Plattforminkubator med bevegelig XY Stage: En ny plattform for implementering av in-cell rask fotokjemisk oksidasjon av proteiner

Summary

En ny statisk plattform brukes til å karakterisere proteinstruktur og interaksjonssteder i det opprinnelige cellemiljøet ved hjelp av en proteinfotavtrykksteknikk kalt in-cell rask fotokjemisk oksidasjon av proteiner (IC-FPOP).

Abstract

Rask fotokjemisk oksidasjon av proteiner (FPOP) kombinert med massespektrometri (MS) har blitt et uvurderlig verktøy i strukturell proteomikk for å forhøre proteininteraksjoner, struktur og proteinkonformasjonsdynamikk som en funksjon av løsningsmiddeltilgjengelighet. I de senere år har omfanget av FPOP, en hydroksylradikal proteinfotutskriftsteknikk (HRPF), blitt utvidet til proteinmerking i levende cellekulturer, noe som gir midler til å studere proteininteraksjoner i det innviklede cellulære miljøet. In-cell protein modifikasjoner kan gi innsikt i ligand induserte strukturelle endringer eller konformasjonsendringer som følger med proteinkompleksdannelse, alt innenfor den cellulære konteksten. Proteinfotavtrykk er oppnådd ved hjelp av et vanlig strømningsbasert system og en 248 nm KrF excimer laser for å gi hydroksylradikaler via fotolyse av hydrogenperoksid, som krever 20 minutters analyse for en celleprøve. For å lette tidsavklarte FPOP-eksperimenter ble bruken av en ny 6-brønns platebasert IC-FPOP-plattform banebrytende. I det nåværende systemet bestråler en enkelt laserpuls en hel brønn, noe som avkorter FPOP eksperimentell tidsramme som resulterer i 20 sekunders analysetid, en 60 ganger reduksjon. Denne sterkt reduserte analysetiden gjør det mulig å forske på cellulære mekanismer som biokjemiske signalkaskader, proteinfolding og differensialeksperimenter (dvs. stofffrie vs. legemiddelbundne) på en tidsavhengig måte. Denne nye instrumenteringen, med tittelen Platform Incubator with Movable XY Stage (PIXY), lar brukeren utføre cellekultur og IC-FPOP direkte på den optiske benken ved hjelp av en plattforminkubator med temperatur, CO₂ og fuktighetskontroll. Plattformen inkluderer også et posisjoneringsstadium, peristaltiske pumper og speiloptikk for laserstråleveiledning. IC-FPOP-forhold som optikkkonfigurasjon, strømningshastigheter, forbigående transfeksjoner og H₂O_{2-konsentrasjon} i PIXY er optimalisert og fagfellevurdert. Automatisering av alle komponenter i systemet vil redusere menneskelig manipulering og øke gjennomstrømningen.

Introduction

Proteinfotavtrykksteknikker kan avsløre dyp informasjon om organisering av proteiner. Disse essensielle strukturelle biologi MS-baserte teknikkene er en komponent i massespektrometri verktøykassen. Disse metodene sonderer protein høyere ordensstruktur (HOS) og synergi via kovalente merking^1,2,3,4. Rask fotokjemisk oksidasjon av proteiner (FPOP) bruker hydroksylradikaler for å oksidativt modifisere løsningsmiddel tilgjengelige sidekjeder av aminosyrer^5,6 (Tabell 1). Metoden benytter en excimer laser på 248 nm for fotolyse av hydrogenperoksid_(H2O₂) for å generere hydroksylradikaler. Teoretisk sett kan 19 av de 20 aminosyrene oksidativt modifiseres med Gly som det eneste unntaket. På grunn av de varierende reaktivitetsratene for aminosyrer med hydroksylradikaler, har imidlertid modifikasjon av bare en undergruppe av disse blitt observert eksperimentelt. Likevel har metoden potensial for analyse over lengden på en proteinsekvens⁵. FPOP endrer proteiner på mikrosekund tidsskalaen, noe som gjør det nyttig å studere svake interaksjoner med raske avhastigheter. Løsningsmiddeltilgjengelighet endres ved ligandbinding eller en endring i proteinkonformasjon, og dermed ligger metodens kraft i sammenligningen av etikettmønsteret til et protein i flere tilstander (dvs. ligandfritt sammenlignet med ligandbundet). Som et resultat har FPOP lykkes i å identifisere proteinprotein og protein-ligand interaksjonssteder og områder av konformasjonsendring^7,8,9,10. FPOP-metoden er utvidet fra studiet av rensede proteinsystemer til in-cell analyse. In-cell FPOP (IC-FPOP) kan oksidativt modifisere over tusen proteiner i celler for å gi strukturell informasjon på tvers av proteomet^11,12. Den konvensjonelle IC-FPOP-plattformen bruker et strømningssystem for å strømme celler enkeltfil forbi laserstrålen. Utviklingen av dette systemet tillot individuelle celler å ha lik eksponering for laserbestråling. Dette førte til en 13 ganger økning i antall oksidativt merkede proteiner¹². En begrensning av strømningssystemet er imidlertid lengden på et enkelt prøveeksperiment som består av et 10-minutters bestrålingsintervall der modifikasjonen finner sted og en ekstra 10-minutters vaskesyklus. Tidsbegrensningene til IC-FPOP gjør det uegnet til å studere kortvarige proteinfoldende mellomprodukter eller endringer som eksisterer blant interaksjonsnettverk i biokjemiske signalkaskader. Denne tidsbegrensningen inspirerte utformingen av en ny IC-FPOP-plattform utstyrt med høyere gjennomstrømning.

