Summary
En ny statisk plattform används för att karakterisera proteinstruktur och interaktionsplatser i den inhemska cellmiljön med hjälp av en proteinavtrycksteknik som kallas snabb fotokemisk oxidation av proteiner (IC-FPOP).
Abstract
Snabb fotokemisk oxidation av proteiner (FPOP) i kombination med masspektrometri (MS) har blivit ett ovärderligt verktyg inom strukturell proteomik för att förhöra proteininteraktioner, struktur och proteinkonformationsdynamik som en funktion av lösningsmedelstillgänglighet. Under de senaste åren har omfattningen av FPOP, en hydroxylradikal proteinfottrycksteknik (HRPF), utvidgats till proteinmärkning i levande cellkulturer, vilket ger möjlighet att studera proteininteraktioner i den invecklade cellmiljön. In-cell protein modifieringar kan ge insikt i ligand inducerade strukturella förändringar eller conformational förändringar som åtföljer protein komplexa bildandet, allt inom cellulära sammanhang. Proteinavtryck har åstadkommits med hjälp av ett vanligt flödesbaserat system och en 248 nm KrF excimerlaser för att ge hydroxylradikaler via fotolys av väteperoxid, vilket kräver 20 minuters analys för ett cellprov. För att underlätta tidsbesedda FPOP-experiment var användningen av en ny 6-brunns plattbaserad IC-FPOP-plattform banbrytande. I det nuvarande systemet bestrålar en enda laserpuls en hel brunn, vilket trunkerar FPOP-experimentell tidsram vilket resulterar i 20 sekunders analystid, en 60-faldig minskning. Denna kraftigt minskade analystid gör det möjligt att undersöka cellulära mekanismer som biokemiska signalkaskader, proteinvikning och differentialexperiment (dvs. läkemedelsfria kontra läkemedelsbundna) på ett tidsberoende sätt. Denna nya instrumentering, med titeln Platform Incubator with Movable XY Stage (PIXY), gör det möjligt för användaren att utföra cellkultur och IC-FPOP direkt på den optiska bänken med hjälp av en plattformsinkubator med temperatur, CO2 och fuktighetskontroll. Plattformen innehåller också ett positioneringssteg, peristaltiska pumpar och spegeloptik för laserstrålestyrning. IC-FPOP-förhållanden som optikkonfiguration, flödeshastigheter, övergående transfektioner och H2O2-koncentration i PIXY har optimerats och peer-reviewed. Automatisering av alla komponenter i systemet kommer att minska mänsklig manipulation och öka dataflödet.
Introduction
Proteinavtryckstekniker kan avslöja djup information om proteinorganisationen. Dessa viktiga strukturbiologiska MS-baserade tekniker är en komponent i verktygslådan för masspektrometri. Dessa metoder sondprotein högre ordning struktur (HOS) och synergi via kovaleent märkning1,2,3,4. Snabb fotokemisk oxidation av proteiner (FPOP) använder hydroxylradikaler för att oxidativt modifiera lösningsmedelsanpassade sidokedjor avaminosyror 5,6 (Tabell 1). Metoden använder en excimerlaser vid 248 nm för fotolys av väteperoxid (H2O2) för att generera hydroxylradikaler. Teoretiskt kan 19 av de 20 aminosyrorna oxidativt modifieras med Gly som det enda undantaget. På grund av de varierande reaktivitetshastigheterna hos aminosyror med hydroxylradikaler har dock modifiering av endast en delmängd av dessa observerats experimentellt. Ändå har metoden potential för analys över längden på en proteinsekvens5. FPOP modifierar proteiner på mikrosekunds tidsskalan, vilket gör det användbart att studera svaga interaktioner med snabba priser. Lösningsmedelstillgänglighet förändras vid ligandbindning eller en förändring i proteinkonformationen, vilket innebär att metodens kraft ligger i jämförelsen av märkningsmönstret för ett protein i flera tillstånd (dvs. ligandfri jämfört med ligand-bunden). Som ett resultat har FPOP lyckats identifiera protein-protein och protein-ligand interaktion platser och regioner för conformational förändring7,8,9,10. FPOP-metoden har utvidgats från studier av renade proteinsystem till cellanalys. In-cell FPOP (IC-FPOP) kan oxidativt modifiera över tusen proteiner i celler för att ge strukturell information över proteomen11,12. Den konventionella IC-FPOP-plattformen använder ett flödessystem för att flöda celler enkel fil förbi laserstrålen. Utvecklingen av detta system gjorde det möjligt för enskilda celler att ha lika exponering för laser bestrålning. Detta ledde till en 13-faldig ökning av antalet oxidativt märkta proteiner12. En begränsning av flödessystemet är dock längden på ett enda provförsök som består av ett 10-minuters bestrålningsintervall under vilket modifiering sker och ytterligare 10 minuters tvättcykel. Tidsbegränsningarna för IC-FPOP gör det olämpligt för att studera kortlivade proteinvikningsinteraler eller förändringar som finns bland interaktionsnätverk i biokemiska signalkaskader. Denna tidsbegränsning inspirerade utformningen av en ny IC-FPOP-plattform utrustad med högre genomströmning.
