Summary
Wir präsentieren ein Protokoll zur Erzeugung kieferorthopädischer Zahnbewegungen bei Mäusen und Methoden zur 3D-Visualisierung der Kollagenfasern und Blutgefäße von Parodontalbändern ohne Schnitt.
Abstract
Kieferorthopädische Zahnbewegung ist ein komplexer biologischer Prozess des veränderten Weich- und Hartgewebeumbaus als Folge äußerer Kräfte. Um diese komplexen Umbauprozesse zu verstehen, ist es wichtig, das Zahn- und Parodontalgewebe in ihrem 3D-Kontext zu untersuchen und somit Schnitte und Gewebeartefakte zu minimieren. Mausmodelle werden aufgrund ihrer geringen Größe, hohen Stoffwechselrate, Genetik und einfachen Handhabung häufig in der Entwicklungs- und Strukturbiologie sowie in der Biomechanik eingesetzt. Prinzipiell sind sie damit auch hervorragende Modelle für zahnärztliche Studien. Ein großes Hindernis ist jedoch ihre geringe Zahngröße, insbesondere die Backenzähne. Dieses Papier zielt darauf ab, ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Erzeugung kieferorthopädischer Zahnbewegungen und zwei Methoden zur 3D-Bildgebung der parodontalen Bandfaserkomponente eines Maus-Unterkiefermolaren bereitzustellen. Die erste vorgestellte Methode basiert auf einem Mikro-CT-Setup, das die Phasenverstärkungsbildgebung von frischem Kollagengewebe ermöglicht. Die zweite Methode ist eine Knochenreinigungsmethode mit Ethylzimt, die eine Bildgebung durch den Knochen ohne Schnitt ermöglicht und die endogene Fluoreszenz bewahrt. Kombination dieser Clearing-Methode mit Reportermäusen wie Flk1-Cre; TdTomato bot eine erste Gelegenheit seiner Art, das 3D-Gefäßsystem in der PDL und im Alveolarknochen abbilden zu können.
Introduction
Der grundlegende biologische Prozess in der kieferorthopädischen Zahnbewegung (OTM) ist der Knochenumbau. Der Auslöser für diesen Umbauprozess wird auf Veränderungen in der Struktur des Parodontalbandes (PDL) wie extrazellulären Matrix (ECM) Stress, Nekrose sowie Blutgefäßzerstörung und -bildung zurückgeführt1,2,3. Andere mögliche Auslöser für den Alveolarknochenumbau sind die Krafterfassung durch Osteozyten im Knochen sowie die mechanische Verformung des Alveolarknochens selbst; ihre Rolle im OTM ist jedoch noch nicht vollständig aufgeklärt4,5.
Trotz vieler Studien, die darauf abzielten, Struktur-Funktions-Beziehungen der PDL während der OTM aufzudecken, muss noch ein klarer funktioneller Mechanismus definiert werden6,7. Der Hauptgrund dafür ist die Herausforderung, Daten eines Weichgewebes (PDL) zwischen zwei Hartgeweben (Zement und Alveolarknochen) abzurufen. Die akzeptierten Methoden zum Sammeln von Strukturinformationen erfordern in der Regel Fixierungen und Abschnitte, die die PDL-Struktur stören und modifizieren. Darüber hinaus liefern die meisten dieser Methoden 2D-Daten, die, selbst wenn sie nicht verzerrt sind, nur teilweise und lokalisierte Informationen liefern. Da die PDL in ihrer Struktur und Funktion nicht einheitlich ist, ist ein Ansatz gerechtfertigt, der die intakte 3D-Struktur des gesamten Zahn-PDL-Knochenkomplexes adressiert.
In diesem Artikel werden eine Methode zur Erzeugung eines OTM in Mäusen und zwei Methoden beschrieben, die eine 3D-Visualisierung der Kollagenfasern in der PDL ohne Schnitt der Probe ermöglichen.
Murine Modelle werden häufig für In-vivo-Experimente in der Medizin, Entwicklungsbiologie, Medikamentenabgabe und Strukturstudien verwendet. Sie können genetisch verändert werden, um bestimmte Proteine und Funktionen zu eliminieren oder zu verbessern. sie bieten eine schnelle, wiederholbare und vorhersehbare Entwicklungskontrolle; Sie sind auch aufgrund ihrer geringen Größe 8 leichtabbildbar. Trotz ihrer vielen Vorteile werden Mausmodelle in der Zahnforschung nicht häufig eingesetzt, insbesondere wenn klinische Manipulationen gerechtfertigt sind, meist aufgrund der kleinen Zähne. Tiermodelle wie Ratten9,10,11, Hunde12,13, Schweine14,15,16 und Affen17 werden häufiger als Mäuse verwendet. Mit der jüngsten Entwicklung hochauflösender bildgebungsähnlicher Verfahren sind die Vorteile der Verwendung eines Mausmodells zur Entschlüsselung der verworrenen Prozesse im OTM zahlreich. Dieser Artikel stellt eine Methode vor, um eine mesiale Bewegung des Backenzahns im Unterkiefer mit konstanten Kraftniveaus zu erzeugen, die einen Knochenumbau auslösen. Die meisten OTM-Experimente an Nagetieren werden im Oberkiefer durchgeführt, da die Beweglichkeit des Unterkiefers und das Vorhandensein der Zunge eine weitere Komplexitätsebene hinzufügen. Der Unterkiefer hat jedoch viele Vorteile, wenn strukturelle 3D-Integrität gewünscht wird. Es kann leicht als ganzer Knochen seziert werden; bei einigen Arten kann es durch die faserige Symphyse in zwei Hemi-Unterkiefer getrennt werden; es ist kompakt, flach und enthält nur die Zähne ohne Sinusräume. Im Gegensatz dazu ist der Oberkiefer ein Teil des Schädels und eng mit anderen Organen und Strukturen verwandt, so dass umfangreiche Schnitte erforderlich sind, um den Alveolarknochen mit den zugehörigen Zähnen zu sezieren.