For å nøyaktig måle protein høyere ordensstruktur i det opprinnelige cellemiljøet, gjør den nye designen det mulig å oppnå cellekultur direkte på laserplattformen, noe som gjør at IC-FPOP kan være høy gjennomstrømning. Dette oppsettet tillater også minimerte perturbasjoner til mobilmiljøet, i motsetning til IC-FPOP ved hjelp av flyt der tilhengerceller må fjernes fra substratet. Den nye plattformen tillater IC-FPOP å forekomme i et sterilt inkubasjonssystem ved hjelp av et CO_2- og temperaturkontrollert toppkammer mens du bruker konfigurert speiloptikk for laserstråleveiledning, et posisjoneringssystem for XY-bevegelse og peristaltiske pumper for kjemisk utveksling. Den nye plattformen for gjennomføring av IC-FPOP har tittelen Plattforminkubator med bevegelig XY Stage (PIXY) (Figur 1). I PIXY utføres IC-FPOP på menneskelige celler som vokser i seks brønnplater i plattforminkubatorkammeret. For denne konfigurasjonen reflekteres laserstrålen nedover på platen ved hjelp av strålekompatible speil som et posisjoneringsstadium som holder inkubatoren, i XY-flyet, slik at laserstrålen er strategisk justert for å bare bestråle en brønn om gangen. Valideringsstudier viser at IC-FPOP kan utføres raskere i PIXY enn i strømningssystemet og fører til økte aminosyremodifikasjoner per protein. Utviklingen av denne nye IC-FPOP-plattformen vil avsløre kunnskapen som kan oppnås fra cellulære eksperimenter¹³.

Protocol

1. Montering av plattforminkubator med bevegelig XY-trinn

MERK: Den nye plattformen inkluderer inkubasjonssystemet, posisjoneringstrinnet og kontrollerne, de peristaltiske pumpene, 248 nm KrF excimer laser og de optiske speilene montert på et Imperial optisk brødbrett.

1. Monter inkubasjonssystemet: temperaturenheten, karbondioksidenheten, luftfukteren, luftpumpen og berøringsovervåkingssystemet (Figur 2A-E).
   MERK: Produsenten har detaljerte monteringsinstruksjoner. Inkubasjonssystemet må stabilisere seg til 5% CO_2,37 °C og 85 % fuktighet før vekstceller i inkubatoren. Disse parameterne kan avhenge av cellelinjen.
2. Monter den tilpassede seksbrønns plateinkubatoren, nanoposisjoneringsdrivtrinnet og XY-drivtrinnet. Førstnevnte skruer inn i sistnevnte, henholdsvis.
   MERK: Detaljerte monteringsinstruksjoner fra produsenten.
3. Koble de fire peristaltiske pumpene i en "tusenfrydkjede" sekvens via RS-232 kabler, med en RS-232 til USB-kabel koblet til den kontrollerende datamaskinen. Koble 3,18 mm ID-polymerrør (f.eks. Tygon) til hver kanal på hver pumpekanalrull.
   MERK: Hver pumpe har fire ruller. Retningen og strømningshastigheten til ruller manipuleres manuelt.
4. Sett inn 1/16" x 1/8" kontakter på enden av hvert 3,18 mm ID-polymerrør. Sett den 1/16'' enden av kontakten inn i 1,59 ID polymerrør, og sett deretter polymerslangen inn i inkubatoren via tilpassede porter. Plasser den andre enden av røret i løsningen som skal infunderes under IC-FPOP-eksperimentering.
   MERK: For perfusjonslinjene har inkubatoren 36 tilpassede porter for rørlinjer rundt hele periferien for å imøtekomme alle reagensene som brukes.
5. Skru ett 50 mm, 248 nm, 45° excimer laserlinjespeil i et kinematisk speilfeste for Ø2" optikk inn i brødplaten 10-11 gitterpunkter fra 248 nm laseråpning. Plasser det andre speilet i en 90° vinkel til det første på den andre siden av inkubatoren. Vink det andre speilet nedover ved ca. 45° for laserstråleveiledning til inkubatoren (Figur 2F-J).

