Summary
En ny statisk platform bruges til at karakterisere proteinstruktur og interaktionssteder i det oprindelige cellemiljø ved hjælp af en proteinfodaftryksteknik kaldet in-cell hurtig fotokemisk oxidation af proteiner (IC-FPOP).
Abstract
Hurtig fotokemisk oxidation af proteiner (FPOP) kombineret med massespektrometri (MS) er blevet et uvurderligt værktøj i strukturelle proteomics til at afhøre proteininteraktioner, struktur og proteinformationsdynamik som funktion af tilgængelighed af opløsningsmidler. I de senere år er fpop-området, en hydroxylradikale proteinfodstrykteknik (HRPF), blevet udvidet til proteinmærkning i levende cellekulturer, hvilket giver mulighed for at studere proteininteraktioner i det indviklede cellulære miljø. In-cell protein modifikationer kan give indsigt i ligand induceret strukturelle ændringer eller konformationelle ændringer, der ledsager protein kompleks dannelse, alle inden for cellulære sammenhæng. Proteinaftryk er opnået ved hjælp af et sædvanligt flowbaseret system og en 248 nm KrF excimer laser til at give hydroxylradikaler via fotolyse af hydrogenperoxid, der kræver 20 minutters analyse for en celleprøve. For at lette tidsløste FPOP-eksperimenter blev brugen af en ny 6-brønds pladebaseret IC-FPOP-platform banebrydende. I det nuværende system bestråler en enkelt laserpuls en hel brønd, hvilket afkorter FPOP eksperimentel tidsramme, hvilket resulterer i 20 sekunders analysetid, et 60-fold fald. Denne stærkt reducerede analysetid gør det muligt at forske i cellulære mekanismer såsom biokemiske signalkaskader, proteinfoldning og differentialeksperimenter (dvs. stoffri vs. bundet lægemiddel) på en tidsafhængig måde. Denne nye instrumentering med titlen Platform Incubator with Movable XY Stage (PIXY) giver brugeren mulighed for at udføre cellekultur og IC-FPOP direkte på den optiske bænk ved hjælp af en platforminkubator med temperatur, CO2 og fugtighedskontrol. Platformen indeholder også en positioneringsfase, peristaltiske pumper og spejloptik til laserstrålevejledning. IC-FPOP-forhold såsom optikkonfiguration, strømningshastigheder, forbigående transinfektioner og H2O2-koncentration i PIXY er blevet optimeret og peer-reviewed. Automatisering af alle komponenter i systemet vil reducere menneskelig manipulation og øge gennemstrømningen.
Introduction
Protein footprinting teknikker kan afsløre dybtgående oplysninger om organiseringen af proteiner. Disse væsentlige ms-baserede teknikker til strukturel biologi er en del af værktøjskassen massespektrometri. Disse metoder sonde protein højere orden struktur (HOS) og synergi via kovalente mærkning1,2,3,4. Hurtig fotokemisk oxidation af proteiner (FPOP) anvender hydroxylradikaler til oxidativt at ændre opløsningsmiddeltilgængelige sidekæder af aminosyrer5,6 (Tabel 1). Metoden anvender en excimer laser ved 248 nm til fotolyse af hydrogenperoxid (H2O2) til at generere hydroxylradikaler. Teoretisk set kan 19 af de 20 aminosyrer oxideres oxidativt, og Gly er den eneste undtagelse. På grund af de forskellige reaktivitetsrater for aminosyrer med hydroxylradikaler er der imidlertid eksperimentelt observeret ændring af en delmængde af disse. Alligevel har metoden potentialet til analyse over længden af en proteinsekvens5. FPOP ændrer proteiner på mikrosekund tidshorisonten, hvilket gør det nyttigt at studere svage interaktioner med hurtige hastigheder. Tilgængeligheden af opløsningsmidler ændres ved ligandbinding eller en ændring i proteinformationen, således at metodens effekt ligger i sammenligningen af mærkningsmønsteret for et protein i flere tilstande (dvs. ligandfri sammenlignet med ligand-bundet). Som følge heraf har FPOP haft succes med at identificere proteinprotein- og protein-ligand-interaktionssteder og regioner med kropsbygningsændring7,8,9,10. FPOP-metoden er blevet udvidet fra studiet af rensede proteinsystemer til in-cell-analyse. In-cell FPOP (IC-FPOP) kan oxidativt ændre over tusind proteiner i celler for at give strukturelle oplysninger på tværs af proteome11,12. Den konventionelle IC-FPOP-platform bruger et flowsystem til at flyde celler enkelt fil forbi laserstrålen. Udviklingen af dette system gjorde det muligt for de enkelte celler at have samme eksponering for laserbestråling. Dette førte til en 13-fold stigning i antallet af oxidativt mærkede proteiner12. En begrænsning af strømningssystemet er imidlertid længden af et enkelt prøveeksperiment bestående af et bestrålingsinterval på 10 minutter, hvor ændringen finder sted, og en yderligere 10-minutters vaskecyklus. Tidsbegrænsningerne for IC-FPOP gør det uegnet til at studere kortlivede proteinfoldende mellemprodukter eller ændringer, der findes blandt interaktionsnetværk i biokemiske signalkaskader. Denne tidsmæssige begrænsning inspirerede til designet af en ny IC-FPOP-platform udstyret med højere gennemløb.
