Summary
我们提出了在小鼠中产生正畸牙齿运动的方案，以及无需分割即可对牙周韧带胶原纤维和血管进行3D可视化的方法。
Abstract
正畸牙齿运动是一种复杂的生物过程，由于外力而改变软硬组织改造。为了了解这些复杂的改造过程，研究牙齿和牙周组织在其3D上下文中至关重要，因此尽量减少任何分割和组织人工制品。由于小老鼠体积小、代谢率高、遗传学和易处理性，它们经常用于发育和结构生物学以及生物力学。原则上，这也使他们成为牙科相关研究的优秀模型。然而，一个主要的障碍是它们的牙齿尺寸小，尤其是摩尔。本文旨在为产生正畸牙齿运动的逐步协议和小鼠手底摩尔牙周韧带纤维成分的三维成像提供两种方法。提出的第一种方法是基于微CT设置，使新鲜胶原蛋白组织具有相增强成像功能。第二种方法是使用乙基肉桂的骨清除方法，使成像通过骨骼无需分割，并保留内源性荧光。结合这种结算方法与记者鼠标像Flk1-Cre：TdTomato 提供了第一次这样的机会来映像 PDL 和肺骨中的 3D 血管。
Introduction
正畸牙齿运动 （OTM） 中的基本生物学过程是骨骼重塑。这种改造过程的触发因素归因于牙周韧带（PDL）结构的变化，如细胞外基质（ECM）应力、坏死以及血管破坏和形成1、2、3。其他可能的紫外骨重塑触发因素与骨细胞在骨骼中的力感应以及骨质疏松体本身的机械变形有关：然而，他们在OTM中的角色仍然没有完全阐明4，5。
尽管许多研究旨在揭示在OTM期间PDL的结构-功能关系，一个明确的功能机制尚未定义6，7。其主要原因是在检索位于两个硬组织（水泥和肺骨）之间的软组织 （PDL） 的数据方面面临挑战。收集结构信息的公认方法通常需要固定和分割，从而破坏和修改 PDL 结构。此外，这些方法大多产生二元数据，即使没有失真，也只提供部分和本地化的信息。由于 PDL 的结构和功能不均匀，因此有必要采用一种处理整个齿-PDL-骨骼复合体完整 3D 结构的方法。
本文将描述在小鼠中生成 OTM 的方法和两种在不分割样品的情况下实现 PDL 中胶原纤维的 3D 可视化的方法。
Murine 模型广泛应用于医学、发育生物学、药物输送和结构研究中的活体实验。它们可以进行基因改造，以消除或增强特定的蛋白质和功能：它们提供快速、可重复和可预测的发展控制;它们也很容易图像，因为他们的小尺寸8。尽管它们有许多优点，但牙科研究中的鼠标模型并不经常使用，尤其是在需要临床操作时，这主要是因为牙齿尺寸小。动物模型，如老鼠9，10，11，狗12，13，猪14，15，16和猴子17比老鼠使用更多。随着高分辨率成像技术的不断发展，利用鼠标模型破译OTM中错综复杂的过程的优点是多种多方面的。本文提出了一种方法，以产生摩尔牙在可塑性与恒定力水平，触发骨重塑的中微运动。大多数在啮齿动物中的OTM实验是在最大值进行的，因为可操纵性和舌头的存在增加了另一个复杂程度。但是，当需要 3D 结构完整性时，可强制具有许多优势。它可以很容易地解剖为整个骨头：在某些物种中，它可以通过纤维共生被分成两个下摆：它是紧凑的，平坦的，只包含没有任何鼻窦空间的牙齿。相比之下，最大骨是头骨的一部分，与其他器官和结构密切相关，因此需要进行广泛的分割，以便用相关的牙齿解剖杏骨。
我们利用室内湿度室与高分辨率微CT内部的加载系统相结合，实现相位增强，开发出一种3D中可视化新鲜纤维组织的方法，如先前描述的9、18、19、20、21、22、23。动物牺牲后立即扫描新鲜组织，无需任何污渍或固定，从而减少组织人工制品以及生物力学特性的改变。这些3D数据可用于分布和方向分析的纤维，如其他地方描述19。
这里介绍的第二个 3D 全组织成像方法基于可拆解的光学清除，使 PDL 纤维在无需任何分割的情况下通过骨骼成像。有趣的是，它也使骨骼本身的胶原纤维可视化，但这里不会讨论这个问题。一般来说，组织清除有两种方法。第一种是水基清除，样品浸入水溶液中，通过简单的浸入、高水化或水凝胶嵌入，折射指数大于 1.4。然而，这种方法在透明度和组织结构保存方面是有限的，因此需要固定组织。第二种方法，产生高度透明的样品，不需要固定是溶剂为基础的清除方法24，25。我们为曼迪布拉样品生成了基于乙基-3-苯丙-2-苯酸酯（乙基肉碱，ECi）的改性溶剂清除方法。该方法具有使用无毒食品级清除剂、最小组织收缩和荧光蛋白保存等优点。
