Summary
يتم استخدام منصة ثابتة جديدة لتوصيف بنية البروتين ومواقع التفاعل في بيئة الخلايا الأصلية باستخدام تقنية بصمة البروتين تسمى الأكسدة الكيميائية الضوئية السريعة داخل الخلية للبروتينات (IC-FPOP).
Abstract
الأكسدة الضوئية السريعة للبروتينات (FPOP) إلى جانب قياس الطيف الكتلي (MS) أصبحت أداة لا تقدر بثمن في علم البروتيات الهيكلي لاستجواب تفاعلات البروتين والهيكل وديناميكيات تكوين البروتين كدالة على إمكانية الوصول إلى المذيبات. في السنوات الأخيرة ، تم توسيع نطاق FPOP ، وهي تقنية طباعة القدم البروتين الراديكالي الهيدروكسيل (HRPF) ، إلى وضع العلامات على البروتين في ثقافات الخلايا الحية ، مما يوفر الوسائل لدراسة تفاعلات البروتين في البيئة الخلوية المعقدة. يمكن أن توفر تعديلات البروتين داخل الخلية نظرة ثاقبة للتغيرات الهيكلية المستحثة في الليغند أو التغييرات التشكيلية المصاحبة لتشكيل مجمع البروتين ، كل ذلك في السياق الخلوي. وقد تم إنجاز بصمة البروتين باستخدام نظام التدفق العرفي والليزر 248 نانومتر KrF excimer لتسفر عن الجذور الهيدروكسيل عن طريق التحليل الضوئي لبيروكسيد الهيدروجين، مما يتطلب 20 دقيقة من التحليل لعينة خلية واحدة. ولتيسير تجارب FPOP التي تم حلها زمنيا، كان استخدام منصة IC-FPOP جديدة قائمة على 6 آبار رائدا. في النظام الحالي ، يقوم نبض ليزر واحد بتشعيع بئر واحد كامل ، مما يؤدي إلى اقتطاع الإطار الزمني التجريبي FPOP مما يؤدي إلى 20 ثانية من وقت التحليل ، وهو انخفاض 60 ضعفا. هذا الوقت تحليل انخفاض كبير يجعل من الممكن للبحث في الآليات الخلوية مثل السلاسل الإشارات الكيميائية الحيوية، طي البروتين، والتجارب التفاضلية (أي، خالية من المخدرات مقابل المخدرات ملزمة) بطريقة تعتمد على الوقت. هذا الجهاز الجديد، بعنوان حاضنة منصة مع المرحلة XY المنقولة (PIXY)، يسمح للمستخدم لأداء ثقافة الخلية وIC-FPOP مباشرة على مقاعد البدلاء البصرية باستخدام حاضنة منصة مع درجة الحرارة، CO2 والتحكم في الرطوبة. كما تتضمن المنصة مرحلة تحديد المواقع، والمضخات العتمة، والبصريات المرآة لتوجيه شعاع الليزر. تم تحسين ظروف IC-FPOP مثل تكوين البصريات ومعدلات التدفق والأمراض العابرة وتركيز H2O2 في PIXY ومراجعتها من قبل الأقران. أتمتة جميع مكونات النظام سوف تقلل من التلاعب البشري وزيادة الإنتاجية.
Introduction
تقنيات البصمة البروتين يمكن أن تكشف عن معلومات عميقة عن تنظيم البروتينات. هذه التقنيات الأساسية القائمة على البيولوجيا الهيكلية MS هي عنصر من عناصر مجموعة أدوات قياس الطيف الكتلي. هذه الأساليب التحقيق البروتين أعلى بنية النظام (HOS) والتآزر عن طريق وضع العلامات التساهمية1،2،3،4. أكسدة البروتينات الضوئية السريعة (FPOP) توظف الجذور الهيدروكسيل لتعديل السلاسل الجانبية للمذيبات التي يمكن الوصول إليها من الأحماض الأمينية5،6 (الجدول 1). تستخدم هذه الطريقة ليزر اكسيمر في 248 نانومتر للتحلل الضوئي لبيروكسيد الهيدروجين (H2O2) لتوليد الجذور الهيدروكسيل. نظريا، 19 من الأحماض الأمينية 20 يمكن تعديلها بشكل مؤاكس مع غلي يجري الاستثناء الوحيد. ومع ذلك ، نظرا لمعدلات التفاعل متفاوتة من الأحماض الأمينية مع الجذور الهيدروكسيل ، تم رصد تعديل مجموعة فرعية فقط من هذه تجريبيا. ومع ذلك ، فإن الطريقة لديها القدرة على التحليل على طول تسلسل البروتين5. يقوم FPOP بتعديل البروتينات على مقياس الوقت ميكروثانية، مما يجعله مفيدا في دراسة التفاعلات الضعيفة مع معدلات إيقاف سريع. تغييرات إمكانية الوصول المذيبات على الربط ليغاند أو تغيير في تشكيل البروتين، وبالتالي، فإن قوة الأسلوب يكمن في مقارنة نمط وضع العلامات من البروتين في ولايات متعددة (أي، ليجاند خالية بالمقارنة مع ليغاند ملزمة). ونتيجة لذلك، وقد FPOP ناجحة في تحديد البروتين البروتين والبروتين ليغاند مواقع التفاعل والمناطق من تغيير تشكيلي7،8،9،10. تم توسيع طريقة FPOP من دراسة أنظمة البروتين النقي إلى التحليل داخل الخلية. يمكن FPOP داخل الخلية (IC-FPOP) تعديل التأكسدي أكثر من ألف البروتينات في الخلايا لتوفير المعلومات الهيكلية عبر البروتيوم11،12. تستخدم منصة IC-FPOP التقليدية نظام تدفق لتدفق الخلايا ملف واحد بعد شعاع الليزر. وقد أتاح تطوير هذا النظام للخلايا الفردية التعرض على قدم المساواة للإشعاع بالليزر. وأدى ذلك إلى ارتفاع 13 أضعاف في عدد البروتينات المسماة التأكسدي12. ومع ذلك، فإن أحد القيود المفروضة على نظام التدفق هو طول تجربة عينة واحدة تتكون من فاصل إشعاعي مدته 10 دقائق يتم خلاله التعديل ودورة غسيل إضافية مدتها 10 دقائق. القيود الزمنية لIC-FPOP يجعلها غير مناسبة لدراسة وسيطة طي البروتين قصيرة الأجل أو التغيرات الموجودة بين شبكات التفاعل في سلاسل الإشارات الكيميائية الحيوية. وقد ألهم هذا القيد الزمني تصميم منصة جديدة من نوع IC-FPOP مجهزة بكمية إنتاجية أعلى.