For præcist at måle protein højere orden struktur i den oprindelige celle miljø, det nye design gør det muligt cellekultur, der skal udføres direkte på laser platform, som gør det muligt IC-FPOP at være høj gennemløb. Denne opsætning giver også mulighed for minimerede forstyrrelser i mobilmiljøet i modsætning til IC-FPOP ved hjælp af flow, hvor vedhængende celler skal fjernes fra substratet. Den nye platform tillader IC-FPOP at forekomme i et sterilt inkubationssystem ved hjælp af et CO2 og temperaturstyret øverste kammer, mens du bruger konfigureret spejloptik til laserstrålestyring, et positioneringssystem til XY-bevægelse og peristaltiske pumper til kemisk udveksling. Den nye platform for gennemførelse af IC-FPOP har titlen Platform Incubator with Movable XY Stage (PIXY) (Figur 1). I PIXY udføres IC-FPOP på menneskelige celler, der dyrkes i seksbrøndsplader i platformens inkubatorkammer. Til denne konfiguration reflekteres laserstrålen nedad på pladen ved hjælp af strålekompatible spejle, da et positioneringstrin, der holder inkubatoren, flyttes i XY-flyet, så laserstrålen er strategisk justeret til kun at bestråle en brønd ad gangen. Valideringsundersøgelser viser, at IC-FPOP kan udføres hurtigere i PIXY end i flowsystemet og fører til øgede aminosyremodifikationer pr. protein. Udviklingen af denne nye IC-FPOP-platform vil forklare den viden, der kan opnås ved cellulære eksperimenter13.
Protocol
1. Samling af platforminkubator med bevægelig XY-fase
BEMÆRK: Den nye platform omfatter inkubationssystemet, positioneringsfasen og controllerne, peristaltiske pumper, 248 nm KrF excimer laser og de optiske spejle samlet på et imperialistisk optisk brødbræt.
- Sammensæt inkubationssystemet: temperaturenheden, kuldioxidenheden, luftfugteren, luftpumpen og berøringsovervågningssystemet(Figur 2A-E).
BEMÆRK: Producenten tilser detaljerede monteringsinstruktioner. Inkubationssystemet skal stabilisere sig til 5% CO2, 37 °C og 85% fugtighed, før der dyrkes celler i inkubatoren. Disse parametre kan afhænge af cellelinjen. - Saml den brugerdefinerede seks-godt plade inkubator, nanopositioning drive fase, og XY drive fase. Førstnævnte skruer ind i sidstnævnte, henholdsvis.
BEMÆRK: Detaljerede monteringsvejledninger fra producenten. - Tilslut de fire peristaltiske pumper i en "daisy chain"-sekvens via RS-232-kabler med et RS-232 til USB-kabel tilsluttet den styrende computer. Tilslut 3,18 mm ID polymerrør (f.eks. Tygon) til hver kanal på hver pumpekanalrulle.
BEMÆRK: Hver pumpe har fire ruller. Retning og strømningshastighed for ruller manipuleres manuelt. - Sæt 1/16" x 1/8" stik i slutningen af hvert 3,18 mm ID-polymerrør. Sæt 1/16'' enden af stikket i 1,59 ID polymerrør, og indsæt derefter polymerslangen i inkubatoren via brugerdefinerede porte. Placer den anden ende af røret i den opløsning, der vil blive infunderet under IC-FPOP-eksperimenter.
BEMÆRK: Til perfusionslinjerne har inkubatoren 36 brugerdefinerede porte til slangelinjer rundt om periferien for at imødekomme alle de anvendte reagenser. - Skru et 50 mm, 248 nm, 45° excimer laserlinjespejl i et kinematisk spejlmontering til Ø2" optik i breadboardet 10-11 gitterpunkter fra 248 nm laseråbningen. Det andet spejl anbringes i en vinkel på 90° til det første på den anden side af inkubatoren. Vinkel det andet spejl nedad ved ca. 45° for laserstrålestyring til inkubatoren (Figur 2F-J).
2. Synkronisering og indledende automatisering af systemet via integrationssoftware
- Installer den nyeste version af integrationssoftwaren, der er nødvendig for at styre drivere og pumper.
- Med henvisning til pumpemanualen skal pumperne omdøbes fra '5' og øges i værdi. Kommandoerne kan sendes til pumpesystemet ved hjælp af underprogrammet Manuel styring i integrationssoftwaren.
BEMÆRK: Hvis du indstiller en pumpe til kanaltilstand, ændres pumpens navngivningskonvention automatisk til sættet, 1, 2, 3 og 4, svarende til de fire pumpekanaler. - Åbn integrationssoftwareprogrammet til automatisering af platformskuvøsen.
- Vælg det relevante USB comport-enhedsnavn (f.eks.
- Klik på knappen Scriptgenerator for at redigere/oprette et script til den automatiserede platforminkubatorplatform. Klik på Gem script for at gemme sekvensen som en tekstfil (Figur 3A).
BEMÆRK: Scriptbyggeren har en brugergrænseflade til at definere scriptet med definitioner af pumpenummer, retning, hastighed, volumen, slangediameter, kanaltilstand og tidsforsinkelse. - Hvis kanaltilstand ønskes ved fremstillingen af scriptet, skal et trin i scriptet være dedikeret til at ændre pumpen ind og ud af kanaltilstand, og følgende trin, der svarer til pumpekanalerne, skal mærkes som pumper 1-4.
BEMÆRK: Dette sikrer, at ikke to pumper samtidig kan være i kanaltilstand under et platformsinkubatorscript, og at hver pumpe skiftes tilbage til ældre tilstand, efter at kommandoerne er sendt til de nødvendige kanaler. - Klik på knappen Læs script, og vælg den ønskede scriptfil til platformsinkubatorhandlingen.
- Skift knappen Kør sekvens til positionen TIL (grøn) for at køre scriptet, og klik derefter på knappen START (Figur 3B) .
