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Neuroscience

Imágenes in vivo de tejido cerebral completamente activo en larvas y juveniles de pez cebra despiertos mediante la extirpación del cráneo y la piel

Published: February 10, 2021 doi: 10.3791/62166

Summary

Aquí presentamos un método para obtener imágenes del cerebro embrionario del pez cebra in vivo hasta etapas larvales y juveniles. Este procedimiento microinvasivo, adaptado de enfoques electrofisiológicos, proporciona acceso a detalles celulares y subcelulares de neuronas maduras y se puede combinar con estudios optogenéticos y neurofarmacológicos para caracterizar la función cerebral y la intervención farmacológica.

Abstract

Comprender los cambios efímeros que ocurren durante el desarrollo y la maduración del cerebro requiere imágenes detalladas de alta resolución en el espacio y el tiempo a resolución celular y subcelular. Los avances en las tecnologías moleculares y de imágenes nos han permitido obtener numerosos conocimientos detallados sobre los mecanismos celulares y moleculares del desarrollo cerebral en el embrión transparente de pez cebra. Recientemente, los procesos de refinamiento de la conectividad neuronal que ocurren en etapas larvales posteriores varias semanas después de la fertilización, que son, por ejemplo, el control del comportamiento social, la toma de decisiones o el comportamiento impulsado por la motivación, se han trasladado al foco de la investigación. En estas etapas, la pigmentación de la piel del pez cebra interfiere con la penetración de la luz en el tejido cerebral, y las soluciones para las etapas embrionarias, por ejemplo, la inhibición farmacológica de la pigmentación, ya no son factibles.

Por lo tanto, se proporciona una solución quirúrgica mínimamente invasiva para el acceso de microscopía al cerebro del pez cebra despierto que se deriva de enfoques electrofisiológicos. En los teleóstos, la piel y el cartílago blando del cráneo se pueden eliminar cuidadosamente mediante la micro-peeling de estas capas, exponiendo las neuronas subyacentes y los tractos axonales sin daño. Esto permite registrar la morfología neuronal, incluidas las estructuras sinápticas y su contenido molecular, y la observación de cambios fisiológicos como transitorios de Ca2+ o eventos de transporte intracelular. Además, es factible el interrogatorio de estos procesos mediante inhibición farmacológica o manipulación optogenética. Este enfoque de exposición cerebral proporciona información sobre los cambios estructurales y fisiológicos en las neuronas, así como la correlación e interdependencia de estos eventos en el tejido cerebral vivo en el rango de minutos u horas. La técnica es adecuada para imágenes cerebrales in vivo de larvas de pez cebra hasta 30 días después de la fertilización, la última etapa de desarrollo probada hasta ahora. Por lo tanto, proporciona acceso a cuestiones tan importantes como el refinamiento sináptico y la escala, el transporte axonal y dendrítico, la orientación sináptica de la carga citoesquelética o la expresión dependiente de la actividad local. Por lo tanto, se puede anticipar un amplio uso para este enfoque de montaje e imágenes.

Introduction

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En las últimas décadas, el pez cebra(Danio rerio)ha evolucionado como uno de los organismos modelo de vertebrados más populares para estudios de desarrollo embrionario y larvario. La gran fecundidad de las hembras de pez cebra junto con el rápido desarrollo ex utero del embrión y su transparencia durante las primeras etapas del desarrollo embrionario son solo algunos factores clave que hacen del pez cebra un poderoso organismo modelo para abordar las preguntas del desarrollo1. Los avances en las tecnologías genéticas moleculares combinados con estudios de imágenes in vivo de alta resolución permitieron abordar los mecanismos biológicos celulares subyacentes a los procesos de desarrollo2. En particular, en el campo de la diferenciación neuronal, la fisiología, la conectividad y la función, el pez cebra ha arrojado luz sobre la interacción de la dinámica molecular, las funciones cerebrales y el comportamiento organísmico con un detalle sin precedentes.

Sin embargo, la mayoría de estos estudios se restringen a etapas embrionarias y larvales tempranas durante la primera semana de desarrollo, ya que la transparencia del tejido del sistema nervioso se pierde progresivamente. En estas etapas, el tejido cerebral se ve impedido de acceder por los enfoques de microscopía de alta resolución quedando protegido por la diferenciación y pigmentación del cráneo3.

