yderligere 200 μL behandling blev tilføjet. Dette blev gentaget for i alt 3 behandlinger. For at måle spredning i realtid blev mus afbildet ved hjælp af IVIS før behandling, umiddelbart efter behandling (0 timer), 10 timer og 20 timer efter behandlingen. Ved 20 timers efterbehandling blev musene aflivet, og sårbedene og milterne blev indsamlet. Prøverne blev skyllet i PBS og derefter homogeniseret i frisk PBS to gange ved 5 m/s i 60 s. Prøverne blev derefter serielt fortyndet og spotbelagt. CFU blev optalt, og CFU/gram blev beregnet. Niveauet af spredning af bakterier fra såret kan enten ved vurderes af IVIS eller ved at bestemme antallet af CFU, der spredes systemisk til milten. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Repræsentative data viser, hvordan man vurderer spredning in vivo. Sår inficeret med 104 PAO1(pQF50-lux) i 48 timer blev behandlet med enten PBS eller 10% GH (biofilm dispergør enzymopløsning). PBS-behandling blev brugt som køretøjskontrol. Sårsenge blev behandlet med 3 x 30 minutters behandlinger. Mus blev afbildet ved hjælp af IVIS før behandling, umiddelbart efter behandling, 10 timer efter behandling og 20 timer efter behandlingen. Det skal bemærkes, at sidebillederne er fra forskellige PBS- og GH-behandlede mus end dem, der vises i billederne i ovenoverstøndelse (A). ROI'erne for hver forbehandlingssårseng og hver 20 timers sårseng efter behandling blev registreret. Procentvis ændring fra forbehandling blev beregnet som (ROI pre-treatment-ROI post-treatment/ ROI pre-treatment) x 100 (B). Ved 20 timers efterbehandling blev mus aflivet. Sårsenge og milt blev indsamlet og vejet for at bestemme henholdsvis CFU/gram (C og D). N=3. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Seriel fortynding og pletbelægning. Homogeniseret prøve blev hvirvlet, og 100 μL blev overført til et 1,5 mL Eppendorf-rør indeholdende 900 μL PBS. Prøven blev hvirvlet, og 100 μL blev overført til et andet 1,5 mL Eppendorf-rør med 900 μL PBS. Denne proces blev gentaget 5 gange. Begyndende med det sidste fortyndingsrør blev 10 μL prøven punkteret på agarpladen i punkt 10-8. Dette blev fortsat op til fortynding 10-3. Typisk, de 10-3 fortynding resulterer i en græsplæne af bakterier på stedet. Nogle organer, som har lave bakterielle belastninger, kan kræve spot plating op til 10-1 fortynding. Gentag dette for hver vævsprøve. Anbragte agarpladen i en inkubator ved 37 °C i 24-48 timer, eller tilstøm under forhold, der er optimale for de bakteriearter af interesse. For at optælle CFU skal du tælle individuelle kolonier ved den lavest mulige fortynding og formere sig med den relevante fortyndingsfaktor for at bestemme CFU/mL eller bruge vævsvægt til at beregne CFU/g væv. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4. Måling af spredning fra inficeret væv ex vivo. Mus blev aflivet, og det inficerede sårvæv blev aseptisk fjernet. Det inficerede væv blev placeret i en 2 mL perle mølle homogenisere rør og skylles kort med PBS. Der blev tilsat 1 mL dispergatorisk middel, og prøven blev inkuberet i 2 timer ved 37 °C med omrystning ved 80 omdrejninger i minuttet. Efter inkubation blev opløsningen, der indeholder de spredte celler, fjernet og placeret i et separat 1,5 ml rør. Det resterende væv blev skyllet med 1 mL PBS. 1 mL frisk PBS blev tilsat vævet og homogeniseret ved 5 m/s i 60 s. Enzymopløsningen og homogeniseret væv blev derefter serielt fortyndet og spotbelagt på selektiv agar. CFU blev opregnet og spredning blev beregnet som: CFU fra enzymopløsning / (CFU fra enzymopløsning + CFU fra væv) x 100. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 1. Måling in vivo spredning. Sår blev smittet med 104 PAO1(pQF50-lux) i 48 timer og derefter behandlet med enten PBS eller 10% GH (biofilm dispergør enzymopløsning). PBS-behandling blev brugt som køretøjskontrol. Sårsenge blev behandlet med 3 x 30 min vandingsbehandlinger. Mus blev afbildet ved hjælp af IVIS før behandling, umiddelbart efter behandling, 10 timer efter behandling og 20 timer efter behandlingen (A). Ved 20 timers efterbehandling blev mus aflivet. Sårsenge og milt blev indsamlet og vejet for at bestemme henholdsvis CFU/gram (B og C). N=3. Klik her for at hente denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her beskriver vi protokoller, der kan bruges til at studere effekten af biofilm dispergringsmidler. Disse protokoller kan let tilpasses til brug med forskellige typer spredningsmidler, bakteriearter eller ex vivo-prøver, herunder kliniske debridementprøver. Denne protokol giver også en klinisk relevant model til at indsamle og studere spredte bakterieceller. Det har vist sig, at fænotyperne af spredte bakterieceller adskiller sig fra dem, der findes i enten planktoniske celler eller biofilmceller 5,24,25,26; dog er fænotyperne af bakterier spredt in vivo endnu ikke beskrevet. Hvis dispergringsmidler skal anvendes terapeutisk, er det vigtigt at bestemme deres effektivitet samt forstå den fænotype, som disse celler vedtager. Derudover kan denne protokol bruges til at undersøge, hvordan variationer i EPS-struktur eller ændring af signalveje påvirker spredningen. For eksempel kan spredning af P. aeruginosastammer med mutationer i forskellige exopolysaccharidkomponenter (f.eks. Pel, Psl, Alginat) sammenlignes med spredningen af stammer af vildtype.