Unter Verwendung einer hauseigenen Feuchtigkeitskammer, die mit einem Beladungssystem in einem hochauflösenden Mikro-CT gekoppelt ist, das eine Phasenverstärkung ermöglicht, haben wir eine Methode entwickelt, um frisches faseriges Gewebe in 3D zuvisualisieren,wie zuvor beschrieben9,18 , 19,20,21,22,23. Frisches Gewebe wird unmittelbar nach dem Opfer des Tieres ohne Färbung oder Fixierung gescannt, was Gewebeartefakte sowie Veränderungen der biomechanischen Eigenschaften reduziert. Diese 3D-Daten können für Verteilungs- und Richtungsanalysen der Fasern wie an anderer Stelle beschrieben verwendet werden19.
Die zweite hier vorgestellte 3D-Ganzgewebsbildgebungsmethode basiert auf der optischen Reinigung des Unterkiefers, die eine Bildgebung der PDL-Fasern durch den Knochen ohne Schnittbildung ermöglicht. Interessanterweise ermöglicht es auch die Visualisierung der Kollagenfasern des Knochens selbst, dies wird hier jedoch nicht diskutiert. Im Allgemeinen gibt es zwei Methoden zur Gewebereinigung. Die erste ist die wässrige Reinigung, bei der die Probe in eine wässrige Lösung mit einem Brechungsindex von mehr als 1,4 getaucht wird, entweder durch einfaches Eintauchen, Hyperhydratation oder Hydrogeleinbettung. Diese Methode ist jedoch sowohl in der Transparenz als auch in der strukturellen Erhaltung des Gewebes begrenzt und erfordert daher eine Fixierung des Gewebes. Das zweite Verfahren, das hochtransparente Proben liefert und keine Fixierung erfordert, ist das lösungsmittelbasierte Clearingverfahren24,25. Für die Unterkieferproben haben wir ein modifiziertes lösemittelbasiertes Clearingverfahren auf Basis von Ethyl-3-phenylprop-2-enoat (Ethylzimt, ECi) erstellt. Diese Methode hat die Vorteile der Verwendung von ungiftigem Clearingmittel in Lebensmittelqualität, minimaler Gewebeschrumpfung und Konservierung von fluoreszierenden Proteinen.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den NIH-Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren und den Richtlinien des Harvard University Institutional Animal Care and Use Committee (Protokoll Nr. 01840) durchgeführt.
1. Kieferorthopädische Zahnbewegung
- Um ein Mausbett zu erzeugen, verwenden Sie eine flache Kunststoffplattform mit einer keilförmigen, um 45 ° abgewinkelten Kopfstütze. Die Kopfstütze kann durch Schneiden einer Kunststoffbox erzeugt werden.
- Heben Sie das Kopfende der Plattform an, um einen Winkel von etwa 30 ° zwischen der Kopfstütze und der Tischebene zu erzeugen. Befestigen Sie eine gebogene dicke Büroklammer (0,036" Durchmesser) am Kopfseitenende, um die oberen Schneidezähne zu halten.
- Erzeugen Sie am Heck eine erhöhte Oberfläche, an der eine kieferorthopädische Stromkette befestigt werden kann, um die unteren Schneidezähne zu halten. Eine Beispielplattform finden Sie in Abbildung 1.
- Anästhesie der Maus durch intraperitoneale Injektion von Xylazin bei 10 mg/kg und Ketamin 100 mg/kg mit 1 ml Spritze und einer 27 Gauge Nadel.
- Legen Sie die betäubte Maus auf eine maßgeschneiderte Plattform und immobilisieren Sie den Oberkiefer, indem Sie die oberen Schneidezähne an der Büroklammerschlaufe einhaken. Öffnen Sie den Unterkiefer der Maus mit der kieferorthopädischen Stromkette, die an den unteren Schneidezähnen eingehakt ist. Halten Sie die Wangen mit dem Mini-Colibri-Mundretraktor eingezogen.
- Legen Sie die Plattform unter ein Operationsmikroskop oder ein anderes Stereoskop, das eine 5-6-fache Vergrößerung erreichen kann.
- Tragen Sie 50 μL Kochsalzlösung (ca. 1 Tropfen) auf die Mausaugen auf, um eine Hornhautaustrocknung zu verhindern. Salzhaltige Linie alle 20 Minuten auffüllen.
- Schneiden Sie ein Stück eines Aluminiumdrahtes (0,08 mm Durchmesser) von 1 cm Länge. Schieben Sie den Draht von der Wangenseite lingual im interproximalen Bereich unterhalb des Kontaktpunkts zwischen dem ersten und zweiten Backenzähnen mit einem mikrochirurgischen Nadelhalter. Lassen Sie 2 mm freie Kante vor dem ersten Backenzahn, um in das Federende eingefädelt zu werden.
- Schneiden Sie ein Stück Nickel-Titan (NiTi) -Spule, etwa 7 bis 9 Fäden lang.
HINWEIS: Die elastischen Eigenschaften der Spule sorgen für eine konstante Kraft für kieferorthopädische Bewegungen. Die gesamte ungespannte Länge der Spule sollte kürzer sein als der Spalt zwischen dem Schneidezahn und dem Backenzahn. Denken Sie daran, dass an jedem Ende zusätzliche 2 Fäden benötigt werden, um die Spule am Zahn zu verankern. Aluminiumdraht wird ausgewählt, um Scanartefakte wie Strahlhärtung während des Mikro-CT-Scans zu reduzieren. - Einsetzen NiTi Schraubenfeder (0,15 mm Drahtdurchmesser, 0,9 mm Innendurchmesser der Spule; liefert eine Kraft von 10 g) zwischen unterem ersten Backenzahn und unterem Schneidezahn. Verwenden Sie die Drahtligatur, die in Schritt 1.6 um den ersten Backenzahn eingeführt wurde, und drehen Sie den Draht fest um 2 Gewinde der Schraubenfeder, um die Spule auf der molaren Seite zu fixieren.
