Summary
Farelerde ortodontik diş hareketi oluşturmak için bir protokol ve periodontal ligamentin kollajen liflerinin ve kan damarlarının bölümlenmeden 3D görselleştirilmesi için yöntemler sunuyoruz.
Abstract
Ortodontik diş hareketi, dış kuvvetlerin bir sonucu olarak değiştirilmiş yumuşak ve sert doku tadilatının karmaşık bir biyolojik sürecidir. Bu karmaşık tadilat süreçlerini anlamak için diş ve periodontal dokuların 3D bağlamlarında incelenmesi ve bu nedenle herhangi bir kesit ve doku yapıtının en aza indirilmesi kritik öneme sahiptir. Fare modelleri genellikle gelişimsel ve yapısal biyolojinin yanı sıra küçük boyutları, yüksek metabolizma hızları, genetikleri ve kullanım kolaylığı nedeniyle biyomekanikte de kullanılır. Prensip olarak bu aynı zamanda onları dişle ilgili çalışmalar için mükemmel modeller yapar. Bununla birlikte, büyük bir engel, küçük diş boyutları, özellikle azı dişleridir. Bu makale, ortodontik diş hareketinin oluşturulması için adım adım bir protokol ve bir fare mandibular azı dişinin periodontal ligament fibrus bileşeninin 3D görüntülenmesi için iki yöntem sağlamayı amaçlamaktadır. Sunulan ilk yöntem, taze kollajen dokuların faz geliştirme görüntülemesini sağlayan bir mikro-BT kurulumuna dayanmaktadır. İkinci yöntem, kesit olmadan kemikten görüntülemeyi sağlayan ve endojen floresanları koruyan etil cinnamat kullanan bir kemik temizleme yöntemidir. Bu temizleme yöntemini Flk1-Cregibi muhabir farelerle birleştirmek; TdTomato, PDL ve alveolar kemikteki 3D vaskülatları görüntüleme fırsatı sağladı.
Introduction
Ortodontik diş hareketinde (OTM) altta kalan temel biyolojik süreç kemik tadilatıdır. Bu tadilat işleminin tetikleyicisi, periodontal ligamentin (PDL) yapısındaki hücreler arası matris (ECM) stresi, nekroz, kan damarı yıkımı ve oluşumu 1 ,2,3gibideğişikliklereatfedilir. Alveolar kemik tadilatı için diğer olası tetikleyiciler, kemikteki osteositler tarafından zorla algılamanın yanı sıra alveolar kemiğin kendisinin mekanik deformasyonu ile ilgilidir; ancak OTM'deki rolleri hala tam olarak aydınlatılmamıştır4,5.
OTM sırasında PDL'nin yapı-işlev ilişkilerini ortaya çıkarmayı amaçlayan birçok çalışmaya rağmen, net bir fonksiyonel mekanizma henüz tanımlanmamıştır6,7. Bunun başlıca nedeni, iki sert doku (çimento ve alveolar kemik) arasında bulunan yumuşak bir dokunun (PDL) verilerinin alınarak ele geçirildir. Yapısal bilgi toplamak için kabul edilen yöntemler genellikle PDL yapısını bozan ve değiştiren sabitleme ve bölümleme gerektirir. Ayrıca, bu yöntemlerin çoğu, bozulmamış olsa bile, yalnızca kısmi ve yerelleştirilmiş bilgiler veren 2D veriler sağlar. PDL yapısında ve işlevinde tekdüze olmadığından, tüm diş-PDL-kemik kompleksinin sağlam 3D yapısını ele alan bir yaklaşım garanti edilir.
Bu makalede, farelerde bir OTM oluşturmak için bir yöntem ve pdl'deki kollajen liflerinin numunenin herhangi bir bölümü olmadan 3D görselleştirilmesini sağlayan iki yöntem açıklanmaktadır.
Murine modelleri tıp, gelişim biyolojisi, ilaç teslimi ve yapısal çalışmalarda in-vivo deneyler için yaygın olarak kullanılmaktadır. Belirli proteinleri ve fonksiyonları ortadan kaldırmak veya geliştirmek için genetik olarak değiştirilebilirler; hızlı, tekrarlanabilir ve öngörülebilir gelişimsel kontrol sağlarlar; ayrıca küçük boyutları nedeniyle görüntüleri kolaydır8. Birçok avantajlarına rağmen, diş araştırmalarındaki fare modelleri, özellikle klinik manipülasyonlar garanti edildiğinde, çoğunlukla küçük boyutlu dişler nedeniyle sık kullanılmaz. Sıçanlar9,10,11,köpekler12,13,domuzlar14 , 15,16ve maymunlar17 gibi hayvan modelleri farelerden daha sık kullanılır. Yüksek çözünürlüklü görüntüleme tekniklerinin son zamanlarda gelişmesiyle, OTM'deki dolambaçlı süreçleri çözmek için bir fare modeli kullanmanın avantajları çoktur. Bu makale, kemik tadilatını tetikleyen sabit kuvvet seviyelerine sahip mandibuladaki azı dişinin mesial hareketini oluşturmak için bir yöntem sunun. Kemirgenlerdeki OTM deneylerinin çoğu maksillada yapılır, çünkü mandibulanın hareketliliği ve dilin varlığı başka bir karmaşıklık seviyesi ekler. Bununla birlikte, 3D yapısal bütünlük istendiğinde mandibula birçok avantaja sahiptir. Bütün bir kemik olarak kolayca parçalanabilir; bazı türlerde lifli senfonik yoluyla iki hemi-mandibulaya ayrılabilir; kompakt, düzdür ve herhangi bir sinüs alanı olmayan sadece dişleri içerir. Buna karşılık, maksilla kafatasının bir parçasıdır ve diğer organlar ve yapılarla yakından ilgilidir, bu nedenle alveolar kemiği ilişkili dişlerle parçalamak için kapsamlı bir bölümleme gerekir.