لقياس دقيق للبروتين أعلى ترتيب هيكل في بيئة الخلية الأصلية، والتصميم الجديد يسمح لثقافة الخلية أن يتحقق مباشرة في منصة الليزر، والتي تمكن IC-FPOP أن تكون الإنتاجية العالية. يسمح هذا الإعداد أيضا الاضطرابات المصغرة للبيئة الخلوية، على النقيض من IC-FPOP باستخدام تدفق حيث يجب إزالة الخلايا الملتصقة من الركيزة. تسمح المنصة الجديدة ل IC-FPOP بالحدوث في نظام حضانة معقم باستخدامثاني أكسيد الكربون وغرفة المرحلة العليا التي يتم التحكم في درجة حرارتها مع استخدام البصريات المتطابقة المكونة لتوجيه شعاع الليزر ، ونظام تحديد المواقع لحركة XY ، والمضخات العاكسة للتبادل الكيميائي. المنصة الجديدة لإجراء IC-FPOP بعنوان حاضنة المنصة مع المرحلة XY المنقولة (PIXY)(الشكل 1). في PIXY ، يتم تنفيذ IC-FPOP على الخلايا البشرية التي تزرع في لوحات من ست آبار داخل غرفة حاضنة المنصة. لهذا التكوين، وينعكس شعاع الليزر إلى أسفل على لوحة باستخدام المرايا متوافقة مع شعاع كمرحلة تحديد المواقع التي تحمل الحاضنة يتم نقلها، في الطائرة XY، لذلك يتم محاذاة شعاع الليزر استراتيجيا لتشعيع بئر واحد فقط في وقت واحد. تظهر دراسات التحقق من الصحة أنه يمكن إجراء IC-FPOP بشكل أسرع في PIXY مما هو عليه في نظام التدفق ويؤدي إلى زيادة تعديلات الأحماض الأمينية لكل بروتين. تطوير هذه المنصة الجديدة IC-FPOP سوف شرح على المعرفة التي يمكن الحصول عليها من التجارب الخلوية13.
Protocol
1. تجميع حاضنة المنصة مع مرحلة XY المنقولة
ملاحظة: تتضمن المنصة الجديدة نظام الحضانة، ومرحلة تحديد المواقع ووحدات التحكم، والمضخات العتمة، والليزر 248 نانومتر KrF، والمرايا البصرية المجمعة على لوح الخبز البصري الإمبراطوري.
- تجميع نظام الحضانة: وحدة درجة الحرارة، وحدة ثاني أكسيد الكربون، مرطب، مضخة الهواء، ونظام مراقبة اللمس(الشكل 2A-E).
ملاحظة: إرشادات التجميع المفصلة يتم توفيرها من قبل الشركة المصنعة. يجب أن يستقر نظام الحضانة إلى 5٪ CO2و 37 درجة مئوية و 85٪ رطوبة قبل نمو الخلايا داخل الحاضنة. قد تعتمد هذه المعلمات على خط الخلية. - تجميع مخصص ستة جيدا لوحة حاضنة، nanopositioning مرحلة محرك الأقراص، ومرحلة محرك XY. مسامير الأولى في هذا الأخير ، على التوالي.
ملاحظة: إرشادات التجميع المفصلة المقدمة من قبل الشركة المصنعة. - قم بتوصيل المضخات التجستيكية الأربعة في تسلسل "سلسلة ديزي" عبر كابلات RS-232 ، مع كابل RS-232 إلى USB متصل بالكمبيوتر المسيطر. قم بتوصيل أنابيب البوليمر 3.18 مم (مثل تايغون) بكل قناة على كل أسطوانة قناة مضخة.
ملاحظة: تحتوي كل مضخة على أربع بكرات. يتم التلاعب الاتجاه ومعدل تدفق بكرات يدويا. - أدخل موصلات مقاس 1/16 بوصة × 1/8 بوصة في نهاية كل أنبوب بوليمر ID مقاس 3.18 مم. أدخل نهاية الموصل 1/16 بوصة في أنابيب البوليمر 1.59 معرف، ثم أدخل أنابيب البوليمر في الحاضنة عبر منافذ مخصصة. ضع الطرف الآخر من الأنبوب في الحل الذي سيتم غرسه أثناء تجربة IC-FPOP.
ملاحظة: بالنسبة لخطوط التشوه، تحتوي الحاضنة على 36 منفذا مخصصا لخطوط الأنابيب في جميع أنحاء المحيط لاستيعاب جميع الكواشف المستخدمة. - المسمار واحد 50 ملم، 248 نانومتر، 45° مرآة خط الليزر اكسيمر داخل جبل مرآة الحركية للبصريات Ø2 "في لوحة الخبز 10-11 نقاط الشبكة من فتحة الليزر 248 نانومتر. ضع المرآة الثانية بزاوية 90 درجة إلى الأولى على الجانب الآخر من الحاضنة. زاوية المرآة الثانية إلى الأسفل في حوالي 45 درجة لتوجيه شعاع الليزر إلى الحاضنة(الشكل 2F-J).
2. تزامن والتشغيل الآلي الأولي للنظام عن طريق برامج التكامل
- تثبيت أحدث إصدار من برنامج التكامل اللازمة للسيطرة على السائقين والمضخات.
- في إشارة إلى دليل المضخة، قم بإعادة تسمية المضخات بدءا من '5' وزيادة في القيمة. يمكن إرسال الأوامر إلى نظام المضخة باستخدام برنامج التحكم اليدوي الفرعي في برنامج التكامل.
ملاحظة: تعيين مضخة إلى وضع القناة تلقائيا بتغيير اصطلاح تسمية المضخة في المجموعة، 1 و 2 و 3 و 4، المقابلة لقنوات المضخة الأربعة. - افتح برنامج التكامل لأتمتة حاضنة المنصة.
- اختر اسم جهاز USB comport المناسب (على سبيل المثال، COM4) المطابق لنظام المضخة كابل USB من القائمة المنسدلة للاتصال المسمى Comport للمضخات.
- انقر فوق الزر Script Builder لتحرير/ إنشاء برنامج نصي لمنصة حاضنة النظام الأساسي التلقائي. انقر فوق حفظ Script لحفظ التسلسل كملف نصي (الشكل 3A).
ملاحظة: يحتوي منشئ البرنامج النصي على واجهة مستخدم لتعريف البرنامج النصي مع تعريفات رقم المضخة والاتجاه والمعدل والحجم وقطر الأنابيب ووضع القناة والتأخير في الوقت المناسب. - إذا كان وضع القناة مرغوبا في صنع السيناريو، يجب تخصيص خطوة في السيناريو لتغيير المضخة داخل وخارج وضع القناة، ويجب وضع علامة على الخطوات التالية المقابلة لقنوات المضخة على أنها مضخات 1-4.