För att noggrant mäta proteinstrukturen med högre ordning i den ursprungliga cellmiljön gör den nya designen det möjligt att åstadkomma cellkulturen direkt på laserplattformen, vilket gör att IC-FPOP kan vara hög genomströmning. Den här inställningen möjliggör också minimerade störningar i cellmiljön, i motsats till IC-FPOP med hjälp av flöde där vidhäftande celler måste tas bort från substratet. Den nya plattformen tillåter IC-FPOP att uppstå i ett sterilt inkubationssystem med hjälp av en CO2 och temperaturstyrd stegskiva medan den använder konfigurerad spegeloptik för laserstrålestyrning, ett positioneringssystem för XY-rörelse och peristaltiska pumpar för kemiskt utbyte. Den nya plattformen för att genomföra IC-FPOP heter Platform Incubator with Movable XY Stage (PIXY) (Figur 1). I PIXY utförs IC-FPOP på mänskliga celler som odlas i sexbrunnsplattor i plattformens inkubatorkammare. För denna konfiguration reflekteras laserstrålen nedåt på plattan med strålkompatibla speglar som ett positioneringssteg som håller inkubatorn flyttad, i XY-planet, så laserstrålen är strategiskt justerad för att endast bestråla en brunn i taget. Valideringsstudier visar att IC-FPOP kan utföras snabbare i PIXY än i flödessystemet och leder till ökade aminosyramodifieringar per protein. Utvecklingen av denna nya IC-FPOP-plattform kommer att förklara den kunskap som kan vinnas från cellulära experiment13.
Protocol
1. Montering av plattformsinkubator med rörlig XY-scen
OBS: Den nya plattformen inkluderar inkubationssystemet, positioneringssteget och styrenheterna, peristaltiska pumparna, 248 nm KrF-excimerlaser och de optiska speglarna monterade på en kejserlig optisk brödbräda.
- Montera inkubationssystemet: temperaturenheten, koldioxidenheten, luftfuktaren, luftpumpen och beröringsövervakningssystemet (figur 2A-E).
OBS: Tillverkaren tillhandahåller detaljerade monteringsanvisningar. Inkubationssystemet måste stabiliseras till 5% CO2,37 °C och 85% fuktighet innan cellerna växer i inkubatorn. Dessa parametrar kan bero på cellinjen. - Montera den anpassade sexbrunnsplattans inkubator, nanopositioneringsdriftsteg och XY-drivsteg. Den förstnämnda skruvar in i den senare, respektive.
OBS: Detaljerade monteringsanvisningar från tillverkaren. - Anslut de fyra peristaltiska pumparna i en "kedjekedja" -sekvens via RS-232-kablar, med en RS-232 till USB-kabel ansluten till styrdatorn. Anslut 3,18 mm ID-polymerrör (t.ex. Tygon) till varje kanal på varje pumpkanalrulle.
OBS: Varje pump har fyra rullar. Rullarnas riktning och flödeshastighet manipuleras manuellt. - Sätt i 1/16 x 1/8"-kontakter i slutet av varje 3,18 mm ID-polymerrör. Sätt in 1/16'''-änden av kontakten i 1,59 ID-polymerrör och för sedan in polymerslangen i inkubatorn via anpassade portar. Placera den andra änden av röret i lösningen som kommer att infunderas under IC-FPOP-experiment.
OBS: För perfusionslinjerna har inkubatorn 36 anpassade portar för rörledningar runt om i periferin för att rymma alla reagenser som används. - Skruva en 50 mm, 248 nm, 45° excimer laserlinjespegel i ett kinematiskt spegelfäste för Ø2" optik i brödbrädan 10-11 gallerpunkter från 248 nm laseröppning. Placera den andra spegeln i 90° vinkel mot den första på inkubatorns andra sida. Vinkla den andra spegeln nedåt vid cirka 45° för laserstrålestyrning till inkubatorn (Figur 2F-J).
2. Synkronisering och initial automatisering av systemet via integrationsprogram
- Installera den senaste versionen av integrationsprogramvaran som behövs för att styra drivrutiner och pumpar.
- Med hänvisning till pumphandboken, byt namn på pumparna från och med "5" och öka i värde. Kommandona kan skickas till pumpsystemet med hjälp av delprogrammet Manuell styrning i integrationsprogrammet.
OBS: Om du ställer in en pump i kanalläge ändras automatiskt pumpens namngivningskonvention till setet, 1, 2, 3 och 4, motsvarande de fyra pumpkanalerna. - Öppna integrationsprogrammet för automatisering av plattformsinkubatorn.
- Välj lämpligt USB-komportenhetsnamn (t.ex. COM4) som motsvarar pumpsystemets USB-kabel från anslutningsmenyn som heter Comport för pumpar.
- Klicka på knappen Script Builder om du vill redigera/skapa ett skript för den automatiserade plattforminkubatorplattformen. Klicka på Spara skript om du vill spara sekvensen som en textfil (bild 3A).
OBS: Skriptbyggaren har ett användargränssnitt för att definiera skriptet med definitioner av pumpnummer, riktning, hastighet, volym, slangdiameter, kanalläge och tidsfördröjning. - Om kanalläget önskas vid tillverkningen av skriptet måste ett steg i skriptet ägnas åt att byta pump in och ut ur kanalläget, och följande steg som motsvarar pumpkanalerna måste märkas som pumpar 1-4.
OBS: Detta säkerställer att inga två pumpar samtidigt kan vara i kanalläge under ett plattformsinkubatorskript och att varje pump växlas tillbaka till äldre läge efter att kommandona har skickats till de kanaler som behövs. - Klicka på knappen Läs skript och välj lämplig skriptfil som önskas för plattformsinkubatoråtgärden.