Faz geliştirme sağlayan yüksek çözünürlüklü bir mikro BT içindeki bir yükleme sistemine bağlı bir ev içi nem odası kullanarak, daha önce açıklandığı gibi3Dtaze lifli dokuları görselleştirmek için bir yöntem geliştirdik 9 , 18,19,20,21,22,23. Taze dokular, hayvan herhangi bir lekelenme veya fiksasyon olmadan kurban edildikten hemen sonra taranır, bu da doku eserlerini ve biyomekanik özelliklerin değişikliklerini azaltır. Bu 3D veriler, başka bir yerde açıklandığı gibi liflerin dağıtım ve yön analizleri için kullanılabilir19.
Burada sunulan ikinci 3D tüm doku görüntüleme yöntemi, PDL liflerinin herhangi bir kesit olmadan kemik yoluyla görüntülenmesini sağlayan mandibulanın optik olarak temizlenmesine dayanmaktadır. İlginçtir ki, kemiğin kollajen liflerinin görselleştirilmesini de sağlar, ancak bu burada tartışılmaz. Genel olarak, doku temizleme için iki yöntem vardır. Birincisi, numunenin basit bir daldırma, hiperhidrasyon veya hidrojel gömme yoluyla 1,4'ten büyük bir kırılma indeksine sahip sulu bir çözeltiye batırıldığı sulu bazlı temizlemedir. Bununla birlikte, bu yöntem şeffaflık düzeyinde olduğu kadar dokunun yapısal korunmasında da sınırlıdır ve bu nedenle dokunun sabitlenerek yapılmasını gerektirir. Son derece şeffaf numuneler veren ve fiksasyon gerektirmeyen ikinci yöntem solvent bazlı temizleme yöntemi24,25. Mandibular numuneler için etil-3-fenilprop-2-enoate (etil cinnamat, ECi) bazlı modifiye solvent bazlı bir temizleme yöntemi oluşturduk. Bu yöntem toksik olmayan gıda sınıfı temizleme maddesi, minimum doku büzülmesi ve floresan proteinlerin korunması avantajlarına sahiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri, NIH'nin Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımına ilişkin Yönergeleri ve Harvard Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin yönergelerine uygun olarak gerçek gerçekleştirildi (Protokol no. 01840).
1. Ortodontik Diş Hareketi
- Bir fare yatağı oluşturmak için, kama şeklinde, 45 ° açılı bir başlık ile düz bir plastik platform kullanın. Başlık plastik bir kutu kesilerek oluşturulabilir.
- Başlık ve masa düzlemi arasında yaklaşık 30° açı oluşturmak için platformun baş ucunu yükseltin. Üst kesici dişleri tutmak için baş yan uca bükülmüş kalın bir ataş (0,036" çapında) takın.
- Kuyruk ucunda, alt kesici dişleri tutmak için ortodontik bir güç zincirinin takılabileceği yükseltilmiş bir yüzey oluşturun. Örnek bir platform için Şekil 1'e bakın.
- 10 mg/ kg'da intraperitoneal ksilazin enjeksiyonu ve 1 mL şırınga ve 27 Gauge iğne kullanarak ketamin 100mg / kg ile fareyi uyuşturun.
- Uyuşturuldu fareyi özel yapım platforma yerleştirin ve üst kesici dişleri ataç halkasına bağlayarak üst çeneyi hareketsiz hale getirin. Alt kesici dişlere bağlı ortodontik güç zinciri ile fare alt çenesini açın. Mini-colibri ağız retraktörü ile yanakları geri çekin.
- Platformu cerrahi bir mikroskop veya 5-6x büyütmeye ulaşabilen başka bir stereoskop altına yerleştirin.
- Kornea dehidrasyonunu önlemek için fare gözlerine 50 μL salin (kabaca 1 damla) uygulayın. Her 20 dakikada bir salin doldur.
- 1 cm uzunluğunda alüminyum telin bir parçasını (0,08 mm çapında) kesin. Mikrocerrahi iğne tutucu kullanarak birinci ve ikinci azı dişleri arasındaki temas noktasını lingual olarak bukkal taraftan kaydırın. yay ucuna geçirilmek üzere ilk azı dişinin önüne 2 mm serbest kenar bırakın.
- Yaklaşık 7 ila 9 iplik uzunluğunda bir nikel titanyum (NiTi) bobini kesin.
NOT: Bobinin elastik özellikleri ortodontik hareket için sabit kuvvet sağlayacaktır. Bobinin toplam sınırsız uzunluğu kesici diş ile azı dişi arasındaki boşluktan daha kısa olmalıdır. Dişin bobinini tutturmak için her iki ucunda fazladan 2 dişe ihtiyaç olduğunu unutmayın. Mikro CT taraması sırasında ışın sertleştirme gibi tarama yapıtlarını azaltmak için alüminyum tel seçilir. - NiTi bobin yayı (0,15 mm tel çapı, 0,9 mm iç bobin çapı; alt ilk azı dişi ve alt kesici diş arasına 10 g kuvvet sağlar) yerleştirin. 1.6. adımda ilk azı dişinin etrafına yerleştirilen tel bağını kullanın, bobini azı dişi tarafındaki sabitlemek için kabloyu bobin yayı etrafında sıkıca bükün.
- Düzgün kuvvet seviyesi sağlamak için, ilk azı dişi ve kesici diş arasında tam olarak 3 aktif diş kullanın. Güç zincirini kesici dişten geçici olarak çıkarın ve bobini tutturmak için kesici diş üzerinde 2 ila 3 sınırlanmamış diş döngüsü. diş parçacıklarını kesici diş serbest dişeti kenar boşluğuna kaydırın.
- Bobinin insidans sınırına bir akışlı kompozit reçine tabakası yerleştirin ve diş kürleme ışığı ile kürleyin. Reçineyi iyileştirdikten sonra güç zincirini değiştirin.
- Aynı kür ışığını kullanarak, NiTi bobini 20 sn ısıtın. Bu, NiTi bobini sıkır. Bitmiş yerleşim Şekil 1Cgösterilir.
- Kontralteral tarafı sağlam bırakın veya birinci ve ikinci azı dişleri arasına tel gibi bir düzmece yerleştirin.
- Fareyi iyileşene kadar sıcak tutmak için anestezi edilmiş fareyi ısıtılmış bir ışığın altına yerleştirin.
- Fareyi tekrar tek bir kafese yerleştirin ve günlük olarak izleyin. Ortodontik hareket sırasında diyet değişikliğine gerek yoktur.