2. Synkronisering og første automatisering av systemet via integrasjonsprogramvare

1. Installer den nyeste versjonen av integrasjonsprogramvaren som trengs for å kontrollere driverne og pumpene.
2. Hvis du refererer til pumpehåndboken, endrer du navnet på pumpene fra og med '5' og øker i verdi. Kommandoene kan sendes til pumpesystemet ved hjelp av underprogrammet Manuell kontroll i integrasjonsprogramvaren.
   MERK: Hvis du setter en pumpe i kanalmodus, endres automatisk pumpenavnekonvensjonen til settet, 1, 2, 3 og 4, som tilsvarer de fire pumpekanalene.
3. Åpne integrasjonsprogrammet for automatisering av plattforminkubatoren.
4. Velg riktig USB-kommunikasjonsenhetsnavn (f.eks. COM4) som tilsvarer pumpesystemets USB-kabel fra rullegardinmenyen for tilkobling merket Comport for pumper.
5. Klikk på Script Builder-knappen for å redigere / opprette et skript for den automatiserte plattforminkubatorplattformen. Klikk Lagre skript for å lagre sekvensen som en tekstfil ( Figur3A).
   MERK: Skriptbyggeren har et brukergrensesnitt for å definere skriptet med definisjoner av pumpenummer, retning, hastighet, volum, rørdiameter, kanalmodus og tidsberegnet forsinkelse.
6. Hvis kanalmodus ønskes ved skriptproduksjon, må et trinn i skriptet være dedikert til å endre pumpen inn og ut av kanalmodus, og følgende trinn som tilsvarer pumpekanalene må merkes som pumper 1-4.
   MERK: Dette sikrer at ingen pumper samtidig kan være i kanalmodus under et plattforminkubatorskript, og at hver pumpe byttes tilbake til eldre modus etter at kommandoene er sendt til de nødvendige kanalene.
7. Klikk les skript-knappen, og velg riktig skriptfil som er ønsket for plattforminkubatoroperasjonen.
8. Bytt Kjør sekvens -knappen til PÅ-posisjon (grønn) for å kjøre skriptet, og klikk deretter START - knappen (Figur 3B) .

3. Vokse celler i plattformen inkubator

MERK: Celler må plasseres i plattforminkubatoren under sterile forhold i en cellekulturhette dagen før eksperimentering.

1. Skru ut plattforminkubatoren fra nanoposisjoneringstrinnet og koble fra temperatur-, gass- og luftfukterlinjene. Etter sprøyting av inkubatoren med 70% etanol, plasser den i en cellekulturhette.
2. Vokse celler i en T-175 til ca 80-90% samløp før overføring.
   MERK: Begrepet samløp brukes som et mål på antall/dekning av cellene i en cellekulturrett eller en kolbe.
3. Fjern medier og skyll med buffer.
4. Koble fra celler ved hjelp av trypsin-EDTA ved hjelp av produsentens protokoll.
5. Resuspend i 8 ml medier og telle cellene.
6. Frøfibronektin/kollagen¹⁴ belagte seksbrønnsplater med ca. 90-95 μL resuspenderte celler i hver brønn. Dette volumet vil være hensiktsmessig for å oppnå 80-90% samløp (~ 1,2 millioner celler) i hver brønn neste dag.
   MERK: Seks brønnplater må belegges med kollagen før sådd. Reagensene som brukes under IC-FPOP er tilført raske strømningshastigheter. Belagte plater sikrer at cellene ikke løsnes for tidlig på grunn av infusjon av reagenser.
7. Plasser frøplaten i plattforminkubatoren og dekk med kvartslokket.
   MERK: Under design og utvikling ble et glassinkubatorlokk endret til kvarts, så det er kompatibelt med ultrafiolett laserlys.
8. Sett plattforminkubatoren tilbake på nanoposisjoneringsdrivtrinnet. Koble sammen temperatur-, gass- og luftfukterlinjene.
9. La cellene vokse til samløp over natten.
   MERK: Følgende cellekulturtrinn er valgfrie og er ment for eksperimenter der menneskelige celler er transient transfektert. Disse trinnene vurderer transfeksjonseffektivitet under cellekulturforhold.
10. Transfekt plasmidet som inneholder genet for det chimeriske proteinet GCaMP2 til HEK 293-celler ved hjelp av et kommersielt kationisk lipidtransfeksjonssett.
11. Utfør forbigående transfeksjoner av GCaMP2 i HEK293T-celler i to seksbrønnsplater.
12. Inkuber en seksbrønnsplate i plattforminkubatoren, og den andre seksbrønnsplaten i en standard CO 2-inkubator.
13. Sammenlign transfeksjonseffektivitet i hver plate ved fluorescensavbildning ved hjelp av et fluorescensmikroskop.

4. Lag slukkebuffer og H₂O₂

1. Lag 100 ml slukkebuffer som inneholder 125 mM N-tert-Butyl-α-fenylnitron (PBN) og 125 mM N, N′-Dimethylthiourea (DMTU).
   MERK: DMTU og PBN er frie radikale scavengers og er cellegjennomtrengelige.
2. Fortynn H₂O₂ til 200 mM. Hver prøve krever 6 ml H₂O₂ for å fullstendig nedsenke cellelaget nederst i hver brønn.
   MERK: Slukkebufferen gjøres dagen før og lagres ved 4 °C over natten, beskyttet mot lys. Fortynn H₂O₂ på eksperimentets dag.

5. Sett opp plattforminkubatoren for IC-FPOP

MERK: Plattforminkubatoren må monteres under sterile forhold. Monter inkubatoren i en steril cellekulturhette.