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Protocol
所有动物实验均符合国家卫生研究院《实验室动物护理和使用指南》和哈佛大学机构动物护理与使用委员会的准则（第01840号议定书）。
1. 矫形牙齿运动
- 要生成鼠标床，请使用带楔形、45° 角头的扁平塑料平台。头靠面可以通过切割塑料盒生成。
- 提升平台的头部端，在头架和桌面平面之间产生大约 30° 角。将弯曲的厚回形针（直径为 0.036"）连接到头部侧端，以保持上切口。
- 在尾端，生成一个高架表面，其中可连接一个声像电源链，以保持较低的切口。请参阅 图 1 示例平台。
- 麻醉小鼠通过在10毫克/千克的静脉注射和氯胺酮100mg/kg使用1mL注射器和27量表针。
- 将麻醉鼠标放在定制平台上，通过钩住回形针环上的上切口来固定上颚。打开鼠标的下颚，将矫形电源链钩在下切口上。保持脸颊缩回与迷你大肠杆菌口缩回器。
- 将平台置于手术显微镜或任何其他可达到 5-6 倍放大倍数的立体镜下。
- 在小鼠眼睛上涂抹50微升盐水（约1滴），以防止角膜脱水。每20分钟补充一次盐水。
- 切一根铝线（直径0.08毫米）1厘米长。使用显微手术针架，在可复制区域内以语言方式从胸侧滑动电线，使第一和第二摩尔之间的接触点响起。在第一个摩尔前面留有 2 毫米的自由边缘，以便线程进入弹簧端。
- 切一块镍钛（NiTi）线圈，长度约7至9根线。
注：线圈的弹性特性将为体畸运动提供恒定的力量。线圈的总无拘无束长度应短于切口和摩尔之间的间隙。请记住，每端需要额外的 2 个线程来将线圈固定在牙齿上。选择铝线是为了减少微CT扫描过程中的光束硬化等扫描人工制品。 - 在下部第一摩尔和下切口之间插入 NiTi 线圈弹簧（0.15 毫米线直径，0.9 毫米内线圈直径;提供 10 克的力）。使用在第 1.6 步中插入第一个摩尔周围的线连字，将线紧紧地围绕线圈弹簧的 2 根线线扭动，以修复摩尔侧的线圈。
- 为了确保统一的力水平，在第一个摩尔和切口之间精确使用 3 个活动线。暂时从切口上取下电源链，并在切口上将 2 到 3 个未受约束的螺纹固定在切口上以锚定线圈。将线程滑动到切口自由银杏边缘。
- 将一层可流动的复合树脂放在线圈的切口边框上，用牙科治疗灯将其固化。固化树脂后更换电源链。
- 使用相同的固化光，加热尼蒂线圈20s。这将收紧尼蒂线圈。完成的位置显示图1C。
- 要么保持反面完好无损，要么插入假象，如第一个摩尔和第二个摩尔之间的电线。
- 将麻醉的鼠标置于加热光线下，使鼠标保持温暖，直到恢复。
- 将鼠标放回单独的笼子里，每天进行监控。在正畸运动期间，不需要改变饮食。
注意：一侧的 OTM 设备会引起一些不适，但不会损害进食。但是，由于增加的不适量，不建议在两侧插入设备。除非看到疼痛的外在迹象，否则没有必要服用止痛药。
2. 新鲜下皮纤维的PDL纤维的微CT扫描
- 安装下皮 （图 2）
- 在矫形运动的预期持续时间后，通过颈椎脱位牺牲小鼠。取出可下达的，并分离成下皮。
注意：由于样品无法固定，因此必须尽快进行下颚解剖和安装，最好是在 30 分钟内。 - 用干净的无绒擦拭轻轻取出周围的软组织。
- 使用显微外切刀和钳子在立体显微镜下取出矫形器，其放大倍数至少为 4 倍。
- 将样品保湿在 1.5 mL 的体积中，微型离心管以及一块用水滋润的无绒擦拭。
- 将可打包的牙科复合树脂放入舞台上的样品槽中，然后将新鲜的下摆可制剂放入复合物中。安装前，确保与牙齿复合物接触的骨表面不含任何软组织和干燥，否则牙齿复合物无法正常治愈。
- 调整半人马的位置，直到第一个摩尔位于舞台的中线槽处。确保遮挡表面是水平的。当对定位感到满意时，可以固化复合材料。
注：可在切口和/或切口两侧放置少量牙科复合材料，以帮助稳定样本。 - 在样品阶段将无湿润绒擦拭放在湿度池内。将牙齿复合物放在第一个摩尔的遮挡表面。在关闭腔室之前，确保没有任何东西阻挡标本级别的 X 射线路径。
- 将房间贴在微型 CT 中。将腔室拧入微CT样品阶段，以便最大限度地减少成像过程中的运动。
- 打开 X 射线，在垂直降低铁锤时拍摄 2D 图像，直到铁锤尖端被复合物包围，但未检测到力增加。
- 一旦铁锤嵌入复合材料中，关闭 X 射线源。然后，打开微型 CT 腔室，通过透明的Plexiglas窗口固化复合材料。