- Um ein gleichmäßiges Kraftniveau zu gewährleisten, verwenden Sie genau 3 aktive Gewinde zwischen dem ersten Backenzahn und dem Schneidezahn. Entfernen Sie vorübergehend die Stromkette vom Schneidestift und schleifen Sie 2 bis 3 ungeübte Gewinde über den Schneideplan, um die Spule zu verankern. Schieben Sie die Fäden bis zum schneidebogenfreien Zahnfleischrand nach unten.
- Legen Sie eine Schicht aus fließfähigem Kompositharz auf den Schneiderand der Spule und härten Sie sie mit Zahnhärtelicht aus. Ersetzen Sie die Stromkette nach dem Aushärten des Harzes.
- Erhitzen Sie die NiTi-Spule mit dem gleichen Aushärtungslicht für 20 s. Dadurch wird die NiTi-Spule festgezogen. Die fertige Platzierung ist in Abbildung 1C dargestellt.
- Lassen Sie entweder die kontralaterale Seite intakt oder führen Sie einen Schein wie den Draht zwischen dem ersten und zweiten Backenzähnen ein.
- Legen Sie die betäubte Maus unter ein erhitztes Licht, um die Maus bis zur Genesung warm zu halten.
- Setzen Sie die Maus wieder in einen einzelnen Käfig und überwachen Sie sie täglich. Während der kieferorthopädischen Bewegung ist keine Ernährungsumstellung notwendig.
HINWEIS: OtM-Gerät auf einer Seite verursacht einige Beschwerden, beeinträchtigt aber nicht die Fütterung. Das Einsetzen von Geräten auf beiden Seiten wird jedoch aufgrund der zusätzlichen Beschwerden nicht empfohlen. Schmerzmittel sind nicht notwendig, es sei denn, äußere Anzeichen von Schmerzen werden gesehen.
2. Mikro-CT-Scan von PDL-Fasern in frischen Hemi-Unterkiefern
- Montage des Halbmischiblen (Abbildung 2)
- Nach der gewünschten Dauer der kieferorthopädischen Bewegung opfern Sie die Maus durch zervikale Luxation. Entfernen Sie den Unterkiefer und trennen Sie ihn in Hemi-Unterkiefer.
HINWEIS: Da die Probe nicht fixiert wird, ist es wichtig, die Dissektion der Backe und die Montage so schnell wie möglich durchzuführen, idealerweise innerhalb von 30 Minuten. - Entfernen Sie das umgebende Weichgewebe vorsichtig mit einem sauberen fusselfreien Tuch.
- Entfernen Sie das kieferorthopädische Gerät mit einer mikrochirurgischen Schere und Pinzette unter einem Stereomikroskop mit mindestens 4-facher Vergrößerung.
- Halten Sie die Probe feucht in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit 1,5 ml Volumen und einem stück fusselfreiem Tuch, das mit Wasser angefeuchtet ist.
- Legen Sie packbares Dentalverbundharz in den Probenschlitz auf der Bühne und legen Sie dann den frischen Hemi-Unterkiefer in den Verbundwerkstoff. Stellen Sie vor der Montage sicher, dass die Knochenoberfläche in Kontakt mit dem Dentalkomposit frei von Weichteilen und trocken ist, da sonst der Dentalkomposit nicht richtig aushärtet.
- Stellen Sie die Position des Hemi-Unterkiefers ein, bis der erste Backenzahn an der Mittellinienrille der Bühne zentriert ist. Stellen Sie sicher, dass die Okklusionsoberfläche horizontal ist. Härten Sie den Verbundwerkstoff aus, wenn Er mit der Positionierung zufrieden ist.
HINWEIS: Zusätzliche kleine Mengen an Dentalkompositen können an den Seiten des Hemi-Unterkiefers und / oder über den Schneidezahn gelegt werden, um die Stabilisierung der Probe zu unterstützen. - Legen Sie das feuchte fusselfreie Tuch in die Feuchtigkeitspools in der Probenphase. Legen Sie den Dentalkomposit auf die Okklusionsoberfläche des ersten Backenzahns. Bevor Sie die Kammer schließen, stellen Sie sicher, dass nichts den Röntgenweg auf Probenebene blockiert.
- Befestigen Sie die Kammer im Mikro-CT. Schrauben Sie die Kammer in den Mikro-CT-Probenstand, so dass die Bewegung während der Bildgebung minimiert wird.
- Schalten Sie die Röntgenbilder ein und machen Sie 2D-Bilder, während Sie den Amboss vertikal absenken, bis die Spitze des Ambosses vom Komposit umgeben ist, aber keine Zunahme der Kraft festgestellt wird.
- Sobald der Amboss in das Komposit eingebettet ist, schließen Sie die Röntgenquelle. Öffnen Sie dann die Mikro-CT-Kammer und härten Sie den Verbundwerkstoff durch das klare Plexiglasfenster aus.
- Nach der gewünschten Dauer der kieferorthopädischen Bewegung opfern Sie die Maus durch zervikale Luxation. Entfernen Sie den Unterkiefer und trennen Sie ihn in Hemi-Unterkiefer.
- Mikro-CT-Einstellungen
- Stellen Sie die Quellspannung auf 40 kV und den Strom auf 200 μA ein. Positionieren Sie die Probe mit einem 10-fachen Vergrößerungsdetektor innerhalb des Sichtrahmens. Verwenden Sie binning von 2 für die aufgenommenen Bilder.
HINWEIS: Da die PDL deutlich weniger dicht ist als Knochen und Zahn, erfordert die Visualisierung der PDL eine höhere Leistung und Belichtungszeit. Dieses Protokoll stellt Einstellungen für die Visualisierung der PDL zur Verfügung. - Stellen Sie die Belichtungszeit für ein einzelnes Bild auf 25 s ein. Stellen Sie die Drehung des Probentsatzes auf einen Bereich von 183 Grad oder mehr ein. Legen Sie den Scan für 2500 Projektionen fest. Verwenden Sie keinen Röntgenquellenfilter, die resultierenden Scans haben auf jeder Seite eine Voxelgröße von 0,76 μm.