ملاحظة: هذا يضمن أن لا يمكن أن يكون في نفس الوقت مضختين في وضع القناة أثناء برنامج نصي حاضنة النظام الأساسي و أن يتم تبديل كل مضخة مرة أخرى إلى وضع القديمة بعد أن تم إرسال الأوامر إلى القنوات المطلوبة. - انقر فوق الزر قراءة البرنامج النصي واختر ملف البرنامج النصي المناسب المطلوب لعملية حاضنة النظام الأساسي.
- قم بتبديل زر تشغيل التسلسل إلى موضع ON (أخضر) لتشغيل البرنامج النصي ثم انقر فوق الزر START (الشكل 3B) .
3. زراعة الخلايا في حاضنة المنصة
ملاحظة: يجب وضع الخلايا في حاضنة المنصة في ظل ظروف معقمة في غطاء محرك السيارة لثقافة الخلية في اليوم السابق للتجريب.
- فك حاضنة المنصة من مرحلة وضع النانو وفصل خطوط درجة الحرارة والغاز والترطيب. بعد رش الحاضنة بالإيثانول بنسبة 70٪، ضعها في غطاء محرك السيارة لثقافة الخلية.
- تنمو الخلايا في T-175 إلى حوالي 80-90٪ التقاء قبل نقل.
ملاحظة: يستخدم مصطلح التقاء كمقياس لعدد / تغطية الخلايا في طبق ثقافة الخلية أو قارورة. - إزالة الوسائط وشطف مع العازلة.
- فصل الخلايا باستخدام تريبسين-EDTA باستخدام بروتوكول الشركة المصنعة.
- Resuspend في 8 مل من وسائل الإعلام والعد الخلايا.
- بذور فيبروكتين/ الكولاجين14 مطلية بستة أطباق بئر مع ما يقرب من 90-95 ميكرولتر من الخلايا التي أعيد إنفاقها في كل بئر. هذا الحجم سيكون من المناسب لتحقيق التقاء 80-90 ٪ (~ 1.2 مليون خلية) في كل بئر في اليوم التالي.
ملاحظة: يجب أن تكون مغلفة لوحات ستة آبار مع الكولاجين قبل البذر. يتم غرس الكواشف المستخدمة أثناء IC-FPOP بمعدلات تدفق سريعة. تضمن الصفائح المغلفة عدم انفصال الخلايا قبل الأوان بسبب ضخ الكواشف. - ضع اللوحة المصنفة في حاضنة المنصة وغطها بغطاء الكوارتز.
ملاحظة: أثناء التصميم والتطوير، تم تغيير غطاء حاضنة زجاجية إلى كوارتز، لذلك فهو متوافق مع ضوء الليزر فوق البنفسجي. - استبدال وتأمين حاضنة المنصة مرة أخرى على مرحلة محرك nanopositioning. أعد توصيل خطوط درجة الحرارة والغاز ومرطب الهواء.
- دع الخلايا تنمو إلى التقاء بين عشية وضحاها.
ملاحظة: الخطوات التالية ثقافة الخلية اختيارية وهي مخصصة للتجارب التي يتم نقل الخلايا البشرية عابر. هذه الخطوات تقييم كفاءة العدوى في ظل ظروف زراعة الخلايا. - تحويل البلازميد الذي يحتوي على الجين للبروتين الشميري GCaMP2 إلى خلايا HEK 293 باستخدام عدة العدوى التجارية cationic-الدهون.
- إجراء عمليات نقل عابرة من GCaMP2 في خلايا HEK293T في لوحتين من ست آبار.
- احتضان لوحة واحدة من ستة آبار في حاضنة المنصة، والثانية من ستة آبار في حاضنة ثاني أكسيد الكربونالقياسية 2.
- قارن كفاءة العدوى داخل كل لوحة عن طريق التصوير الفلوري باستخدام مجهر مضان.
4. جعل إخماد العازلة وH2O2
- جعل 100 مل من إخماد العازلة التي تحتوي على 125 mM N-tert-بوتيل-α-فينيلنيترون (PBN) و 125 MM N, N′-Dimethylthiourea (DMTU).
ملاحظة: DMTU و PBN هي الزبالين الجذور الحرة و هي خلية نفاذية. - تمييع H2O2 إلى 200 mM. تتطلب كل عينة 6 مل من H2O2 لتزج تماما طبقة الخلايا في الجزء السفلي من كل بئر.
ملاحظة: يتم إجراء المخزن المؤقت quench في اليوم السابق وتخزينها في 4 °C بين عشية وضحاها, محمية من الضوء. تمييع H2O2 في يوم التجربة.
5. إنشاء حاضنة المنصة لIC-FPOP
ملاحظة: يجب تجميع حاضنة المنصة في ظروف معقمة. تجميع الحاضنة في غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية العقيمة.
- فك حاضنة المنصة من مرحلة تحديد المواقع وفصل خطوط درجة الحرارة والغاز والترطيب.
- بعد رش الحاضنة بالإيثانول بنسبة 70٪، ضعها في غطاء محرك السيارة لثقافة الخلية.
- قم بإزالة اللوحة ذات الست آبار من حاضنة المنصة، وتأمين الغطاء الأصلي للوح، وتأكيد التقاء الخلايا باستخدام المجهر.
- بعد أن تم تأكيد التقاء الخلايا، استبدل لوحة الستة آبار بخلايا التقاء في حاضنة المنصة داخل غطاء محرك السيارة لثقافة الخلية.
- أدخل ثلاثة أنابيب بوليمر معرفية (15 سم) 1.59 قطعة في كل بئر عبر المنافذ المضمنة. تدفق الأنابيب إلى جدران البئر وعقد مع حلقات مطبوعة 3D مخصصة.
ملاحظة: ستة 33 ملم PLA خيوط 3D الحلقات المطبوعة كانت مصممة خصيصا لتأمين الأنابيب إلى جدران لوحة دون إزعاج الخلايا أو الحصول على الطريق من نبض الليزر. - قم بتغطية حاضنة المنصة بغطاء الكوارتز الخاص بها. استبدال وتأمين حاضنة المرحلة العليا على نظام تحديد المواقع. أعد توصيل خطوط درجة الحرارة والغاز ومرطب الهواء.
- ربط 1.59 ID البوليمر أنابيب إلى 1/16 "نهاية 1/16x1/8" موصلات.
6. أداء IC-FPOP في حاضنة المنصة
- إعداد برنامج تكامل البرنامج النصي لسحب المضخة. استخدم مضخة واحدة معج (مضخة 8) لإزالة وسائط الخلية بالكامل من جميع الآبار الستة.