- Växla knappen Kör sekvens till läget PÅ (grön) för att köra skriptet och klicka sedan på START-knappen (Bild 3B).
3. Odla celler i plattformsinkubatorn
OBS: Cellerna måste placeras i plattformsinkubatorn under sterila förhållanden i en cellkulturhuv dagen före experimentet.
- Skruva loss plattformsinkubatorn från nanopositionssteget och koppla bort temperatur-, gas- och luftfuktarledningarna. Efter sprutning av inkubatorn med 70% etanol, placera den i en cellkulturhuv.
- Odla celler i en T-175 till ca 80-90% sammanflöde före överföring.
OBS: Termen sammanflöde används som ett mått på cellernas antal/täckning i en cellkulturrätt eller en kolv. - Ta bort media och skölj med buffert.
- Ta bort celler med trypsin-EDTA med tillverkarens protokoll.
- Återanvänd i 8 ml media och räkna cellerna.
- Fröfibronectin/kollagen14 belagda sexbrunnsplattor med cirka 90-95 μL återanvända celler i varje brunn. Denna volym kommer att vara lämplig för att uppnå 80-90% sammanflöde (~ 1,2 miljoner celler) i varje brunn nästa dag.
OBS: Sexbrunnsplattor måste vara belagda med kollagen före sådd. Reagenserna som används under IC-FPOP är infunderade med snabba flödeshastigheter. Belagda plattor säkerställer att cellerna inte lossnar i förtid på grund av infusion av reagenser. - Placera den sådda plattan i plattformsinkubatorn och täck med kvartslocket.
OBS: Under design och utveckling byttes ett glasinkubatorlock till kvarts, så det är kompatibelt med ultraviolett laserljus. - Byt ut och säkra plattformsinkubatorn på nanopositionsdriftssteget. Återanslut temperatur-, gas- och luftfuktarledningarna.
- Låt cellerna växa till confluency över natten.
OBS: Följande cellkultursteg är valfria och är avsedda för experiment där mänskliga celler övergående överträds. Dessa steg bedömer transfection effektivitet under cell kultur förhållanden. - Transfekt plasmiden som innehåller genen för det chimeriska proteinet GCaMP2 till HEK 293 celler med hjälp av en kommersiell katjonlipid transfection kit.
- Utför tillfälliga transfektioner av GCaMP2 i HEK293T-celler i två sexbrunnsplattor.
- Inkubera en sex-brunnsplatta i plattformsinkubatorn och den andra sexbrunnsplattan i en vanlig CO 2-inkubator.
- Jämför transfection effektivitet inom varje platta genom fluorescens imaging med hjälp av ett fluorescensmikroskop.
4. Gör släckbuffert och H2O2
- Gör 100 ml släckbuffert som innehåller 125 mM N-tert-Butyl-α-fenylnitron (PBN) och 125 mM N, N′-Dimetyletyletylmåttur (DMTU).
OBS: DMTU och PBN är fria radikala asätare och är cellpermeabla. - Späd H2O2 till 200 mM. Varje prov kräver 6 ml H2O2 för att helt sänka celllagret längst ner i varje brunn.
OBS: Släckbufferten görs dagen innan och förvaras vid 4 °C över natten, skyddad mot ljus. Späd H2O2 på experimentdagen.
5. Ställ in plattformsinkubatorn för IC-FPOP
OBS: Plattformsinkubatorn måste monteras under sterila förhållanden. Montera inkubatorn i en steril cellkulturhuv.
- Skruva loss plattformsinkubatorn från positioneringssteget och koppla bort temperatur-, gas- och luftfuktarledningarna.
- Efter sprutning av inkubatorn med 70% etanol, placera den i cellkulturhuven.
- Ta bort sexbrunnsplattan från plattformsinkubatorn, fäst plattans ursprungliga lock och bekräfta cellkonfluensen med hjälp av ett mikroskop.
- När cellkonfluensen har bekräftats, byt ut sexbrunnsplattan mot sammanflödesceller tillbaka i plattformsinkubatorn inuti cellkulturhuven.
- Sätt in tre förskridade (15 cm) 1,59 ID-polymerrör i varje brunn via de inbäddade portarna. Spola rören till brunnsväggarna och håll med anpassade 3D-tryckta ringar.
OBS: Sex 33 mm PLA-glödtråds 3D-tryckta ringar var specialdesignade för att fästa slangarna på plattans väggar utan att störa cellerna eller komma i vägen för laserpulsen. - Täck plattformsinkubatorn med kvartslocket. Byt ut och säkra sceninkubatorn på positioneringssystemet. Återanslut temperatur-, gas- och luftfuktarledningarna.
- Anslut 1,59 ID-polymerrör till 1/16" änden av 1/16x1/8"-kontakterna.
6. Utföra IC-FPOP i plattformsinkubatorn
- Förbered ett integrationsprogramskript för pumputtag. Använd en peristaltisk pump (pump 8) för att helt ta bort cellmedia från alla sex brunnarna.
- Primaa lösningsmedel i varje kanal av de andra tre peristaltiska pumparna (Pumparna 5-7). Infusera H2O2 och släcka bufferten i sina respektive alternerande rör tills reagenserna når inkubatorportarna.
- Kontrollera att laserstrålen har vinklats korrekt av speglarna och når inkubatorn ohämmad.