3. Dyrk celler i platforminkubatoren
BEMÆRK: Cellerne skal placeres i perroninkubatoren under sterile forhold i en cellekulturhætte dagen før forsøget.
- Skru platforminkubatoren ud af nanopositioneringsfasen, og afbryd temperatur-, gas- og luftfugterlinjerne. Efter sprøjtning af inkubatoren med 70% ethanol, læg den i en cellekulturhætte.
- Vokse celler i en T-175 til omkring 80-90% sammenløb før overførsel.
BEMÆRK: Udtrykket sammenløb anvendes som et mål for antallet/dækningen af cellerne i en cellekulturskål eller en kolbe. - Fjern medier og skyl med buffer.
- Fjern celler ved hjælp af trypsin-EDTA ved hjælp af producentens protokol.
- Genbrug i 8 mL medier og tæl cellerne.
- Frø fibronectin/kollagen14 belagte seks-brønds plader med ca. 90-95 μL genbrugte celler i hver brønd. Dette volumen vil være hensigtsmæssigt at opnå 80-90% sammenløb (~ 1,2 millioner celler) i hver brønd på den næste dag.
BEMÆRK: Seks-brønds plader skal belægges med kollagen før såning. De reagenser, der anvendes under IC-FPOP, infunderes med hurtige strømningshastigheder. Coatede plader sikrer, at cellerne ikke løsnes for tidligt på grund af infusion af reagenser. - Placer den seedede plade i platforminkubatoren og dæk med kvartslåget.
BEMÆRK: Under design og udvikling blev et glasinkubatorlåg ændret til kvarts, så det er kompatibelt med det ultraviolette laserlys. - Udskift og fastgør platforminkubatoren tilbage på nanopositioneringsdrevet. Tilslut temperatur-, gas- og luftfugterledningerne igen.
- Lad cellerne vokse til sammenløb natten over.
BEMÆRK: Følgende cellekulturtrin er valgfrie og er beregnet til forsøg, hvor menneskelige celler er forbigående transfected. Disse trin vurderer transinfektionseffektiviteten under cellekulturforhold. - Transfekt plasmid indeholder genet for kimære protein GCaMP2 i HEK 293 celler ved hjælp af en kommerciel kationisk-lipid transfekt kit.
- Udfør forbigående transfekt af GCaMP2 i HEK293T celler i to seks-godt plader.
- Inkuber en seks-godt plade i platformen inkubator, og den anden seks-godt plade i en standard CO2 inkubator.
- Sammenlign transfekt effektivitet inden for hver plade ved fluorescens billeddannelse ved hjælp af en fluorescens mikroskop.
4. Lav dæmpningsbuffer og H2O2
- Lav 100 mL slukbuffer, der indeholder 125 mM N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) og 125 mM N, N′-Dimethylthiourea (DMTU).
BEMÆRK: DMTU og PBN er frie radikaler ådselædere og er celle gennemtrængelige. - H 2 O2til200 mM fortyndes. Hver prøve kræver 6 mL H2O2 for fuldt ud at nedsænke cellelaget i bunden af hver brønd.
BEMÆRK: Stødpuden laves dagen før og opbevares ved 4 °C natten over, beskyttet mod lys. H2O2 fortyndes på forsøgsdagen.
5. Konfigurer platforminkubatoren til IC-FPOP
BEMÆRK: Perroninkubatoren skal samles under sterile forhold. Saml inkubatoren i en steril cellekulturhætte.
- Skru platforminkubatoren ud af positioneringsfasen, og afbryd temperatur-, gas- og luftfugterlinjerne.
- Efter sprøjtning af inkubatoren med 70% ethanol skal du placere den i cellekulturhætten.
- Fjern seksbrøndspladen fra perroninkubatoren, fastgør pladens oprindelige låg, og bekræft cellesammenløbet ved hjælp af et mikroskop.
- Når cellesammenløbet er blevet bekræftet, skal du udskifte den seks-brønds plade med sammenflydende celler tilbage i platformens inkubator inde i cellekulturhætten.
- Sæt tre forskæringer (15 cm) 1,59 ID polymerrør i hver brønd via de indlejrede porte. Skyl rørene til brøndvæggene og hold med brugerdefinerede 3D-printede ringe.
BEMÆRK: Seks 33 mm PLA-glødetråd 3D-printede ringe var specialdesignede til at fastgøre slangen til pladens vægge uden at forstyrre cellerne eller komme i vejen for laserpulsen. - Dæk perroninkubatoren med kvartslåget. Udskift og fastgør fasetopinkubatoren på positioneringssystemet. Tilslut temperatur-, gas- og luftfugterledningerne igen.
- Tilslut 1,59 ID polymerrør til 1/16" enden af 1/16x1/8"-stikkene.
6. Udførelse af IC-FPOP i platformskuvøsen
- Forbered et integrationssoftwarescript til pumpeudtræk. Brug en peristaltisk pumpe (Pumpe 8) til helt at fjerne cellemedier fra alle seks brønde.
- Prime opløsningsmidler i hver kanal af de tre andre peristaltiske pumper (Pumper 5-7). Infuse H2O2 og sluk buffer i deres respektive vekslende rør, indtil reagenserne når inkubatorportene.
- Bekræft, at laserstrålen er blevet vinklet korrekt af spejlene og når inkubatoren uhæmmet.