- Sammeln Sie einen Referenzscan für die korrekte Rekonstruktion gemäß den Mikro-CT-Richtlinien. Verwenden Sie 1/3 Anzahl der Referenzbilder als Gesamtprojektionen. Rekonstruieren Sie das Volumen ohne zusätzliches Binning mithilfe eines gefilterten Algorithmus für die Rückprojektion.
- Stellen Sie die Quellspannung auf 40 kV und den Strom auf 200 μA ein. Positionieren Sie die Probe mit einem 10-fachen Vergrößerungsdetektor innerhalb des Sichtrahmens. Verwenden Sie binning von 2 für die aufgenommenen Bilder.
3. Clearing-Methode (Abbildung 3)
- Bereiten Sie fünf 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen vor.
- 1,4 ml der folgenden Lösungen werden in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen hergestellt: 4% Paraformaldehyd (PFA) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), 50% Ethanol (EtOH) in entionisiertem (DI) Wasser, 70% EtOH in DI-Wasser und zwei Röhrchen mit 100% EtOH.
HINWEIS: PFA wird zur Fixierung der Probe verwendet. Das ECi-Clearing funktioniert auch bei nicht fixierten Proben. Um nicht fixierte Proben zu löschen, überspringen Sie einfach den PFA-Schritt. - Sezierten Hemi-Unterkiefer in 4% PFA platzieren. Mit Alufolie abdecken und bei sanfter Einstellung bei Raumtemperatur für 6 h auf die Wippe legen.
- Bewegen Sie den Hemi-Unterkiefer auf 50% EtOH. Legen Sie es für 16 h auf die mit Licht bedeckte Wippe.
- Bewegen Sie den Hemi-Unterkiefer auf 70% EtOH. Legen Sie es für 16 h auf die mit Licht bedeckte Wippe.
- Bewegen Sie den Hemi-Unterkiefer auf 100% EtOH. Legen Sie es für 16 h auf die mit Licht bedeckte Wippe.
- Wiederholen Sie 3.6. in der zweiten 100% EtOH-Röhre.
- Bereiten Sie 5 ml ECi in einem Glas- oder Polypropylenrohr vor.
HINWEIS: ECi löst Polystyrol, aber kein Polypropylen. Wenn kein Gewebe mit fluoreszierenden Proteinen verwendet wird, kann die Probe während des Clearing-Verfahrens Licht ausgesetzt werden. - Bewegen Sie den Hemi-Unterkiefer in das ECi-Rohr. Decken Sie das Rohr mit Aluminiumfolie ab und legen Sie es bei sanfter Einstellung für mindestens 12 h auf die Wippe.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden. Dehydrierte Proben können in ECi bei Raumtemperatur gelagert werden. Der Gefrier- bzw. Schmelzpunkt von ECi liegt bei 6,5 bis 8,0 °C. Nicht bei 4 °C lagern. - Der Hemi-Unterkiefer ist bereit für die Bildgebung mit dem Fluoreszenzmikroskop.
HINWEIS: Während der Bildgebung muss die Probe in den ECi eingetaucht werden, um optisch transparent zu bleiben.
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Representative Results
Dieser Artikel stellt eine Methode zur Herstellung von OTM sowie zwei Methoden zur 3D-Bildgebung von Kollagenfasern innerhalb der PDL ohne Schnitte vor. Für Tierversuchszwecke gilt eine Zahnbewegung, wenn eine Ausrichtung der Zähne nicht notwendig ist, als kieferorthopädisch, wenn sie einen Umbau des Alveolarknochens auf allen Wurzelebenen erzeugt. Um ein zuverlässiges OTM zu erzeugen, ist ein konstantes Kraftniveau auf die Zähne erforderlich. Hier wird eine aktivierte Formgedächtnis-NiTi-Spule verwendet, um eine konstante Kraft von 10 g während der Versuchszeit von 7 Tagen und darüber hinaus zu erzeugen, wenn dies gerechtfertigt ist. Die hier beschriebene Spulenaktivierung (Abbildung 1) erzeugt eine Dehnung der NiTi-Spule innerhalb der martensitischen Phase und bringt die Spule in den Hysteresezustand, der den Zahn konstant belastet. Das Erwärmen der Spule mit dem Aushärtungslicht nach dem Einsetzen der Spule stellt auch sicher, dass die Legierung in ihre austenitische Form über wechselt und der Formgedächtniseffekt stattfindet.
Hier zeigen wir repräsentative Ergebnisse von 9 Wochen alten, männlichen Mäusen. Der gemittelte mesiodistale Raum zwischen den Kronen des ersten und zweiten Molars nach 7 Tagen OTM beträgt 40 μm, gemessen zwischen den interproximalen Oberflächen der Molaren im Mikro-CT mit 1-facher Vergrößerung (n= 12, st.dev. = 15 μm) (Abbildung 1E). Der gemittelte Raum der PDL in mesiodistaler Richtung beträgt 80 μm vor und nach 7 Tagen OTM (Abbildung 4B). Dies bestätigt, dass der erste Molar, der messial übersetzt wird, und 7 Tage eine ausreichende Zeit für die Erzeugung von OTM in einem Mausmodell ist, während Prozesse der Knochenresorption und -apposition in der Natur erzeugt werden (Abbildung 4). Mäuse wurden mit einer Standard-Hartpalettendiät gefüttert. Nach dem Einsetzen des Geräts wurde keine Ernährungsumstellung vorgenommen.