NOT: Bir tarafta OTM cihazı bazı rahatsızlıklara neden olur, ancak beslenmeyi bozmaz. Bununla birlikte, her iki tarafa da cihaz takmak, ilave rahatsızlık miktarı nedeniyle tavsiye edilir. Dışa doğru ağrı belirtileri görülmediği sürece ağrı kesiciye gerek yoktur.
2. Taze hemi-mandibulalarda PDL liflerinin mikro-CT taraması
- Hemi-mandibula montajı (Şekil 2)
- İstenilen ortodontik hareket süresinden sonra, fareyi servikal çıkık yoluyla feda edin. Mandibulayı çıkarın ve hemi-mandibulalara ayırın.
NOT: Numune düzeltilmeyeceğinden, çenenin diseksiyonunun ve montajının en kısa sürede, ideal olarak 30 dakika içinde yapılması önemlidir. - Temiz tüy bırakmayan bir mendille çevredeki yumuşak dokuyu nazikçe çıkarın.
- Ortodontik cihazı, stereo mikroskop altında mikrocerrahi makas ve cımbız kullanarak en az 4 kat büyütme ile çıkarın.
- Numuneyi 1,5 mL hacimde, mikro santrifüj tüpünde ve suyla nemlendirilmiş tüy bırakmayan bir silme parçasında saklayın.
- Paketlenebilir diş kompozit reçinesini sahnedeki numune yuvasına yerleştirin, ardından taze hemi-mandibulayı kompozit içine yerleştirin. Montajdan önce, diş kompoziti ile temas eden kemik yüzeyinin yumuşak dokulardan arındırılmış ve kuru olduğundan emin olun, aksi takdirde diş kompoziti düzgün bir şekilde tedavi etmeyecektir.
- İlk azı dişi sahnenin orta çizgisi oluğuna ortalanana kadar hemi-mandibulanın konumunu ayarlayın. Oklüzal yüzeyin yatay olduğundan emin olun. Konumlandırmadan memnun kaldığında kompoziti iyileştirin.
NOT: Numunenin stabilize edilmesine yardımcı olmak için hemmi mandibulanın yanlarına ve/veya kesici ucun üzerine ek az miktarda diş kompoziti yerlenebilir. - Örnek aşamasındaki nem havuzlarının içine sönümlenmiş tüy bırakmayan mendil yerleştirin. Diş kompozitini ilk azı dişinin oklüzal yüzeyine yerleştirin. Odayı kapatmadan önce, numune seviyesinde x-ray yolunu hiçbir şeyin engellemediş olduğundan emin olun.
- Odayı mikro-CT'ye yapıştırın. Hazneyi mikro-CT numune aşamasına vidalayarak görüntüleme sırasındaki hareketin en aza indirilmesini sağla.
- X ışınlarını açın ve örs dikey olarak indirilirken, örs ucu kompozitle çevrilinceye kadar 2D görüntüler çekin, ancak kuvvette bir artış tespit edilir.
- Örs kompozit içine gömüldükten sonra x-ray kaynağını kapatın. Ardından, mikro CT odasını açın ve kompoziti açık Pleksiglas pencereden iyileştirin.
- İstenilen ortodontik hareket süresinden sonra, fareyi servikal çıkık yoluyla feda edin. Mandibulayı çıkarın ve hemi-mandibulalara ayırın.
- Mikro BT ayarları
- Kaynak voltajı 40 kV ve akımı 200 μA olarak ayarlayın. Yakalanan görüntüler için 2 binning kullanın.
NOT: PDL kemik ve dişten önemli ölçüde daha az yoğun olduğundan, PDL'yi görselleştirmek daha yüksek güç ve pozlama süresi gerektirir. Bu protokol PDL'yi görselleştirmek için ayarlar sağlar. - Tek görüntü pozlama süresini 25 s olarak ayarlayın. Örnek aşamanın dönüşünü 183 derece veya daha fazla bir aralığa ayarlayın. 2500 projeksiyon için taramayı ayarlayın. Herhangi bir x-ışını kaynak filtresi kullanmayın, elde eden taramaların her iki tarafında 0,76 μm voksel boyutu vardır.
- Mikro BT yönergelerine göre uygun rekonstrüksiyon için bir referans taraması toplayın. Toplam projeksiyon olarak 1/3 sayıda referans görüntü kullanın. Geri projeksiyon filtreli bir algoritma kullanarak, ek binning olmadan birimi yeniden oluşturun.
- Kaynak voltajı 40 kV ve akımı 200 μA olarak ayarlayın. Yakalanan görüntüler için 2 binning kullanın.
3. Temizleme yöntemi (Şekil 3)
- Beş 1,5 mL mikro santrifüj tüpü hazırlayın.
- 1,5 mL mikro santrifüj tüplerde aşağıdaki çözeltilerden 1,4 mL hazırlayın: Fosfat tamponlu salinde (PBS) %4 paraformaldehit (PFA), deiyonize (DI) suda %50 etanol (EtOH), DI suyunda %70 EtOH ve %100 EtOH iki tüp.
NOT: PFA, numunenin sabitlenmesi için kullanılır. ECi temizleme, düzeltilmemiş numuneler üzerinde de çalışır. Düzeltilmemiş örnekleri temizlemek için PFA adımını atlamanız yeterlidir. - %4 PFA'da parçalanmış hemi-mandibula yerleştirin. Alüminyum folyo ile örtün ve 6 saat boyunca oda sıcaklığında yumuşak ayarda sallayıcıya yerleştirin.
- Hemi-mandibulayı % 50 EtOH'a taşıyın. 16 saat boyunca ışıktan kaplanmış rocker üzerine yerleştirin.
- Hemi-mandible'ı % 70 EtOH'a taşıyın. 16 saat boyunca ışıktan kaplanmış rocker üzerine yerleştirin.
- Hemi-mandible'ı % 100 EtOH'a taşıyın. 16 saat boyunca ışıktan kaplanmış rocker üzerine yerleştirin.
- 3.6'ı tekrarlayın. ikinci %100 EtOH tüpünde.
- Bir cam veya polipropilen tüpte 5 mL ECi hazırlayın.