Samlet set kan denne protokol opdeles i fire hovedafsnit: 1) etablering af en infektion (2) administration af behandling eller (3) indsamling af inficeret væv til ex vivo-behandling og (4) bestemmelse af spredningseffektivitet. Den kritiske del af afsnit 1 er den vellykkede etablering af infektionen i sårbunden. Hvis selvlysende stammer, som kræver antibiotika for at opretholde plasmid stabilitet, bliver udnyttet er det bydende nødvendigt at tilføje de relevante antibiotika, når dyrkning af stammer som forberedelse til infektion. Det bør også tages i betragtning, at plasmiderne ikke må opretholdes under infektion i dyret (uden antibiotisk tryk), og vurderingen af bakteriebelastningen bør derfor ikke helt baseres på IVIS-billeddannelse, men bekræftes af CFU. Den vaccinerende dosis er også et kritisk skridt til at indlede infektion. For P. aeruginosa og S. aureus anvendes typisk en inficerende dosis på 104-5 CFU, men den optimale dosis kan variere afhængigt af de anvendte bakterie- og musearter.

Den kritiske del af afsnit 2 er at sikre, at sårbunden er dækket af dressingen under hele udviklingen af infektion og behandling. Hvis bandagen ikke klæbes korrekt, kan behandlingen lække fra sårbunden og kan være ineffektiv. Dressingen er også vigtig for at holde sårbunden beskyttet mod potentielle forurenende stoffer og forringe kontraktil heling med musen, hvilket er afgørende for at efterligne menneskelig sårheling. Endelig er den kritiske del af afsnit 3 korrekt at håndtere de indsamlede prøver. For at opregne CFU skal det inficerede væv skylles med 1 mL PBS inden tilsætning af yderligere 1 mL PBS til homogenisering. Mere fiberholdige organer, såsom lungerne, kan kræve en mere grundig homogenisering.

De primære begrænsninger af disse protokoller omfatter den nødvendige nøje overvågning af dressing og udnyttelse af IVIS til billedspredning og gøre antagelser om spredning effekt. For langsigtede undersøgelser kan revæksten af pels være problematisk, fordi det kan hindre dressing overholdelse af såret. Forbindinger kræver ofte udskiftning, og fjernelse af dem kan føre til utilsigtet debridement af såret og mulighed for forurening. For at visualisere spredningen fra sårbunden skal der anvendes en bioluminescerende bakteriestamme. Hvis de bakterielle arter af interesse mangler en bioluminescerende reporter, er denne mulighed ikke mulig. En anden begrænsning er potentialet i spredningsbehandlingen for at fremkalde bakteriemi, hvilket kan føre til musens død. Vi har dog set, at spredte celler effektivt kan dræbes af antibiotika in vivo7.