- المذيبات الرئيسية في كل قناة من المضخات التجاوي الثلاث الأخرى (مضخات 5-7). غرس H2O2 وحاجز إخماد في أنابيب بالتناوب كل منهما حتى تصل الكواشف إلى منافذ الحاضنة.
- تأكد من أن شعاع الليزر قد تم الزاوية بشكل صحيح من قبل المرايا وتصل إلى الحاضنة دون عائق.
ملاحظة: يجب ارتداء نظارات السلامة بالليزر كلما كان الليزر قيد الاستخدام. لا تشعع الخلايا قبل الأوان أثناء عملية الصيد/المحاذاة. استخدم الورق المقوى لتغطية غطاء الكوارتز بالكامل عند محاذاة الشعاع. أيضا، استخدم مخطط مطبوع على ورقة بيضاء من لوحة من ستة آبار لمزيد من تأكيد شعاع الليزر هو ضرب مركز كل بئر. استخدم إعداد النبض المستمر بأقل تردد وطاقة للمحاذاة. - تحقق من طاقة الليزر باستخدام مستشعر خارجي. استخدم نبضة ليزر واحدة 160 ميجاجول بسرعة 50 هرتز و27 كيلو فولت.
ملاحظة: هناك حاجة إلى مؤقت للخطوات التالية. - إعداد البرنامج النصي تكامل ضخ مضخة بعد تأكيد محاذاة الحزمة.
- بدء تشغيل المؤقت ثم اضغط الزر ابدأ على البرنامج النصي مضخة برنامج التكامل في نفس الوقت.
- غرس 200 م م ه2O2 في 35 مل / دقيقة في البئر الأول (6-10 علامة ثانية على الموقت).
ملاحظة: هناك تأخير خمس ثوان قبل أن تبدأ مضخة لبث. كما يستغرق الليزر سبع ثوان قبل أن يتم تشغيل النبض. يجب أن يأتي نبض الليزر مباشرة بعد ضخ H2O2. - اضغط على زر البدء على برنامج الليزر عند علامة 5 ثانية لتشغيل النبض عند علامة 11 ثانية على جهاز ضبط الوقت.
- غرس محلول إخماد 125 مللي متر في 35 مل/دقيقة في البئر الأول مباشرة بعد نبض الليزر. يدويا تحريك مرحلة تحديد المواقع لمحاذاة البئر المقبل مع شعاع الليزر.
- كرر الخطوات أعلاه 6.5-6.9 حتى يتم معالجة كل بئر.
ملاحظة: يتم تنفيذ IC-POP في ثلاثية التقنية من ثلاثة عينات ليزر وثلاثة غير ليزر. واحد معالجة ستة آبار لوحة بمثابة تكرار البيولوجية واحدة. - في غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية، استخدم مكشطة الخلية لنقل الخلايا من كل بئر إلى أنابيب مخروطية 15 مل الفردية. خلايا الطرد المركزي في 1200 × غرام لمدة 5 دقائق.
- تجاهل الخلايا الفائقة وإعادة الإنفاق في 100 ميكرولتر من العازلة تحلل RIPA.
- نقل الخلايا إلى أنابيب البولي بروبلين 1.2 مل الفردية.
- فلاش تجميد جميع العينات في النيتروجين السائل ومكان في الفريزر -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
7. استخراج البروتين وتنقية وانحلال البروتين
- إذابة العينات والحرارة في 95 درجة مئوية في كتلة الحرارة لمدة 5 دقائق.
- بعد التدفئة، تبرد على الجليد لمدة 5 دقائق.
- إضافة 25 وحدة من النيوكليز إلى lysate الخلية لتحلل واحد تقطعت بهم السبل، مزدوجة تقطعت بهم السبل، الحمض النووي الخطي والتعميمي والحمض النووي الريبي واحتضان في غرفة المعتدلة لمدة 15 دقيقة.
- عينات الطرد المركزي عند 16,000 x g لمدة 10 دقائق عند 4 °C.
- جمع supernatant ونقل إلى أنبوب البولي بروبلين نظيفة.
- تحقق من تركيز البروتين باستخدام مقايسة بروتين اللوني.
- نقل 100 ميكروغرام من العينة إلى أنبوب البولي بروبلين نظيفة وجلب إلى 100 ميكرولتر مع العازلة تحلل الخلية.
- قلل العينات باستخدام ثنائي الثيوثيريتول (DTT) 10 م عند 50 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.
- عينات باردة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
- الألكيلات مع 50 mM iodoacetamide (IAA) في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
ملاحظة: حماية IAA من الضوء - أضف 460 ميكرولتر من الأسيتون المبرد مسبقا (-20 درجة مئوية). دوامة العينات ومكان في -20 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. - في اليوم التالي، عينات الطرد المركزي في 16،000 × ز لمدة 10 دقائق في 4 درجة مئوية.
- إزالة الأسيتون دون تعطيل بيليه البروتين.
- أضف 50 ميكرولتر من الأسيتون المبرد مسبقا بنسبة 90٪ (-20 درجة مئوية). عينات دوامة لخلط والطرد المركزي في 16،000 × ز لمدة 5 دقائق إضافية في 4 درجة مئوية.
- إزالة الأسيتون والسماح للعينات الجافة لمدة 2-3 دقائق.
- Resuspend البروتين بيليه مع 10 mM تريس العازلة pH 8.
- Resuspend MS الصف تريبسين (20 ميكروجرام الأسهم) في 40 ميكرولتر من 10 mM تريس العازلة درجة الحموضة 8 وإضافة 2.5 ميكروغرام من تريبسين إلى كل عينة.
- احتضان العينات عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. - تقييم تركيز الببتيد باستخدام المقايسة الببتيد colorimetric.
- إخماد العينات مع حمض الفورميك 5٪.
- نقل 10 ميكروغرام من العينة إلى أنبوب البولي بروبلين نظيفة.
- جفف العينة باستخدام جهاز طرد مركزي فراغي وإعادة الإنفاق مع 20 ميكرولتر من حمض الفورميك من درجة MS 0.1٪ (FA) في الماء.
- نقل كل عينة لتنظيف قوارير autosampler مع قبعات قبل الشق.
8. عالية الأداء السائل الكروماتوغرافيا الترادفية الطيف الكتل (LC-MS/MS)
- لترجمة تعديلات FPOP تحليل lysate الخلية المهضوم باستخدام تحليل LC-MS/MS.
- استخدام مراحل المحمول من 0.1٪ FA في الماء (A) و 0.1٪ FA في أسيتونيتريل (ACN) (B).