- 在矫形运动的预期持续时间后，通过颈椎脱位牺牲小鼠。取出可下达的，并分离成下皮。
- 微CT设置
- 将源电压设置为 40 kV，电流设置为 200 μA。使用 10 倍放大探测器，将样品定位在视图框架内。对于捕获的图像使用 2 的装箱。
注意：由于 PDL 的密度明显低于骨骼和牙齿，因此可视化 PDL 需要更高的功率和暴露时间。此协议将提供可视化 PDL 的设置。 - 将单个图像曝光时间设置为 25 s。将样本阶段的旋转设置为 183 度或更高范围。设置 2500 个投影的扫描。不要使用任何 X 射线源过滤器，由此产生的扫描每侧的 voxel 大小为 0.76 μm。
- 根据微CT指南收集适当的重建参考扫描。使用 1/3 的参考图像作为总投影。使用后投影过滤算法，在不附加装箱的情况下重建体积。
- 将源电压设置为 40 kV，电流设置为 200 μA。使用 10 倍放大探测器，将样品定位在视图框架内。对于捕获的图像使用 2 的装箱。
3. 结算方法 （图3）
- 准备五根1.5mL的微型离心管。
- 在 1.5 mL 微离心管中准备以下解决方案的 1.4 mL：磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中的 4% 副甲醛 （PFA），除离子 （DI） 水中的 50% 乙醇 （EtOH），DI 水中 70% EtOH，以及两管 100% EtOH。
注：PFA 用于固定样品。ECi 清除还将对未修复的样品进行工作。要清除未修复的样品，只需跳过 PFA 步骤即可。 - 将解剖的六溴化物放在4%PFA中。用铝箔盖住，在室温下轻轻设置 6 小时，放在摇动器上。
- 将下皮可移动到 50% Etoh 。将其放在从光覆盖的摇动器上16小时。
- 将下皮可移动到 70% Etoh 。将其放在从光覆盖的摇动器上16小时。
- 将下皮移动到100%EtOH。将其放在从光覆盖的摇动器上16小时。
- 重复 3.6。在第二个100%埃托赫管。
- 在玻璃或聚丙烯管中准备 5 毫升 ECi。
注：ECi溶解聚苯乙烯，但不溶于聚丙烯。此外，如果不使用含有荧光蛋白的组织，样品可以在清除过程中暴露在光线下。 - 将下皮可移动到 ECi 管。用铝箔盖住管子，放在摇动器上，以至少12小时的速度轻轻设置。
注：协议可在此处暂停。脱水样品可在室温下储存在 ECi 中。ECi 的冻结或熔点为 6.5 至 8.0 °C。 不要存储在4°C。 - 下皮可用荧光显微镜成像。
注意：在成像过程中，样品必须浸入 ECi 中才能保持光学透明度。
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Representative Results
本文提出了一种生产OTM的方法，以及两种在PDL内对胶原纤维进行三维成像的方法，无需任何分割。出于动物研究目的，当牙齿不对齐时，如果牙齿运动在所有根部产生对腹膜骨的重塑，则被视为正畸运动。为了生成可靠的 OTM，需要在牙齿上施加恒定的力水平。在这里，激活的形状记忆 NiTi 线圈用于在 7 天及以后的实验时间内产生 10 克的一致力（如果有必要）。此处描述的线圈激活 （图 1） 在孕期内产生 NiTi 线圈中的应变，并将线圈带到歇斯底里状态，从而持续给牙齿带来压力。线圈插入后，用固化灯加热线圈，还将确保合金将转移到其形式，并发生形状记忆效果。
在这里，我们展示来自9周大的雄性小鼠的代表性结果。在 OTM 7 天后，第一个摩尔和第二摩尔冠之间的平均间歇空间为 40 μm，测量在微CT中具有 1 倍放大（n=12，st.dev 的摩尔的中间表面之间 。=15μm（图1E）。PDL 在间质方向的平均空间在 OTM （图 4B）7 天之前和之后为 80 μm。这证实了第一个摩尔在本质上进行中度转换，7天是产生小鼠模型中的OTM的足够时间，同时产生自然界中骨质吸收和应用的过程（图4）。老鼠被喂食标准的硬托盘饮食。插入设备后没有改变饮食。