De repræsentative resultater, der er afbildet i figur 2, illustrerer en begrænsning af IVIS til måling af spredningseffektivitet. For det første skal en selvlysende stamme af de bakterielle arter af interesse udnyttes. Stammen skal producere et selvlysende signal, der er lyst nok til at detektere gennem flere lag af væv for at visualisere spredning fra sårbunden til andre dele af kroppen. Det er blevet foreslået, at der kræves mindst 106 bakterier for at producere et selvlysende signal, der er stærkt nok til at detektere ved IVIS27. Et fald i selvlysende signal er også blevet beskrevet, når bakterier går ind i stationær fase28. Dette kan medføre en afbrydelse mellem målte ROI'er og CFU optalt29. Denne begrænsning kan føre til falske antagelser, når der ikke er et signal stærkt nok til påvisning, men bakterier er stadig til stede. Som det fremgår af figur 2B, resulterede PBS- og 10% GH-behandlingerne i øget luminescens efter behandling. Dette er en nysgerrig og konsekvent observation, som også er set efter spredning af celler in vitro (Cláudia Marques, Binghamton University, personlig kommunikation). Det er muligt, at biofilmens fysiske forstyrrelse fra administration af behandlingen simpelthen spreder celler, der var tæt pakket, hvilket resulterer i øget lyssignal. Alternativt kan spredningsbehandling "vække" biofilmceller, som tidligere var metabolisk inaktive, hvilket resulterede i øget bioluminescens. Uanset hvad, er det vigtigt at bekræfte resultaterne af IVIS billeddannelse med CFU data. Endelig er der en heterogen fordeling af bakterier i inficeret sårvæv30,31. Hvis vævet derfor er opdelt ex vivo for at give flere prøver, bør det ikke antages, at bakteriebelastningen i hvert sårafsnit er identisk.

Der er ændringer og fejlfinding, der kan udføres for at overvinde begrænsningerne i disse modeller. For det første kan det være nødvendigt at justere den tid, der er afsat til eksponering af depilatory cream, afhængigt af de anvendte musearter. For eksempel bruges 7 min typisk til schweiziske Webster mus, mens C57BL/6 mus kan have brug for op til 10 minutters eksponering for at kunne fjerne pelsen. Dette afhænger naturligvis også af det anvendte produkt, og eksponeringstiderne bør aldrig overstige producentens anvisninger. Hvis der udføres en lang undersøgelse (4+ dage), kan det være nødvendigt at genanvende depilatorisk creme for at fjerne hjemmedyrket pels og sikre en korrekt forsegling af dressingen. Hvis det er vanskeligt at detektere et selvlysende signal, kan eksponeringstiden derefter øges under IVIS-billedbehandling. Den vaccinerende dosis og infektionstid kan også justeres. Det er vigtigt at bruge en inficerende dosis, der ikke er for høj, at den overvælder musen, men er heller ikke for lav, at bakterierne straks ryddes af immunresponset.

I denne protokol beskriver vi behandling af 48 h-gamle sårinfektioner med spredningsmidler, da dette er et tidspunkt, hvor vi har vist infektioner forårsaget af P. aeruginosa og / eller S. aureus er etableret og biofilm-associeret 12,15,16. Afhængigt af bakteriearterne kan andre tidspunkter dog være mere optimale. Ideelt set bør bakteriebelastningen i såret plateau, når en infektion er etableret. For eksempel har vi set, at med både P. aeruginosa og S. aureus når bakteriebelastningen i såret ca. 108 CFU / g væv med 48 timer efter infektion og forbliver på dette niveau indtil sårlukning. Figur 1 illustrerer behandling med en opløsning, der kræver 3 x 30 min. vasker. Men hvis spredningsmidlet var i en anden form, ville vaskene ikke være nødvendige. For eksempel kan en creme, gel eller manipuleret dressing simpelthen placeres oven på sårbunden. Endelig kan såret blive smittet på en række forskellige måder, herunder podning af planktoniske bakterieceller, præformerede biofilm12, eller endda inficeret debridementvæv fra et andet dyr eller menneske19,32. Vi har set, at transplantation af en præformet biofilm eller debridementprøve på sårbunden resulterer i mere vellykkede polymikrobielle infektioner, end når flere arter podes i deres planktoniske form12.