NOT: ECi polistireni çözrür, ancak polipropilen çözmez. Ayrıca, floresan proteinli bir doku kullanmazsa, numune temizleme işlemi sırasında ışığa maruz kalabilir. - Hemi-mandibulayı ECi tüpüne taşıyın. Tüpü alüminyum folyo ile örtün ve en az 12 saat boyunca hafif bir ayarda rocker üzerine yerleştirin.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Susuz numune oda sıcaklığında ECi'de saklanabilir. ECi'nin donma veya erime noktası 6,5 ila 8,0 °C'dir. 4 °C'de saklamayın. - Hemi-mandibula floresan mikroskop ile görüntüleme için hazırdır.
NOT: Görüntüleme sırasında, optik olarak saydam kalabilmesi için numunenin ECi'ye batırılması gerekir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu makale, OTM üretmek için bir yöntemin yanı sıra PDL içindeki kollajen liflerinin herhangi bir bölümleme olmadan 3D görüntülenmesi için iki yöntem sürmektedir. Hayvansal araştırma amacıyla, dişlerin hizalanması gerekli olmadığında, alveolar kemiğin tüm kök seviyelerinde yeniden şekillendirilmesini sağlarsa, bir diş hareketi ortodontik olarak kabul edilir. Güvenilir bir OTM oluşturmak için dişlere uygulanan sabit kuvvet seviyesi gereklidir. Burada, etkinleştirilmiş bir şekil-bellek NiTi bobini, garanti edilirse 7 gün ve sonrasındaki deneysel süre boyunca 10 g tutarlı bir kuvvet oluşturmak için kullanılır. Burada açıklanan bobin aktivasyonu (Şekil 1) martensitik faz içinde NiTi bobininde suş oluşturur ve bobini dişe sürekli stres sağlayan histegenez durumuna getirir. Bobin yerleştirildikten sonra bobini kürleme ışığı ile ısıtmak da alaşımların austenitik formuna kaymasını ve şekil bellek etkisinin gerçekleşmesini sağlayacaktır.
Burada 9 haftalık erkek farelerden temsili sonuçlar gösteriyoruz. 7 günlük OTM'den sonra birinci ve ikinci azı dişlerinin kronları arasındaki ortalama mesiodistal boşluk, mikro-CT'deki azı dişlerinin 1X büyütmeli interproksimal yüzeyleri arasında ölçüldüğü gibi 40 μm'dir (n=12, st.dev. = 15 μm) (Şekil 1E). PDL'nin mesiodistal yönde ortalama alanı 7 günlük OTM öncesi ve sonrası 80 μm'dir(Şekil 4B). Bu, ilk azı dişinin mesially ve 7 gün, doğada kemik erimesi ve apseleme işlemleri oluştururken bir fare modelinde OTM üretmek için yeterli bir zaman olduğunu doğrular (Şekil 4). Fareler standart bir sert palet diyeti ile beslendi. Cihaz takılması sonrası diyet değişikliği yapılmadı.
OTM sırasında diş-PDL-kemik kompleksindeki değişiklikleri görselleştirmek için sunulan ilk yöntem, daha önce 9 , 18 ,19, 20 ,22,23olarak açıklanan taze dokuların faz-geliştirilmiş mikro-CT görüntülemesine dayanmaktadır (Şekil 4). Kısacası, bir mikro-CT veya senkrotron faz geliştirme yeteneği, lifli dokunun mekanik stabilizasyonu ve nemlendirilmiş ortam sağlanan, taze kollajenöz lifler herhangi bir fiksasyon veya zıt ajanlar olmadan görselleştirilebilir. PDL'de görülen lifler hem dişe hem de kemiğe bağlı olanlardır, özellikle tip I kollajen19. 3D'de sağlam bir PDL'yi görselleştirmek için bu eşsiz fırsat, daha önce açıklandığı gibi 3D lif yoğunluğunun, liflerin yönünün ve dişin 3D hareketinin analizini sağlar9,19. Özellikle, burada PDL'deki lifli ağın görselleştirilmesini sunuyoruz. Zaman 0'da hem kemikte hem de PDL'de fizyolojik tadilat gözlenebilir. Remodeling hücresel çimentoda da meydana gelir; ancak, bu sunulan yöntemle doğrudan ilişkili değildir ve bu nedenle ayrıntılı olarak detaylandırılmayacaktır. Kemik-PDL arayüzü, herhangi bir kuvvet uygulamasından önce hem enine (Şekil 4A) hem de sagittal (Şekil 4B) düzlemlerde çoğunlukla pürüzsüzdür. Koronal düzlemde (Şekil 4C), kemik-PDL arayüzü özellikle yeniden şekillendirme dengesinin resorpsiyona doğru yöneldiğini gösteren apikal bölgeye doğru daha serttir. İlk azı dişinin mesially olarak taşındığı 3 günlük OTM'de(Şekil 4D-F),PDL'deki lif yoğunluğu azalır (beyaz ok kafaları). Kemik-PDL arayüzü, kemik yüzeyinde osteoklastik aktivitenin göstergesi olan kraterlerin gelişimi ve PDL26'dakiesas olarak sıkıştırma kuvvetleriyle ilişkili kemik erimesi işlemleri nedeniyle 0 günden daha pürüzlüdür , ancak burada 3 günde gerginlik bölgelerinde görülür. PDL içindeki gerginlik bölgelerinde doku yıkımı27,28 önerildi ve bu yöntem kullanılarak açıkça görülebilir. Pürüzlü sınır köklerin farklı seviyelerinde (beyaz oklar) görülür ve bu nedenle diş hareketinin sadece tacın devrilmesi değil, doğada çevirisel olduğunu gösterir. 7 günlük OTM'de (Şekil 4G-I), kemik içindeki kraterler, pürüzlü sınırlar ve PDL alanının genişlemesi gibi kemik resorpsiyon işaretleri tüm düzlemlerde görülür, ancak ortalama PDL alanı 3 günlük OTM'den daha dardır(Şekil 4D-F). Bununla birlikte, bazı bölgelerde, kemik-PDL sınırı 7 günlük OTM'den sonra daha pürüzsüz hale gelmiştir, bu alanlar köklerin distal yüzeylerinde bulunur, bu da otm'de beklendiği gibi kemik apsasyonu için bir göstergedir.