OBS: Lasersnappar måste bäras när lasern används. Bestråla inte cellerna i förtid under mete/justeringsprocessen. Använd kartong för att helt täcka kvartslocket när du justerar balken. Använd också en tryckt kontur på vitt papper av en sexbrunnsplatta för att ytterligare bekräfta att laserstrålen träffar mitten av varje brunn. Använd inställningen Kontinuerlig puls vid lägsta frekvens och energi för justering. - Kontrollera laserenergin med hjälp av en extern sensor. Använd en enda laserpuls på 160 mJ vid 50 Hz och 27 kV.
OBS: En timer behövs för följande steg. - Förbered integrationsskriptet för pumpinfusion efter bekräftelse av stråljustering.
- Börja timern och tryck på Start-knappen på integrationsprogramvaran pumpskript samtidigt.
- Ingjut 200 mM H2O2 vid 35 ml/min in i första brunnen (6-10 sekunders märke på timer).
OBS: Det är fem sekunders fördröjning innan en pump börjar infusera. Det tar också lasern sju sekunder innan pulsen utlöses. Laserpulsen måste komma omedelbart efter H2O2 infusion. - Tryck på Start-knappen på laserprogramvaran vid 5-sekundersmarkeringen för att utlösa pulsen vid 11 sekunders markering på timern.
- Ingjut 125 mM släcklösning vid 35 ml/min i den första brunnen direkt efter laserpulsen. Flytta positionssteget manuellt för att justera nästa brunn med laserstrålen.
- Upprepa ovanstående steg 6.5-6.9 tills varje brunn har bearbetats.
OBS: IC-POP utförs i teknisk tre exemplar av tre laser- och tre icke-laserprover. En bearbetad sexbrunnsplatta fungerar som en biologisk replikat. - I en cellkulturhuv, använd en cellskrapa för att överföra cellerna från varje brunn till enskilda 15 ml koniska rör. Centrifugceller vid 1 200 x g i 5 minuter.
- Kassera supernatanten och återanvänd cellerna i 100 μL RIPA lysbuffert.
- Överför celler till enskilda 1,2 ml polypropylenrör.
- Flash frys alla prover i flytande kväve och placera i en -80 °C frys tills den används.
Protokollet kan pausas här.
7. Proteinutvinning, rening och proteolys
- Tina proverna och värm vid 95 °C i ett värmeblock i 5 minuter.
- Efter uppvärmning, svalna på is i 5 minuter.
- Tillsätt 25 atomkärnor i celllysatorn för att bryta ner enkelsträngat, dubbelsträngat, linjärt och cirkulärt DNA och RNA och inkubera i rumstempret i 15 minuter.
- Centrifugprover vid 16 000 x g i 10 minuter vid 4 °C.
- Samla supernatanten och överför till ett rent polypropylenrör.
- Kontrollera proteinkoncentrationen med hjälp av en kolorimetrisk proteinanalys.
- Överför 100 μg prov till ett rent polypropylenrör och för till 100 μL med celllysbuffert.
- Minska proverna med 10 mM dithiothreitol (DTT) vid 50 °C i 45 minuter.
- Kyl prover vid rumstemperatur i 10 minuter.
- Alkylat med 50 mM jodacetamid (IAA) vid rumstemperatur i 20 minuter.
OBS: Skydda IAA från ljus - Tillsätt 460 μL förkyld (-20 °C) aceton. Virvelprover och placera vid -20 °C över natten.
Protokollet kan pausas här. - Nästa dag provspringprover med 16 000 x g i 10 minuter vid 4 °C.
- Ta bort aceton utan att störa proteinpelleten.
- Tillsätt 50 μL 90% förkyld (-20 °C) aceton. Virvelprover för blandning och centrifugering vid 16 000 x g i ytterligare 5 minuter vid 4 °C.
- Ta bort aceton och låt proverna torka i 2-3 minuter.
- Återanvänd proteinpellet med 10 mM Tris buffert pH 8.
- Återanvänd ms-sort trypsin (20 μg lager) i 40 μL 10 mM Tris buffert pH 8 och tillsätt 2,5 μg trypsin till varje prov.
- Inkubera prover vid 37 °C över natten.
Protokollet kan pausas här. - Utvärdera peptidkoncentrationen med hjälp av en kolorimetrisk peptidanalys.
- Släcker proverna med 5% myrsyra.
- Överför 10 μg prov till ett rent polypropylenrör.
- Torka provet med en vakuumcentrifug och återanvänd med 20 μL MS-klass 0,1% myrsyra (FA) i vatten.
- Överför varje prov för att rengöra autosampler injektionsflaska med förslitskåpor.
8. Högpresterande vätskekromatografi-tandemmasspektrometri (LC-MS/MS)
- Om du vill lokalisera FPOP-ändringar analyserar du det smälta celllyatet med hjälp av LC-MS/MS-analys.
- Använd mobila faser på 0,1% FA i vatten (A) och 0,1% FA i acetonitril (ACN) (B).
- Ladda 0,5 μg prov på en 180 μm x 20 mm C18 (5 μm och 100 Å) fångstkolonn och tvätta kolonnen med 99% (A) och 1% (B) i 15 minuter.
- Använd en analyskolonn på 75 μm x 30 cm C18 (5 μm och 125 Å) och eluera och separera smälta peptider med en flödeshastighet på 0,300 μL/min i 120 minuter.
- Kör LC-lutning enligt följande: 0−1 min, 3% lösningsmedel B; 2−100 min, 10−45% B;100−110 min, 45-100% B; 110−115 min, 100% B.