Por lo tanto, las cuestiones clave de la diferenciación neuronal, la maduración y la plasticidad, como el refinamiento de la conectividad neuronal o la escala sináptica, son difíciles de estudiar. Estos procesos celulares son importantes para definir los mecanismos celulares que impulsan, por ejemplo, el comportamiento social, la toma de decisiones o el comportamiento basado en la motivación, áreas a las que la investigación del pez cebra sobre larvas de varias semanas de edad ha contribuido recientemente con hallazgos clave basados en estudios de comportamiento4.

Los enfoques farmacológicos para inhibir la pigmentación en larvas de pez cebra durante varias semanas son apenas factibles o incluso pueden causar efectos perjudiciales5,6,7,8. Las cepas mutantes dobles o triples con defectos específicos de pigmentación, como casper9 o cristal10,se han convertido en herramientas tremendamente valiosas, pero son laboriosas en la reproducción, proporcionan poca descendencia y plantean el peligro de acumular malformaciones genéticas debido a la endogamia excesiva.

Aquí, se proporciona un procedimiento mínimamente invasivo como alternativa que es aplicable a cualquier cepa de pez cebra. Este procedimiento se adaptó a partir de estudios electrofisiológicos para registrar la actividad neuronal en larvas de pez cebra vivas y despiertas. En los teleóstos, la piel y el cartílago blando del cráneo se pueden eliminar cuidadosamente mediante la micro-peeling de estas capas, ya que no están estrechamente entrelazadas con la vasculatura cerebral. Esto permite exponer el tejido cerebral que contiene neuronas y tractos axonales sin daño y registrar la morfología neuronal, incluidas las estructuras sinápticas y su contenido molecular, que a su vez incluye la observación de cambios fisiológicos como transitorios de Ca2 + o eventos de transporte intracelular durante varias horas. Además, más allá de las caracterizaciones descriptivas, el acceso directo al tejido cerebral permite interrogar las funciones neuronales maduras mediante la administración de sustancias neurofarmacológicas y enfoques optogenéticos. Por lo tanto, las verdaderas relaciones de función de la estructura se pueden revelar en el cerebro juvenil del pez cebra utilizando esta estrategia de exposición cerebral.

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Protocol

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Todo el trabajo con animales descrito aquí está de acuerdo con las regulaciones legales (Directiva UE 2010/63). El mantenimiento y la manipulación de los peces han sido aprobados por las autoridades locales y por el representante de bienestar animal de la Technische Universität Braunschweig.

1. Preparación de líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF), agarosa de baja fusión y agujas de vidrio afiladas