1. Skru ut plattforminkubatoren fra posisjoneringstrinnet og koble fra temperatur-, gass- og luftfukterlinjene.
2. Etter sprøyting av inkubatoren med 70% etanol, plasser den i cellekulturhetten.
3. Fjern seksbrønnsplaten fra plattforminkubatoren, fest platens originale lokk og bekreft cellesammenstrømning ved hjelp av et mikroskop.
4. Etter at cellesamstrømningen er bekreftet, erstatt seksbrønnplaten med konfluenteceller tilbake i plattforminkubatoren inne i cellekulturhetten.
5. Sett inn tre precut (15 cm) 1,59 ID polymerrør i hver brønn via de innebygde portene. Skyll rørene til brønnveggene og hold med tilpassede 3D-trykte ringer.
   MERK: Seks 33 mm PLA filament 3D-trykte ringer ble spesialdesignet for å feste slangen til platens vegger uten å forstyrre cellene eller komme i veien for laserpulsen.
6. Dekk plattforminkubatoren med kvartslokket. Sett på plass og fest trinnstoppinkubatoren på posisjoneringssystemet. Koble sammen temperatur-, gass- og luftfukterlinjene.
7. Koble 1,59 ID-polymerslangen til 1/16" enden av 1/16x1/8"-kontaktene.

6. Utføre IC-FPOP i plattforminkubatoren

1. Klargjør et programvareskript for integrering for pumpeuttak. Bruk en peristaltisk pumpe (pumpe 8) for å fjerne cellemedier helt fra alle seks brønnene.
2. Prime løsemidler i hver kanal av de tre andre peristaltiske pumpene (Pumper 5-7). Tilsett H₂O₂ og slukke bufferen i de respektive vekselrørene til reagensene når inkubatorportene.
3. Kontroller at laserstrålen er riktig vinklet av speilene og når inkubatoren uhemmet.
   MERK: Lasersikkerhetsbriller må brukes når laseren er i bruk. Ikke bestråle cellene for tidlig under sportsfiske/justeringsprosessen. Bruk papp til å dekke kvartslokket helt når du justerer bjelken. Bruk også en trykt kontur på hvitt papir av en seksbrønnsplate for å bekrefte at laserstrålen treffer midten av hver brønn. Bruk innstillingen for kontinuerlig puls med lavest frekvens og energi for justering.
4. Kontroller laserenergien ved hjelp av en ekstern sensor. Bruk en enkelt laserpuls på 160 mJ ved 50 Hz og 27 kV.
   MERK: En tidtaker er nødvendig for følgende trinn.
5. Klargjør integrasjonsprogramvareskriptet for pumpeinfusjon etter å ha bekreftet strålejustering.
6. Start tidtakeren og trykk på Start-knappen på pumpeskriptet for integrasjonsprogramvaren samtidig.
7. Tilsett 200 mM H₂O₂ ved 35 ml/min i den første brønnen (6-10 sekunders merke på timer).
   MERK: Det er en fem sekunders forsinkelse før en pumpe begynner å infisere. Det tar også laseren syv sekunder før pulsen utløses. Laserpulsen må komme umiddelbart etter H₂O₂ infusjon.
8. Trykk på Start-knappen på laserprogramvaren ved 5 sekundersmerket for å utløse pulsen ved 11 sekundersmerket på timeren.
9. Tilsett 125 mM slukkeløsning ved 35 ml/min i den første brønnen umiddelbart etter laserpulsen. Flytt posisjoneringstrinnet manuelt for å justere den neste brønnen etter laserstrålen.
10. Gjenta trinnene ovenfor 6,5-6,9 til hver brønn er behandlet.
    MERK: IC-POP utføres i teknisk triplikat av tre laser- og tre ikke-laserprøver. En bearbeidet seksbrønnsplate fungerer som en biologisk replikering.
11. I en cellekulturhette, bruk en celleskraper for å overføre cellene fra hver brønn til individuelle 15 ml koniske rør. Sentrifuger celler ved 1200 x g i 5 minutter.
12. Kast supernatant- og resuspendcellene i 100 μL RIPA lysisbuffer.
13. Overfør celler til individuelle 1,2 ml polypropylenrør.
14. Blitsfrys alle prøver i flytende nitrogen og plasser dem i en -80 °C fryser til bruk.
    MERK: Protokollen kan settes på pause her.