- تحميل 0.5 ميكروغرام من العينة على 180 ميكرومتر × 20 مم C18 (5 ميكرومتر و 100 ألف) محاصرة العمود وغسل مع 99٪ (A) و 1٪ (B) لمدة 15 دقيقة.
- باستخدام عمود تحليلي 75 ميكرومتر × 30 سم C18 (5 ميكرومتر و 125 Å) ، الببتيدات المهضومة والفصلة بمعدل تدفق 0.300 ميكرولتر / دقيقة لمدة 120 دقيقة.
- تشغيل LC التدرج على النحو التالي: 0-1 دقيقة، 3٪ المذيبات B؛ 2-100 دقيقة، 10-45٪ ب؛ 100−110 دقيقة، 45-100٪ ب؛ 110-115 دقيقة، 100٪ ب.
- إعادة تجديد العمود في 3٪ (B) من 115-116 دقيقة وعقد في 3٪ (B) من 116-120 دقيقة.
- تحليل الببتيدات المبتزة في وضع الأيونات الإيجابية مع تأين الرذاذ الكهربائي النانوي.
- الحصول على أطياف MS1 على مدى m/z مسح من 375-1500 في قرار من 60،000.
- تعيين هدف التحكم التلقائي في الكسب (AGC) إلى 5.0e5 مع حد أقصى لحقن 50 مللي ثانية و5.0e4 عتبة كثافة.
- عزل أيونات السلائف مع الدول تهمة 2-6 عن طريق الحصول على البيانات التابعة (DDA) مع نافذة العزل من 1.2 م / ض ووقت دورة من 4 ثوان.
- إخضاع أيونات MS2 للتفكك التصادمي عالي الطاقة (HCD) (32٪ من الطاقة العادية).
- استبعاد الببتيدات بعد اكتساب MS/MS واحد لمدة 60 ثانية.
- تعيين دقة MS/MS إلى 15,000 مع هدف AGC 5.0e4 وأقصى مدة حقن 35 مللي ثانية.
9. بروتيوم مكتشف / معالجة البيانات
- البحث جنبا إلى جنب ملفات البيانات الخام على المتاحة من أسفل إلى أعلى برنامج تحليل البروتيوميات ضد قاعدة بيانات البروتين الإنسان العاقل ذات الصلة وانزيم الهضم.
- تعيين معلمات البحث تحليل البروتين.
- تعيين التسامح جزء إلى 0.02 دا والتحمل الأيون الأصل إلى 10 جزء في المليون.
- تعيين خصوصية الانزيم إلى تريبسين والسماح لانشقاق واحد غاب.
- تعيين نطاق الكتلة إلى 375-1500 م / ض.
- ترسيخ الثقة الببتيد في 95٪ (المتوسطة) وبقايا الثقة في 99٪ (عالية).
- قبول البروتينات إذا تم تحديد اثنين على الأقل من الببتيدات المتميزة مع معدل اكتشاف 5٪ (FDR) مرشح.
- تعيين carbamidomethylation كتعديلات ثابتة وجميع التعديلات المعروفة هيدروكسيل الراديكالية الجانبية سلسلة15،16 كتعديلات ديناميكية.
- بمجرد الانتهاء من البحث الملفات، تسلسل التصدير، مواقع التعديل، الانضمام البروتين، ملف الطيف، وفرة السلائف، ومعلومات وقت الاحتفاظ إلى قاعدة بيانات إلكترونية.
- حساب مدى التعديل لكل ببتيد أو بقايا من هذه المعادلة:
ملاحظة: منطقة EIC المعدلة هي المنطقة الكروماتوغرافية الأيونية المستخرجة (EIC) للببتيد أو البقايا مع تعديل التأكسدي ، ومنطقة EIC هي المساحة الإجمالية لنفس الببتيد أو البقايا مع وبدون التعديل التأكسدي. مع مرور الوقت، سوف البروتين في وجود بيروكسيد الهيدروجين تتأكسد، مما أدى إلى أكسدة الخلفية. لحساب مدى التعديل ، يتم تقسيم مساحة الببتيد المعدل حسب المساحة الإجمالية. عينة تحكم غير مشعة حسابات للأكسدة الخلفية. يتم طرح أكسدة الخلفية من عينة التحكم من العينة المعالجة بالليزر لتحديد تعديل FPOP.
Representative Results
للتأكد من أن ظروف حاضنة المنصة كافية لثقافة الخلايا في منصة الليزر ، تم تحويل GCaMP2 بشكل عابر إلى HEK293T وتم تقييم كفاءة العدوى لكلا اللوحين عن طريق التصوير الفلوري(الشكل 4A). GCaMP2 هو بروتين فلوري استشعار الكالسيوم يستخدم كمؤشر الكالسيوم المشفرة وراثيا داخل الخلايا. وهو مزيج من البروتين الفلوري الأخضر (GFP) والبروتين الملزم للكالسيوم، كالمودولين. تم إجراء فحص لوسيفيراز على خلايا HEK 293 المصابة بplasmid prl-TK من أجل تحديد كفاءة العدوى(الشكل 4B). وتظهر هذه النتائج أن حاضنة المنصة تجاوزت أداء الحاضنة القياسية، مع زيادة قدرها 1.13 مرة في كفاءة العدوى، مما يوفر معيارا كميا لبيئة زراعة الخلايا المثلى.
تمت مقارنة تعديلات FPOP في خلايا HEK293T المسماة في نظام التدفق بتلك المسماة في حاضنة المنصة وأظهرت أن حاضنة المنصة تتفوق على نظام التدفق سواء في عدد البروتينات المعدلة(الشكل 5)أو إجمالي تغطية FPOP في تلك البروتينات. وكان عدد البروتينات المعدلة FPOP المكتسبة في حاضنة المنصة حوالي 1051، 2.2 أضعاف تلك المكتسبة في تجربة نموذجية. وتم الجمع بين تعديلات بين نسختين بيولوجيتين متماثلتين لكل تجربة. علاوة على ذلك، يوفر PIXY سرعة نقل أعلى.
ولإثبات ميزة تغطية التعديل الأعلى عبر البروتين، تم تحديد موضع تعديلات IC-FPOP على مستوى الببتيد وتم تحديد مدى التعديل كميا لتمييز الاختلافات في النتائج بين أنظمة أكتين، وهو بروتين حمض أميني 375. في نظام التدفق، تم الكشف عن اثنين من الببتيدات المعدلة، وتوفير معلومات هيكلية محدودة(الشكل 6A). ومع ذلك ، تم الكشف عن خمسة الببتيدات المعدلة التي تمتد على تسلسل actin في حاضنة المنصة. أطياف كتلة جنبا إلى جنب تشير إلى أن بقايا Pro322 تم تعديلها على حد سواء والكشف عنها في كل تجربة (الشكل 6B). تحتوي الببتيدات الخمس المعدلة في عينات حاضنة المنصة على اثني عشر بقايا معدلة ، في حين تم تعديل أربعة بقايا فقط مع نظام التدفق(الشكل 6C). توفر الزيادة في تغطية الأكسدة المزيد من المعلومات الهيكلية عبر البروتين.