Uzun mikro-CT görüntüleme süresi (~19 h) ve aşamanın dönüşü nedeniyle, numunenin yerinde kalması için numunenin montajı esastır. Kararsız numune bulanık taramalara neden olur. Şekil 5, numune tarama sırasında hareket ettiğinde mikro BT taramasının nasıl göründüğünü sunar. Diş ve kemik bulanık. Ne PDL lifleri ne de osteositler gözlenmez. Bu tür olaylarda, bir nesnenin kenar boşluğunun etrafında bir siluet bulunur. Şekil 5'tediş tacında birden fazla anahat (ok) görülebilir.
Araştırma hedefine bağlı olarak, PDL liflerinin çözünürlüğü ve görselleştirilmesi, sadece sert dokular hakkında bilgi istendiğinde daha kısa tarama süresi için ticarette feda edilebilir.
PDL fiberlerinin herhangi bir kesit olmadan 3D görselleştirilmesi için tamamlayıcı bir yöntem, ECi kullanılarak optik olarak temizlenen numunelerde optik mikroskopi ile yapılır (Şekil 3). Bu yöntem sabitlenmeden bir numunede kullanılabilir ve temizlemeden önce dokuda bulunan floresan sinyallerini korur. ECi temizlemeden önce ve sonra hemi-mandibulalar Şekil 3B ve 3C'de gösterilmiştir. Bir ızgara kağıdı mandibulanın ramus'u boyunca görülebildiğinde PDL'nin yeterli numune temizlenmesi doğrulanabilir. Temizleme miktarı, dehidrasyon işleminin uzaması ile ayarlanabilir. Şekil 6, hem alveolar kemikte hem de PDL'de temizlenmiş bir mandibuladaki kollajen liflerinden gelen ikinci harmonik nesil (SHG) sinyalini göstermektedir. Kemiğin kollajen liflerinin 3D olarak görüntülenmesi, genellikle FIB/SEM gibi elektron mikroskopi yöntemlerini kullanan karmaşık bir süreçtir. Bununla birlikte, ECi tabanlı temizleme yöntemi ve SHG kullanılarak, alveolar kemik lifleri özellikle yatay yönde açıkça görülmektedir. Örnek kemik yüzeyinden PDL'nin derinliklerine çevrilirken, lifler aniden dikey bir seviyeye yönelimlerini değiştirdiğinden PDL lif seviyesine geçiş çok açıktır.
Işık çizelgesi mikroskopisi, floresan proteinlerin kemik yoluyla görüntülenmesi için de kullanılabilir. Transgenik flk1-cre'dentemizlenmiş bir örnek durumunda; Tdtomato fare19,29,30, kan damarlarını kaplayan floresan endotel hücreleri açıkça gözlenir ( Şekil7A,B, C, E). Uygun temizleme, ışık sayfası mikroskopisi ile anlaşılabilir görüntüler oluşturmanın anahtarıdır. Kemik tamamen temizlenmediğinde, PDL içindeki kan damarları gözlenmedi(Şekil 7D, F).
Şekil 1: Ortodontik cihaz yerleştirme kurulumu. A. Hayvanı desteklemek ve ağzı açık tutmak için laboratuvar malzemelerinden yapılmış fare yatağı. Gövde için plastik platform (PP) 30° eğimde ve başlık (HR) PP yüzeyinden 45° açıyla. PP'nin uç kafasını yükseltmek için 2 katmanlı bir boru standı (TS) kullanılır. Ataş döngüsü (siyah ok) üst kesici dişleri tutturur ve alt ortodontik güç zinciri (beyaz ok) alt kesici dişlere bağlanır. Azı dişlerinin görsel muayenesi için 5 mm çapında muayene aynası kullanılmıştır. B. Fare yatağının yan görünümü. Yüzeyler arasındaki açılar işaretlenir (yeşil ve macenta). C. Düzgün yerleştirilmiş cihazın temsili görüntüsü. D. Cihaz implantasyonundan önce muayene aynası ile görülen azı dişleri. E. Ortodontik hareket sonrası azı dişlerinin temsili görüntüsü. Kesik çizgiler birinci ve ikinci azı dişlerinin ana hatlarını izler. F. Cihazın şeması ve yerleşimi. Kırmızı çizgi, ilk azı dişi etrafındaki tel bağını temsil eder. Turuncu çizgi, bobini tutturmak için kullanılan akışlı kompozit reçineyi temsil eder. NiTi bobin mavi renkte gösterilir ve etiketlenmiştir. G. 7 günlük ortodontik hareket sonrası takılan cihazla parçalanmış hemi-mandibula. Bobinin 7 gün sonra hala aktif olduğunu gösteren 3 bobin ipliğinin hala nasıl açık olduğunu unutmayın. Ölçek çubuğu = E ve G'de 1 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Mikro BT görüntüleme için özel yapım bir odaya monte edilmiş hemi-mandibula. X-ray kaynağı solda ve dedektör sağda görülür. Kırmızı dikdörtgen, örnek aşamasındaki (SS) odaya monte edilen hemmi mandibulayı özetler. Burada gösterilen örnek oda, motor (M), örs (A, beyaz kesik çizgilerle özetlenmiştir) ve haznenin üstündeki örs mili (AS) dahil olmak üzere mekanik bir test kurulumunun bir parçasıdır. Tam kurulum CT sahnesine vidalanmış. İç görüntü, içinde numune bulunan nem odasını içeren kırmızı anahatlı bölgenin yakın çekimini gösterir. B. Örnek aşamasına monte edilen numunenin üst görünümü. Nem havuzları (gri ok), görüntüleme sırasında nemi korumak için çevreye yerleştirilmiştir. Ortadaki dairesel sahnede, hemi-mandibula eğimli derin oluğa (siyah ok) monte edilebilir. İnce bir oluk (beyaz ok), numunenin yönlendirilirken yardımcı olmak için sahnenin orta çizgisini işaretler. C. Örnek oluklu dairesel aşamanın diyagramı. Oluğun eğimi mandibulayı destekler ve azı dişlerinin köklerin dikey ekseni boyunca monte edilmesine izin verir. D. Temsili mikro-CT 2D dilim, hemmi mandibula örneğinin 3D hacimli görüntüsüyle birleştirildi. Buradaki galaksiler arası boşluk 52 μm. Örnek aşağıdaki örnek aşamasına monte edilir (gösterilmez) ve örs (A) diş kompoziti (DC) ile üsttedir. Ölçek çubuğu = 500 