Die erste vorgestellte Methode zur Visualisierung der Veränderungen im Zahn-PDL-Knochenkomplex während der OTM basiert auf der phasenverstärkten Mikro-CT-Bildgebung von frischem Gewebe (Abbildung 4), die zuvor ausführlich beschrieben wurde9,18,19,20,22,23. Kurz gesagt, mit einer Phasenverstärkungsfähigkeit eines Mikro-CT oder eines Synchrotrons, mechanischer Stabilisierung des faserigen Gewebes und befeuchteter Umgebung können frische kollagene Fasern ohne Fixierung oder Kontrastmittel visualisiert werden. In der PDL sind die Fasern, die gesehen werden, diejenigen, die sowohl mit dem Zahn als auch mit dem Knochen verbunden sind, hauptsächlich Kollagen Typ I19. Diese einzigartige Möglichkeit, in 3D eine intakte PDL zu visualisieren, ermöglicht die Analyse der 3D-Faserdichte, der Faserorientierung sowie der 3D-Bewegung des Zahnes wie zuvor beschrieben9,19. Konkret stellen wir hier die Visualisierung des Fasernetzwerks in der PDL vor. Zum Zeitpunkt 0 kann ein physiologischer Umbau sowohl im Knochen als auch in der PDL beobachtet werden. Umbau findet auch im zellulären Zement statt; Dies steht jedoch nicht in direktem Zusammenhang mit der vorgestellten Methode und wird daher nicht weiter ausgeführt. Die Knochen-PDL-Schnittstelle ist sowohl in der Quer- (Abbildung 4A) als auch in der sagittalen (Abbildung 4B) Ebene vor jeder Kraftanwendung meist glatt. In der koronalen Ebene (Abbildung 4C) ist die Knochen-PDL-Grenzfläche rauer, insbesondere in Richtung der apikalen Region, die auf die Resorption des Umbaugleichgewichts hinweisen könnte. Bei 3 Tagen OTM (Abbildung 4D-F), an denen der erste Backenzahn messial bewegt wird (Richtung wird durch den gestrichelten Pfeil dargestellt), wird die Faserdichte in der PDL reduziert (weiße Pfeilspitzen). Die Knochen-PDL-Grenzfläche ist rauer als bei 0 Tagen aufgrund der Entwicklung von Kratern in der Knochenoberfläche, die auf osteoklastische Aktivität und Knochenresorptionsprozesse hinweisen, die hauptsächlich mit Kompressionskräften in der PDL26verbunden sind, jedoch hier in Spannungsgebieten nach 3 Tagen. Gewebezerstörung in Spannungsbereichen innerhalb der PDL wurde27,28 vorgeschlagen und kann mit dieser Methode deutlich gesehen werden. Der raue Rand ist auf verschiedenen Ebenen der Wurzeln zu sehen (weiße Pfeile) und deutet daher darauf hin, dass die Zahnbewegung translationaler Natur ist und nicht nur das Kippen der Krone. Bei 7 Tagen OTM (Abbildung 4G-I) sind Knochenresorptionszeichen wie Krater im Knochen, grobe Grenzen und Ausdehnung des PDL-Raums auf allen Ebenen zu sehen, aber der gemittelte PDL-Raum ist schmaler als bei 3 Tagen OTM (Abbildung 4D-F). In einigen Bereichen ist die Knochen-PDL-Grenze jedoch nach 7 Tagen OTM glatter geworden, diese Bereiche befinden sich an den distalen Oberflächen der Wurzeln, was höchstwahrscheinlich ein Hinweis auf eine Knochenapposition ist, wie in OTM in mesialer Richtung erwartet.
Aufgrund der langen Mikro-CT-Bildgebungszeit (~19 h) und der Rotation der Stufe ist die Montage der Probe unerlässlich, um die Probe still zu halten. Instabile Stichprobe führt zu verschwommenen Scans. Abbildung 5 zeigt, wie der Mikro-CT-Scan aussieht, wenn sich die Probe während des Scans bewegt hat. Zahn und Knochen sind verschwommen. Weder PDL-Fasern noch Osteozyten werden beobachtet. Bei solchen Vorfällen ist eine Silhouette um den Rand eines Objekts vorhanden. In Abbildung 5sind mehrere Umrisse der Zahnkrone zu beobachten (Pfeile).
Je nach Forschungsziel kann die Auflösung und Visualisierung der PDL-Fasern im Handel für kürzere Scanzeit geopfert werden, wenn nur Informationen über die Hartgewebe gewünscht werden.
Eine ergänzende Methode zur 3D-Visualisierung der PDL-Fasern ohne Jegliche Schnittführung ist die optische Mikroskopie an optisch gereinigten Proben mittels ECi (Abbildung 3). Diese Methode kann ohne Fixierung an einer Probe angewendet werden und bewahrt fluoreszierende Signale, die vor der Reinigung im Gewebe vorhanden sind. Hemi-Unterkiefer vor und nach der ECi-Beseitigung sind in Abbildung 3B und 3C dargestellt. Eine ausreichende Probenreinigung der PDL kann bestätigt werden, wenn ein Gitterpapier durch den Ramus des Unterkiefers gesehen werden kann. Die Clearingmenge kann durch Verlängerung des Dehydratisierungsprozesses eingestellt werden. Abbildung 6 zeigt das Signal der zweiten harmonischen Generation (SHG) von Kollagenfasern sowohl im Alveolarknochen als auch in der PDL in einem gereinigten Unterkiefer. Die Abbildung der Kollagenfasern des Knochens in 3D ist ein komplizierter Prozess, bei dem häufig elektronenmikroskopische Methoden wie FIB / REM verwendet werden. Unter Verwendung der ECi-basierten Clearing-Methode und SHG sind die alveolären Knochenfasern jedoch deutlich zu sehen, insbesondere in horizontaler Richtung. Beim Übersetzen durch die Probe tief in die PDL von der Knochenoberfläche ist der Übergang zur PDL-Faserebene sehr klar, da die Fasern plötzlich ihre Ausrichtung in eine vertikale ändern.