Espino وآخرون أظهرت قدرة FPOP أن يؤديها في الجسم الحي (IV-FPOP) داخل C. elegans, نموذج دودة لأمراض الإنسان الدول17. بينما يتم أيضا تنفيذ IV-FPOP عبر نظام تدفق، تم اختبار نظام PIXY للتوافق مع الديدان. وتم احتضان ما يقرب من 10,000 دودة في كل بئر في حاضنة المنصة عند 20 درجة مئوية، وكشف تحليل LC−MS/MS أن 792 بروتينا تم تعديلها بواسطة IV-FPOP في حاضنة المنصة مقارنة ب 545 بروتينا تم تعديلها بنظام التدفق(الشكل 7). هذه النتائج تثبت أنه بالإضافة إلى زراعة الخلايا 2D، هذه المنهجية الجديدة متوافقة أيضا مع دراسة النظم البيولوجية الأخرى مثل C. elegans.
الشكل 1. تخطيطي لنظام PIXY. مكونات النظام: (أ) حاضنة المرحلة العليا، (ب) نظام تحديد المواقع ، (ج) مضخات التثاقين، و (د) خطوط التغلغل. تتم إزالة وسائط ثقافة الخلية من كل بئر عبر المضخات قبل H2O2 ويتم غرس حلول التبريد في النقاط الزمنية المحسوبة. عرض مسار الليزر للإشعاع باللون الأبيض. أعيد طبعها بإذن من جونسون، د. ت. ، بونشون سميث، ب. ، إسبينو، ج. أ. ، غيرشينسون، أ. ، جونز، L.M، تنفيذ الأكسدة الكيميائية الضوئية السريعة في الخلية من البروتينات في حاضنة منصة مع مرحلة XY المنقولة. الكيمياء التحليلية، 92(2)، 1691-1696 2019. حقوق الطبع والنشر 2020 الجمعية الكيميائية الأمريكية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. نظام PIXY مجمع بالكامل. (أ) نظام مراقبة اللمس،(ب)وحدة ثاني أكسيد الكربون، (ج) وحدة درجة الحرارة، (D) مضخة الهواء، (E) مرطب، (F) المرايا البصرية، (G) حاضنة منصة، (H) مرحلة تحديد المواقع، (I) 248nm KrF ليزر إكسيمر، و (J) مضخات التجلي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. أتمتة مضخات التثابير. (أ) مثال الأمر النصي في LABVIEW. تتضمن خيارات الأمر الحجم ومعدل التدفق والوقفات واتجاه التدفق. ويجري حاليا التشغيل الآلي للسرعة والمسافة في المرحلة والموقع. (ب) قارئ البرامج النصية في LABVIEW. هنا، يتم تحميل البرامج النصية الأمر ثم تشغيل تسلسل ويتم الضغط على START لبدء مضخات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. كفاءة نقل خلية HEK. (أ)متوسط كثافة الفلورسنت مقارنة GCaMP2 transfection بين الحاضنة القياسية (التحكم) وحاضنة المرحلة العليا (PIXY). تمثل النقاط والمربعات كل نقطة في بئر تم فيها اتخاذ إجراء. (ب)كفاءة العدوى كمية ومعتمدة مع ناقل مختلف البلازميد، pRL-TK. قيمة P< 0.005. أعيد طبعها بإذن من جونسون، د. ت. ، بونشون سميث، ب. ، إسبينو، ج. أ. ، غيرشينسون، أ. ، جونز، L.M، تنفيذ الأكسدة الكيميائية الضوئية السريعة في الخلية من البروتينات في حاضنة منصة مع مرحلة XY المنقولة. الكيمياء التحليلية، 92(2)، 1691-1696 2019. حقوق الطبع والنشر 2020 الجمعية الكيميائية الأمريكية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5. مقارنة بين البروتينات المعدلة في نظام تدفق الخلية الواحدة وPIXY. رسم تخطيطي Venn للبروتينات المعدلة باستخدام في نظام التدفق (الأرجواني) وفي PIXY (أخضر). أعيد طبعها بإذن من جونسون، د. ت. ، بونشون سميث، ب. ، إسبينو، ج. أ. ، غيرشينسون، أ. ، جونز، L.M، تنفيذ الأكسدة الكيميائية الضوئية السريعة في الخلية من البروتينات في حاضنة منصة مع مرحلة XY المنقولة. الكيمياء التحليلية، 92(2)، 1691-1696 2019. حقوق الطبع والنشر 2020 الجمعية الكيميائية الأمريكية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6. توطين تعديلات IC-FPOP. مقارنة بين التعديلات IC-FPOP بين الأنظمة. (أ) شريط الرسم البياني للببتيدات المعدلة بشكل مؤاكس داخل أكتين من نظام التدفق (الأرجواني) مقابل حاضنة منصة (الأخضر). (ب) أطياف التصلب المتعدد الترادفي من أكتين (الببتيد 316-326) مع برولين معدلة في كلا النظامين والببتيد actin غير المعدلة (C) FPOP المخلفات المعدلة من أكتين (PDB: 6ZXJ، سلسلة A 11 المخلفات المعدلة في حاضنة منصة (الأخضر)، 3 بقايا معدلة في نظام التدفق (الأرجواني)، 1 بقايا معدلة متداخلة (الأصفر). أعيد طبعها بإذن من جونسون، د. ت. ، بونشون سميث، ب. ، إسبينو، ج. أ. ، غيرشينسون، أ. ، جونز، L.M، تنفيذ الأكسدة الكيميائية الضوئية السريعة في الخلية من البروتينات في حاضنة منصة مع مرحلة XY المنقولة. الكيمياء التحليلية، 92(2)، 1691-1696 2019. حقوق الطبع والنشر 2020 الجمعية الكيميائية الأمريكية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7. مقارنة البروتينات المعدلة FPOP في C. elegans حسب التدفق مقابل PIXY. هناك زيادة 1.5 أضعاف في البروتينات المعدلة بشكل مؤأكسد باستخدام PIXY بالمقارنة مع نظام التدفق. أعيد طبعها بإذن من جونسون، د. ت. ، بونشون سميث، ب. ، إسبينو، ج. أ. ، غيرشينسون، أ. ، جونز، L.M، تنفيذ الأكسدة الكيميائية الضوئية السريعة في الخلية من البروتينات في حاضنة منصة مع مرحلة XY المنقولة. الكيمياء التحليلية، 92(2)، 1691-1696 2019. حقوق الطبع والنشر 2020 الجمعية الكيميائية الأمريكية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1 - الجداول توزيع تعديل سير العمل والتحولات الجماعية (Da).