Samlet set beskriver disse protokoller metoder til undersøgelse af spredning af biofilm og evaluering af terapeutiske biofilmspredningsmidler. Disse modeller giver mulighed for udvikling af komplekse polymikrobielle biofilmrelaterede infektioner, der efterligner klinisk relevante menneskelige infektioner. Vores håb er, at disse protokoller vil blive udnyttet og raffineret til at fremme udviklingen af anti-biofilm spredningsmidler til terapeutisk brug.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health (R21 AI137462-01A1), Ted Nash Long Life Foundation, Jasper L. og Jack Denton Wilson Foundation og Department of Defense (DoD MIDRP W0318_19_NM_PP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Fisher 14823434 Use to complete serial dilutions of samples
25G 58 in needle Fisher 14823434 Attaches to 1 mL syringe
Ampicillin Sodium Salt Fisher BP1760-5 Make a 50 mg/ mL stock solution and add 100 µL to 10 mL of LB broth for both overnight and subculture
Amylase MP Biomedicals 2100447 Make a 5% w/v solution, vortex- other dispersal agents can be used
Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL) ZooPharm RX216118 Use as pain mainagement- may use other options
Cellulase MP Biomedicals 2150583 Add 5% w/v to the 5% w/v amylase solution, vortex, activate at 37 °C for 30 min- other dispersal agents can be used
Depilatory cream Walmart 287746 Use a small amount to massage into the hair follicles on the back of the animal and allot 10 min to remove hair
Dressing Forceps, Serrated Tips Fisher 12-460-536 Can use other forms of forceps
Erlenmeyer flasks baffled 125 mL Fisher 101406 Use to grow overnights and sub-cultures of bacteria
FastPrep-24 Benchtop Homogenizer MP Biomedicals 6VFV9 Use 5 m/s for 60 s two times to homogenize tissue
Fatal Plus Vortech Pharmaceuticals 0298-9373-68 Inject 0.2 mL intraperitaneal for each mouse
Homogenizing tubes (Bead Tube 2 mL 2.4 mm Metal) Fisher 15340151 Used to homogenize samples for plating
Isoflurane Diamond Back Drugs
Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution C-IIIN Sigma Aldrich K4138 Use as anasethia- other options can also be utilized to gain a surgical field of anasethia
LB broth, Miller Fisher BP1426-2 Add 25 g/L and autoclave
Lidocaine 2% Injectable Diamond Back Drugs 2468 Inject 0.05 mL through the side of the marked wound bed area so it is deposited in the center of the mark. Allot 10 min prior to cutting
Meropenem Sigma Aldrich PHR1772-500MG Make 5 mg/mL to add to the GH solution to apply topically and a 15 mg/mL solution to inject intraperitaneal 4 h prior and 6 h post-treatment
Non-sterile cotton gauze sponges Fisher 13-761-52 Use to remove the depilatory cream
PAO1 pQF50-lux bacterial strain Ref [13] N/A PAO1 pgF50-lux was used as the P. aeruginosa strain of interest in this paper's representative results
Petri dishes Fisher PHR1772-500MG
Phosphate Buffer Saline 10x Fisher BP3991 Dilute 10x to 1x prior to use
Polyurethane dressing Mckesson 66024007 Cut the rounded edge off and cut the remaining square into 4 equal sections
Pseudomonas isolation agar VWR 90004-394 Add 20 mL/L of glycerol and 45 g/mL to water, autoclave, and pour 20 mL into petri dishes
Refresh P.M. Walmart Use on eyes to reduce dryness during procedure.
Sterile Alcohol Prep Pads Fisher 22-363-750 Use to clean the skin immediately prior to wounding to disinfect the area
Straight Delicate Scissors Fisher 89515 Can also use curved scissors
Swiss Webster mice Charles River 551NCISWWEB Other mice strains can be used
Syring Slip Tip 1 mL Fisher 14823434 Used to administer drugs and enzyme treatment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rossolini, G. M., Arena, F., Pecile, P., Pollini, S. Update on the antibiotic resistance crisis. Current Opinion in Pharmacology. 18, 56-60 (2014).
  2. Stewart, P. S. Antimicrobial Tolerance in Biofilms. Microbiology Spectrum. 3 (3), (2015).
  3. Flemming, H. C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).
  4. Rumbaugh, K. P. How well are we translating biofilm research from bench-side to bedside. Biofilm. 2 (100028), (2020).
  5. Rumbaugh, K. P., Sauer, K. Biofilm dispersion. Nature Reviews Microbiology. 18 (10), 571-586 (2020).
  6. Fleming, D., Chahin, L., Rumbaugh, K. Glycoside Hydrolases Degrade Polymicrobial Bacterial Biofilms in Wounds. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (2), (2017).
  7. Fleming, D., Rumbaugh, K. The Consequences of Biofilm Dispersal on the Host. Scientific Reports. 8 (1), 10738 (2018).