Die Lichtblattmikroskopie kann auch zur Abbildung fluoreszierender Proteine durch den Knochen verwendet werden. In diesem Fall einer geräumten Probe aus einem transgenen Flk1-cre; Tdtomato Maus19,29,30, die fluoreszierenden Endothelzellen, die die Blutgefäße auskleiden, sind deutlich zu beobachten ( Abbildung7A,B, C, E). Die richtige Klärung ist der Schlüssel zur Erzeugung verständlicher Bilder mit Der Lightsheet-Mikroskopie. Wenn der Knochen nicht vollständig gereinigt ist, wurden Blutgefäße innerhalb der PDL nicht beobachtet (Abbildung 7D, F).
Abbildung 1:Einrichtung des einsetzenden kieferorthopädischen Geräts. A. (A). Mausbett aus Laborbedarf, um das Tier zu unterstützen und den Mund offen zu halten. Die Kunststoffplattform (PP) für den Körper befindet sich auf einer Neigung von 30 ° und die Kopfstütze (HR) befindet sich in einem Winkel von 45 ° von der Oberfläche von PP. Ein 2-stufiger Rohrständer (TS) wird verwendet, um den Endkopf von PP anzuheben. Die Büroklammerschlaufe (schwarzer Pfeil) verankert die oberen Schneidezähne, und die untere kieferorthopädische Stromkette (weißer Pfeil) hängt an den unteren Schneidezähnen. Für die Sichtprüfung der Backenzähne wurde ein Inspektionsspiegel mit einem Durchmesser von 5 mm verwendet. B. Seitenansicht des Mausbettes. Winkel zwischen den Flächen sind markiert (grün und magenta). C. (EN) Repräsentatives Bild des ordnungsgemäß platzierten Geräts. D. Molaren, die vor der Implantation des Geräts durch den Inspektionsspiegel gesehen werden. E. (D. ) Repräsentatives Bild von Backenzähnen nach der kieferorthopädischen Bewegung. Gestrichelte Linien zeichnen den Umriss des ersten und zweiten Backenzähns nach. F. (F. Diagramm des Geräts und seiner Platzierung. Die rote Linie stellt die Drahtligatur um den ersten Backenzahn dar. Die orangefarbene Linie steht für fließfähiges Verbundharz, das zur Verankerung der Spule verwendet wird. NiTi-Spule ist blau dargestellt und beschriftet. G. (EN) Sezierte Hemi-Unterkiefer mit dem Gerät nach 7-tägiger kieferorthopädischer Bewegung. Beachten Sie, dass die 3 Spulengewinde noch offen sind, was darauf hinweist, dass die Spule nach 7 Tagen noch aktiv ist. Maßstabsleiste = 1 mm in E und G. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Hemi-Unterkiefer montiert in einer maßgeschneiderten Kammer für die Mikro-CT-Bildgebung. A. Vollständige Einrichtung der Probenkammer innerhalb der Mikro-CT-Maschine. Die Röntgenquelle ist links und der Detektor rechts zu sehen. Das rote Rechteck umreißt den in der Kammer auf der Probenbühne (SS) montierten Hemi-Unterkiefer. Die hier gezeigte Beispielkammer ist Teil eines mechanischen Prüfaufsatzes, einschließlich Motor (M), Amboss (A, umrandet von weißen gestrichelten Linien) und Ambosswelle (AS) auf der Kammer. Das komplette Setup wird auf die CT-Bühne geschraubt. Das Inset-Bild zeigt die Nahaufnahme des rot umrandeten Bereichs, der die Feuchtigkeitskammer mit der Probe im Inneren enthält. B. Dreste Ansicht der probemontierten Probe. Feuchtigkeitspools (grauer Pfeil) sind am Umfang integriert, um die Feuchtigkeit während der Bildgebung aufrechtzuerhalten. Auf der kreisförmigen Bühne in der Mitte kann ein Hemi-Unterkiefer in der schrägen tiefen Nut (schwarzer Pfeil) montiert werden. Eine dünne Rille (weißer Pfeil) markiert die Mittellinie der Bühne, um die Orientierung der Probe zu unterstützen. C. (EN) Diagramm der kreisförmigen Stufe mit der Probennut. Die Neigung der Nut stützt den Unterkiefer und ermöglicht die Montage der Backenzähne entlang der vertikalen Achse der Wurzeln. D. Repräsentative Mikro-CT-2D-Scheibe kombiniert mit einem 3D-Volumenbild der Hemi-Unterkieferprobe. Die interproximale Lücke beträgt hier 52 μm. Die Probe wird auf dem Probenstadium unten (nicht gezeigt) und dem Amboss (A) oben durch Dentalverbund (DC) montiert. Maßstabsleiste = 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3. ECi-basierte Clearing-Methode für sezierte Maus-Hemi-Unterkiefer. A. (A). Der sezierte Hemi-Unterkiefer wird nacheinander in 4% PFA, 50% EtOH, 70% EtOH und 100% EtOH getaucht. Nach der Dehydrierung wird der Hemi-Unterkiefer bis zur Bildgebung mindestens 12 Stunden in ECi gelagert. B. Hemi-Unterkiefer unmittelbar nach der Dissektion. C. (EN) Hemi-Unterkiefer nach Abschluss der Räumung. Maßstabsbalken = 5 mm Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Repräsentative in-situ Mikro-CT-Scans der PDL einer frischen Probe in den verschiedenen Stadien der kieferorthopädischen Bewegung. A-C, Keine kieferorthopädische Bewegung. A. (A). Mikro-CT 2D-Bild in der Querebene des Hemi-Unterkiefers, das die mesialen (M) und distalen (D) Wurzeln im Alveolarknochen, B-Buccal, L-Lingual Seiten des Alveolarknochens zeigt. Zwischen den Zahnwurzeln und dem Alveolarknochen sind der PDL-Raum und die darin enthaltenen Fasern deutlich zu beobachten. B. 2D-Bild in der sagittalen Ebene. C. 2D-Bild in der koronalen Ebene. D-E, 2D-Bilder nach 3 Tagen OTM, Pfeilspitzen zeigen auf Bereiche in der PDL mit Verringerung der Kollagenfaserdichte, weiße Pfeile zeigen auf Bereiche der Knochenresorption. G-I, 2D-Bilder nach 7 Tagen OTM, schwarze Pfeile zeigen auf Bereiche der Knochenapposition. Maßstabsbalken = 150 