7. Proteinutvinning, rensing og proteolyse

1. Tine prøvene og varm ved 95 °C i en varmeblokk i 5 minutter.
2. Etter oppvarming, avkjøl på is i 5 minutter.
3. Tilsett 25 enheter av nuklease til cellen lysate å forringe enkeltstrenget, dobbeltstrenget, lineært og sirkulært DNA og RNA og inkubere på rommet temperert i 15 minutter.
4. Sentrifugeprøver ved 16 000 x g i 10 minutter ved 4 °C.
5. Samle supernatanten og overfør til et rent polypropylenrør.
6. Kontroller proteinkonsentrasjonen ved hjelp av en kolorimetrisk proteinanalyse.
7. Overfør 100 μg prøve til et rent polypropylenrør og ta med til 100 μL med cellelysbuffer.
8. Reduser prøver med 10 mM dithiothreitol (DTT) ved 50 °C i 45 minutter.
9. Avkjøl prøver ved romtemperatur i 10 minutter.
10. Alkylat med 50 mM iodoacetamid (IAA) ved romtemperatur i 20 minutter.
    MERK: Beskytt IAA mot lys
11. Tilsett 460 μL forkjølt (-20 °C) aceton. Virvelprøver og plasser ved -20 °C over natten.
    MERK: Protokollen kan settes på pause her.
12. Neste dag, sentrifuge prøver på 16,000 x g i 10 minutter ved 4 °C.
13. Fjern aceton uten å forstyrre proteinpellet.
14. Tilsett 50 μL 90 % ferdigkjølt (-20 °C) aceton. Virvelprøver for å blande og sentrifuge ved 16.000 x g i ytterligere 5 minutter ved 4 °C.
15. Fjern aceton og la prøvene tørke i 2-3 minutter.
16. Resuspend proteinpellet med 10 mM Tris buffer pH 8.
17. Resuspend MS grade trypsin (20 μg lager) i 40 μL av 10 mM Tris buffer pH 8 og tilsett 2,5 μg trypsin i hver prøve.
18. Inkuber prøver ved 37 °C over natten.
    MERK: Protokollen kan settes på pause her.
19. Vurder peptidkonsentrasjon ved hjelp av en kolorimetrisk peptidanalyse.
20. Slukk prøvene med 5% maursyre.
21. Overfør 10 μg prøve til et rent polypropylenrør.
22. Tørk prøven med en vakuumsentrifuge og resuspend med 20 μL MS-grad 0,1% maursyre (FA) i vann.
23. Overfør hver prøve for å rengjøre autosampler hetteglass med pre-slit caps.

8. Høy ytelse flytende kromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS / MS)

1. Hvis du vil lokalisere FPOP-modifikasjoner, analyserer du den fordøyde cellen lysat ved hjelp av LC-MS/MS-analyse.
2. Bruk mobile faser på 0,1 % FA i vann (A) og 0,1 % FA i acetonitril (ACN) (B).
3. Legg 0,5 μg prøve på en 180 μm x 20 mm C18 (5 μm og 100 Å) overlappingskolonne og vask kolonnen med 99% (A) og 1% (B) i 15 minutter.
4. Ved hjelp av en analytisk kolonne på 75 μm x 30 cm C18 (5 μm og 125 Å) elute og separate fordøyde peptider med en strømningshastighet på 0,300 μL/min i 120 minutter.
5. Kjør LC gradient som følger: 0−1 min, 3% løsningsmiddel B; 2−100 min, 10−45% B;100−110 min, 45-100% B; 110−115 min, 100% B.
6. Rekondisjoner kolonnen med 3% (B) fra 115-116 minutter og hold på 3% (B) fra 116-120 minutter.
7. Analyser eluterte peptider i positiv ionmodus med nanoelektrosprayionisering.
8. Skaff MS1-spektra over et m/z-skanneområde på 375-1500 med en oppløsning på 60 000.
9. Sett målet for automatisk forsterkningskontroll (AGC) til 5,0e⁵ med en maksimal injeksjonstid på 50 ms og 5,0e⁴ intensitetsterskel.
10. Isoler forløperioner med ladetilstander 2-6 via dataavhengig anskaffelse (DDA) med et isolasjonsvindu på 1,2 m/z og en syklustid på 4 sekunder.
11. Utsette MS2-ioner for høyenergikollisjonsdissosiasjon (HCD) (32 % normalisert energi).
12. Utelat peptider etter 1 MS/MS-anskaffelse i 60 sekunder.
13. Sett MS/MS-oppløsningen til 15 000 med et AGC-mål på 5,0e⁴ og en maksimal injeksjonstid på 35 ms.

9. Proteome oppdager / databehandling

1. Søk tandem rå datafiler på tilgjengelig bottom-up proteomics analyse programvare mot en relevant Homo sapiens protein database og fordøye enzym.
2. Angi søkeparameterne for proteinanalyse.
3. Sett fragmenttoleranse til 0,02 Da og overordnet iontoleranse til 10 ppm.
4. Sett enzym spesifisitet til trypsin og tillate en savnet spalting.
5. Sett masseområdet til 375-1500 m/z.
6. Etablere peptid tillit på 95% (medium) og rester tillit på 99% (høy).
7. Godta proteiner hvis minst to forskjellige peptider identifiseres med FDR-filteret (5 %.
8. Angi karbamidometylering som en statisk modifikasjon og alle kjente hydroksylradikale sidekjedemodifikasjoner^15,16 som dynamiske modifikasjoner.
9. Når filene er ferdig med å søke, eksportere sekvens, modifikasjonssteder, proteintiltredelse, spektrumfil, forløperoverflod og informasjon om oppbevaringstid til en elektronisk database.
10. Beregn omfanget av modifikasjon per peptid eller rester fra denne ligningen:
    
    MERK: EIC-området som er modifisert er det ekstraherte ionkromatografiske området (EIC) i peptidet eller rester med oksidativ modifikasjon, og EIC-området er det totale arealet av samme peptid eller rester med og uten oksidativ modifikasjon. Over tid vil protein i nærvær av hydrogenperoksid oksidere, noe som resulterer i bakgrunnsoksidasjoner. For å beregne omfanget av modifikasjon, er området av det modifiserte peptidet delt på det totale området. En ikke-bestrålet kontrollprøve står for bakgrunnsoksidasjon. Bakgrunnsoksidasjonen fra kontrollprøven trekkes ut fra den laserbehandlede prøven for å identifisere en FPOP-modifikasjon.

Representative Results

For å bekrefte at plattforminkubatorforholdene er tilstrekkelige for cellekultur på laserplattformen, ble GCaMP2 transfektet til HEK293T og transfeksjonseffektivitet for begge platene ble vurdert via fluorescensavbildning (figur 4A). GCaMP2 er et kalsiumsensorerende fluorescerende protein som brukes som en genetisk kodet intracellulær kalsiumindikator. Det er en blanding av grønt fluorescerende protein (GFP) og kalsiumbindende protein, calmodulin. En luciferaseanalyse ble utført på HEK 293 celler transfektert med plasmid prl-TK for å kvantifisere transfeksjonseffektivitet (Figur 4B). Disse resultatene viser at plattforminkubatoren overgikk ytelsen til standardinkubatoren, med en 1,13 ganger økning i transfeksjonseffektivitet, noe som gir en kvantitativ målestokk for optimalt cellekulturmiljø.

FPOP-modifikasjoner i HEK293T-celler merket i strømningssystemet ble sammenlignet med de som er merket i plattforminkubatoren og viste at plattforminkubatoren overgår strømningssystemet både i antall proteiner modifisert (figur 5) og den totale FPOP-dekningen i disse proteinene. Antall FPOP-modifiserte proteiner kjøpt i plattformen inkubator var ca 1051, 2,2 ganger mer enn de som er anskaffet i et typisk eksperiment. Modifikasjoner ble kombinert mellom to biologiske repliker for hvert eksperiment. Videre gir PIXY høyere gjennomstrømning.

For å demonstrere fordelen med høyere modifikasjonsdekning på tvers av et protein, ble IC-FPOP-modifikasjoner lokalisert på peptidnivå og omfanget av modifikasjonen ble kvantifisert for å skille forskjeller i utfall mellom systemene for aktin, et 375 aminosyreprotein. I strømningssystemet ble det påvist to modifiserte peptider som gir begrenset strukturell informasjon (figur 6A). Imidlertid ble fem modifiserte peptider som spenner over aktinsekvensen oppdaget i plattforminkubatoren. Tandemmassespektra indikerer at rester pro322 både ble modifisert og oppdaget i hvert eksperiment (figur 6B). De fem peptidene som ble modifisert i plattforminkubatorprøvene inneholdt tolv modifiserte rester, mens bare fire rester ble modifisert med strømningssystemet (figur 6C). Økningen i oksidasjonsdekningen gir mer strukturell informasjon på tvers av proteinet.

Espino et al. demonstrerte kapasiteten til FPOP som skal utføres in vivo (IV-FPOP) i C. elegans, en ormmodell for human sykdomstilstander¹⁷. Mens IV-FPOP også utføres via et strømningssystem, ble PIXY-systemet testet for kompatibilitet med ormene. Omtrent 10.000 ormer ble inkubert i hver brønn i plattforminkubatoren ved 20 °C. LC-MS/MS-analyse viste at 792 proteiner ble modifisert av IV-FPOP i plattforminkubatoren sammenlignet med de 545 proteinene som ble modifisert med strømningssystemet (Figur 7). Disse resultatene viser at i tillegg til 2D-cellekultur er denne nye metodikken også kompatibel med studiet av andre biologiske systemer som C. elegans.