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. Parçalanmış fare hemi-mandibulaları için ECi tabanlı temizleme yöntemi. A. Parçalanmış hemi-mandibula ardışık olarak % 4 PFA, % 50 EtOH, % 70 EtOH ve% 100 EtOH'a daldırılır. Dehidrasyondan sonra, hemi-mandibula görüntülemeye kadar en az 12 saat boyunca ECi'de saklanır. B. Diseksiyondan hemen sonra hemi-mandible. C. Temizleme tamamlandıktan sonra hemi-mandible. Ölçek çubukları = 5 mm Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Ortodontik hareketin farklı aşamalarında yeni bir numunenin PDL'sinde temsili yerinde mikro-CT taramaları. A-C, Ortodontik hareket yok. A. Alveolar kemiğin B-Buccal, L-Lingual taraflarındaki mesial (M) ve distal (D) kökleri gösteren hemmi-mandibulanın enine düzleminde mikro-CT 2D görüntü. Diş kökleri ve alveolar kemik arasında PDL alanı ve içindeki lifler açıkça gözlenir. B. Sagittal düzlemde 2D görüntü. C. Koronal düzlemde 2D görüntü. D-E, 3 günlük OTM'den sonra 2D görüntüler, ok başları KOLLAJEN lif yoğunluğunda azalma ile PDL'deki alanları, beyaz oklar kemik erimesi alanlarını işaret eder. G-I, 7 günlük OTM'den sonra 2D görüntüler, siyah oklar kemik appozisyon bölgelerini işaret eder. Ölçek çubukları = 150 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Sagittal düzlemde 2D mikro-CT görüntüsü, tarama sırasında dişin hareketine bağlı olarak hem dişin hem de kemiğin bulanık yapılarını gösterir. Oklar dişin birden fazla tahta çizgisini işaret eder ve hareketini gösterir. Ölçek çubuğu 150 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: ECi, ikinci harmonik nesil (SHG) ile görüntülenmiş ilk azı dişini gösteren temizlenmiş mandibula. Pdl'nin kolajen liflerinin görüldüğü bir bölgede beyaz ok noktaları, dikey yönelime dikkat edin, siyah oklar PDL'nin hem dikey liflerinin hem de alveolar kemiğin yatay liflerinin görüldüğü bir bölgeyi işaret eder. T-tooth, F-furcation, AB-alveolar kemik, MR-mesial kök, DR-Distal kök, ölçek çubuğu 150 μm. Görüntüler, 1.33-1.56 RI'ya sahip çözümler için 20X çoklu daldırma lensi kullanılarak elde edildi. Excitation lazer 860nm%10 güçte ayarlandı. Piksel konut süresi: 0.51μs; Tarama modu: çerçeve; Ortalama: 16; Dedektör Türü: sıradan fotomultiplier tüp dedektörü; Dedektör Kazancı 800V. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7. ECi temizlenmiş Flk1-Cre;tdTomato faresinin lightsheet mikroskop görüntüleri. A. En iyi şekilde temizlenmiş kontrol hemi-mandibula. Kemik (ok kafası) ve PDL alanı (ok) içindeki kan damarları ağı görülebilir. B. ilk azı dişinin mesiolingual bölgesinin başlangıcı (A'da özetlenen kırmızı) kan damarlarını gösterir. C. en iyi şekilde temizlenmiş 7 günlük OTM hemi-mandibula ve D. alt-en uygun şekilde temizlenmiş hemi-mandibula. E. Sagittal düzlemde C panelinin 2D görüntüsü, görüntü kemik (gri ok) ve PDL uzayında (beyaz oklar) iyi tanımlanmış kan damarlarını gösterir. F. Panel D'nin iki boyutlu dilim görüntüsü, E'deki görüntülerle aynı bölge, bulanık bir görüntüyle sonuçlanır. Ölçek çubukları A, C, D = 500 μm, B, E, F = 100 μm Kamera dedektör olarak kullanılarak 5X plan hedefiyle çekilmiştir. Excitation lazer %4 güçte 561 nm idi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Farelerde OTM üretmek, boyut, genetik ve elleçleme avantajları nedeniyle çok arzu edilir. Mandibulanın kullanılması hem doku diseksiyonu hem de numune hazırlama ve görüntüleme açısından kolay bir kullanım sağlar. Burada OTM'den sonraki 7 gün içinde dişin kemik içindeki çevirisel hareketi ile OTM üretmek için bir yöntem sunduk. Bu protokol kullanılarak, diş hareketinin genel süresi uzatılabilir, çünkü aktif bobin yaklaşık 1 mm'ye kadar hareket için sabit bir kuvvet seviyesi sağlar. Bununla birlikte, bobinin mesial tarafı sürekli püsküren kesici dişe sabitlenir. Sonuç olarak, kuvvet vektörleri yavaş yavaş değişir ve ekstrüzyon kuvvetleri üretmeye başlar. Mesial uçta bağlantı seviyesinin ayarlanmasında 7 günde bir yapılırsa bu önlenebilir.
PDL, OTM'nin başlatıcısıdır, bu nedenle OTM'nin farklı aşamalarında yapısını ve işlevini anlamak büyük önem taşımaktadır. Ancak, PDL hem yapısında hem de işlevi19,22, 31,32'detekdüzedeğildir. Sonuç olarak, anlamlı verilerin alınabilmesi için PDL'nin 3D olarak incelenmesi ve mümkün olduğunca herhangi bir doku kesitleme ve manipülasyondan kaçınılması gerekir. Yine de, iki sert doku arasında bulunan yumuşak bir dokuyu araştırmak, bu gereksinimlerin yerine getirilmesini zorlaştırır. PDL'yi incelemenin geleneksel yöntemleri genellikle 3D yapıyı tehlikeye atarak dokuyu fizyolojik ortamından çıkarmayı içerir, bu da PDL yapısal ve biyomekanik özelliklerini değiştirir. Otm sırasında hem yapısal hem de biyomekanik özellikler, doku 3D bağlamını daha da korumayı haklı çıkaran dinamik değişikliklere uğrar. Bunu yapmak için, aynı numunenin floresan sinyalleri, morfolojik ve mineralizasyon verilerini birlikte lokalize etmesinde de kullanılabilen, bölümleme olmadan tüm doku görüntülemesini sağlayan iki yöntem tanımladık.
