Her presenterer vi en metode for å avbilde sebrafisk embryonal hjerne in vivo upto larval og juvenile stadier. Denne mikroinvasive prosedyren, tilpasset elektrofysiologiske tilnærminger, gir tilgang til cellulære og subcellulære detaljer om moden nevron og kan kombineres med optogenetikk og nevrofarmakologiske studier for karakterisering av hjernefunksjon og legemiddelintervensjon.
Å forstå de flyktige endringene som oppstår under hjerneutvikling og modning krever detaljert høyoppløselig avbildning i rom og tid ved cellulær og subcellulær oppløsning. Fremskritt innen molekylære og avbildningsteknologier har gjort det mulig for oss å få mange detaljerte innsikter i cellulære og molekylære mekanismer for hjerneutvikling i det gjennomsiktige sebrafiskembryoet. Nylig har prosesser for raffinering av nevronforbindelse som oppstår på senere larvestadier flere uker etter befruktning, som for eksempel er kontroll over sosial atferd, beslutningstaking eller motivasjonsdrevet oppførsel, beveget seg i fokus for forskning. På disse stadiene forstyrrer pigmentering av sebrafiskhuden lysinntrengning i hjernevev, og løsninger for embryonale stadier, for eksempel farmakologisk hemming av pigmentering, er ikke mulig lenger.
Derfor er en minimalt invasiv kirurgisk løsning for mikroskopitilgang til hjernen til våken sebrafisk gitt som er avledet fra elektrofysiologiske tilnærminger. I teleoster kan hud og myk hodeskallebrusk forsiktig fjernes ved mikroskalling av disse lagene, og utsetter underliggende nevroner og axonale trakter uten skade. Dette gjør det mulig å registrere nevronal morfologi, inkludert synaptiske strukturer og deres molekylære innhold, og observasjon av fysiologiske endringer som Ca2 + transienter eller intracellulære transporthendelser. I tillegg er avhør av disse prosessene ved hjelp av farmakologisk inhibering eller optogenetisk manipulasjon mulig. Denne hjerneeksponeringsmetoden gir informasjon om strukturelle og fysiologiske endringer i nevroner, samt korrelasjon og gjensidig avhengighet av disse hendelsene i levende hjernevev i løpet av minutter eller timer. Teknikken er egnet for in vivo hjerneavbildning av sebrafisk larver opptil 30 dager etter befruktning, det siste utviklingsstadiet testet så langt. Det gir dermed tilgang til slike viktige spørsmål som synaptisk raffinement og skalering, axonal og dendritisk transport, synaptisk målretting av cytoskeletal last eller lokalt aktivitetsavhengig uttrykk. Derfor kan en bred bruk for denne monterings- og bildemetoden forventes.
I løpet av de siste tiårene har sebrafisken (Danio rerio) utviklet seg som en av de mest populære virveldyrmodellorganismer for embryonale og larveutviklingsstudier. Den store fecundity av sebrafisk kvinner kombinert med den raske ex utero utviklingen av embryoet og dets gjennomsiktighet i tidlige embryonale utviklingsstadier er bare noen få nøkkelfaktorer som gjør sebrafisk til en kraftig modellorganisme for å kle opp utviklingsspørsmål1. Fremskritt innen molekylær genetisk teknologi kombinert med høyoppløselige in vivo-avbildningsstudier tillatt for å adressere cellebiologiske mekanismer som ligger til grunn for utviklingsprosesser2. Spesielt innen nevronal differensiering, fysiologi, tilkobling og funksjon har sebrafisk kastet lys over samspillet mellom molekylær dynamikk, hjernefunksjoner og organismisk oppførsel i enestående detalj.
Likevel er de fleste av disse studiene begrenset til embryonale og tidlige larvestadier i løpet av den første uken av utviklingen, da gjennomsiktigheten av nervesystemvevet gradvis går tapt. På disse stadiene forhindres hjernevev fra tilgang ved høyoppløselige mikroskopi tilnærminger blir skjermet av hodeskalledifferensiering og pigmentering3.
Derfor er viktige spørsmål om nevronal differensiering, modning og plastisitet som raffinement av nevrontilkobling eller synaptisk skalering vanskelig å studere. Disse cellulære prosessene er viktige for å definere cellulære mekanismer som driver, for eksempel sosial atferd, beslutningstaking eller motivasjonsbasert oppførsel, områder som sebrafiskforskning på flere uker gamle larver nylig har bidratt med viktige funn basert på atferdsstudier4.