第一种方法是根据对新鲜组织（图4）的相增强微CT成像（图4）来可视化OTM期间牙齿-PDL-骨复合物的变化，该成像在之前9、18、19、20、22、23等详细描述。简言之，只要具备微CT或同步加速器的相位增强功能、纤维组织和潮湿环境的机械稳定性，新鲜胶原纤维可以可视化，无需任何固定或对比剂。在PDL中看到的纤维是那些连接到牙齿和骨骼，主要是I型胶原蛋白19。这种独特的机会，以可视化在3D完整的PDL，使分析3D纤维密度，纤维方向，以及牙齿的3D运动，如先前描述的9，19。具体来说，在这里我们介绍 PDL 中纤维网络的可视化。在时间 0 时，可以观察到骨骼和 PDL 的生理重塑。细胞水泥中也会发生改造：然而，这与提出的方法没有直接关系，因此不会详细说明。骨-PDL接口在任何力应用之前，在横向（图4A）和下垂（图4B）平面上都比较光滑。在日冕平面（图4C）中，骨-PDL接口更粗糙，特别是对可能表示重塑平衡趋向于恢复的阿皮亚区域。在 OTM 的 3 天（图 4D-F），第一个摩尔被静音移动（方向由虚线箭头表示），PDL 中的纤维密度降低（白色箭头）。骨-PDL接口比0天粗糙，因为骨表面的陨石坑的发展表明骨质疏松活动和骨质疏松过程与主要压缩力在PDL26相关，然而这里在紧张地区看到3天。建议在PDL内部的张力区域组织破坏27，28，并可以清楚地看到使用这种方法。粗糙的边框出现在根部的不同水平（白箭），因此表明牙齿运动是转化性质的，而不仅仅是冠的翻倒。在 OTM （图4G-I）的 7 天，骨质吸收迹象，如骨骼内的陨石坑、粗糙的边界和 PDL 空间的扩展，在所有平面上都可以看到，但平均 PDL 空间比 3 天的 OTM（图 4D-F）窄。然而，在某些区域，骨-PDL边界在OTM的7天后变得更加平滑，这些区域位于根部的解剖表面，这很可能是骨浮积的迹象，正如OTM对冰层方向的预期。
由于微CT成像时间长（~19 h）和舞台旋转，安装样品对于保持样品静止至关重要。不稳定的样品会导致模糊扫描。 图 5 展示了微 CT 扫描在扫描过程中样品移动时的外观。牙齿和骨头模糊不清。既未观察到 PDL 纤维，也不观察到骨细胞。在此类事件中，物体边缘周围存在剪影。在 图 5中，可以观察到牙冠的多个轮廓（箭头）。
根据研究目标，PDL 纤维的分辨率和可视化可能会在交易中牺牲更短的扫描时间，而此时只需要有关硬组织的信息。
使用 ECi （图 3 ） 对光学显微镜对光学清除样品进行 PDL 光纤的3D可视化，无需任何分割。此方法可用于标本而不固定，并保留清除前存在于组织中的荧光信号。ECi 清除前后的海米可燃物显示在 图 3B 和 3C中。当可以通过可强制的拉莫斯看到网格纸时，可以确认 PDL 的充分样品清除。通过延长脱水过程可以调整清除量。 图6 显示第二个谐波生成（SHG）信号从胶原蛋白纤维在肺气管骨和PDL在清除的可操纵性。将骨骼的胶原纤维成像在3D是一个复杂的过程，它经常使用电子显微镜方法，如FIB/SEM。然而，利用基于ECi的清除方法和SHG，可以清楚地看到紫藻骨纤维，特别是在水平方向上。当通过样品从骨骼表面深入到PDL时，当纤维突然将其方向更改为垂直方向时，向PDL纤维水平的过渡非常清晰。
光片显微镜也可用于通过骨骼成像荧光蛋白。在这种情况下，从转基因Flk1-cre清除样本：Tdtomato小鼠19日、29日、30日，在血管内衬的荧光内皮细胞被清晰观察到（图7A、B、C、E）。适当的清除是使用光表显微镜生成可理解图像的关键。当骨骼未完全清除时，未观察到 PDL 内的血管（图 7D，F）。
图1：设置矫形器具插入。A. 老鼠床由实验室供应制成，以支持动物，并保持嘴张开。身体的塑料平台 （PP） 位于 30° 倾斜上，头盖 （HR） 位于 PP 表面的 45° 角度上。2 层管支架 （TS） 用于提升 PP 的末端头。回形针环（黑色箭头）锚定顶部切口，底部直觉电源链（白箭头）钩在下切口上。直径为5毫米的检查镜用于对摩尔进行目视检查。 B. 鼠标床的侧视图。表面之间的角度被标记（绿色和洋红色）。 C. 正确放置的设备的代表图像。 D. 在植入设备之前，摩尔人通过检查镜看到。 E. 矫形运动后摩尔的代表形象。破折号线跟踪第一和第二摩尔的轮廓。 F. 设备的图表及其位置。红线表示第一摩尔周围的线连字。橙色线表示用于锚定线圈的可流动复合树脂。尼蒂线圈以蓝色显示并标记。 G. 在 7 天的正畸运动后，用所连接的设备解剖了下肢。请注意 3 线圈线程如何仍然打开，表示线圈在 7 天后仍然处于活动状态。