- Rekonditionera kolumnen vid 3% (B) från 115-116 minuter och håll vid 3% (B) från 116-120 minuter.
- Analysera eluterade peptider i positivt jonläge med nanoelektrosprayjonisering.
- Skaffa MS1-spektra över ett m/z-skanningsområde på 375-1500 med en upplösning på 60 000.
- Ställ in målet för automatisk förstärkningskontroll (AGC) på 5,0e5 med en maximal injektionstid på 50 ms och 5,0e4 intensitetströskel.
- Isolera prekursorjoner med laddnings tillstånd 2-6 via data beroende förvärv (DDA) med ett isolerings fönster på 1,2 m/z och en cykeltid på 4 sekunder.
- Subjekt MS2 joner till högenergi kollisionsdisociation (HCD) (32% normaliserad energi).
- Exkludera peptider efter 1 MS/MS förvärv i 60 sekunder.
- Ställ in MS/MS-upplösningen på 15 000 med ett AGC-mål på 5,0e4 och en maximal injektionstid på 35 ms.
9. Proteome discoverer/databehandling
- Sök tandem rådatafiler på tillgängliga bottom-up proteomics analys programvara mot en relevant Homo sapiens protein databas och smälta enzym.
- Ställ in sökparametrarna för proteinanalys.
- Ställ in fragmenttoleransen på 0,02 Da och den överordnade jontoleransen till 10 ppm.
- Ställ in enzymspecifikitet till trypsin och tillåt en missad klyvning.
- Ställ in massintervallet på 375-1500 m/z.
- Etablera peptidförtroende vid 95% (medium) och rester förtroende vid 99% (hög).
- Acceptera proteiner om minst två distinkta peptider identifieras med filtret 5% upptäcktshastighet (FDR).
- Ställ in karbamidetylering som en statisk modifiering och alla kända hydroxylradikala sidokedjeändringar15,16 som dynamiska modifieringar.
- När filerna är klara med sökningen, exportsekvensen, ändringsplatserna, proteinanslutningen, spektrumfilen, prekursorns överflöd och information om lagringstid till en elektronisk databas.
- Beräkna omfattningen av modifieringen per peptid eller rester från denna ekvation:
OBS: Modifierat EIC-område är extraktionkromatografiskt område (EIC) av peptiden eller rester med en oxidativ modifiering, och EIC-området är den totala areaen av samma peptid eller rester med och utan oxidativ modifiering. Med tiden kommer protein i närvaro av väteperoxid att oxidera, vilket resulterar i bakgrundsoxidationer. För att beräkna omfattningen av modifieringen divideras den modifierade peptidens yta med den totala ytan. Ett icke bestrålat kontrollprov står för bakgrundsoxidation. Bakgrundsoxidationen från kontrollprovet subtraheras ut från det laserbehandlade provet för att identifiera en FPOP-modifiering.
Representative Results
För att bekräfta att plattformsinkubatorförhållandena är tillräckliga för cellkulturen vid laserplattformen, överträddes GCaMP2 tillfälligt till HEK293T och transfection effektivitet för båda plattorna bedömdes via fluorescens imaging (Figur 4A). GCaMP2 är ett kalciumavkännande fluorescerande protein som används som en genetiskt kodad intracellulär kalciumindikator. Det är en fusion av grönt fluorescerande protein (GFP) och kalciumbindande protein, kalmodulin. En luciferasanalys utfördes på HEK 293 celler transfected med plasmid prl-TK för att kvantifiera transfection effektivitet (Figur 4B). Dessa resultat visar att plattformsinkubatorn överskred prestandan hos standardinkubatorn, med en 1,13-faldig ökning av transfectioneffektiviteten, vilket ger ett kvantitativt riktmärke för optimal cellkulturmiljö.
FPOP-modifieringar i HEK293T-celler märkta i flödessystemet jämfördes med de som var märkta i plattformsinkubatorn och visade att plattformsinkubatorn överträffar flödessystemet både i antalet modifierade proteiner (figur 5) och den totala FPOP-täckningen i dessa proteiner. Antalet FPOP-modifierade proteiner som förvärvades i plattformsinkubatorn var cirka 1051, 2,2 gånger mer än de som förvärvats i ett typiskt experiment. Modifieringar kombinerades mellan två biologiska replikat för varje experiment. Dessutom ger PIXY högre data flöde.
För att visa fördelen med högre modifiering täckning över ett protein, IC-FPOP modifieringar lokaliserades på peptid nivå och omfattningen av modifiering kvantifierades för att skilja skillnader i resultat mellan systemen för aktin, en 375 aminosyra protein. I flödessystemet upptäcktes två modifierade peptider, vilket gav begränsad strukturell information (figur 6A). Fem modifierade peptider som spänner över aktinsekvensen upptäcktes dock i plattformsinkubatorn. Tandemmasspektra indikerar att rester Pro322 både modifierades och upptäcktes i varje experiment (figur 6B). De fem peptider som modifierats i plattformsinkubatorproverna innehöll tolv modifierade rester, medan endast fyra rester modifierades med flödessystemet (figur 6C). Ökningen av oxidationstäckningen ger mer strukturell information över hela proteinet.