Sağlanan metodolojik açıklama, okuyucuları çalışma alanlarındaki yöntemleri uygulamaya yönlendirir. Mikro BT görüntüleme, PDL lifli ağının 3D görselleştirilmesini sağlar. Görüntüler, yönlülük ve yoğunluk analizleri üretmek ve OTM sırasında PDL'deki değişiklikleri nicel olarak araştırmak için analiz edilebilir. Ayrıca, ışık tablosu mikroskopisi ve konfokal görüntüleme gibi hazır optik mikroskobik yöntemlerle görselleştirmeyi sağlayan bir temizleme yöntemi tanımladık. Lightsheet mikroskopisi, nispeten hızlı görüntüleme hızına sahip büyük örneklerin 3D görüntüsünü üretme avantajına sahiptir. Konfokal mikroskopi, kollajen lifleri görüntüleme ve floresan etiketler için SHG sinyali kullanarak yüksek çözünürlüklü 3D görselleştirme sağlar. Bu yöntemler bağımsız olarak veya kombine, minimal doku hazırlığı ile 3D yapısal çalışmalara birçok olasılık açar.
Bu protokoldeki birkaç zorlu adım ekstra dikkat gerektirir:
İlk olarak, bobin yerleşimi sırasında, bağ teli birinci ve ikinci azı dişleri arasına güvenli bir şekilde yerleştirilmelidir. Bu işlem fare dişlerinin küçük boyutları nedeniyle zordur. Yerleşime rehberlik etmek için tezgah üstü stereomikroskop kullanılmasını öneririz. Ancak, işlem sırasındaki küçük hareketler fareyi hareket ettirebilir ve ilgi alanının görüş alanının dışına çıkmasına neden olabilir. Alternatif olarak, operatöre takılabilecek 4-5x büyüteçler kullanmanızı öneririz, bu da bölgeyi daha dinamik bir şekilde görüntülemeye yardımcı olabilir.
İkincisi, temizleme sonuçları dehidrasyon sürecine bağlıdır. Numune istenilen şeffaflık seviyesine ulaşmadıysa önerimiz dehidrasyon süresinin artırılmasıdır. Daha spesifik olarak, %100 EtOH'da daha uzun daldırma süresinin nihai ürünün şeffaflığını artırdığı gösterilmiştir. Bununla birlikte, artan dehidrasyon seviyesinin floresan seviyelerini önemli ölçüde azaltabileceği belirtilmelidir24,25. Sunulan ECi tabanlı yöntemin floresan sinyalleri 2 haftadan uzun süre koruduğu gösterilmiştir24.
Bu protokolün yönleri, çok sayıda başka amacı incelemek için değiştirilebilir. Mikro BT'nin içinde tasarladığımız oda bir yük hücresi ve bir motor ile birleştirilmiştir ve hemipi mandibula numuneleri üzerinde gerilim/sıkıştırma testleri yapma yeteneğine sahiptir. Mikro BT'nin görselleştirilmesiyle birlikte, bu kurulum PDL yerinde değişiklikleri farklı mekanik yükler21ile gösterebilir. Açıklanan temizleme yöntemi, çeşitli görüntüleme yöntemlerinin ilginç bir kombinasyonu için bir fırsat sağlayan düzeltilmemiş örnekler üzerinde de uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH (NIDCR R00- DE025053, PI:Naveh) tarafından desteklenmiştir. Harvard Biyolojik Görüntüleme Merkezi'ne altyapı ve destek için teşekkür ederiz. Tüm rakamlar biorender.com ile oluşturulur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-mL BD Luer-Lok syringe | BD | 309628 | |
| 1X phosphate buffered saline | VWR Life Sciences | 0780-10L | |
| 200 proof ethanol | VWR Life Sciences | V1016 | |
| Aluminum alloy 5019 wire | Sigma-aldrich | GF15828813 | 0.08 mm diameter wire, length 100th, temper hard. Used as wire ligature around molar. |
| Avizo 9.7 | Thermo Fisher Scientific | N/A | Used to analyze microCT scans |
| Castroviejo Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Clr Plan-Apochromat 20x/1.0,CorrVIS-IR M27 85mm | Zeiss | N/A | Used for second harmonic generation imaging |
| Cone socket handle, single ended, hand-form | G.Hartzell and son | 126-CSH3 | Handle of the inspection mirror |
| EC Plan-Neofluar 5x/0.16 | Zeiss | 440321-9902 | Used for light-sheet imaging |
| Elipar DeepCure-S LED curing light | 3M ESPE | 76985 | |
| Eppendorf safe-lock tubes, 1.5mL | Eppendorf | 22363204 | |
| Ethyl cinnamate, >= 98% | Sigma-aldrich | W243000-1KG-K | |
| Hypodermic Needle, 27G x 1/2'' | BD | 305109 | |
| Ketathesia 100mg/ml | Henry Schein Animal Health | NDC:11695-0702-1 | |
| KIMWIPES delicate task wipers | Kimberly-Clark | 21905-026 (VWR Catalog number) | Purchased from VWR |
| LightSheet Z.1 dual illumination microscope system | Zeiss | LightSheet Z.1/LightSheet 7 | Used for lightsheet imaging |
| LSM 880 NLO multi-photon microscope | Zeiss | LSM 880 NLO | Used for two-photon imaging |
| MEGAmicro, plane, 5mm dia, SS-Thread | Hahnenkratt | 6220 | Front surface inspectrio mirror |
| MicroCT machine, MicroXCT-200 | Xradia | MICRO XCT-200 | |
| Mini-Colibri | Fine Science Tools | 17000-01 | |
| PermaFlo Flowable Composite | Ultradent | 948 | |
| Procedure platform | N/A | N/A | Custom-made from lab materials |
| Routine stereo micscope M80 | Leica Micosystems | M80 | |
| Sentalloy NiTi open coil spring | TOMY Inc. | A 0.15mm diameter closed NiTi coil with an inner coil diameter of 0.9mm delivers a force of 10g. Similar products can be purchased from Dentsply Sirona. | |
| T-304 stainless steel ligature wire, 0.009'' diameter | Orthodontics | SBLW109 | 0.009''(.23mm) diameter, Soft temper |
| X-Ject E (Xylazine) 100mg/ml | Henry Schein Animal Health | NDC:11695-7085-1 | |
| Z100 Restorative, A2 shade | 3M ESPE | 5904A2 |
References
- Li, Y., et al. Orthodontic tooth movement: The biology and clinical implications. The Kaohsiung Journal of Medical Sciences. 34 (4), 207-214 (2018).