Figur 1. Skjematisk for PIXY-systemet. Systemkomponenter: (A) trinn-topp inkubator, (B) posisjoneringssystem , (C) peristaltiske pumper og (D) perfusjonslinjer. Cellekulturmedier fjernes fra hver brønn via pumper før H₂O₂ og slukkeløsninger infunderes på beregnede tidspunkter. Laserbane for bestråling vist i hvitt. Gjengitt med tillatelse fra Johnson, D. T., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L.M., Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins in a Platform Incubator with a Movable XY Stage. Analytisk kjemi, 92(2), 1691-1696 2019. Opphavsrett 2020 American Chemical Society. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2. Fullstendig montert PIXY-system. (A) Berøringsovervåkingssystem, (B) karbondioksidenhet, (C) temperaturenhet, (D) luftpumpe, (E) luftfukter, (F) optiske speil, (G) plattforminkubator, (H) posisjoneringstrinn, (I) 248nm KrF excimer laser og (J) peristaltiske pumper. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3. Automatisering av peristaltiske pumper. (A) Eksempel på kommandoskript i LABVIEW. Kommandoalternativer inkluderer volum, strømningshastighet, pauser, flytretning. Hastighet, sceneavstand og plassering automatiseres for øyeblikket. (B) Skriptleser i LABVIEW. Her lastes kommandoskript opp, deretter trykkes Kjør sekvens og START for å starte pumper. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4. HEK celle transfeksjon effektivitet. (A) Gjennomsnittlig fluorescerende intensitet av GCaMP2 transfeksjon sammenligning mellom standard inkubator (Kontroll) og stage-top inkubator (PIXY). Prikker og firkanter representerer hvert punkt i en brønn der et tiltak ble tatt. (B) Transfection effektivitet kvantisert og validert med en annen vektor plasmid, pRL-TK. P-verdi< 0,005. Gjengitt med tillatelse fra Johnson, D. T., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L.M., Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins in a Platform Incubator with a Movable XY Stage. Analytisk kjemi, 92(2), 1691-1696 2019. Opphavsrett 2020 American Chemical Society. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5. Sammenligning av proteiner modifisert i enkeltcellestrømningssystemet og PIXY. Venn diagram over proteiner modifisert ved hjelp av i strømningssystemet (lilla) og i PIXY (grønn). Gjengitt med tillatelse fra Johnson, D. T., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L.M., Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins in a Platform Incubator with a Movable XY Stage. Analytisk kjemi, 92(2), 1691-1696 2019. Opphavsrett 2020 American Chemical Society. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 6. Lokalisering av IC-FPOP-endringer. Sammenligning av IC-FPOP-modifikasjoner mellom systemer. (A) Søylediagram over oksidativt modifiserte peptider i aktin fra strømningssystemet (lilla) vs plattforminkubator (grønn). (B) Tandem MS spektra av aktin (peptid 316-326) med modifisert prolin i begge systemer og umodifisert aktin peptid (C) FPOP modifiserte rester av aktin (PDB: 6ZXJ, kjede A 11 modifiserte rester i plattforminkubator (grønn), 3 modifiserte rester i strømningssystemet (lilla), 1 overlappende modifiserte rester (gul). Gjengitt med tillatelse fra Johnson, D. T., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L.M., Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins in a Platform Incubator with a Movable XY Stage. Analytisk kjemi, 92(2), 1691-1696 2019. Opphavsrett 2020 American Chemical Society. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 7. Sammenligning av FPOP modifiserte proteiner i C. elegans etter strømning vs PIXY. Det er en 1,5 ganger økning i oksidativt modifiserte proteiner ved bruk av PIXY sammenlignet med strømningssystemet. Gjengitt med tillatelse fra Johnson, D. T., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L.M., Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins in a Platform Incubator with a Movable XY Stage. Analytisk kjemi, 92(2), 1691-1696 2019. Opphavsrett 2020 American Chemical Society. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1. Distribusjon av arbeidsflytendringer og masseskift (Da).

Discussion

Proteiner utfører mye av arbeidet i levende celler. Gitt denne betydningen er det nødvendig med detaljerte data om proteinfunksjon og høyere ordensstruktur (HOS) i det cellulære miljøet for å utdype forståelsen av vanskelighetene i større komplekser og enzymatiske reaksjoner i celler i motsetning til rensede systemer. For å gjøre dette ble en hydroksylradikal proteinfotutskrift (HRFP) -metode vedtatt med tittelen In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins (IC-FPOP). De fleste FPOP-studier har blitt gjort in vitro i relativt rene proteinsystemer, som markert står i kontrast til det overfylte molekylære miljøet som påvirker bindende interaksjoner og proteinkonformasjonsdynamikk. Som et resultat er det en kløft mellom funnene fra in vitro-eksperimenter ¹⁸ og de som vil bli oppnådd i et faktisk mobilmiljø. For å bygge bro mellom de idealiserte forholdene til et in vitro FPOP-eksperiment og cellens komplekse natur, er det utviklet en ny automatisert seksbrønns platebasert i celle-FPOP-plattformen. Denne nye FPOP-teknologien er i stand til å identifisere og karakterisere disse molekylære artene og spore deres dynamiske molekylære interaksjoner i både sunne og syke tilstander. Denne nye plattformen kalles Platform Incubator med Bevegelig XY-trinn (PIXY).

FPOP har blitt brukt til å karakterisere strukturinformasjonen i proteomet. Imidlertid har hver biologisk teknikk visse begrensninger som krever ytterligere forbedring. Spesifikke reagenser kreves under laserfotolyse og for effektivt å slukke ikke-utførte hydroksylradikaler. Separasjon av fordøyde peptider kan kreve store mengder tid for å maksimere strukturell informasjon. Denne mengden informasjon kan også kreve omfattende mengder under dataanalyse etter MS¹. Plattforminkubatoren, inkludert det perifere maskineriet som trengs for cellekultur og IC-FPOP på laserplattformen, kommer med en stor kostnad som kanskje ikke er mulig for noen laboratorier. Etter hvert som fremgangen fortsetter å bli gjort, bør robuste programvare- og analyseverktøy fremme teknikken ytterligere; noen av dem vises frem i denne studien. Nåværende studier i denne plattformen inkubator har blitt utført på HEK293T celler og i C. elegans. IC-FPOP-metoden har vist seg å være kompatibel med en rekke cellelinjer, inkludert kinesisk hamsterovarie (CHO), Vero, MCF-7 og MCF10-A-cellene¹⁹. Siden den generelle IC-FPOP-metoden kan oversettes til denne statiske plattformen, bør disse cellelinjene også være egnet for studier ved hjelp av PIXY.

IC-FPOP bruker H₂O₂ til å oksidativt modifisere løsemiddel tilgjengelige sidekjeder av aminosyrer, for deretter å ytterligere skjelne proteininteraksjoner, struktur og metabolske effekter i levedyktige celler som er signifikante i å gi biologisk kontekst. Det er viktig før et IC-FPOP-eksperiment for å bekrefte at cellene er levedyktige etter H₂O₂ tillegg. Celle levedyktighetsstudier viste at cellene var levedyktige i nærvær av H₂O_{2-konsentrasjoner} opp til 200 mM ¹³. Det er også viktig å sørge for at H₂O₂ er infundert ved en endelig konsentrasjon på 200 mM direkte på celler etter at mediet er fjernet. Unnlatelse av å fjerne cellekulturmedier helt vil føre til varierende konsentrasjoner av H₂O₂. Sammenlignet med standardforhold førte økning av inkubasjonstiden til 10 sekunder sammen med å øke H₂O_{2-konsentrasjonen} til et høyere antall proteiner modifisert av IC-FPOP i plattforminkubatoren. Det er viktig å klargjøre peristaltiske pumper før bruk for å sikre at pumpene fungerer som de skal og at væsken spres. Unnlatelse av å gjøre dette kan føre til luftbobler i slangen, utilstrekkelig volum av H₂O₂ til å senke ned celler, og / eller utilstrekkelig volum av slukkeoppløsning.

Et annet problem som kan oppstå er uønskede forsinkelser i systemet. Et eksempel på dette er prosessen med å verifisere mottatte kommandoer for pumpesystemene som legger til betydelige forsinkelser i rekkefølgen 1000 eller flere millisekunder ved hjelp av integrasjonsprogramvaren. Dette problemet kan løses ved å minimere kommunikasjonen med pumpene under eksperimentet og bruke forhåndsinnstilte kommandoer på forhånd så mye som mulig.

I fremtiden produserer målet for PIXY et helautomatisk og integrert system. I tillegg til de peristaltiske pumpene, vil utløsningen av laserpulsen bli automatisert. Et nytt posisjoneringssystem vil også bli brukt til rask bevegelse av plattforminkubatoren for å forbedre hastighet og nøyaktighet. Alle komponenter i systemet vil fortsatt være programmert ved hjelp av integrasjonsprogramvaren for å øke gjennomstrømningen ytterligere.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ismatec Reglo ICC Peristaltic Pumps	Cole-Palmer	122270050
Kinematic Mirror Mount for Ø2" Optics	Thor Labs
10X trypsin−EDTA	Corning	AB00490-00005
50.0mm 248nm 45°, Excimer Laser Line Mirror	Edmond Optics
Acetone, HPLC Grade	Fisher Scientific
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade	Fisher Scientific
ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg	Waters	23275	other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used
ACQUITY UPLC M-Class System	Waters	A53225
Afinia H480 3D Printer	(Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library)
air pump	OKOlabs	D12345
Aluminum Foil	Fisher Scientific	Stock #63-120
Aqua 5 µm C18 125 Å packing material	Phenomenex
carbon dioxide unit	OKOlabs	MadMotor®-UHV
Centrifuge	Eppendorf
connectors (Y PP 1/16” and 1/16x1/8”)	Cole-Palmer	116891000
Delicate Task Wipers	Fisher Scientific	022625501
Dithiothreiotol (DTT)	AmericanBio
DMSO, Anhydrous	Invitrogen	LS118-500
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS)	Corning	SK-78001-82
EX350 excimer laser	GAM Laser	PI89900
Fetal bovine serum (FBS)	Corning	SK-12023-78
Formic Acid, LC/MS Grade	Fisher Scientific	A929-4	4 L quantity is not necessary
HEK293T cells	Paul Shapiro Lab (University of Maryland Baltimore)
humidifier	OKOlabs	Nano-LPMW stage
HV3-2 VALVE	Hamilton	BP152-500
Hydrogen Peroxide	Fisher Scientific	LS120-500
Iodoacetamide (IAA)	ACROS Organics
LABVIEW Professional 2018	National Instruments	86728
MadMotor Positioning system and controllers	Mad City Labs	W6-4
Methanol, LC/MS Grade	Fisher Scientific	01-213-100	any brand is sufficient
Microcentrifuge	Thermo Scientific	H301-T Unit-BL-PLUS
N,N′-Dimethylthiourea (DMTU)	ACROS Organics
Nanopositioinging stage	Mad City Labs
N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN)	ACROS Organics
OKO Touch Monitoring System	OKOlabs
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer	Thermo Scientific	7Z02936
PE50-C pyroelectric energy meter	Ophir Optronics
Penicillin-streptomycin	Corning
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay	Thermo Scientific
Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific
Pierce Trypsin Protease, MS Grade	Thermo Scientific	75002436
Pierce Universal Nuclease for Cell Lysis	Fisher Scientific	06-666A
pressure gauge	OKOlabs	OKO-AIR-PUMP-BL
PTFE filter	OKOlabs	CO2-UNIT-BL
Six 33 mm PLA filament rings	(Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library)
sterile incubator	OKOlabs
temperature unit	OKOlabs	OKO-TOUCH
Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer	Fisher Scientific	A117-50
TiNKERcad	(Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library)
Tris Base	Fisher Scientific	H325-100	any 30% hydrogen peroxide is sufficient
tubing (Tygon 3.18 and 1.59 ID)	Cole-Palmer	177350250
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade	Fisher Scientific	A454SK-4	4 L quantity is not necessary
Water, LC/MS Grade	Fisher Scientific	88702
		90058
		KM200
		186007496