BEMÆRK: Lasersikkerhedsbriller skal bæres, når laseren er i brug. Cellerne må ikke bestråles for tidligt under lystfiskeriet/justeringsprocessen. Brug pap til helt at dække kvartslåget, når du justerer strålen. Brug også en trykt kontur på hvidt papir af en seks-godt plade til yderligere at bekræfte laserstrålen rammer midten af hver brønd. Brug indstillingen Kontinuerlig puls ved den laveste frekvens og energi til justering. - Kontroller laserenergien ved hjælp af en ekstern sensor. Brug en enkelt laserpuls på 160 mJ ved 50 Hz og 27 kV.
BEMÆRK: Der kræves en timer til følgende trin. - Forbered integrationssoftwarescriptet til pumpeinfusion efter bekræftelse af strålejustering.
- Start timeren, og tryk samtidig på knappen Start på integrationssoftwarepumpescriptet.
- Infuse 200 mM H2O2 ved 35 mL/min. ind i den første brønd (6-10 sekunders mærke på timeren).
BEMÆRK: Der er en fem sekunders forsinkelse, før en pumpe begynder at indgyde. Det tager også laseren syv sekunder, før pulsen udløses. Laserpulsen skal komme umiddelbart efter H2O2 infusion. - Tryk på startknappen på lasersoftwaren ved 5 sekunders mærket for at udløse pulsen ved 11 sekunders mærket på timeren.
- Indgyde 125 mM stødløsning ved 35 ml/min. ind i den første brønd umiddelbart efter laserpulsen. Flyt positioneringsfasen manuelt for at justere den næste brønd med laserstrålen.
- Gentag ovenstående trin 6.5-6.9, indtil hver brønd er blevet behandlet.
BEMÆRK: IC-POP udføres i teknisk tre eksemplarer af tre laser- og tre ikke-laserprøver. En forarbejdet seks-godt plade tjener som en biologisk replikat. - I en cellekultur hætte, bruge en celle skraber til at overføre cellerne fra hver brønd i individuelle 15 mL koniske rør. Centrifuge celler ved 1.200 x g i 5 minutter.
- Supernatanten kasseres og genanvendes celler i 100 μL RIPA lysis buffer.
- Celler overføres til individuelle 1,2 mL polypropylenrør.
- Flash fryse alle prøver i flydende nitrogen og sted i en -80 °C fryser indtil brug.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her.
7. Proteinudvinding, rensning og proteolyse
- Prøverne optøs og opvarmes ved 95 °C i en varmeblok i 5 minutter.
- Efter opvarmning afkøles på is i 5 minutter.
- Tilføj 25 enheder af nuklease til celle lysate at nedbryde enkelt-strandede, dobbelt-strandede, lineære og cirkulære DNA og RNA og inkubere i rummet tempereret i 15 minutter.
- Centrifugeprøver ved 16.000 x g i 10 minutter ved 4 °C.
- Opsamle supernatant og overføre til en ren polypropylen rør.
- Kontroller proteinkoncentrationen ved hjælp af en kolorimetrisk proteinanalyse.
- 100 μg prøve overføres til et rent polypropylenrør, og der tilføres 100 μL med celle lysis buffer.
- Prøverne reduceres med 10 mM dithiothreitol (DTT) ved 50 °C i 45 minutter.
- Afkøl prøver ved stuetemperatur i 10 minutter.
- Alkylat med 50 mM iodoacetamid (IAA) ved stuetemperatur i 20 minutter.
BEMÆRK: Beskyt IAS mod lys - Der tilsættes 460 μL forkølet (-20 °C) acetone. Vortex prøver og sted ved -20 °C natten over.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her. - Næste dag udtages centrifugeprøver ved 16.000 x g i 10 minutter ved 4 °C.
- Fjern acetone uden at forstyrre proteinpillen.
- Der tilsættes 50 μL på 90 % forkølet (-20 °C) acetone. Hvirvelprøver til blanding og centrifuge ved 16.000 x g i yderligere 5 minutter ved 4 °C.
- Fjern acetone og lad prøverne tørre i 2-3 minutter.
- Genbrugt proteinpille med 10 mM Tris buffer pH 8.
- Opsnå ms-klasse trypsin (20 μg bestand) i 40 μL på 10 mM Tris buffer pH 8 og tilsæt 2,5 μg trypsin til hver prøve.
- Prøverne inkuberes ved 37 °C natten over.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her. - Vurder peptidkoncentrationen ved hjælp af en kolorimetrisk peptidanalyse.
- Forspørge prøverne med 5% myresyre.
- 10 μg prøve overføres til et rent polypropylenrør.
- Prøven tørres med en vakuumcentrifuge og genbruges med 20 μL MS-klasse 0,1% myresyre (FA) i vand.
- Overfør hver prøve for at rengøre autosamplerglas med forskårne hætter.
8. Højtydende væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS/MS)
- Hvis du vil lokalisere FPOP-ændringer, skal du analysere det fordøjede cellelysat ved hjælp af LC-MS/MS-analyse.
- Brug mobile faser på 0,1% FA i vand (A) og 0,1% FA i acetonontril (ACN) (B).
- 0,5 μg prøve på en fangstkolonne på 180 μm x 20 mm C18 (5 μm og 100 Å) og vask kolonnen med 99% (A) og 1% (B) i 15 minutter.
- Ved hjælp af en analytisk kolonne på 75 μm x 30 cm C18 (5 μm og 125 Å) elute og separate fordøjede peptider med en strømningshastighed på 0,300 μL/min i 120 minutter.
- Kør LC-gradient som følger: 0−1 min. , 3% opløsningsmiddel B; 2−100 min, 10−45% B;100−110 min, 45-100% B; 110−115 min. 100% B.
- Istandsættelse kolonnen på 3% (B) fra 115-116 minutter og hold på 3% (B) fra 116-120 minutter.
- Analyser eluterede peptider i positiv iontilstand med nanoelektronikionisering.
- Anskaf MS1-spektre over et m/z-scanningsområde på 375-1500 med en opløsning på 60.000.
- Sæt målet for automatisk forstærkningskontrol (AGC) til 5,0e5 med en maksimal injektionstid på 50 ms og 5,0e4 intensitetstærskel.
- Isoler prækursorer med opladningstilstande 2-6 via dataafhængig anskaffelse (DDA) med et isolationsvindue på 1,2 m/z og en cyklustid på 4 sekunder.
- Udsætter MS2-ioner for højenergikollisionsafkobling (HCD) (32 % normaliseret energi).
- Peptider udelukkes efter 1 MS/MS-anskaffelse i 60 sekunder.
- Angiv MS/MS-opløsningen til 15.000 med et AGC-mål på 5,0e4 og en maksimal injektionstid på 35 ms.
9. Proteome-opdager/databehandling
- Søg tandem rå datafiler på tilgængelige bottom-up proteomics analyse software mod en relevant Homo sapiens protein database og fordøje enzym.
- Angiv parametrene for søgning efter proteinanalyse.
- Angiv fragmenttolerance til 0,02 Da og overordnet iontolerance til 10 sider pr. minut.
- Indstil enzym specificitet til trypsin og give mulighed for en savnet kavalergang.
- Indstil masseområdet til 375-1500 m/z.
- Fastlæg peptid tillid på 95% (medium) og restkoncentrationer tillid på 99% (høj).
- Accepter proteiner, hvis mindst to forskellige peptider identificeres med FDR-filteret (5% opdagelseshastighed).
- Indstil carbamidthylering som en statisk modifikation og alle kendte hydroxylradikale sidekædeændringer15,16 som dynamiske modifikationer.
- Når filerne er færdige med at søge, eksportsekvens, ændringssteder, proteintilfend, frekvensfil, overflod af prækursorer og oplysninger om opbevaringstid til en elektronisk database.
- Beregn omfanget af modifikation pr. peptid eller restprodukt fra denne ligning:
BEMÆRK: Det ændrede EIC-område er det ekstraherede ionkromatografiske område (EIC) i peptid eller restkoncentrationer med en oxidativ modifikation, og EIC-området er det samlede areal af samme peptid eller rest med og uden den oxidative modifikation. Over tid vil protein i nærværelse af hydrogenperoxid oxidere, hvilket resulterer i baggrundsoxidationer. For at beregne omfanget af modifikationen divideres arealet af den modificerede peptid med det samlede areal. En ikke-bestrålet kontrolprøve tegner sig for baggrundsoxidation. Baggrundsoxidationen fra kontrolprøven trækkes ud af den laserbehandlede prøve for at identificere en FPOP-ændring.
Representative Results
For at bekræfte, at platformens inkubatorforhold er tilstrækkelige til cellekultur på laserplatformen, blev GCaMP2 forbigående transfected i HEK293T, og transfektureeffektiviteten for begge plader blev vurderet via fluorescensbilleddannelse (Figur 4A). GCaMP2 er et calciumsensoriske fluorescerende protein, der anvendes som en genetisk kodet intracellulær calciumindikator. Det er en fusion af grønt fluorescerende protein (GFP) og calcium-bindende protein, calmodulin. Der blev foretaget en luciferaseanalyse på HEK 293 celler transfected with plasmid prl-TK for at kvantificere transfekteffektiviteten (Figur 4B). Disse resultater viser, at platforminkubatoren oversteg standardinkubatorens ydeevne med en 1,13 gange stigning i transfektureeffektiviteten, hvilket giver et kvantitativt benchmark for optimalt cellekulturmiljø.
FPOP-modifikationer i HEK293T-celler mærket i flowsystemet blev sammenlignet med dem, der var mærket i platforminkubatoren, og viste, at platforminkubatoren overgår flowsystemet både i antallet af modificerede proteiner (Figur 5) og den samlede FPOP-dækning i disse proteiner. Antallet af FPOP modificerede proteiner erhvervet i platformen inkubatoren var ca 1051, 2,2 gange mere end dem, der erhverves i et typisk eksperiment. Modifikationer blev kombineret mellem to biologiske replikater for hvert eksperiment. Desuden giver PIXY højere gennemløb.
For at demonstrere fordelen ved højere modifikationsdækning på tværs af et protein blev IC-FPOP-modifikationer lokaliseret på peptidniveauet, og omfanget af modifikation blev kvantificeret for at skelne mellem forskelle i resultaterne mellem systemerne til actin, et 375 aminosyreprotein. I strømningssystemet blev der påvist to modificerede peptider, som gav begrænsede strukturelle oplysninger (figur 6A). Der blev dog påvist fem modificerede peptider, der spænder over actinsekvensen, i platforminkubatoren. Tandemmassespektre indikerer, at restkoncentrationerne Pro322 både blev modificeret og påvist i hvert forsøg (Figur 6B). De fem peptider, der blev modificeret i perroninkubatorprøverne, indeholdt tolv modificerede rester, mens kun fire rester blev modificeret med strømningssystemet (Figur 6C). Stigningen i oxidationsdækning giver mere strukturel information på tværs af proteinet.
Espino et al. påviste FPOP's evne til at blive udført in vivo (IV-FPOP) inden for C. elegans, en ormemodel for sygdomme hos mennesker17. Mens IV-FPOP også udføres via et flowsystem, blev PIXY-systemet testet for kompatibilitet med ormene. Ca. 10.000 orme blev inkuberet i hver brønd i platforminkubatoren ved 20 °C. LC−MS/MS-analysen viste, at 792 proteiner blev modificeret af IV-FPOP i platforminkubatoren sammenlignet med de 545 proteiner, der blev modificeret med flowsystemet (Figur 7). Disse resultater viser, at denne nye metode ud over 2D-cellekultur også er kompatibel med undersøgelsen af andre biologiske systemer som C. elegans.
Figur 1. Skematisk over PIXY-system. Systemkomponenter: (A) fase-top inkubator, (B) positioneringssystem , (C) peristaltiske pumper, og (D) perfusionslinjer. Cellekulturmedier fjernes fra hver brønd via pumper, før H2O2 og sænkningsløsninger infunderes på beregnede tidspunkter. Laser sti til bestråling fremvist i hvidt. Genoptrykt med tilladelse fra Johnson, D.T., Punshon-Smith, B., Espino, J.A., Gershenson, A., Jones, L.M., Implementering In-Cell Fast Fotokemisk Oxidation af proteiner i en platform inkubator med en bevægelig XY Stage. Analytisk kemi, 92(2), 1691-1696 2019. Copyright 2020 American Chemical Society. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Fuldt samlet PIXY-system. (A) Touch monitoring system, (B) kuldioxid enhed, (C) temperatur enhed,(D)luftpumpe,(E)luftfugter, (F) optiske spejle, (G) platform inkubator, (H) positioneringstrin, (I) 248nm KrF excimer laser, og (J) peristaltiske pumper. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Automatisering af peristaltiske pumper. (A) Eksempel på kommandoscript i LABVIEW. Kommandoindstillingerne omfatter lydstyrke, strømningshastighed, pauser, flowretning. Hastighed, sceneafstand og placering automatiseres i øjeblikket. (B) Scriptlæser i LABVIEW. Her uploades kommandoscripts, hvorefter Run Sequence og START trykkes for at starte pumper. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. HEK celle transfekt effektivitet. (A)Gennemsnitlig fluorescerende intensitet af GCaMP2-transfektsammenligning mellem standardinkubator (Control) og stage-top inkubator (PIXY). Prikker og firkanter repræsenterer hvert punkt i en brønd, hvor en foranstaltning blev truffet. (B) Transfekteffektivitet kvantificeret og valideret med en anden vektorplasmid, pRL-TK. P-værdi< 0,005. Genoptrykt med tilladelse fra Johnson, D.T., Punshon-Smith, B., Espino, J.A., Gershenson, A., Jones, L.M., Implementering In-Cell Fast Fotokemisk Oxidation af proteiner i en platform inkubator med en bevægelig XY Stage. Analytisk kemi, 92(2), 1691-1696 2019. Copyright 2020 American Chemical Society. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Sammenligning af proteiner modificeret i enkeltcelleflowsystemet og PIXY. Venn diagram over proteiner modificeret ved hjælp af i flowsystemet (lilla) og i PIXY (grøn). Genoptrykt med tilladelse fra Johnson, D.T., Punshon-Smith, B., Espino, J.A., Gershenson, A., Jones, L.M., Implementering In-Cell Fast Fotokemisk Oxidation af proteiner i en platform inkubator med en bevægelig XY Stage. Analytisk kemi, 92(2), 1691-1696 2019. Copyright 2020 American Chemical Society. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Lokalisering af IC-FPOP-ændringer. Sammenligning af IC-FPOP-ændringer mellem systemer. (A) Søjlediagram over oxidativt modificerede peptider inden for actin fra strømningssystemet (lilla) vs. platforminkubator (grøn). (B) Tandem MS spektre af actin (peptid 316-326) med modificeret proline i begge systemer og uændret actin peptid (C) FPOP modificerede rester af actin (PDB: 6ZXJ, kæde A 11 modificerede rester i platform inkubator (grøn), 3 modificerede rester i strømningssystemet (lilla), 1 overlappende modificeret restkoncentration (gul). Genoptrykt med tilladelse fra Johnson, D.T., Punshon-Smith, B., Espino, J.A., Gershenson, A., Jones, L.M., Implementering In-Cell Fast Fotokemisk Oxidation af proteiner i en platform inkubator med en bevægelig XY Stage. Analytisk kemi, 92(2), 1691-1696 2019. Copyright 2020 American Chemical Society. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. Sammenligning af FPOP modificerede proteiner i C. elegans efter flow vs PIXY. Der er en 1,5 gange stigning i oxidativt modificerede proteiner ved hjælp af PIXY sammenlignet med flowsystemet. Genoptrykt med tilladelse fra Johnson, D.T., Punshon-Smith, B., Espino, J.A., Gershenson, A., Jones, L.M., Implementering In-Cell Fast Fotokemisk Oxidation af proteiner i en platform inkubator med en bevægelig XY Stage. Analytisk kemi, 92(2), 1691-1696 2019. Copyright 2020 American Chemical Society. Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1. Distribution af arbejdsgangsændringer og masseskift (da). Klik her for at hente denne tabel.
Discussion
Proteiner udfører meget af arbejdet i levende celler. I betragtning af denne betydning er der behov for detaljerede data om proteinfunktion og højere ordensstruktur (HOS) i cellemiljøet for at uddybe forståelsen af snørklede i større komplekser og enzymatiske reaktioner i celler i modsætning til rensede systemer. For at gøre dette blev der anvendt en hydroxylradikale proteinfodtrykningsmetode (HRFP) med titlen In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins (IC-FPOP). De fleste FPOP-undersøgelser er blevet udført in vitro i relativt rene proteinsystemer, hvilket markant står i kontrast til det overfyldte molekylære miljø, som påvirker bindende interaktioner og proteinkonformationsdynamik. Som følge heraf er der en kløft mellem resultaterne fra in vitro-eksperimenter 18 og dem, der ville blive opnået i et faktisk cellulært miljø. For at bygge bro mellem de idealiserede forhold i et in vitro FPOP-eksperiment og cellens komplekse karakter er der udviklet en ny automatiseret seks-godt pladebaseret i celle-FPOP-platform. Denne nye FPOP-teknologi er i stand til at identificere og karakterisere disse molekylære arter og spore deres dynamiske molekylære interaktioner i både sunde og syge tilstande. Denne nye platform kaldes Platform Incubator med Movable XY stage (PIXY).
FPOP er med succes blevet brugt til at karakterisere de strukturelle oplysninger inden for proteomet. Men hver biologisk teknik har visse begrænsninger, der kræver yderligere forbedring. Specifikke reagenser er påkrævet under laserfotolyse og for effektivt at slukke ureagerede hydroxylradikaler. Adskillelse af fordøjede peptider kan kræve store mængder tid for at maksimere strukturelle oplysninger. Denne mængde information kan også kræve omfattende kvantantitation under dataanalyser efter MS1. Platforminkubatoren, herunder de perifere maskiner, der er nødvendige for cellekultur og IC-FPOP på laserplatformen, leveres med en stor omkostning, der muligvis ikke er mulig for nogle laboratorier. Efterhånden som der fortsat gøres fremskridt, bør robuste software- og analyseværktøjer fremme teknikken yderligere; hvoraf nogle er fremvist i denne undersøgelse. Aktuelle undersøgelser i denne platform inkubator er blevet udført på HEK293T celler og i C. elegans. IC-FPOP-metoden har vist sig at være kompatibel med en lang række cellelinjer, herunder kinesisk hamster æggestokke (CHO), Vero, MCF-7 og MCF10-A celler19. Da den generelle IC-FPOP-metode kan oversættes til denne statiske platform, bør disse cellelinjer også kunne studeres ved hjælp af PIXY.
IC-FPOP anvender H2O2 til oxidativt at ændre opløsningsmiddeltilgængelige bivirkninger af aminosyrer for derefter yderligere at skelne proteininteraktioner, struktur og metaboliske virkninger i levedygtige celler, hvilket er signifikant for at give biologisk kontekst. Det er vigtigt, før et IC-FPOP-eksperiment bekræfter, at cellerne er levedygtige efter H2O2-tilsætning. Celle levedygtighed undersøgelser viste, at cellerne var levedygtige i nærværelse af H2O2 koncentrationer op til 200 mM 13. Det er også vigtigt at sikre, at H2O2 infunderes ved en endelig koncentration på 200 mM direkte på celler, efter at mediet er fjernet. Hvis cellekulturmedierne ikke fjernes fuldstændigt, vil det medføre forskellige koncentrationer af H2O2. Sammenlignet med standardbetingelser førte en forøgelse af inkubationstiden til 10 sekunder sammen med en forøgelse af H2O2-koncentrationen til et højere antal proteiner modificeret af IC-FPOP i platforminkubatoren. Det er bydende nødvendigt at prime peristaltic pumper før brug for at sikre pumper fungerer korrekt og væske bliver spredt. Hvis dette ikke gøres, kan luftbobler i slangen, utilstrækkeligt volumen på H2O2 til at nedsænke celler og/eller utilstrækkelig lydstyrke.
Et andet problem, der kan opstå, er uønskede forsinkelser i systemet. Et eksempel på dette er processen med at verificere modtagne kommandoer til pumpesystemerne, hvilket tilføjer betydelige forsinkelser i størrelsesordenen 1000 eller flere millisekunder ved hjælp af integrationssoftwaren. Dette problem kan løses ved at minimere kommunikationen med pumperne under eksperimentet og ved hjælp af forudindstillede kommandoer på forhånd så meget som muligt.
I fremtiden er målet for PIXY at producere et fuldt automatiseret og integreret system. Ud over de peristaltiske pumper vil udløsningen af laserpulsen blive automatiseret. Et nyt positioneringssystem vil også blive brugt til hurtig bevægelse af platforminkubatoren for at forbedre hastighed og nøjagtighed. Alle komponenter i systemet vil fortsat blive programmeret ved hjælp af integrationssoftwaren for yderligere at øge gennemløbet.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser.
Forskningen præsenteres heri er forbundet med nedenstående refererede patentansøgning:
Usa's ikke-midlertidige patentansøgningsnummer: 17/042,565
Titel: "Enhed og metode til bestemmelse af proteinfoldning"
UMB Docket Nummer: LJ-2018-104 UMass Ref: UMA 18-059.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af et tilskud fra NIH R01 GM128983-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ismatec Reglo ICC Peristaltic Pumps | Cole-Palmer | 122270050 | |
| Kinematic Mirror Mount for Ø2" Optics | Thor Labs | ||
| 10X trypsin−EDTA | Corning | AB00490-00005 | |
| 50.0mm 248nm 45°, Excimer Laser Line Mirror | Edmond Optics | ||
| Acetone, HPLC Grade | Fisher Scientific | ||
| Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | ||
| ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg | Waters | 23275 | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used |
| ACQUITY UPLC M-Class System | Waters | A53225 | |
| Afinia H480 3D Printer | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
| air pump | OKOlabs | D12345 | |
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | Stock #63-120 | |
| Aqua 5 µm C18 125 Å packing material | Phenomenex | ||
| carbon dioxide unit | OKOlabs | MadMotor®-UHV | |
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| connectors (Y PP 1/16” and 1/16x1/8”) | Cole-Palmer | 116891000 | |
| Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 022625501 | |
| Dithiothreiotol (DTT) | AmericanBio | ||
| DMSO, Anhydrous | Invitrogen | LS118-500 | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | SK-78001-82 | |
| EX350 excimer laser | GAM Laser | PI89900 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | SK-12023-78 | |
| Formic Acid, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A929-4 | 4 L quantity is not necessary |
| HEK293T cells | Paul Shapiro Lab (University of Maryland Baltimore) | ||
| humidifier | OKOlabs | Nano-LPMW stage | |
| HV3-2 VALVE | Hamilton | BP152-500 | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | LS120-500 | |
| Iodoacetamide (IAA) | ACROS Organics | ||
| LABVIEW Professional 2018 | National Instruments | 86728 | |
| MadMotor Positioning system and controllers | Mad City Labs | W6-4 | |
| Methanol, LC/MS Grade | Fisher Scientific | 01-213-100 | any brand is sufficient |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | H301-T Unit-BL-PLUS | |
| N,N′-Dimethylthiourea (DMTU) | ACROS Organics | ||
| Nanopositioinging stage | Mad City Labs | ||
| N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) | ACROS Organics | ||
| OKO Touch Monitoring System | OKOlabs | ||
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | 7Z02936 | |
| PE50-C pyroelectric energy meter | Ophir Optronics | ||
| Penicillin-streptomycin | Corning | ||
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | ||
| Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | ||
| Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 75002436 | |
| Pierce Universal Nuclease for Cell Lysis | Fisher Scientific | 06-666A | |
| pressure gauge | OKOlabs | OKO-AIR-PUMP-BL | |
| PTFE filter | OKOlabs | CO2-UNIT-BL | |
| Six 33 mm PLA filament rings | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
| sterile incubator | OKOlabs | ||
| temperature unit | OKOlabs | OKO-TOUCH | |
| Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer | Fisher Scientific | A117-50 | |
| TiNKERcad | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
| Tris Base | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
| tubing (Tygon 3.18 and 1.59 ID) | Cole-Palmer | 177350250 | |
| Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | A454SK-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | 88702 | |
| 90058 | |||
| KM200 | |||
| 186007496 |
References
- Johnson, D. T., Di Stefano, L. H., Jones, L. M. Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP): A powerful mass spectrometry based structural proteomics tool. Journal of Biological Chemistry. 294 (32), 11969-11979 (2019).
- Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications. Chemical Reviews. 120 (10), 4355-4454 (2019).
- Li, J., Chen, G. The use of fast photochemical oxidation of proteins coupled with mass spectrometry in protein therapeutics discovery and development. Drug Discovery Today. 24 (3), 829-883 (2019).
- Zhao, B., et al. Covalent Labeling with an α,β-Unsaturated Carbonyl Scaffold for Studying Protein Structure and Interactions by Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 92 (9), 6637-6644 (2020).
- Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser Flash Photolysis of Hydrogen Peroxide to Oxidize Protein Solvent-Accessible Residues on the Microsecond Timescale. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).
- Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. Mass Spectrometry-Based Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP) for Higher Order Structure Characterization. Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).
- Chea, E. E., Jones, L. M. Modifications generated by fast photochemical oxidation of proteins reflect the native conformations of proteins. Protein Science. 27 (6), 1047-1056 (2018).
- Hambly, D., Gross, M. Laser flash photochemical oxidation to locate heme binding and conformational changes in myoglobin. International Journal of Mass Spectrometry. 259 (1), 124-129 (2007).
- Yan, Y. Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) maps the epitope of EGFR binding to adnectin. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 25 (12), 2084-2092 (2014).
- Zhang, Y., Wecksler, A. T., Molina, P., Deperalta, G., Gross, M. L. Mapping the Binding Interface of VEGF and a Monoclonal Antibody Fab-1 Fragment with Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP) and Mass Spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (5), 850-858 (2017).
- Espino, J. A., Mali, V. S., Jones, L. M. In Cell Footprinting Coupled with Mass Spectrometry for the Structural Analysis of Proteins in Live Cells. Analytical Chemistry. 87 (15), 7971-7978 (2015).
- Rinas, A., Mali, V. S., Espino, J. A., Jones, L. M. Development of a Microflow System for In-Cell Footprinting Coupled with Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (20), 10052-10058 (2016).
- Johnson, D. T., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L. M. Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins in a Platform Incubator with a Movable XY Stage. Analytical Chemistry. 92 (2), 1691-1696 (2019).
- Bangel-Ruland, N., et al. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator-mRNA delivery: a novel alternative for cystic fibrosis gene therapy. The Journal of Gene Medicine. 15 (11-12), 414-426 (2013).
- Gau, B. C., Chen, H., Zhang, Y., Gross, M. L. Sulfate Radical Anion as a New Reagent for Fast Photochemical Oxidation of Proteins. Analytical Chemistry. 82 (18), 7821-7827 (2010).
- Xu, G. C., et al. Hydroxyl Radical-Mediated Modification of Proteins as Probes for StructuralProteomics. Chemical Reviews. American Chemical Society. 107 (8), 3514-3543 (2007).
- Espino, J. A., Jones, L. M. Illuminating Biological Interactions with In Vivo Protein Footprinting. Analytical Chemistry. 9 (10), 6577-6584 (2019).
- Gau, B. C., Sharp, J. S., Rempel, D. L., Gross, M. L. Fast Photochemical Oxidation of Protein Footprints Faster than Protein Unfolding. Analytical Chemistry. 81 (16), 6563-6571 (2009).
- Kaur, U., Johnson, D. T., Jones, L. M. Validation of the Applicability of In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins across Multiple Eukaryotic Cell Lines. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (7), 1372-1379 (2020).