Espino et al. visade kapaciteten hos FPOP att utföras in vivo (IV-FPOP) inom C. elegans, en maskmodell för mänskliga sjukdomar stater17. Medan IV-FPOP också utförs via ett flödessystem, testades PIXY-systemet för kompatibilitet med maskarna. Cirka 10 000 maskar inkuberades i varje brunn i plattformsinkubatorn vid 20 °C. LC−MS/MS-analys visade att 792 proteiner modifierades av IV-FPOP i plattformsinkubatorn jämfört med de 545 proteiner som modifierats med flödessystemet (figur 7). Dessa resultat visar att förutom 2D-cellkultur är denna nya metodik också förenlig med studien av andra biologiska system som C. elegans.
Figur 1. Schematiskt för PIXY-systemet. Systemkomponenter: (A) inkubator,(B)positioneringssystem,(C)peristaltiska pumpar och(D)perfusionsledningar. Cellkulturmedier avlägsnas från varje brunn via pumpar innan H2O2 och släckningslösningar infunderas vid beräknade tidpunkter. Laserväg för bestrålning visas i vitt. Omtryckt med tillstånd från Johnson, D. T., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L.M., Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins in a Platform Incubator with a Movable XY Stage. Analytisk kemi, 92(2), 1691-1696 2019. Upphovsrätt 2020 American Chemical Society. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2. Fullt monterat PIXY-system. (A)Beröringsövervakningssystem,(B)koldioxidenhet,(C)temperaturenhet,(D)luftpump,(E)luftfuktare,(F)optiska speglar,(G)plattformsinkubator,(H)positioneringssteg,(I)248nm KrF excimerlaser och(J)peristaltiska pumpar. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 3. Automatisering av peristaltiska pumpar. (A) Exempel kommandoskript i LABVIEW. Kommandoalternativ inkluderar volym, flödeshastighet, pauser, flödesriktning. Hastighet, scenavstånd och plats automatiseras för närvarande. (B) Skriptläsare i LABVIEW. Här laddas kommandoskript upp och kör sedan sekvens och START trycks in för att initiera pumpar. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4. HEK-celltransfektionseffektivitet. (A) Genomsnittlig fluorescerande intensitet av GCaMP2-transfectionjämförelse mellan standardinkubator (Control) och steginkubator (PIXY). Punkter och rutor representerar varje punkt i en brunn där en åtgärd togs. B)Transfection effektivitet kvantifieras och valideras med en annan vektor plasmid, pRL-TK. P-värde< 0,005. Omtryckt med tillstånd från Johnson, D. T., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L.M., Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins in a Platform Incubator with a Movable XY Stage. Analytisk kemi, 92(2), 1691-1696 2019. Upphovsrätt 2020 American Chemical Society. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5. Jämförelse av proteiner modifierade i encellsflödessystemet och PIXY. Venndiagram över proteiner modifierade med hjälp av i flödessystemet (lila) och i PIXY (grön). Omtryckt med tillstånd från Johnson, D. T., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L.M., Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins in a Platform Incubator with a Movable XY Stage. Analytisk kemi, 92(2), 1691-1696 2019. Upphovsrätt 2020 American Chemical Society. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 6. Lokalisering av IC-FPOP-ändringar. Jämförelse av IC-FPOP-modifieringar mellan system. (A) Stapelgraf av oxidativt modifierade peptider inom aktin från flödessystemet (lila) vs plattformsinkubator (grön). (B) Tandem MS-spektra av aktin (peptid 316-326) med modifierad proline i båda systemen och oförändrad aktinpeptid (C) FPOP-modifierade rester av aktin (PDB: 6ZXJ, kedja A 11 modifierade rester i plattformsinkubator (grön), 3 modifierade rester i flödessystemet (lila), 1 överlappande modifierade rester (gul). Omtryckt med tillstånd från Johnson, D. T., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L.M., Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins in a Platform Incubator with a Movable XY Stage. Analytisk kemi, 92(2), 1691-1696 2019. Upphovsrätt 2020 American Chemical Society. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 7. Jämförelse av FPOP modifierade proteiner i C. elegans efter flöde vs PIXY. Det finns en 1,5-faldig ökning av oxidativt modifierade proteiner med PIXY jämfört med flödessystemet. Omtryckt med tillstånd från Johnson, D. T., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L.M., Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins in a Platform Incubator with a Movable XY Stage. Analytisk kemi, 92(2), 1691-1696 2019. Upphovsrätt 2020 American Chemical Society. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Tabell 1. Distribution av arbetsflödesändringar och massförskjutningar (Da). Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Discussion
Proteiner utför mycket av arbetet i levande celler. Med tanke på denna betydelse behövs detaljerade data om proteinfunktion och högre orderstruktur (HOS) i cellmiljön för att fördjupa förståelsen för invecklingarna i större komplex och enzymatiska reaktioner i celler i motsats till renade system. För att göra detta antogs en hydroxylradikal proteinfottryck (HRFP) metod med titeln In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins (IC-FPOP). De flesta FPOP-studier har gjorts in vitro i relativt rena proteinsystem, vilket tydligt står i kontrast till den trånga molekylära miljön som påverkar bindningsinteraktioner och proteinkonformationsdynamik. Som ett resultat finns det en klyfta mellan resultaten från in vitro-experiment 18 och de som skulle erhållas i en faktisk cellulär miljö. För att överbrygga klyftan mellan de idealiserade förhållandena för ett in vitro FPOP-experiment och cellens komplexa natur har en ny automatiserad sex-brunnsplatta-baserad i cell-FPOP-plattform utvecklats. Denna nya FPOP-teknik kan identifiera och karakterisera dessa molekylära arter och spåra deras dynamiska molekylära interaktioner i både friska och sjuka tillstånd. Denna nya plattform kallas Platform Incubator med Movable XY-scenen (PIXY).
FPOP har framgångsrikt använts för att karakterisera den strukturella informationen i proteomen. Varje biologisk teknik har dock vissa begränsningar som kräver ytterligare förbättringar. Specifika reagenser krävs under laser fotolys och för att effektivt släcka oreacted hydroxyl radikaler. Separation av smälta peptider kan kräva stora mängder tid för att maximera strukturell information. Denna mängd information kan också kräva omfattande kvantifiering under dataanalysen efter medlemsstaterna1. Plattformsinkubatorn, inklusive de perifera maskiner som behövs för cellkultur och IC-FPOP vid laserplattformen, kommer med en stor kostnad som kanske inte är genomförbar för vissa laboratorier. I och med att framsteg fortsätter att göras bör robusta programvaru- och analysverktyg föra tekniken vidare. några av dem visas i denna studie. Aktuella studier i denna plattform inkubator har utförts på HEK293T celler och i C. elegans. IC-FPOP-metoden har visat sig vara kompatibel med en mängd olika cellinjer, inklusive kinesisk hamster äggstock (CHO), Vero, MCF-7 och MCF10-A celler19. Eftersom den allmänna IC-FPOP-metoden kan översättas till denna statiska plattform, bör dessa cellinjer också vara mottagliga för studier med PIXY.
IC-FPOP använder H2O2 för att oxidativt modifiera lösningsmedelsanpassade sidokedjor av aminosyror, för att sedan ytterligare urskilja proteininteraktioner, struktur och metabola effekter inom livskraftiga celler som är signifikant för att ge biologiskt sammanhang. Det är viktigt före ett IC-FPOP-experiment att bekräfta att cellerna är livskraftiga efter H2O2-tillägg. Studier av cellens livskraft visade att cellerna var livskraftiga i närvaro av H2O2-koncentrationer upp till 200 mM 13. Det är också viktigt att se till att H2O2 infunderas vid en slutlig koncentration på 200 mM direkt på celler efter att media har avlägsnats. Underlåtenhet att helt ta bort cellkulturmedier kommer att orsaka varierande koncentrationer av H2O2. Jämfört med standardförhållanden ledde en ökning av inkubationstiden till 10 sekunder tillsammans med att öka H2O2-koncentrationen till ett högre antal proteiner som modifierats av IC-FPOP i plattformsinkubatorn. Det är absolut nödvändigt att prime peristaltic pumpar före användning för att säkerställa att pumparna fungerar korrekt och vätska sprids. Underlåtenhet att göra detta kan orsaka luftbubblor i slangen, otillräcklig volym på H2O2 för att nedsänka celler och/eller otillräcklig volym av släcklösning.
En annan fråga som kan uppstå är oönskade förseningar i systemet. Ett exempel på detta är processen att verifiera mottagna kommandon för pumpsystemen, vilket innebär betydande förseningar i storleksordningen 1000 eller fler millisekunder med hjälp av integrationsprogrammet. Det här problemet kan åtgärdas genom att minimera kommunikationen med pumparna under experimentet och använda förinställt kommandon i förväg så mycket som möjligt.
I framtiden är målet för PIXY att producera ett helt automatiserat och integrerat system. Förutom de peristaltiska pumparna kommer utlösningen av laserpulsen att automatiseras. Ett nytt positioneringssystem kommer också att användas för plattformsinkubatorns snabba rörelse för att öka hastigheten och noggrannheten. Alla komponenter i systemet kommer även fortsättningsvis att programmeras med hjälp av integrationsprogramvaran för att ytterligare öka dataflödet.
Disclosures
Författarna förklarar inget konkurrerande ekonomiskt intresse.
Den forskning som presenteras häri är associerad med nedan refererad patentansökan:
Amerikanskt icke-provisoriskt patentansökningsnummer: 17/042,565
Benämning: "Anordning och metod för bestämning av proteinvikning"
UMB Docket Nummer: LJ-2018-104 UMass Ref: UMA 18-059.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett bidrag från NIH R01 GM128983-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ismatec Reglo ICC Peristaltic Pumps | Cole-Palmer | 122270050 | |
| Kinematic Mirror Mount for Ø2" Optics | Thor Labs | ||
| 10X trypsin−EDTA | Corning | AB00490-00005 | |
| 50.0mm 248nm 45°, Excimer Laser Line Mirror | Edmond Optics | ||
| Acetone, HPLC Grade | Fisher Scientific | ||
| Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | ||
| ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg | Waters | 23275 | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used |
| ACQUITY UPLC M-Class System | Waters | A53225 | |
| Afinia H480 3D Printer | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
| air pump | OKOlabs | D12345 | |
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | Stock #63-120 | |
| Aqua 5 µm C18 125 Å packing material | Phenomenex | ||
| carbon dioxide unit | OKOlabs | MadMotor®-UHV | |
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| connectors (Y PP 1/16” and 1/16x1/8”) | Cole-Palmer | 116891000 | |
| Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 022625501 | |
| Dithiothreiotol (DTT) | AmericanBio | ||
| DMSO, Anhydrous | Invitrogen | LS118-500 | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | SK-78001-82 | |
| EX350 excimer laser | GAM Laser | PI89900 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | SK-12023-78 | |
| Formic Acid, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A929-4 | 4 L quantity is not necessary |
| HEK293T cells | Paul Shapiro Lab (University of Maryland Baltimore) | ||
| humidifier | OKOlabs | Nano-LPMW stage | |
| HV3-2 VALVE | Hamilton | BP152-500 | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | LS120-500 | |
| Iodoacetamide (IAA) | ACROS Organics | ||
| LABVIEW Professional 2018 | National Instruments | 86728 | |
| MadMotor Positioning system and controllers | Mad City Labs | W6-4 | |
| Methanol, LC/MS Grade | Fisher Scientific | 01-213-100 | any brand is sufficient |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | H301-T Unit-BL-PLUS | |
| N,N′-Dimethylthiourea (DMTU) | ACROS Organics | ||
| Nanopositioinging stage | Mad City Labs | ||
| N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) | ACROS Organics | ||
| OKO Touch Monitoring System | OKOlabs | ||
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | 7Z02936 | |
| PE50-C pyroelectric energy meter | Ophir Optronics | ||
| Penicillin-streptomycin | Corning | ||
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | ||
| Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | ||
| Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 75002436 | |
| Pierce Universal Nuclease for Cell Lysis | Fisher Scientific | 06-666A | |
| pressure gauge | OKOlabs | OKO-AIR-PUMP-BL | |
| PTFE filter | OKOlabs | CO2-UNIT-BL | |
| Six 33 mm PLA filament rings | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
| sterile incubator | OKOlabs | ||
| temperature unit | OKOlabs | OKO-TOUCH | |
| Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer | Fisher Scientific | A117-50 | |
| TiNKERcad | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
| Tris Base | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
| tubing (Tygon 3.18 and 1.59 ID) | Cole-Palmer | 177350250 | |
| Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | A454SK-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | 88702 | |
| 90058 | |||
| KM200 | |||
| 186007496 |
References
- Johnson, D. T., Di Stefano, L. H., Jones, L. M. Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP): A powerful mass spectrometry based structural proteomics tool. Journal of Biological Chemistry. 294 (32), 11969-11979 (2019).
- Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications. Chemical Reviews. 120 (10), 4355-4454 (2019).
- Li, J., Chen, G. The use of fast photochemical oxidation of proteins coupled with mass spectrometry in protein therapeutics discovery and development. Drug Discovery Today. 24 (3), 829-883 (2019).
- Zhao, B., et al. Covalent Labeling with an α,β-Unsaturated Carbonyl Scaffold for Studying Protein Structure and Interactions by Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 92 (9), 6637-6644 (2020).
- Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser Flash Photolysis of Hydrogen Peroxide to Oxidize Protein Solvent-Accessible Residues on the Microsecond Timescale. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).
- Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. Mass Spectrometry-Based Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP) for Higher Order Structure Characterization. Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).
- Chea, E. E., Jones, L. M. Modifications generated by fast photochemical oxidation of proteins reflect the native conformations of proteins. Protein Science. 27 (6), 1047-1056 (2018).
- Hambly, D., Gross, M. Laser flash photochemical oxidation to locate heme binding and conformational changes in myoglobin. International Journal of Mass Spectrometry. 259 (1), 124-129 (2007).
- Yan, Y. Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) maps the epitope of EGFR binding to adnectin. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 25 (12), 2084-2092 (2014).
- Zhang, Y., Wecksler, A. T., Molina, P., Deperalta, G., Gross, M. L. Mapping the Binding Interface of VEGF and a Monoclonal Antibody Fab-1 Fragment with Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP) and Mass Spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (5), 850-858 (2017).
- Espino, J. A., Mali, V. S., Jones, L. M. In Cell Footprinting Coupled with Mass Spectrometry for the Structural Analysis of Proteins in Live Cells. Analytical Chemistry. 87 (15), 7971-7978 (2015).
- Rinas, A., Mali, V. S., Espino, J. A., Jones, L. M. Development of a Microflow System for In-Cell Footprinting Coupled with Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (20), 10052-10058 (2016).
- Johnson, D. T., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L. M. Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins in a Platform Incubator with a Movable XY Stage. Analytical Chemistry. 92 (2), 1691-1696 (2019).
- Bangel-Ruland, N., et al. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator-mRNA delivery: a novel alternative for cystic fibrosis gene therapy. The Journal of Gene Medicine. 15 (11-12), 414-426 (2013).
- Gau, B. C., Chen, H., Zhang, Y., Gross, M. L. Sulfate Radical Anion as a New Reagent for Fast Photochemical Oxidation of Proteins. Analytical Chemistry. 82 (18), 7821-7827 (2010).
- Xu, G. C., et al. Hydroxyl Radical-Mediated Modification of Proteins as Probes for StructuralProteomics. Chemical Reviews. American Chemical Society. 107 (8), 3514-3543 (2007).
- Espino, J. A., Jones, L. M. Illuminating Biological Interactions with In Vivo Protein Footprinting. Analytical Chemistry. 9 (10), 6577-6584 (2019).
- Gau, B. C., Sharp, J. S., Rempel, D. L., Gross, M. L. Fast Photochemical Oxidation of Protein Footprints Faster than Protein Unfolding. Analytical Chemistry. 81 (16), 6563-6571 (2009).
- Kaur, U., Johnson, D. T., Jones, L. M. Validation of the Applicability of In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins across Multiple Eukaryotic Cell Lines. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (7), 1372-1379 (2020).