Farmakologiske tilnærminger for å hemme pigmentering i sebrafisk larver i flere uker er knapt mulig eller kan til og med forårsake skadelige effekter5,6,7,8. Doble eller tredoble mutantstammer med spesifikke pigmenteringsfeil, som casper9 eller krystall10, har blitt enormt verdifulle verktøy, men er arbeidskrevende i avl, gir få avkom og utgjør faren for å akkumulere genetiske misdannelser på grunn av overdreven innavl.
Her er en minimal invasiv prosedyre som et alternativ gitt som gjelder for enhver sebrafiskstamme. Denne prosedyren ble tilpasset fra elektrofysiologiske studier for å registrere nevronal aktivitet i levende og våken sebrafisk larver. I teleoster kan hud og myk hodeskallebrusk forsiktig fjernes ved mikroskalling av disse lagene, fordi de ikke er tett vevd sammen med hjernens vaskulatur. Dette gjør det mulig å eksponere hjernevev som inneholder nevroner og axonale trakter uten skade og for registrering av nevronal morfologi, inkludert synaptiske strukturer og deres molekylære innhold, som igjen inkluderer observasjon av fysiologiske endringer som Ca2 + transienter eller intracellulære transporthendelser i opptil flere timer. Videre, utover beskrivende karakteriseringer, muliggjør direkte tilgang til hjernevev forhør av modne nevronfunksjoner ved hjelp av nevrofarmakologisk substansadministrasjon og optogenetiske tilnærminger. Derfor kan ekte strukturfunksjonsrelasjoner avsløres i den juvenile sebrafiskhjernen ved hjelp av denne hjerneeksponeringsstrategien.
Den presenterte metoden gir en alternativ tilnærming til hjerneisolasjon eller behandling av sebrafisk larver med legemidler som hemmer pigmentering for registrering av høyoppløselige bilder av nevroner i deres in vivo-miljø. Kvaliteten på bilder som er tatt med denne metoden, kan sammenlignes med bilder fra utplantede hjerner, men under naturlige forhold.
Videre unngås et tap i intensitet av fluorescens, fordi det ikke er behov for behandling med fikseringer18…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker spesielt Timo Fritsch for utmerket dyrepleie og Hermann Döring, Mohamed Elsaey, Sol Pose-Méndez, Jakob von Trotha, Komali Valishetti og Barbara Winter for deres hjelpsomme støtte. Vi er også takknemlige til alle de andre medlemmene av Köster-laboratoriet for deres tilbakemeldinger. Prosjektet ble delvis finansiert av det tyske forskningsstiftelsen (DFG, KO1949/7-2) prosjektet 241961032 (til RWK) og Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF; Era-Net NEURON II CIPRESS prosjekt 01EW1520 til JCM) er anerkjent.
Calcium chloride | Roth | A119.1 | |
Confocal Laser scanning microscope | Leica | TCS SP8 | |
d-Glucose | Sigma | G8270-1KG | |
d-Tubocurare | Sigma-Aldrich | T2379-100MG | |
Glass Capillary type 1 | WPI | 1B150F-4 | |
Glass Capillary type 2 | Harvard Apparatus | GC100F-10 | |
Glass Coverslip | deltalab | D102424 | |
HEPES | Roth | 9105.4 | |
Hoechst 33342 | Invitrogen (Thermo Fischer) | H3570 | |
Imaging chamber | Ibidi | 81156 | |
Potassium chloride | Normapur | 26764298 | |
LM-Agarose | Condalab | 8050.55 | |
Magnesium chloride (Hexahydrate) | Roth | A537.4 | |
Microscope Camera | Leica | DFC9000 GTC | |
Needle-Puller type 1 | NARISHIGE | Model PC-10 | |
Needle-Puller type 2 | Sutter Instruments | Model P-2000 | |
Pasteur-Pipettes 3ml | A.Hartenstein | 20170718 | |
Sodium chloride | Roth | P029.2 | |
Sodium hydroxide | Normapur | 28244262 | |
Tricain | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
Waterbath | Phoenix Instrument | WB-12 | |
35 mm petri dish | Sarstedt | 833900 | |
90 mm petri dish | Sarstedt | 821473001 |