Discussion
البروتينات أداء الكثير من العمل في الخلايا الحية. ونظرا لهذه الأهمية، هناك حاجة إلى بيانات مفصلة عن وظيفة البروتين وهيكل النظام الأعلى (HOS) في البيئة الخلوية لتعميق فهم التعقيدات في المجمعات الكبيرة والتفاعلات الأنزيمية في الخلايا بدلا من الأنظمة المنقى. للقيام بذلك، تم اعتماد طريقة طباعة القدم البروتين الراديكالي هيدروكسيل (HRFP) بعنوان الأكسدة الضوئية السريعة في الخلية من البروتينات (IC-FPOP). وقد أجريت معظم الدراسات FPOP في المختبر في أنظمة البروتين النقي نسبيا، والذي يتناقض بشكل ملحوظ مع البيئة الجزيئية المزدحمة التي تؤثر على التفاعلات ملزمة وديناميات البروتين تشكيلية. ونتيجة لذلك، هناك هوة بين النتائج المستخلصة من التجارب المختبرية 18 وتلك التي يمكن الحصول عليها في بيئة خلوية فعلية. ولسد الفجوة بين الظروف المثالية لتجربة FPOP في المختبر والطبيعة المعقدة للخلية، تم تطوير لوحة آلية جديدة من ستة آبار في منصة الخلية-FPOP. هذه التكنولوجيا الجديدة FPOP قادرة على تحديد وتميز هذه الأنواع الجزيئية وتتبع تفاعلاتها الجزيئية الديناميكية في كل من الحالات الصحية والمرضية. وتسمى هذه المنصة الجديدة حاضنة المنصة مع المرحلة XY المنقولة (PIXY).
وقد استخدمت بنجاح FPOP لتوصيف المعلومات الهيكلية داخل البروتيوم. ومع ذلك ، فإن كل تقنية بيولوجية لها بعض القيود التي تتطلب المزيد من التحسين. مطلوبة الكواشف محددة أثناء تحلل ضوئي ليزر وإرواء بكفاءة الجذور الهيدروكسيل غير المنقحة. فصل الببتيدات المهضومة يمكن أن تتطلب كميات كبيرة من الوقت لتحقيق أقصى قدر من المعلومات الهيكلية. هذه الثروة من المعلومات يمكن أن تتطلب أيضا كميات واسعة النطاق أثناء تحليل بيانات ما بعدمرض التصلبالعصبي المتعدد 1 . حاضنة المنصة، بما في ذلك الآلات الطرفية اللازمة لثقافة الخلايا وIC-FPOP في منصة الليزر، تأتي مع تكلفة كبيرة قد لا تكون مجدية لبعض المختبرات. ومع استمرار إحراز تقدم، ينبغي أن تقدم البرمجيات القوية وأدوات التحليل هذه التقنية؛ بعضها معروض في هذه الدراسة. وقد أجريت الدراسات الحالية في هذه الحاضنة منصة على خلايا HEK293T وفي C. elegans. وقد ثبت أن طريقة IC-FPOP متوافقة مع مجموعة واسعة من خطوط الخلية بما في ذلك مبيض الهامستر الصيني (CHO) ، Vero ، MCF-7 ، وخلايا MCF10-A19. وبما أن طريقة IC-FPOP العامة قابلة للترجمة إلى هذا النظام الأساسي الثابت، يجب أن تكون خطوط الخلايا هذه قابلة للدراسة باستخدام PIXY أيضا.
يستخدم IC-FPOP H2O2 لتعديل السلاسل الجانبية للمذيبات التي يمكن الوصول إليها من الأحماض الأمينية ، ثم تمييز المزيد من التفاعلات البروتينية والهيكل والآثار الأيضية داخل الخلايا القابلة للحياة وهو أمر مهم في توفير السياق البيولوجي. من الضروري قبل تجربة IC-FPOP التأكد من أن الخلايا قابلة للحياة بعد إضافة H2O2. أثبتت دراسات قابلية الخلية للحياة أن الخلايا كانت قابلة للحياة في وجود تركيزات H2O2 تصل إلى 200 mM 13. من المهم أيضا التأكد من أن H2O2 يتم غرسه بتركيز نهائي قدره 200 مليون متر في الخلايا مباشرة بعد إزالة الوسائط. الفشل في إزالة الوسائط ثقافة الخلية تماما سوف يسبب تركيزات متفاوتة من H2O2. بالمقارنة مع الظروف القياسية، أدت زيادة وقت الحضانة إلى 10 ثوان إلى جانب زيادة تركيز H2O2 إلى ارتفاع عدد البروتينات المعدلة بواسطة IC-FPOP في حاضنة المنصة. من الضروري أن المضخات العتمة رئيس قبل استخدامها لضمان مضخات تعمل بشكل صحيح ويتم تشتيت السائل. قد يؤدي الفشل في القيام بذلك إلى فقاعات الهواء في الأنابيب ، وحجم غير كاف من H2O2 لتزج الخلايا ، و / أو حجم غير كاف من محلول التبريد.
وثمة مسألة أخرى قد تنشأ وهي التأخيرات غير المرغوب فيها في النظام. مثال على ذلك هو عملية التحقق من الأوامر الواردة لأنظمة المضخة مما يضيف تأخيرات كبيرة على ترتيب 1000 مللي ثانية أو أكثر باستخدام برنامج التكامل. يمكن إصلاح هذه المشكلة عن طريق تقليل الاتصال مع المضخات أثناء التجربة واستخدام أوامر محددة مسبقا في وقت مبكر قدر الإمكان.
في المستقبل، والهدف من PIXY هو إنتاج نظام مؤتمتة ومتكاملة بالكامل. بالإضافة إلى المضخات العتمة ، سيتم تشغيل نبض الليزر آليا. كما سيتم استخدام نظام تحديد المواقع الجديد للحركة السريعة لحاضنة المنصة لتعزيز السرعة والدقة. وسيستمر برمجة جميع مكونات النظام باستخدام برنامج التكامل لزيادة الإنتاجية.
Disclosures
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود مصلحة مالية متنافسة.