E 和 G 中的缩放条 = 1 mm。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：Hemi-mandible安装在一个定制的微型CT成像室中。A.微CT机器内样品室的完整设置。左侧看到 X 射线源，右侧看到探测器。红色矩形勾勒出安装在样品台 （SS） 腔室中的下腔可勒索。此处显示的示例室是机械测试设置的一部分，包括电机 （M）、铁锤 （A，由白色虚线勾勒）和在腔室上方的铁锤轴 （AS） 。完整的设置被拧到CT阶段。插图显示红色概述区域的特写，包含带样品的湿度室。B.安装在样品舞台上的样品的顶部视图。湿度池（灰色箭头）内置在周边，以在成像过程中保持湿度。在中间的圆形舞台上，半壁可以安装在倾斜的深槽（黑色箭头）中。薄槽（白色箭头）标记舞台的中线，以帮助定向样品。C.带样本槽的圆形阶段图。凹槽的倾斜支撑着可操纵的，并允许沿着根的垂直轴安装摩尔。D.具有代表性的微型 CT 2D 切片与半人形样品的 3D 体积图像相结合。这里的可复制间隙为 52 μm。样品安装在下面的样品阶段（未显示）和顶部的铁锤 （A） 由牙科复合物 （DC）。比例栏 = 500μm.请单击此处查看此图的更大版本。
图3。基于 ECi 的清除方法，用于解剖鼠标下皮。A. 解剖的六合可连续浸入 4% PFA、50% EtOH、70% EtOH 和 100% EtOH 中。脱水后，在ECi中储存至少12小时，直到成像。 B. 解剖后立即进行下密。 C. 清理完毕后，可进行海米-曼德。比例杆 =5 毫米 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：在矫形运动的不同阶段，对新样本的PDL进行 原位 微CT扫描。A-C， 没有矫音运动。 A. 微CT 2D图像在半身体的横向平面显示的隐性（M）和解剖（D）根内的腹膜骨，B-布卡尔，L-语言侧的骨。在牙根和骨瓣之间，可以清楚地观察到PDL空间和牙根内的纤维。 B. 下垂平面中的 2D 图像。 C. 日冕平面上的 2D 图像。 D-E，3 天OTM后的2D图像，箭头指向PDL中胶原纤维密度降低的区域，白箭头指向骨质吸收区域。 G-I，2D 图像在OTM的7天后，黑色箭头指向骨应用区域。比例栏 = 150μm. 请单击此处查看此图的更大版本。
图5：下垂平面上的2D微CT图像，显示扫描过程中牙齿和骨骼的模糊结构。 箭头指向牙齿的多个板线，指示其运动。比例栏 150μm. 请单击此处查看此图的更大版本。
图6：ECi 清除可操纵显示第一个摩尔图像与第二谐波生成 （SHG）. 白色箭头指向看到 PDL 胶原纤维的区域，注意垂直方向，黑色箭头指向同时看到 PDL 的垂直纤维和阿尔韦拉尔骨水平纤维的区域。T 齿、F-毛刺、AB-阿尔韦拉尔骨、MR-磁性根、DR-解剖根、比例杆 150 μm。使用 20 倍多沉浸式镜头获取图像，用于 1.33-1.56 的 RI 解决方案。激发激光被设置为860nm，功率为10%。像素居住时间：0.51μs;扫描模式：帧：平均： 16：探测器类型：非扫描光倍管探测器：探测器增益 800v. 请单击此处查看此图的更大版本。
图7。光表显微镜图像的ECi清除 Flk1-Cre：td托马托 鼠标。A. 最佳清除控制下层可控性。骨骼（箭头）和PDL空间（箭头）内的血管网络是可见的。 B. 第一个摩尔的中音区域（红色在A中勾勒）的插图显示了血管。 C. 最佳清除 7 天 OTM 下摆和 D。 次优清除下皮。 E. 下垂平面中 C 面板的 2D 图像，该图像在骨骼（灰色箭头）和 PDL 空间（白色箭头）中显示定义明确的血管。 F. 面板 D 的二维切片图像，与 E 中的图像区域相同，导致图像模糊。比例杆 A、C、D = 500μm、B、E、F = 100μm 图像采用 5 倍计划目标拍摄，使用相机作为探测器。激发激光是561纳米在4%的功率。 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