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: 2D-Mikro-CT-Bild in der sagittalen Ebene, das verschwommene Strukturen von Zahn und Knochen aufgrund der Bewegung des Zahnes während des Scans zeigt. Pfeile zeigen auf mehrere Brettlinien des Zahnes und zeigen seine Bewegung an. Maßstabsleiste 150 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: ECi geräumte Unterkiefer mit dem ersten Backenzahn, der mit der zweiten harmonischen Generation (SHG) abgebildet wurde. Weißer Pfeil zeigt auf einen Bereich, in dem Kollagenfasern der PDL zu sehen sind, beachten Sie die vertikale Ausrichtung, schwarze Pfeile zeigen auf einen Bereich, in dem sowohl vertikale Fasern der PDL als auch horizontale Fasern des Alveolarknochens zu sehen sind. T-Zahn, F-Furkation, AB-Alveolarknochen, MR-Mesialwurzel, DR-Distalwurzel, Schuppenstab 150 μm. Die Bilder wurden mit einem 20-fachen Multiimmersionsobjektiv für Lösungen mit RI von 1,33-1,56 erhalten. Der Anregungslaser wurde auf 860nm bei 10% Leistung eingestellt. Pixel-Verweildauer: 0,51μs; Scan-Modus: Rahmen; Mittelwert: 16; Detektortyp: nicht abgescannter Photomultiplikatorröhrendetektor; Detektorverstärkung 800V. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7. Lightsheet-Mikroskopaufnahmen der ECi-gelöschten Flk1-Cre;tdTomato Maus. A. (A). Optimal gereinigter Kontroll-Hemi-Unterkiefer. Das Netzwerk der Blutgefäße innerhalb des Knochens (Pfeilspitze) und PDL-Raums (Pfeil) ist sichtbar. B. Der Einschub der mesiolingualen Region des ersten Backenzahns (rot umrandet in A) zeigt die Blutgefäße. C. optimal gereinigt 7-Tage-OTM-Hemi-Unterkiefer und D. suboptimal gereinigter Hemi-Unterkiefer. E. (D. ) 2D-Bild von Panel C in der sagittalen Ebene, das Bild zeigt gut definierte Blutgefäße im Knochen (grauer Pfeil) und PDL-Raum (weiße Pfeile). F. (F. Zweidimensionales Schnittbild von Panel D, gleicher Bereich wie Bilder in E, was zu einem verschwommenen Bild führt. Maßstabsbalken A, C, D = 500 μm, B, E, F = 100 μm Die Bilder wurden mit einem 5X-Planobjektiv unter Verwendung der Kamera als Detektor aufgenommen. Der Anregungslaser betrug 561 nm bei 4% Leistung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die Erzeugung von OTM bei Mäusen ist aufgrund der Größe, Genetik und Handhabungsvorteile sehr erwünscht. Die Verwendung des Unterkiefers bietet eine einfache Handhabung sowohl in Bezug auf die Gewebedissektion als auch auf die Probenvorbereitung und Bildgebung. Hier haben wir eine Methode vorgestellt, um OTM mit translationaler Bewegung des Zahnes im Knochen innerhalb von 7 Tagen nach OTM zu erzeugen. Mit diesem Protokoll kann die Gesamtdauer der Zahnbewegung verlängert werden, da die aktivierte Spule ein konstantes Kraftniveau für Bewegungen von bis zu ca. 1 mm liefert. Die Mesialseite der Spule ist jedoch am Schneidewerk befestigt, das ständig ausbricht. Infolgedessen verändern sich die Kraftvektoren allmählich und beginnen Extrusionskräfte zu erzeugen. Dies kann vermieden werden, wenn alle 7 Tage eine Einstellung des Bindungsniveaus am Messende durchgeführt wird.
Die PDL ist der Initiator für OTM, daher ist es von großer Bedeutung, ihre Struktur und Funktion in den verschiedenen Phasen des OTM zu verstehen. Die PDL ist jedoch sowohl in ihrer Struktur als auch in ihrer Funktion nicht einheitlich19,22,31,32. Um aussagekräftige Daten abzurufen, muss die PDL daher in 3D untersucht und jegliche Gewebeschnitte und -manipulationen so weit wie möglich vermieden werden. Die Untersuchung eines Weichgewebes zwischen zwei Hartgeweben macht es jedoch schwierig, solche Anforderungen zu erfüllen. Traditionelle Methoden zur Untersuchung der PDL beinhalten oft die Kompromittierung der 3D-Struktur und die Entfernung des Gewebes aus seiner physiologischen Umgebung, was folglich die strukturellen und biomechanischen Eigenschaften der PDL verändert. Sowohl strukturelle als auch biomechanische Eigenschaften unterliegen während des OTM dynamischen Veränderungen, die es rechtfertigen, den 3D-Kontext des Gewebes noch weiter zu erhalten. Dazu haben wir zwei Methoden beschrieben, die eine Ganzgewebsbildung ohne Schnittbildung ermöglichen, die auch auf derselben Probe co-lokalisierende fluoreszierende Signale, morphologische und Mineralisierungsdaten angewendet werden können.
Die bereitgestellte methodische Beschreibung weist die Leser an, die Methoden in ihren Studienbereichen anzuwenden. Die Mikro-CT-Bildgebung ermöglicht die 3D-Visualisierung des PDL-Fasernetzwerks. Bilder können analysiert werden, um Richt- und Dichteanalysen zu erstellen und Veränderungen in der PDL während des OTM quantitativ zu untersuchen. Wir haben auch eine Clearing-Methode beschrieben, die eine Visualisierung mit leicht verfügbaren optisch-mikroskopischen Methoden wie Lightsheet-Mikroskopie und konfokale Bildgebung ermöglicht. Die Lightsheet-Mikroskopie hat den Vorteil, ein 3D-Bild von großen Proben mit relativ hoher Bildgeschwindigkeit zu erzeugen. Die konfokale Mikroskopie ermöglicht eine hochauflösende 3D-Visualisierung unter Verwendung des SHG-Signals für die Bildgebung von Kollagenfasern und fluoreszierenden Tags. Diese Methoden unabhängig oder kombiniert eröffnen viele Möglichkeiten für 3D-Strukturstudien mit minimaler Gewebevorbereitung.