- Meikle, M. C. The tissue, cellular, and molecular regulation of orthodontic tooth movement: 100 years after Carl Sandstedt. European Journal of Orthodontics. 28, 221-240 (2006).
- Krishnan, V., Davidovitch, Z., molecular, Cellular, molecular, and tissue-level reactions to orthodontic force. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 129 (4), 1-32 (2006).
- Shoji-Matsunaga, A., et al. Osteocyte regulation of orthodontic force-mediated tooth movement via RANKL expression. Scientific Reports. 7 (1), 8753 (2017).
- Oppenheim, A. Tissue changes, particularly of the bone, incident to tooth movement. European Journal of Orthodontics. 29, suppl 1 2-15 (2007).
- Unnam, D., et al. Accelerated Orthodontics-An overview. Journal of Archives of Oral Biologyogy and Craniofacial Research. 3 (1), 4 (2018).
- von Bohl, M., Kuijpers-Jagtman, A. M. Hyalinization during orthodontic tooth movement : a systematic review on tissue reactions. European Journal of Orthodontics. 31 (1), 30-36 (2009).
- Kirschneck, C., et al. Comparative assessment of mouse models for experimental orthodontic tooth movement. Scientific Reports. 10 (1), 1-12 (2020).
- Naveh, G. R. S., Weiner, S. Initial orthodontic tooth movement of a multirooted tooth: a 3D study of a rat molar. Orthodontics & Craniofacial Research. 18 (3), 134-142 (2015).
- Nakamura, Y., et al. Time-lapse observation of rat periodontal ligament during function and tooth movement, using microcomputed tomography. European Journal of Orthodontics. 30 (3), 320-326 (2008).
- Kawarizadeh, A., Bourauel, C., Jager, A. Experimental and numerical determination of initial tooth mobility and material properties of the periodontal ligament in rat molar specimens. European Journal of Orthodontics. 25 (6), 569-578 (2003).
- Jónsdóttir, S. H., Giesen, E. B. W., Maltha, J. C. Biomechanical behavior of the periodontal ligament of the beagle dog during the first 5 hours of orthodontic force application. European Journal of Orthodontics. 28, 547 (2006).
- Lindhe, J., et al. Experimental breakdown of peri-implant and periodontal tissues. A study in the beagle dog. Clinical Oral Implants Research. 3 (1), 9-16 (1992).
- Salamati, A., et al. Functional tooth mobility in young pigs. Journal of Biomechanics. 104, 109716 (2020).
- Maria, R., et al. An unusual disordered alveolar bone material in the upper furcation region of minipig mandibles: A 3D hierarchical structural study. Journal of Structural Biology. 206 (1), 128-137 (2019).
- Wang, S., et al. The miniature pig: a useful large animal model for dental and orofacial research. Oral Diseases. 10, 1-7 (2007).
- Melsen, B. Tissue reaction to orthodontic tooth movement--a new paradigm. European Journal of Orthodontics. 23 (6), 671-681 (2001).
- Naveh, G. R. S., et al. Direct MicroCT imaging of non-mineralized connective tissues at high resolution. Connective Tissue Research. 55 (1), 52-60 (2014).
- Naveh, G. R. S., et al. Nonuniformity in ligaments is a structural strategy for optimizing functionality. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 9008 (2018).
- Naveh, G. R. S., et al. Tooth periodontal ligament: Direct 3D microCT visualization of the collagen network and how the network changes when the tooth is loaded. Journal of Structural Biology. 181 (2), 108-115 (2013).
- Naveh, G. R. S., et al. Tooth movements are guided by specific contact areas between the tooth root and the jaw bone : A dynamic 3D microCT study of the rat molar. Journal of Structural Biology. 17 (2), 477-483 (2012).
- Naveh, G. R. S., et al. Tooth-PDL-bone complex: Response to compressive loads encountered during mastication -A review. Archives of Oral Biology. 57 (12), 1575-1584 (2012).
- Ben-Zvi, Y., et al. Response of the tooth-periodontal ligament-bone complex to load: A microCT study of the minipig molar. Journal of Structural Biology. 205 (2), 155-162 (2019).
- Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452 (2017).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Taddei, S. R. dA., et al. Experimental model of tooth movement in mice: A standardized protocol for studying bone remodeling under compression and tensile strains. Journal of Biomechanics. 45 (16), 2729-2735 (2012).
- Nakamura, K., Sahara, N., Deguchi, T. Temporal changes in the distribution and number of macrophage-lineage cells in the periodontal membrane of the rat molar in response to experimental tooth movement. Archives of Oral Biology. 46 (7), 593-607 (2001).
- Rygh, P., et al. Activation of the vascular system: A main mediator of periodontal fiber remodeling in orthodontic tooth movement. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 89 (6), 453-468 (1986).
- Nagao, M., et al. Vascular endothelial growth factor in cartilage development and osteoarthritis. Scientific Reports. 7 (1), 13027 (2017).
- Licht, A. H., et al. Endothelium-specific Cre recombinase activity in flk-1-Cre transgenic mice. Developmental Dynamics. 229 (2), 312-318 (2004).
- Connizzo, B. K., Naveh, G. R. S. In situ AFM-based nanoscale rheology reveals regional non-uniformity in viscoporoelastic mechanical behavior of the murine periodontal ligament. Journal of Biomechanics. 111, 109996 (2020).
- Connizzo, B. K., et al. Nonuniformity in Periodontal Ligament: Mechanics and Matrix Composition. Journal of Dental Research. 2, 179-186 (2020).