由于大小、遗传学和处理优势，在小鼠体内产生OTM是非常理想的。使用可手性在组织解剖以及样品制备和成像方面都提供了一个易于处理的操作。在这里，我们介绍了一种在OTM后7天内产生OTM的方法，即牙齿在骨骼内的转化运动。使用此协议，可以延长牙齿运动的整个持续时间，因为激活的线圈为运动提供了高达 1 mm 的恒定力水平。然而，线圈的中微侧固定在切口上，切口不断喷发。因此，力向量将逐渐改变并开始产生挤出力。如果每 7 天进行一次中止端附件级别的调整，则可以避免这种情况。
PDL 是 OTM 的发起者，因此了解其在 OTM 不同阶段的结构和功能非常重要。然而，PDL的结构和功能都不统一，19、22、31、32。因此，为了检索有意义的数据，需要以 3D 方式研究 PDL，并且应尽可能避免任何组织分割和操作。然而，调查位于两个硬组织之间的软组织使得这样的要求难以实现。研究 PDL 的传统方法通常涉及破坏 3D 结构并将组织从其生理环境中移除，从而改变 PDL 的结构和生物力学特性。结构和生物力学特性在OTM期间都发生动态变化，这证明进一步保存组织 3D 上下文是合理的。为此，我们介绍了两种无需分割即可实现整个组织成像的方法，这些方法还可用于同一样本中共同本地化荧光信号、形态学和矿化数据。
所提供的方法说明指导读者在其研究领域应用这些方法。微CT成像允许 PDL 纤维网络的 3D 可视化。可以分析图像以生成方向性和密度分析，并定量调查 OTM 期间 PDL 的变化。我们还描述了一种清除方法，它使可视化与现成的光学显微方法，如光表显微镜和共焦成像。光表显微镜具有产生成像速度相对较快的大型标本的三维图像的优点。共聚焦显微镜利用 SHG 信号实现高分辨率 3D 可视化，用于胶原纤维成像和荧光标签。这些方法独立或结合为3D结构研究提供了许多可能性，并具有最小的组织准备。
本协议中的几个具有挑战性的步骤需要额外的关注：
首先，在线圈放置过程中，必须在第一个摩尔和第二个摩尔之间牢固地放置连字线。由于鼠标牙齿的尺寸很小，这个过程具有挑战性。我们建议使用台式立体显微镜来指导放置。但是，在过程中的小动作可能会移动鼠标，并导致感兴趣的区域离开视场。作为替代方案，我们建议使用 4-5 倍放大的百叶窗，可以在操作员身上佩戴，这有助于更动态地查看区域。
其次，清除结果取决于脱水过程。如果样本未达到所需的透明度水平，我们建议增加脱水时间。更具体地说，在 100% EtOH 中浸入时间更长，可提高最终产品的透明度。然而，应该指出的是，脱水水平的增加可以显著降低荧光水平24，25。所呈现的基于ECi的方法被证明可以保存荧光信号超过2周24。
此协议的各个方面可以修改，以研究许多其他目的。我们在微型 CT 内部设计的腔室与负载单元和电机相结合，能够对下皮样品进行张力/压缩测试。结合微CT的可视化，此设置可以显示PDL 原位 的变化与不同的机械负载21。描述的清除方法也可以在未修复的样品上实施，这为各种成像方式的有趣组合提供了机会。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了国家卫生研究院（NIDCR R00-DE025053，PI：Naveh）的支持。我们要感谢哈佛生物成像中心的基础设施和支持。所有数字均以 biorender.com 生成。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-mL BD Luer-Lok syringe | BD | 309628 | |
| 1X phosphate buffered saline | VWR Life Sciences | 0780-10L | |
| 200 proof ethanol | VWR Life Sciences | V1016 | |
| Aluminum alloy 5019 wire | Sigma-aldrich | GF15828813 | 0.08 mm diameter wire, length 100th, temper hard. Used as wire ligature around molar. |
| Avizo 9.7 | Thermo Fisher Scientific | N/A | Used to analyze microCT scans |