يرتبط البحث المقدم هنا بطلب البراءة المشار إليه أدناه:
رقم طلب براءة الاختراع غير المؤقت في الولايات المتحدة: 17/042,565
العنوان: "الجهاز وطريقة تحديد طي البروتين"
رقم جدول UMB: LJ-2018-104 UMass Ref: UMA 18-059.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل بمنحة من المعهد الوطني للصحة R01 GM128983-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ismatec Reglo ICC Peristaltic Pumps | Cole-Palmer | 122270050 | |
| Kinematic Mirror Mount for Ø2" Optics | Thor Labs | ||
| 10X trypsin−EDTA | Corning | AB00490-00005 | |
| 50.0mm 248nm 45°, Excimer Laser Line Mirror | Edmond Optics | ||
| Acetone, HPLC Grade | Fisher Scientific | ||
| Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | ||
| ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg | Waters | 23275 | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used |
| ACQUITY UPLC M-Class System | Waters | A53225 | |
| Afinia H480 3D Printer | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
| air pump | OKOlabs | D12345 | |
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | Stock #63-120 | |
| Aqua 5 µm C18 125 Å packing material | Phenomenex | ||
| carbon dioxide unit | OKOlabs | MadMotor®-UHV | |
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| connectors (Y PP 1/16” and 1/16x1/8”) | Cole-Palmer | 116891000 | |
| Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 022625501 | |
| Dithiothreiotol (DTT) | AmericanBio | ||
| DMSO, Anhydrous | Invitrogen | LS118-500 | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | SK-78001-82 | |
| EX350 excimer laser | GAM Laser | PI89900 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | SK-12023-78 | |
| Formic Acid, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A929-4 | 4 L quantity is not necessary |
| HEK293T cells | Paul Shapiro Lab (University of Maryland Baltimore) | ||
| humidifier | OKOlabs | Nano-LPMW stage | |
| HV3-2 VALVE | Hamilton | BP152-500 | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | LS120-500 | |
| Iodoacetamide (IAA) | ACROS Organics | ||
| LABVIEW Professional 2018 | National Instruments | 86728 | |
| MadMotor Positioning system and controllers | Mad City Labs | W6-4 | |
| Methanol, LC/MS Grade | Fisher Scientific | 01-213-100 | any brand is sufficient |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | H301-T Unit-BL-PLUS | |
| N,N′-Dimethylthiourea (DMTU) | ACROS Organics | ||
| Nanopositioinging stage | Mad City Labs | ||
| N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) | ACROS Organics | ||
| OKO Touch Monitoring System | OKOlabs | ||
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | 7Z02936 | |
| PE50-C pyroelectric energy meter | Ophir Optronics | ||
| Penicillin-streptomycin | Corning | ||
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | ||
| Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | ||
| Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 75002436 | |
| Pierce Universal Nuclease for Cell Lysis | Fisher Scientific | 06-666A | |
| pressure gauge | OKOlabs | OKO-AIR-PUMP-BL | |
| PTFE filter | OKOlabs | CO2-UNIT-BL | |
| Six 33 mm PLA filament rings | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
| sterile incubator | OKOlabs | ||
| temperature unit | OKOlabs | OKO-TOUCH | |
| Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer | Fisher Scientific | A117-50 | |
| TiNKERcad | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
| Tris Base | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
| tubing (Tygon 3.18 and 1.59 ID) | Cole-Palmer | 177350250 | |
| Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | A454SK-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | 88702 | |
| 90058 | |||
| KM200 | |||
| 186007496 |
References
- Johnson, D. T., Di Stefano, L. H., Jones, L. M. Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP): A powerful mass spectrometry based structural proteomics tool. Journal of Biological Chemistry. 294 (32), 11969-11979 (2019).
- Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications. Chemical Reviews. 120 (10), 4355-4454 (2019).
- Li, J., Chen, G. The use of fast photochemical oxidation of proteins coupled with mass spectrometry in protein therapeutics discovery and development. Drug Discovery Today. 24 (3), 829-883 (2019).
- Zhao, B., et al. Covalent Labeling with an α,β-Unsaturated Carbonyl Scaffold for Studying Protein Structure and Interactions by Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 92 (9), 6637-6644 (2020).
- Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser Flash Photolysis of Hydrogen Peroxide to Oxidize Protein Solvent-Accessible Residues on the Microsecond Timescale. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).
- Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. Mass Spectrometry-Based Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP) for Higher Order Structure Characterization. Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).
- Chea, E. E., Jones, L. M. Modifications generated by fast photochemical oxidation of proteins reflect the native conformations of proteins. Protein Science. 27 (6), 1047-1056 (2018).
- Hambly, D., Gross, M. Laser flash photochemical oxidation to locate heme binding and conformational changes in myoglobin. International Journal of Mass Spectrometry. 259 (1), 124-129 (2007).
- Yan, Y. Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) maps the epitope of EGFR binding to adnectin. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 25 (12), 2084-2092 (2014).
- Zhang, Y., Wecksler, A. T., Molina, P., Deperalta, G., Gross, M. L. Mapping the Binding Interface of VEGF and a Monoclonal Antibody Fab-1 Fragment with Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP) and Mass Spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (5), 850-858 (2017).
- Espino, J. A., Mali, V. S., Jones, L. M. In Cell Footprinting Coupled with Mass Spectrometry for the Structural Analysis of Proteins in Live Cells. Analytical Chemistry. 87 (15), 7971-7978 (2015).
- Rinas, A., Mali, V. S., Espino, J. A., Jones, L. M. Development of a Microflow System for In-Cell Footprinting Coupled with Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (20), 10052-10058 (2016).
- Johnson, D. T., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L. M. Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins in a Platform Incubator with a Movable XY Stage. Analytical Chemistry. 92 (2), 1691-1696 (2019).
- Bangel-Ruland, N., et al. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator-mRNA delivery: a novel alternative for cystic fibrosis gene therapy. The Journal of Gene Medicine. 15 (11-12), 414-426 (2013).
- Gau, B. C., Chen, H., Zhang, Y., Gross, M. L. Sulfate Radical Anion as a New Reagent for Fast Photochemical Oxidation of Proteins. Analytical Chemistry. 82 (18), 7821-7827 (2010).
- Xu, G. C., et al. Hydroxyl Radical-Mediated Modification of Proteins as Probes for StructuralProteomics. Chemical Reviews. American Chemical Society. 107 (8), 3514-3543 (2007).
- Espino, J. A., Jones, L. M. Illuminating Biological Interactions with In Vivo Protein Footprinting. Analytical Chemistry. 9 (10), 6577-6584 (2019).
- Gau, B. C., Sharp, J. S., Rempel, D. L., Gross, M. L. Fast Photochemical Oxidation of Protein Footprints Faster than Protein Unfolding. Analytical Chemistry. 81 (16), 6563-6571 (2009).
- Kaur, U., Johnson, D. T., Jones, L. M. Validation of the Applicability of In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins across Multiple Eukaryotic Cell Lines. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (7), 1372-1379 (2020).