  8. Baker, P., et al. Exopolysaccharide biosynthetic glycoside hydrolases can be utilized to disrupt and prevent Pseudomonas aeruginosa biofilms. Science Advances. 2 (5), 1501632 (2016).
  9. Redman, W. K., Welch, G. S., Rumbaugh, K. P. Differential Efficacy of Glycoside Hydrolases to Disperse Biofilms. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 379 (2020).
  10. Zhu, L., et al. Glycoside hydrolase DisH from Desulfovibrio vulgaris degrades the N-acetylgalactosamine component of diverse biofilms. Environmental Microbiology. 20 (6), 2026-2037 (2018).
  11. Fell, C. F., Rumbaugh, K. P. Antibacterial Drug Discovery to Combat MDR. , 527-546 (2019).
  12. Dalton, T., et al. An in vivo polymicrobial biofilm wound infection model to study interspecies interactions. PLoS One. 6 (11), 27317 (2011).
  13. Wolcott, R. D., et al. Biofilm maturity studies indicate sharp debridement opens a time- dependent therapeutic window. Journal of Wound Care. 19 (8), 320-328 (2010).
  14. Korgaonkar, A., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. Community surveillance enhances Pseudomonas aeruginosa virulence during polymicrobial infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (3), 1059-1064 (2013).
  15. Watters, C., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilms perturb wound resolution and antibiotic tolerance in diabetic mice. Medical Microbiology and Immunology. 202 (2), 131-141 (2013).
  16. Watters, C., Everett, J. A., Haley, C., Clinton, A., Rumbaugh, K. P. Insulin treatment modulates the host immune system to enhance Pseudomonas aeruginosa wound biofilms. Infection and Immunity. 82 (1), 92-100 (2014).
  17. Turner, K. H., Everett, J., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. Requirements for Pseudomonas aeruginosa acute burn and chronic surgical wound infection. PLOS Genetics. 10 (7), 1004518 (2014).
  18. Harrison, F., et al. A 1,000-Year-Old Antimicrobial Remedy with Antistaphylococcal Activity. mBio. 6 (4), 01129 (2015).
  19. Wolcott, R., et al. Microbiota is a primary cause of pathogenesis of chronic wounds. Journal of Wound Care. 25, Sup10 33-43 (2016).
  20. Ibberson, C. B., et al. Co-infecting microorganisms dramatically alter pathogen gene essentiality during polymicrobial infection. Nature Microbiology. 2, 17079 (2017).
  21. Fleming, D., et al. Utilizing Glycoside Hydrolases to Improve the Quantification and Visualization of Biofilm Bacteria. Biofilm. 2, (2020).
  22. DeLeon, S., et al. Synergistic interactions of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in an in vitro wound model. Infection and Immunity. 82 (11), 4718-4728 (2014).
  23. Darch, S. E., et al. Phage Inhibit Pathogen Dissemination by Targeting Bacterial Migrants in a Chronic Infection Model. mBio. 8 (2), (2017).
  24. Chua, S. L., et al. Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles. Nature Communications. 5, 4462 (2014).
  25. Beitelshees, M., Hill, A., Jones, C. H., Pfeifer, B. A. Phenotypic Variation during Biofilm Formation: Implications for Anti-Biofilm Therapeutic Design. Materials (Basel). 11 (7), (2018).
  26. Sauer, K., et al. Characterization of nutrient-induced dispersion in Pseudomonas aeruginosa PAO1 biofilm. J Bacteriol. 186 (21), 7312-7326 (2004).
  27. Kuklin, N. A., et al. Real-time monitoring of bacterial infection in vivo: development of bioluminescent staphylococcal foreign-body and deep-thigh-wound mouse infection models. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (9), 2740-2748 (2003).
  28. Francis, K. P., et al. Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon. Infection and Immunity. 69 (5), 3350-3358 (2001).
  29. Kadurugamuwa, J. L., et al. Noninvasive optical imaging method to evaluate postantibiotic effects on biofilm infection in vivo. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (6), 2283-2287 (2004).
  30. Wimpenny, J., Manz, W., Szewzyk, U. Heterogeneity in biofilms. FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 661-671 (2000).
  31. Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).
  32. Tipton, C. D., et al. Chronic wound microbiome colonization on mouse model following cryogenic preservation. PLoS One. 14 (8), 0221656 (2019).

Tags

Immunologi og infektion Ex vivo In vivo biofilm spredning sårinfektion anti-biofilm agent Pseudomonas aeruginosa
Vurdering biofilm spredning i Murine Sår
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Redman, W. K., Welch, G. S.,… More

Redman, W. K., Welch, G. S., Rumbaugh, K. P. Assessing Biofilm Dispersal in Murine Wounds. J. Vis. Exp. (174), e62136, doi:10.3791/62136 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter