Summary
Vi presenterer en protokoll for å generere kjeveortopedisk tannbevegelse hos mus og metoder for 3D-visualisering av kollagenfibrene og blodkarene i periodontal ligament uten seksjonering.
Abstract
Kjeveortopedisk tannbevegelse er en kompleks biologisk prosess med endret myk og hard vevsoppussing som følge av ytre krefter. For å forstå disse komplekse ombyggingsprosessene er det viktig å studere tann- og periodontalvevet i 3D-konteksten og derfor minimere eventuelle seksjonerings- og vevsgjenstander. Musemodeller brukes ofte i utviklings- og strukturbiologi, så vel som i biomekanikk på grunn av deres lille størrelse, høye metabolske rate, genetikk og enkel håndtering. I prinsippet gjør dette dem også gode modeller for tannrelaterte studier. Imidlertid er en stor hindring deres lille tannstørrelse, spesielt molarene. Dette papiret er rettet mot å gi en trinnvis protokoll for å generere kjeveortopedisk tannbevegelse og to metoder for 3D-avbildning av den periodontale ligamentfibrøse komponenten av en mus mandibulær molar. Den første metoden som presenteres er basert på et mikro-CT-oppsett som muliggjør faseforbedringsavbildning av fersk kollagenvev. Den andre metoden er en beinryddingsmetode ved hjelp av etylcinnamat som gjør det mulig å avbildning gjennom beinet uten seksjonering og bevarer endogen fluorescens. Kombinerer denne clearingmetoden med reportermus som Flk1-Cre; TdTomato ga en første av sitt slag mulighet til å avbilde 3D-vaskulaturen i PDL- og alveolarbenet.
Introduction
Den grunnleggende underliggende biologiske prosessen i kjeveortopedisk tannbevegelse (OTM) er beinoppussing. Utløseren for denne ombyggingsprosessen tilskrives endringer i strukturen av periodontal ligament (PDL) som ekstracellulær matrise (ECM) stress, nekrose samt blodkar ødeleggelse ogformasjon 1,2,3. Andre mulige utløsere for alveolar bein ombygging er relatert til kraft sensing av osteocytter i beinet, samt mekanisk deformasjon av alveolarbenet selv; men deres rolle i OTM er fortsatt ikke fullt belyst4,5.
Til tross for mange studier som tar sikte på å avsløre strukturfunksjonsrelasjoner av PDL under OTM, er en klar funksjonell mekanisme ennå ikke definert6,7. Hovedårsaken til dette er utfordringen med å hente data om et bløtvev (PDL) som ligger mellom to harde vev (sementum og alveolarben). De aksepterte metodene for å samle inn strukturell informasjon krever vanligvis fiksering og seksjonering som forstyrrer og endrer PDL-strukturen. Videre gir de fleste av disse metodene 2D-data som selv om de ikke er forvrengt, bare gir delvis og lokalisert informasjon. Siden PDL ikke er ensartet i sin struktur og funksjon, er en tilnærming som adresserer den intakte 3D-strukturen til hele tann-PDL-beinkomplekset berettiget.
Dette dokumentet vil beskrive en metode for å generere en OTM hos mus og to metoder som muliggjør 3D-visualisering av kollagenfibrene i PDL uten noen seksjonering av prøven.
Murine-modeller er mye brukt til in-vivo-eksperimenter innen medisin, utviklingsbiologi, legemiddellevering og strukturelle studier. De kan genetisk modifiseres for å eliminere eller forbedre spesifikke proteiner og funksjon; de gir rask, repeterbar og forutsigbar utviklingskontroll; de er også enkle å bilde på grunn av sin lille størrelse8. Til tross for deres mange fordeler, brukes musemodeller i tannforskning ikke ofte, spesielt når kliniske manipulasjoner er berettiget, hovedsakelig på grunn av de små tennene. Dyremodeller som rotter9,10,11, hunder12,13, griser14,15,16 og aper17 brukes oftere enn mus. Med den nylige utviklingen av høyoppløselige bildeteknikker er fordelene ved å bruke en musemodell for å dechiffrere de innviklede prosessene i OTM mange. Dette papiret presenterer en metode for å generere en flerårig bevegelse av molartannen i mandibelen med konstante kraftnivåer som utløser beinoppussing. De fleste OTM-forsøkene hos gnagere gjøres i maxilla, siden mobiliteten til mandibelen og tilstedeværelsen av tungen gir et annet kompleksitetsnivå. Mandibelen har imidlertid mange fordeler når 3D strukturell integritet er ønsket. Det kan lett dissekeres som et helt bein; i noen arter kan den deles inn i to hemi-mandibler gjennom den fibrøse symfysen; den er kompakt, flat og inneholder bare tennene uten bihuleplasser. I motsetning er maxilla en del av skallen og nært knyttet til andre organer og strukturer, og dermed er det nødvendig med omfattende seksjonering for å dissekere alveolarbenet med de tilknyttede tennene.
Ved hjelp av et i huset fuktighetskammer koblet til et lastesystem inne i en høyoppløselig mikro-CT som muliggjør faseforbedring, utviklet vi en metode for å visualisere friske fibrøse vev i 3D som tidligere beskrevet9,18,19,20,21,22,23. Friskt vev skannes umiddelbart etter at dyret er ofret uten farging eller fiksering, noe som reduserer vevsgjenstander samt endringer av biomekaniske egenskaper. Disse 3D-dataene kan brukes til distribusjon og retningsanalyser av fibrene som beskrevet andre steder19.
Den andre 3D-metoden for avbildning av hele vevet som presenteres her, er basert på optisk rydding av mandibelen som muliggjør avbildning av PDL-fibrene gjennom beinet uten seksjonering. Interessant er det også mulig å visualisere kollagenfibrene i selve beinet, men dette vil ikke bli diskutert her. Generelt er det to metoder for vevsrydding. Den første er vandig basert rydding der prøven er nedsenket i en vandig løsning med en brytningsindeks større enn 1,4 enten gjennom en enkel nedsenking, hyperhydrering eller hydrogelinnstøtning. Denne metoden er imidlertid begrenset i nivået av gjennomsiktighet samt strukturell bevaring av vevet og krever derfor fiksering av vevet. Den andre metoden som gir svært gjennomsiktige prøver og ikke krever fiksering, er den løsningsmiddelbaserte avregningsmetoden24,25. Vi genererte en modifisert løsningsmiddelbasert clearingmetode basert på etyl-3-fenylprop-2-enoate (etylcinnamat, ECi) for mandibulære prøver. Denne metoden har fordelene ved å bruke ikke-giftig mat-grade clearing agent, minimal vev krymping, og bevaring av fluorescerende proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med NIHs retningslinjer for pleie og bruk av forsøksdyr og retningslinjer fra Harvard University Institutional Animal Care and Use Committee (protokoll nr. 01840).
1. Kjeveortopedisk tannbevegelse
- For å generere en museseng, bruk en flat plastplattform med en kileformet, 45 ° vinklet nakkestøtte. Nakkestøtten kan genereres ved å kutte en plastboks.
- Løft hodeenden av plattformen for å generere en omtrent 30° vinkel mellom hodestøtten og bordplanet. Fest en bøyd tykk binders (0,036" i diameter) til hodesidenden for å holde de øvre snittene.
- På haleenden, generer en forhøyet overflate som en kjeveortopedisk kraftkjede kan festes til for å holde de nedre snittene. Se figur 1 for et eksempel på en plattform.
- Bedøv musen ved intraperitoneal injeksjon av xylazin ved 10 mg/kg og ketamin 100mg/kg ved bruk av 1 ml sprøyte og en 27 gauge nål.
- Plasser bedøvet mus på skreddersydd plattform og immobiliser overkjeven ved å hekte de øvre snittene på bindersløkken. Åpne musens underkjeve med den kjeveortopediske kraftkjeden hektet på de nedre snittene. Hold kinnene trukket tilbake med mini-colibri munnen retractor.
- Plasser plattformen under et kirurgisk mikroskop eller et annet stereoskop som kan nå 5-6x forstørrelse.
- Påfør 50 μL saltvann (omtrent 1 dråpe) på museøyne for å forhindre hornhinnen dehydrering. Etterfyll saltvann hvert 20.
- Klipp et stykke av en aluminiumstråd (0,08 mm diameter) 1 cm i lengde. Skyv ledningen fra bukkal side lingualt i det interproksimale området belg kontaktpunktet mellom første og andre molarer ved hjelp av en mikrokirurgisk nåleholder. La det være 2 mm fri kant foran den første molaren for å bli gjenget inn i fjærenden.
- Klipp et stykke nikkel titan (NiTi) spole, rundt 7 til 9 tråder i lengde.
MERK: Spolens elastiske egenskaper vil gi konstant kraft for kjeveortopedisk bevegelse. Den totale ubegrensede lengden på spolen skal være kortere enn gapet mellom snittet og molaren. Husk at det trengs ytterligere 2 tråder i hver ende for å forankre spolen til tannen. Aluminiumstråd er valgt for å redusere skannegjenstander som stråleherding under mikro-CT-skanningen. - Sett inn NiTi spolefjær (0,15 mm tråddiameter, 0,9 mm indre spolediameter; gir en kraft på 10 g) mellom nedre første molar og nedre snitt. Bruk trådligaturen som er satt inn rundt den første molaren i trinn 1.6, vri ledningen tett rundt 2 tråder på spolefjæren for å feste spolen på molarsiden.
- For å sikre ensartet kraftnivå, bruk nøyaktig 3 aktive tråder mellom den første molaren og snittet. Fjern strømkjeden midlertidig fra snittet og sløyfe 2 til 3 ubebygde tråder over snittet for å forankre spolen. Skyv trådene ned til snittfri gingivalmargin.
- Plasser et lag med flytende komposittharpiks på spolens snittkant og herd det med tannherdende lys. Skift ut strømkjeden etter herding av harpiksen.
- Bruk samme herdelys, varm opp NiTi-spolen i 20 s. Dette vil stramme NiTi-spolen. Den ferdige plasseringen vises figur 1C.
- Enten la den kontralaterale siden være intakt eller sett inn en skam som ledningen mellom første og andre molarer.
- Plasser den bedøvede musen under et oppvarmet lys for å holde musen varm til den er gjenopprettet.
- Plasser musen tilbake i et individuelt bur og overvåk daglig. Ingen diettendring er nødvendig under kjeveortopedisk bevegelse.
MERK: OTM-enheten på den ene siden forårsaker ubehag, men svekker ikke fôring. Det anbefales imidlertid ikke å sette inn enheter på begge sider på grunn av den ekstra mengden ubehag. Smertestillende medisinering er ikke nødvendig med mindre ytre tegn på smerte er sett.
2. Micro-CT-skanning av PDL-fibre i friske hemi-mandibler
- Montering av hemi-mandibelen (Figur 2)
- Etter ønsket varighet av kjeveortopedisk bevegelse, ofre musen via Cervical dislokasjon. Fjern mandibelen og separer i hemi-mandibler.
MERK: Siden prøven ikke vil bli løst, er det viktig å utføre disseksjonen av kjeven og monteringen så snart som mulig, ideelt innen 30 minutter. - Fjern det omkringliggende bløtvevet forsiktig med en ren lofri klut.
- Fjern den kjeveortopediske enheten ved hjelp av mikroskopisk saks og pinsett under et stereomikroskop med minst 4x forstørrelse.
- Oppbevar prøven fuktig i et 1,5 ml volum, mikrosentrifugerør sammen med et stykke lofri klut fuktet med vann.
- Plasser pakkbar dental komposittharpiks i prøvesporet på scenen, og legg deretter den ferske hemi-mandibelen i kompositten. Før montering må du sørge for at benoverflaten i kontakt med tannkompositten er fri for bløtvev og tørr, ellers vil dentalkompositt ikke kurere riktig.
- Juster posisjonen til hemi-mandibelen til den første molaren er sentrert i midtlinjesporet på scenen. Kontroller at okklusaloverflaten er vannrett. Herd kompositten når du er fornøyd med plasseringen.
MERK: Ytterligere små mengder tannkompositter kan plasseres på sidene av hemi-mandibelen og/eller over snittet for å bidra til å stabilisere prøven. - Plasser fuktet lofri klut inne i fuktighetsbassengene i prøvetrinnet. Plasser dental kompositt på okklusal overflaten av den første molaren. Før du lukker kammeret, må du forsikre deg om at ingenting blokkerer røntgenbanen på prøvenivå.
- Fest kammeret i mikro-CT. Skru kammeret inn i mikro-CT-prøvetrinnet slik at bevegelsen under avbildning minimeres.
- Slå på røntgenbildene og ta 2D-bilder mens du senker ambolten vertikalt, til spissen av ambolten er omgitt av komposittet, men ingen økning i kraften oppdages.
- Når ambolt er innebygd i kompositten, lukker du røntgenkilden. Åpne deretter mikro-CT-kammeret og herd kompositten gjennom det klare Plexiglass-vinduet.
- Etter ønsket varighet av kjeveortopedisk bevegelse, ofre musen via Cervical dislokasjon. Fjern mandibelen og separer i hemi-mandibler.
- Mikro-CT-innstillinger
- Sett kildespenningen til 40 kV og strøm til 200 μA. Bruk en 10x forstørrelsesdetektor til å plassere prøven innenfor synsrammen. Bruk binning av 2 for de innspilte bildene.
MERK: Siden PDL er betydelig mindre tett enn bein og tann, krever visualisering av PDL høyere effekt og eksponeringstid. Denne protokollen vil gi innstillinger for visualisering av PDL. - Sett eksponeringstiden for enkeltbilde til 25 s. Sett rotasjonen av prøvetrinnet til et område på 183 grader eller mer. Still inn skanningen for 2500 projeksjoner. Ikke bruk røntgenfilter, de resulterende skanningene har en voxelstørrelse på 0,76 μm på hver side.
- Samle inn en referanseskanning for riktig rekonstruksjon i henhold til mikro-CT-retningslinjene. Bruk 1/3 antall referansebilder som totalprojeksjoner. Rekonstruer volumet uten ekstra binning ved hjelp av en tilbakeprojeksjon filtrert algoritme.
- Sett kildespenningen til 40 kV og strøm til 200 μA. Bruk en 10x forstørrelsesdetektor til å plassere prøven innenfor synsrammen. Bruk binning av 2 for de innspilte bildene.
3. Avregningsmetode (figur 3)
- Forbered fem mikrosentrifugerør på 1,5 ml.
- Forbered 1,4 ml av følgende løsninger i 1,5 ml mikrosentrifugerør: 4 % paraformaldehyd (PFA) i fosfatbufret saltvann (PBS), 50 % etanol (EtOH) i deionisert (DI) vann, 70 % EtOH i DI-vann og to rør med 100 % EtOH.
MERK: PFA brukes til fiksering av prøven. ECi clearing vil også fungere på uløste prøver. For å fjerne uløste prøver, bare hopp over PFA-trinnet. - Sted dissekert hemi-mandibel i 4% PFA. Dekk med aluminiumsfolie og plasser på vippen på skånsom innstilling ved romtemperatur i 6 timer.
- Flytt hemi-mandibelen til 50% EtOH. Plasser den på rockeren dekket av lys i 16 timer.
- Flytt hemi-mandibelen til 70% EtOH. Plasser den på rockeren dekket av lys i 16 timer.
- Flytt hemi-mandibelen til 100% EtOH. Plasser den på rockeren dekket av lys i 16 timer.
- Gjenta 3.6. i det andre 100% EtOH-røret.
- Forbered 5 ml ECi i et glass- eller polypropylenrør.
MERK: ECi løser opp polystyren, men ikke polypropylen. Også, hvis du ikke bruker et vev med fluorescerende proteiner, kan prøven bli utsatt for lys under clearingprosedyren. - Flytt hemi-mandibelen til ECi-røret. Dekk røret med aluminiumsfolie og plasser på vippen på skånsom innstilling i minst 12 timer.
MERK: Protokollen kan settes på pause her. Dehydrert prøve kan lagres i ECi ved romtemperatur. Frysepunktet eller smeltepunktet til ECi er 6,5 til 8,0 °C. Må ikke oppbevars ved 4 °C. - Hemi-mandibelen er klar til avbildning med fluorescensmikroskop.
MERK: Under bildet må prøven være nedsenket i ECi for å forbli optisk gjennomsiktig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dette papiret presenterer en metode for å produsere OTM samt to metoder for 3D-avbildning av kollagenfibre inne i PDL uten seksjonering. For dyreforskningsformål, når justering av tennene ikke er nødvendig, anses en tannbevegelse som kjeveortopedisk hvis det genererer ombygging av alveolarbenet på alle rotnivåer. Konstant kraftnivå påført på tennene er nødvendig for å generere en pålitelig OTM. Her brukes en aktivert formminne NiTi-spole til å generere en konsistent kraft på 10 g gjennom eksperimentell tid på 7 dager og utover hvis det er berettiget. Spoleaktiveringen som er beskrevet her (figur 1), genererer belastning i NiTi-spolen i martensitisk fase og bringer spolen til hysteresetilstanden, noe som gir konstant stress på tannen. Oppvarming av spolen med herdelyset etter spoleinnsettingen vil også sørge for at legeringen skifter til sin austenittiske form og at formminneeffekten vil finne sted.
Her viser vi representative resultater fra 9 uker gamle, mannlige mus. Det gjennomsnittlige mesiodistale rommet mellom kronene i første og andre molarer etter 7 dager med OTM er 40 μm målt mellom moksimale overflater av molarene i mikro-CT med 1X forstørrelse (n = 12, st.dev. = 15 μm) (Figur 1E). Den gjennomsnittlige plassen til PDL i mesiodistal retning er 80 μm før og etter 7 dager med OTM (Figur 4B). Dette bekrefter at den første molaren oversatt mesialt og 7 dager er en tilstrekkelig tid for å generere OTM i en musemodell mens du genererer prosesser for benresorpsjon og appposisjon i naturen (Figur 4). Mus ble matet en standard hard pall diett. Ingen diettendring ble gjort etter innsetting av enhet.
Den første metoden som presenteres for å visualisere endringene i tann-PDL-beinkomplekset under OTM, er basert på faseforbedret mikro-CT-avbildning av friskt vev (figur 4) som ble beskrevet i detalj tidligere9,18,19,20,22,23. Kort sagt, gitt en faseforbedringsevne av enten en mikro-CT eller en synkrotron, mekanisk stabilisering av det fibrøse vevet og fuktige miljøet, kan friske kollagenøse fibre visualiseres uten fiksering eller kontrasterende midler. I PDL er fibrene som ses de som er koblet til både tannen og beinet, hovedsakelig type I kollagen19. Denne unike muligheten til å visualisere i 3D en intakt PDL muliggjør analyse av 3D fibertetthet, fiberorientering samt tannens 3D-bevegelse som tidligere beskrevet9,19. Spesielt presenterer vi visualiseringen av det fibrøse nettverket i PDL. På tid 0 kan fysiologisk ombygging i både beinet og PDL observeres. Ombygging skjer også i det cellulære sementumet; Dette er imidlertid ikke direkte relatert til den presenterte metoden og vil derfor ikke bli utarbeidet. Bone-PDL-grensesnittet er for det meste glatt både i tverrgående (figur 4A) og sagittal (figur 4B) plan før noen kraftpåføring. I koronalplanet (figur 4C) er bein-PDL-grensesnittet grovere, spesielt mot den apikale regionen som kan være en indikasjon på ombyggingsbalansen har en tendens til resorpsjon. Ved 3 dager med OTM (Figur 4D-F), hvorpå den første molaren flyttes mesialt (retningen er representert av den stiplede pilen), reduseres fibertettheten i PDL (hvite pilhoder). Bone-PDL-grensesnittet er grovere enn på 0 dager på grunn av utvikling av kratere i beinoverflaten som indikerer osteoklastisk aktivitet og benreorpsjonsprosesser forbundet med hovedsakelig kompresjonskrefter i PDL26, men her sett i spenningsområder på 3 dager. Vevsdestruksjon i spenningsområder i PDL ble foreslått27,28 og kan tydelig ses ved hjelp av denne metoden. Den grove grensen ses på forskjellige nivåer av røttene (hvite piler) og antyder derfor at tannbevegelsen er translasjonell i naturen og ikke bare tipping av kronen. Ved 7 dager med OTM (Figur 4G-I), er benreorpsjonsskilt, for eksempel kratere i beinet, grove grenser og utvidelse av PDL-rommet, sett på alle plan, men det gjennomsnittlige PDL-rommet er smalere enn ved 3 dager med OTM (Figur 4D-F). I noen områder har imidlertid bein-PDL-grensen blitt jevnere etter 7 dager med OTM, disse områdene ligger på røttenes distale overflater, noe som mest sannsynlig er en indikasjon på benapposition, som forventet i OTM til mesial retning.
På grunn av den lange mikro-CT-bildetiden (~ 19 h) og rotasjonen av scenen, er montering av prøven viktig for å holde prøven stille. Ustabil prøve vil resultere i uklare skanninger. Figur 5 viser hvordan mikro-CT-skanningen ser ut når prøven har beveget seg under skanningen. Tannen og beinet er uklart. Verken PDL-fibre eller osteocytter observeres. I slike tilfeller er det en silhuett til stede rundt margen på et objekt. I figur 5kan flere konturer av tannkronen observeres (piler).
Avhengig av forskningsmålet kan oppløsningen og visualiseringen av PDL-fibrene ofres i handel for kortere skannetid når bare informasjon om det harde vevet er ønsket.
En komplementær metode for 3D-visualisering av PDL-fibrene uten seksjonering er via optisk mikroskopi på optisk klarerte prøver ved hjelp av ECi (figur 3). Denne metoden kan brukes på en prøve uten fiksering og bevarer fluorescerende signaler som eksisterer i vevet før rydding. Hemi-mandibler før og etter ECi-rydding vises i figur 3B og 3C. Tilstrekkelig prøverydding av PDL kan bekreftes når et rutenettpapir kan ses gjennom mandibelens ramus. Mengden avregning kan justeres ved forlengelse av dehydreringsprosessen. Figur 6 viser det andre harmoniske generasjonssignalet (SHG) fra kollagenfibre i både alveolarbenet og PDL i en klar mandibel. Avbildning av kollagenfibrene i beinet i 3D er en komplisert prosess, som ofte bruker elektronmikroskopimetoder som FIB / SEM. Ved å bruke den ECi-baserte clearingmetoden og SHG, er imidlertid alveolarbenfibrene tydelig sett, spesielt i horisontal retning. Når du oversetter gjennom prøven dypt inn i PDL fra beinoverflaten, er overgangen til PDL fibernivå veldig klar da fibrene plutselig endrer orienteringen til en vertikal.
Lightsheet mikroskopi kan også brukes til å avbilde fluorescerende proteiner gjennom beinet. I dette tilfellet av en ryddet prøve fra en transgen Flk1-cre; Tdtomato mus19,29,30, de fluorescerende endotelcellene som fôrer blodkarene, observeres tydelig ( Figur7A,B, C, E). Riktig fjerning er nøkkelen til å generere forståelige bilder med lightsheet-mikroskopi. Når beinet ikke er helt ryddet, ble det ikke observert blodkar i PDL (Figur 7D, F).
Figur 1: Innsetting av kjeveortopediske apparater er satt opp. A. Museseng laget av lab-forsyning for å støtte dyret og holde munnen åpen. Plastplattformen (PP) for kroppen er på en 30 ° helling og hodestøtten (HR) er i en 45 ° vinkel fra overflaten av PP. Et 2-lags rørstativ (TS) brukes til å heve endehodet til PP. Bindersløkken (svart pil) forankrer de øverste snittene, og den nederste kjeveortopediske kraftkjeden (hvit pil) hekter på de nedre snittene. 5 mm diameter inspeksjonsspeil ble brukt til visuell inspeksjon av molarene. B. Sett fra siden av musesengen. Vinkler mellom overflater er merket (grønn og magenta). C. Representativt bilde av den riktig plasserte enheten. D. Molarer sett gjennom inspeksjonsspeilet før enheten implantasjon. E. Representativt bilde av molarer etter den kjeveortopediske bevegelsen. Stiplede linjer sporer omrisset av første og andre molarer. F. Diagram over enheten og plasseringen. Rød linje representerer trådligaturen rundt første molar. Oransje linje representerer flytende komposittharpiks som brukes til å forankre spolen. NiTi-spolen vises i blått og merket. G. Dissekert hemi-mandibel med enheten festet etter 7-dagers kjeveortopedisk bevegelse. Legg merke til hvordan de 3 spoletrådene fortsatt er åpne, noe som indikerer at spolen fortsatt er aktiv etter 7 dager. Skalastang = 1 mm i E og G. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Hemi-mandibel montert i et skreddersydd kammer for mikro-CT-avbildning. A. Fullt oppsett av prøvekammeret i mikro-CT-maskinen. Røntgenkilden ses til venstre og detektoren til høyre. Rødt rektangel skisserer hemi-mandibelen montert i kammeret på prøvetrinnet (SS). Eksempelkammeret som vises her er en del av et mekanisk testoppsett, inkludert motor (M), ambolt (A, skissert av hvite stiplede linjer) og amboltaksel (AS) på toppen av kammeret. Hele oppsettet er skrudd på CT-trinnet. Innsidebildet viser nærbilde av det røde omrisset område, som inneholder fuktighetskammeret med prøve inni. B. Toppvisning av prøve montert på prøvestadiet. Fuktighetsbassenger (grå pil) er innebygd på omkretsen for å opprettholde fuktighet under bildebehandling. På det sirkulære stadiet i midten kan hemi-mandibel monteres i skrått dypt spor (svart pil). Et tynt spor (hvit pil) markerer midtlinjen på scenen for å hjelpe til med å orientere prøven. C. Diagram over det sirkulære stadiet med prøvesporet. Sporets skråning støtter mandibelen og gjør at molarene kan monteres langs røttenes vertikale akse. D. Representativ mikro-CT 2D-skive kombinert med et 3D-volumbilde av den hemi-mandible prøven. Det interproksimale gapet her er 52 μm. Prøven er montert på prøvetrinnet nedenfor (vises ikke) og ambolten (A) på toppen av dentalkompositt (DC). Skalalinje = 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. ECi-basert clearing metode for dissekert mus hemi-mandibles. A. Den dissekerte hemi-mandibelen er nedsenket i 4% PFA, 50% EtOH, 70% EtOH og 100% EtOH fortløpende. Etter dehydrering lagres hemi-mandibelen i ECi i minst 12 timer til avbildning. B. Hemi-mandibel umiddelbart etter disseksjon. C. Hemi-mandibel etter ferdigstillelse av rydding. Skalastenger = 5 mm Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representative in-situ mikro-CT-skanninger av PDL av en ny prøve i de forskjellige stadiene av den kjeveortopediske bevegelsen. A-C, ingen kjeveortopedisk bevegelse. A. Micro-CT 2D-bilde i det tverrgående planet til hemi-mandibelen som viser mesial (M) og distale (D) røtter inne i alveolarbenet, B-Buccal, L-Lingual sider av alveolarbenet. Mellom tannrøttene og alveolarbenet observeres PDL-rommet og fibrene i det tydelig. B. 2D-bilde i sagittalplanet. C. 2D-bilde i koronalplanet. D-E, 2D-bilder etter 3 dager med OTM, pilhoder peker på områder i PDL med reduksjon i kollagenfibretetthet, hvite piler peker på områder med benreorpsjon. G-I, 2D-bilder etter 7 dager med OTM, svarte piler peker på områder med benapposition. Skalastenger = 150 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: 2D-mikro-CT-bilde i sagittalplanet, som viser uklare strukturer av både tann og ben på grunn av tannbevegelsen under skanningen. Piler peker på flere brettlinjer på tannen, noe som indikerer bevegelsen. Skalalinje 150 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: ECi ryddet mandibel som viser den første molaren avbildet med andre harmoniske generasjon (SHG). Hvite pilpunkter på et område der kollagenfibre av PDL ses, legg merke til vertikal orientering, svarte piler peker på et område der både vertikale fibre av PDL samt horisontale fibre i alveolarbenet ses. T-tann, F-furcation, AB-alveolar bein, MR-mesial rot, DR-Distal rot, skala bar 150 μm. Bilder ble oppnådd ved hjelp av en 20X multi-nedsenking linse for løsninger med RI på 1.33-1.56. Eksitasjonslaser ble satt til 860 nm ved 10 % effekt. Piksel boligtid: 0,51μs; Skannemodus: ramme; Gjennomsnitt: 16; Detektor Type: ikke-canned photomultiplier tube detektor; Detektor Gain 800V. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7. Lightsheet mikroskop bilder av ECi-ryddet Flk1-Cre;tdTomato mus. A. Optimalt ryddet kontroll hemi-mandibel. Nettverket av blodkar i beinet (pilhodet) og PDL-rommet (pilen) er synlig. B. innsettende i den mesiospråklige regionen av den første molaren (rød skissert i A) viser blodkarene. C. optimalt ryddet 7-dagers OTM hemi-mandibel og D. under-optimalt ryddet hemi-mandibel. E. 2D-bilde av panel C i sagittalplanet, viser bildet veldefinerte blodkar i bein (grå pil) og PDL-rom (hvite piler). F. Todimensjonalt stykkebilde av panel D, samme område som bilder i E, noe som resulterer i et uskarpt bilde. Skalastenger A, C, D = 500 μm, B, E, F = 100 μm Bilder ble tatt med et 5X planmål, ved hjelp av kamera som detektor. Eksitasjonslaser var 561 nm ved 4% effekt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Generering av OTM hos mus er svært ønsket på grunn av størrelse, genetikk og håndteringsfordeler. Bruk av mandibelen gir en enkel håndtering både når det gjelder vevs disseksjon samt prøvepreparering og avbildning. Her presenterte vi en metode for å generere OTM med translasjonell bevegelse av tannen inne i beinet innen 7 dager etter OTM. Ved hjelp av denne protokollen kan den totale varigheten av tannbevegelsen forlenges, siden den aktiverte spolen gir et konstant kraftnivå for bevegelse på opptil ca. 1 mm. Imidlertid er den flerårige siden av spolen festet til snittet, som stadig bryter ut. Som et resultat vil kraftvektorene gradvis endre og begynne å generere ekstruderingskrefter. Dette kan unngås hvis justering av festenivået på den flerårige enden utføres hver 7.
PDL er initiativtaker for OTM, derfor er det av stor betydning å forstå strukturen og funksjonen i de forskjellige stadiene av OTM. PDL er imidlertid ikke ensartet i både strukturen og funksjonen19,22,31,32. Som et resultat, for å hente meningsfulle data, må PDL studeres i 3D, og enhver vevsseksjon og manipulering bør unngås så mye som mulig. Likevel, å undersøke et mykt vev som ligger mellom to harde vev, gjør slike krav utfordrende å oppfylle. Tradisjonelle metoder for å studere PDL innebærer ofte å kompromittere 3D-strukturen og fjerne vevet ut av sitt fysiologiske miljø, som følgelig endrer PDL strukturelle og biomekaniske egenskaper. Både strukturelle og biomekaniske egenskaper gjennomgår dynamiske endringer under OTM som rettferdiggjør å bevare vevets 3D-kontekst ytterligere. For å gjøre dette beskrev vi to metoder som muliggjør avbildning av hele vev uten seksjonering, som også kan brukes på samme prøve som samlokalisering av fluorescerende signaler, morfologiske og mineraliseringsdata.
Den metodiske beskrivelsen leder leserne til å anvende metodene innen sine fagområder. Mikro-CT-avbildningen tillater 3D-visualisering av PDL fibrøst nettverk. Bilder kan analyseres for å produsere retnings- og tetthetsanalyser og kvantitativt undersøke endringer i PDL under OTM. Vi beskrev også en avregningsmetode som muliggjør visualisering med lett tilgjengelige optiske mikroskopiske metoder som lysarkmikroskopi og konfokal avbildning. Lightsheet-mikroskopi har fordelen av å produsere et 3D-bilde av store prøver med relativt rask bildehastighet. Konfektmikroskopi muliggjør høyoppløselig 3D-visualisering ved hjelp av SHG-signal for kollagenfibreavbildning og fluorescerende koder. Disse metodene uavhengig eller kombinert åpner mange muligheter for 3D strukturelle studier med minimal vevsforberedelse.
Flere utfordrende trinn i denne protokollen krever ekstra oppmerksomhet:
For det første, under spoleplasseringen, må ligaturledningen plasseres sikkert mellom første og andre molarer. Denne prosessen er utfordrende på grunn av de små dimensjonene til musetennene. Vi anbefaler bruk av stasjonært stereomikroskop for å styre plasseringen. Små bevegelser under prosedyren kan imidlertid flytte musen og føre til at interesseområdet går ut av synsfeltet. Som et alternativ foreslår vi å bruke 4-5x forstørrelseslus som kan brukes på operatøren, noe som kan bidra til å se området mer dynamisk.
For det andre avhenger av clearingresultatene av dehydreringsprosessen. Hvis utvalget ikke har nådd ønsket åpenhetsnivå, er vårt forslag å øke dehydreringstiden. Mer spesifikt har lengre nedsenkingstid i 100% EtOH vist seg å forbedre gjennomsiktigheten til sluttproduktet. Det skal imidlertid bemerkes at økt dehydreringsnivå kan dramatisk redusere fluorescensnivåene24,25. Den presenterte ECi-baserte metoden ble vist å bevare fluorescerende signaler i mer enn 2 uker24.
Aspekter av denne protokollen kan endres for å studere en rekke andre formål. Kammeret vi designet inne i mikro-CT er kombinert med en lastcelle og en motor og har evnen til å utføre spennings- / kompresjonstester på hemi-mandible prøver. Kombinert med visualiseringen av mikro-CT, kan dette oppsettet vise endringer i PDL in-situ med varierende mekaniske belastninger21. Den beskrevne avregningsmetoden kan også implementeres på uløste prøver, noe som gir en mulighet for en interessant kombinasjon av ulike bildemodaliteter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av NIH (NIDCR R00- DE025053, PI:Naveh). Vi vil takke Harvard Center for Biological Imaging for infrastruktur og støtte. Alle tall genereres med biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-mL BD Luer-Lok syringe | BD | 309628 | |
| 1X phosphate buffered saline | VWR Life Sciences | 0780-10L | |
| 200 proof ethanol | VWR Life Sciences | V1016 | |
| Aluminum alloy 5019 wire | Sigma-aldrich | GF15828813 | 0.08 mm diameter wire, length 100th, temper hard. Used as wire ligature around molar. |
| Avizo 9.7 | Thermo Fisher Scientific | N/A | Used to analyze microCT scans |
| Castroviejo Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Clr Plan-Apochromat 20x/1.0,CorrVIS-IR M27 85mm | Zeiss | N/A | Used for second harmonic generation imaging |
| Cone socket handle, single ended, hand-form | G.Hartzell and son | 126-CSH3 | Handle of the inspection mirror |
| EC Plan-Neofluar 5x/0.16 | Zeiss | 440321-9902 | Used for light-sheet imaging |
| Elipar DeepCure-S LED curing light | 3M ESPE | 76985 | |
| Eppendorf safe-lock tubes, 1.5mL | Eppendorf | 22363204 | |
| Ethyl cinnamate, >= 98% | Sigma-aldrich | W243000-1KG-K | |
| Hypodermic Needle, 27G x 1/2'' | BD | 305109 | |
| Ketathesia 100mg/ml | Henry Schein Animal Health | NDC:11695-0702-1 | |
| KIMWIPES delicate task wipers | Kimberly-Clark | 21905-026 (VWR Catalog number) | Purchased from VWR |
| LightSheet Z.1 dual illumination microscope system | Zeiss | LightSheet Z.1/LightSheet 7 | Used for lightsheet imaging |
| LSM 880 NLO multi-photon microscope | Zeiss | LSM 880 NLO | Used for two-photon imaging |
| MEGAmicro, plane, 5mm dia, SS-Thread | Hahnenkratt | 6220 | Front surface inspectrio mirror |
| MicroCT machine, MicroXCT-200 | Xradia | MICRO XCT-200 | |
| Mini-Colibri | Fine Science Tools | 17000-01 | |
| PermaFlo Flowable Composite | Ultradent | 948 | |
| Procedure platform | N/A | N/A | Custom-made from lab materials |
| Routine stereo micscope M80 | Leica Micosystems | M80 | |
| Sentalloy NiTi open coil spring | TOMY Inc. | A 0.15mm diameter closed NiTi coil with an inner coil diameter of 0.9mm delivers a force of 10g. Similar products can be purchased from Dentsply Sirona. | |
| T-304 stainless steel ligature wire, 0.009'' diameter | Orthodontics | SBLW109 | 0.009''(.23mm) diameter, Soft temper |
| X-Ject E (Xylazine) 100mg/ml | Henry Schein Animal Health | NDC:11695-7085-1 | |
| Z100 Restorative, A2 shade | 3M ESPE | 5904A2 |
References
- Li, Y., et al. Orthodontic tooth movement: The biology and clinical implications. The Kaohsiung Journal of Medical Sciences. 34 (4), 207-214 (2018).
- Meikle, M. C. The tissue, cellular, and molecular regulation of orthodontic tooth movement: 100 years after Carl Sandstedt. European Journal of Orthodontics. 28, 221-240 (2006).
- Krishnan, V., Davidovitch, Z., molecular, Cellular, molecular, and tissue-level reactions to orthodontic force. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 129 (4), 1-32 (2006).
- Shoji-Matsunaga, A., et al. Osteocyte regulation of orthodontic force-mediated tooth movement via RANKL expression. Scientific Reports. 7 (1), 8753 (2017).
- Oppenheim, A. Tissue changes, particularly of the bone, incident to tooth movement. European Journal of Orthodontics. 29, suppl 1 2-15 (2007).
- Unnam, D., et al. Accelerated Orthodontics-An overview. Journal of Archives of Oral Biologyogy and Craniofacial Research. 3 (1), 4 (2018).
- von Bohl, M., Kuijpers-Jagtman, A. M. Hyalinization during orthodontic tooth movement : a systematic review on tissue reactions. European Journal of Orthodontics. 31 (1), 30-36 (2009).
- Kirschneck, C., et al. Comparative assessment of mouse models for experimental orthodontic tooth movement. Scientific Reports. 10 (1), 1-12 (2020).
- Naveh, G. R. S., Weiner, S. Initial orthodontic tooth movement of a multirooted tooth: a 3D study of a rat molar. Orthodontics & Craniofacial Research. 18 (3), 134-142 (2015).
- Nakamura, Y., et al. Time-lapse observation of rat periodontal ligament during function and tooth movement, using microcomputed tomography. European Journal of Orthodontics. 30 (3), 320-326 (2008).
- Kawarizadeh, A., Bourauel, C., Jager, A. Experimental and numerical determination of initial tooth mobility and material properties of the periodontal ligament in rat molar specimens. European Journal of Orthodontics. 25 (6), 569-578 (2003).
- Jónsdóttir, S. H., Giesen, E. B. W., Maltha, J. C. Biomechanical behavior of the periodontal ligament of the beagle dog during the first 5 hours of orthodontic force application. European Journal of Orthodontics. 28, 547 (2006).
- Lindhe, J., et al. Experimental breakdown of peri-implant and periodontal tissues. A study in the beagle dog. Clinical Oral Implants Research. 3 (1), 9-16 (1992).
- Salamati, A., et al. Functional tooth mobility in young pigs. Journal of Biomechanics. 104, 109716 (2020).
- Maria, R., et al. An unusual disordered alveolar bone material in the upper furcation region of minipig mandibles: A 3D hierarchical structural study. Journal of Structural Biology. 206 (1), 128-137 (2019).
- Wang, S., et al. The miniature pig: a useful large animal model for dental and orofacial research. Oral Diseases. 10, 1-7 (2007).
- Melsen, B. Tissue reaction to orthodontic tooth movement--a new paradigm. European Journal of Orthodontics. 23 (6), 671-681 (2001).
- Naveh, G. R. S., et al. Direct MicroCT imaging of non-mineralized connective tissues at high resolution. Connective Tissue Research. 55 (1), 52-60 (2014).
- Naveh, G. R. S., et al. Nonuniformity in ligaments is a structural strategy for optimizing functionality. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 9008 (2018).
- Naveh, G. R. S., et al. Tooth periodontal ligament: Direct 3D microCT visualization of the collagen network and how the network changes when the tooth is loaded. Journal of Structural Biology. 181 (2), 108-115 (2013).
- Naveh, G. R. S., et al. Tooth movements are guided by specific contact areas between the tooth root and the jaw bone : A dynamic 3D microCT study of the rat molar. Journal of Structural Biology. 17 (2), 477-483 (2012).
- Naveh, G. R. S., et al. Tooth-PDL-bone complex: Response to compressive loads encountered during mastication -A review. Archives of Oral Biology. 57 (12), 1575-1584 (2012).
- Ben-Zvi, Y., et al. Response of the tooth-periodontal ligament-bone complex to load: A microCT study of the minipig molar. Journal of Structural Biology. 205 (2), 155-162 (2019).
- Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452 (2017).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Taddei, S. R. dA., et al. Experimental model of tooth movement in mice: A standardized protocol for studying bone remodeling under compression and tensile strains. Journal of Biomechanics. 45 (16), 2729-2735 (2012).
- Nakamura, K., Sahara, N., Deguchi, T. Temporal changes in the distribution and number of macrophage-lineage cells in the periodontal membrane of the rat molar in response to experimental tooth movement. Archives of Oral Biology. 46 (7), 593-607 (2001).
- Rygh, P., et al. Activation of the vascular system: A main mediator of periodontal fiber remodeling in orthodontic tooth movement. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 89 (6), 453-468 (1986).
- Nagao, M., et al. Vascular endothelial growth factor in cartilage development and osteoarthritis. Scientific Reports. 7 (1), 13027 (2017).
- Licht, A. H., et al. Endothelium-specific Cre recombinase activity in flk-1-Cre transgenic mice. Developmental Dynamics. 229 (2), 312-318 (2004).
- Connizzo, B. K., Naveh, G. R. S. In situ AFM-based nanoscale rheology reveals regional non-uniformity in viscoporoelastic mechanical behavior of the murine periodontal ligament. Journal of Biomechanics. 111, 109996 (2020).
- Connizzo, B. K., et al. Nonuniformity in Periodontal Ligament: Mechanics and Matrix Composition. Journal of Dental Research. 2, 179-186 (2020).