| Castroviejo Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Clr Plan-Apochromat 20x/1.0,CorrVIS-IR M27 85mm | Zeiss | N/A | Used for second harmonic generation imaging |
| Cone socket handle, single ended, hand-form | G.Hartzell and son | 126-CSH3 | Handle of the inspection mirror |
| EC Plan-Neofluar 5x/0.16 | Zeiss | 440321-9902 | Used for light-sheet imaging |
| Elipar DeepCure-S LED curing light | 3M ESPE | 76985 | |
| Eppendorf safe-lock tubes, 1.5mL | Eppendorf | 22363204 | |
| Ethyl cinnamate, >= 98% | Sigma-aldrich | W243000-1KG-K | |
| Hypodermic Needle, 27G x 1/2'' | BD | 305109 | |
| Ketathesia 100mg/ml | Henry Schein Animal Health | NDC:11695-0702-1 | |
| KIMWIPES delicate task wipers | Kimberly-Clark | 21905-026 (VWR Catalog number) | Purchased from VWR |
| LightSheet Z.1 dual illumination microscope system | Zeiss | LightSheet Z.1/LightSheet 7 | Used for lightsheet imaging |
| LSM 880 NLO multi-photon microscope | Zeiss | LSM 880 NLO | Used for two-photon imaging |
| MEGAmicro, plane, 5mm dia, SS-Thread | Hahnenkratt | 6220 | Front surface inspectrio mirror |
| MicroCT machine, MicroXCT-200 | Xradia | MICRO XCT-200 | |
| Mini-Colibri | Fine Science Tools | 17000-01 | |
| PermaFlo Flowable Composite | Ultradent | 948 | |
| Procedure platform | N/A | N/A | Custom-made from lab materials |
| Routine stereo micscope M80 | Leica Micosystems | M80 | |
| Sentalloy NiTi open coil spring | TOMY Inc. | A 0.15mm diameter closed NiTi coil with an inner coil diameter of 0.9mm delivers a force of 10g. Similar products can be purchased from Dentsply Sirona. | |
| T-304 stainless steel ligature wire, 0.009'' diameter | Orthodontics | SBLW109 | 0.009''(.23mm) diameter, Soft temper |
| X-Ject E (Xylazine) 100mg/ml | Henry Schein Animal Health | NDC:11695-7085-1 | |
| Z100 Restorative, A2 shade | 3M ESPE | 5904A2 |
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