Mehrere anspruchsvolle Schritte in diesem Protokoll erfordern besondere Aufmerksamkeit:
Erstens muss der Ligaturdraht während der Spulenplatzierung sicher zwischen den ersten und zweiten Backenzähnen platziert werden. Dieser Prozess ist aufgrund der geringen Abmessungen der Mauszähne eine Herausforderung. Wir empfehlen die Verwendung von Tisch-Stereomikroskop, um die Platzierung zu leiten. Kleine Bewegungen während des Eingriffs können jedoch die Maus bewegen und dazu führen, dass der interessierenswerte Bereich aus dem Sichtfeld herausgeht. Als Alternative empfehlen wir die Verwendung von 4-5-fachen Lupen, die am Bediener getragen werden können, was dazu beitragen könnte, den Bereich dynamischer zu betrachten.
Zweitens hängen die Clearing-Ergebnisse vom Dehydratisierungsprozess ab. Wenn die Probe nicht das gewünschte Transparenzniveau erreicht hat, ist unser Vorschlag, die Dehydratationszeit zu erhöhen. Genauer gesagt hat sich gezeigt, dass eine längere Immersionszeit in 100% EtOH die Transparenz des Endprodukts verbessert. Es sollte jedoch beachtet werden, dass ein erhöhter Austrocknungsgrad die Fluoreszenzwerte dramatisch reduzieren kann24,25. Die vorgestellte ECi-basierte Methode konnte gezeigt werden, dass sie fluoreszierende Signale länger als 2 Wochen24konserviert.
Aspekte dieses Protokolls können modifiziert werden, um eine Vielzahl anderer Zwecke zu untersuchen. Die Kammer, die wir im Inneren des Mikro-CT entworfen haben, ist mit einer Wägezelle und einem Motor gekoppelt und kann Spannungs- / Drucktests an den Hemi-Unterkieferproben durchführen. In Kombination mit der Visualisierung des Mikro-CT kann dieser Aufbau Veränderungen in der PDL in-situ mit unterschiedlichen mechanischen Belastungendarstellen 21. Die beschriebene Clearing-Methode könnte auch an unfixierten Proben implementiert werden, was eine Möglichkeit für eine interessante Kombination verschiedener Bildgebungsmodalitäten bietet.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Diese Studie wurde vom NIH (NIDCR R00- DE025053, PI:Naveh) unterstützt. Wir danken dem Harvard Center for Biological Imaging für die Infrastruktur und Unterstützung. Alle Zahlen werden mit biorender.com generiert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-mL BD Luer-Lok syringe | BD | 309628 | |
| 1X phosphate buffered saline | VWR Life Sciences | 0780-10L | |
| 200 proof ethanol | VWR Life Sciences | V1016 | |
| Aluminum alloy 5019 wire | Sigma-aldrich | GF15828813 | 0.08 mm diameter wire, length 100th, temper hard. Used as wire ligature around molar. |
| Avizo 9.7 | Thermo Fisher Scientific | N/A | Used to analyze microCT scans |
| Castroviejo Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Clr Plan-Apochromat 20x/1.0,CorrVIS-IR M27 85mm | Zeiss | N/A | Used for second harmonic generation imaging |
| Cone socket handle, single ended, hand-form | G.Hartzell and son | 126-CSH3 | Handle of the inspection mirror |
| EC Plan-Neofluar 5x/0.16 | Zeiss | 440321-9902 | Used for light-sheet imaging |
| Elipar DeepCure-S LED curing light | 3M ESPE | 76985 | |
| Eppendorf safe-lock tubes, 1.5mL | Eppendorf | 22363204 | |
| Ethyl cinnamate, >= 98% | Sigma-aldrich | W243000-1KG-K | |
| Hypodermic Needle, 27G x 1/2'' | BD | 305109 | |
| Ketathesia 100mg/ml | Henry Schein Animal Health | NDC:11695-0702-1 | |
| KIMWIPES delicate task wipers | Kimberly-Clark | 21905-026 (VWR Catalog number) | Purchased from VWR |
| LightSheet Z.1 dual illumination microscope system | Zeiss | LightSheet Z.1/LightSheet 7 | Used for lightsheet imaging |
| LSM 880 NLO multi-photon microscope | Zeiss | LSM 880 NLO | Used for two-photon imaging |
| MEGAmicro, plane, 5mm dia, SS-Thread | Hahnenkratt | 6220 | Front surface inspectrio mirror |
| MicroCT machine, MicroXCT-200 | Xradia | MICRO XCT-200 | |
| Mini-Colibri | Fine Science Tools | 17000-01 | |
| PermaFlo Flowable Composite | Ultradent | 948 | |
| Procedure platform | N/A | N/A | Custom-made from lab materials |
| Routine stereo micscope M80 | Leica Micosystems | M80 | |
| Sentalloy NiTi open coil spring | TOMY Inc. | A 0.15mm diameter closed NiTi coil with an inner coil diameter of 0.9mm delivers a force of 10g. Similar products can be purchased from Dentsply Sirona. | |
| T-304 stainless steel ligature wire, 0.009'' diameter | Orthodontics | SBLW109 | 0.009''(.23mm) diameter, Soft temper |
| X-Ject E (Xylazine) 100mg/ml | Henry Schein Animal Health | NDC:11695-7085-1 | |
| Z100 Restorative, A2 shade | 3M ESPE | 5904A2 |
References
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