  1. Prepare el ACSF disolviendo los productos químicos enumerados a las siguientes concentraciones en agua destilada. 134 mM NaCl (58,44 g/mol), 2,9 mM KCl (74,55 g/mol), 2,1 mM CaCl2 (110,99 g/mol), 1,2 mM MgCl2 6x H2O (203,3 g/mol), 10 mM HEPES (238,31 g/mol) y 10 mM d-Glucosa (180,16 g/mol).
    NOTA: Para MgCl2,CaCl2y KCl, las soluciones de stock de 1 M se preparan en agua estéril desalada y se almacenan a 4 °C para la posterior preparación de ACSF fresco. La glucosa, hepes y naCl se disuelven como compuestos sólidos en la solución fresca de ACSF. Para disolver productos químicos, siga las instrucciones del fabricante.
  2. Ajuste el pH del ACSF a 7,8 con 10 M de NaOH. La preparación de ACSF requiere una medición precisa de los productos químicos y un ajuste fino del pH, ya que reemplaza el líquido cefalorraquídeo y mantiene las condiciones fisiológicas requeridas para que las neuronas sean completamente funcionales, de lo contrario podría causar disfunción cerebral y muerte neuronal.
  3. Conservar el ACSF recién preparado a 4 °C durante un máximo de 4 semanas. Para las condiciones de trabajo, alícuota el volumen requerido de ACSF para el día/experimento y precalentarlo a 25-28 °C (y opcionalmente oxigenarlo, paso 2.5)
    NOTA: AsCF recién preparado está bien por 1 día. Si planea usarlo durante varios días, ACSF debe ser filtrado estéril.
  4. Para la anestesia posterior de las larvas, prepare una solución de 50 mM de d-tubocurarina en agua destilada y almacene la solución a -20 °C como alícuotas de 100 μL en el congelador hasta que sea necesario.
  5. Para incrustar el pescado, prepare agarosa de baja fusión (LM) al 2,5% disolviendo 1,25 g de LM-agarosa(Tabla de Materiales)en 50 ml de ACSF y hierva hasta que la agarosa se disuelva por completo.
    NOTA: Alternativamente, se pueden usar concentraciones más altas o más bajas de LM-agarosa dependiendo de la configuración experimental. Sin embargo, si la agarosa es demasiado suave, no podrá mantener al pez en posición al abrir el cráneo.
  6. Almacene la agarosa a 37 °C de baño de agua, para evitar la solidificación y porque esta temperatura tampoco dañará a las larvas al incrustar. Después de que la agarosa hervida se enfríe a 37 ° C en el baño de agua, agregue la cantidad necesaria de d-tubocurarina a la agarosa alicitada necesaria para que el día alcance una concentración de trabajo de 10 μM. Para su uso futuro, guarde la agarosa sobrada a 4 °C para evitar la contaminación.
  7. Prepare agujas de vidrio afiladas y delgadas de capilares de vidrio (Figura suplementaria 1) utilizando un tirón de micropipeta con los siguientes ajustes.
    1. Puller I, Capilar tipo 1: Calor 1: 65.8; Calor 2: 55.1; Tirón de 2 pasos
      Puller II, Capilar tipo 2: Calor = 700; Fil = 4; Vel = 55; Del = 130; Pul = 55; Tirón de 1 paso.
      NOTA: Las unidades son específicas para cada cajón y capilar de vidrio utilizados aquí, respectivamente (ver Tabla de Materiales). Otros capilares y tirantes también se pueden utilizar para preparar las agujas de vidrio. Pero las agujas de vidrio no deben ser demasiado delgadas, ya que pueden romperse al entrar en contacto con el cráneo. Capilar: longitud: 100 mm (4 pulgadas); OD: 1,5 mm; IDENTIFICACIÓN: 0,84 mm; filamento: Sí

2. Anestesia de larvas y preparaciones para incrustar

  1. Al comenzar el experimento del día, transfiera los animales que se necesitan con una pipeta Pasteur de plástico a una placa de Petri de 90 mm de diámetro, que se llena con Danieau (para larvas que todavía se mantienen en una placa de Petri con Danieau) o agua de la instalación de peces (para larvas que tienen más de 7 dpf y se mantienen en la instalación de peces).
    1. Cuando pipetee peces mayores de 2 semanas, asegúrese de que la abertura de la pipeta sea lo suficientemente grande como para evitar dañar a los peces al transferirlos. No use una red porque dañará físicamente especialmente a las larvas más jóvenes.
  2. Añadir rotíferos o nauplios de artemia adecuados para el tamaño de las larvas mantenidas en la placa de Petri, para garantizar el libre acceso a los alimentos y el máximo estado de salud de las larvas y para reducir el estrés.
  3. Para la incrustación, transfiera las larvas seleccionadas a una placa de Petri de 35 mm de diámetro llena de ACSF. Agregue el volumen necesario de d-tubocurarina para alcanzar una concentración de trabajo / dosis efectiva de 10 μM y espere unos minutos hasta que las larvas estén completamente inmovilizadas11.
    NOTA: Cuando los peces envejecen o si se necesita una anestesia completa más rápida (menos de 5 min), es posible aumentar la concentración de d-tubocurarina (LD50 para ratones es de 0,13 mg / kg por vía intravenosa12). También es posible utilizar un anestésico diferente, como α-bungarotoxina (concentración de trabajo: 1 mg/mL), que tiene el mismo efecto que el curare y también mantiene el cerebro completamente activo13. Si un cerebro completamente activo no es necesario para el tema de interés, la tricaína en una dosis no letal (0,02%) también es una opción para anestesiar completamente las larvas. Sin embargo, la tricaína bloquea los canales de sodio, lo que afecta la actividad cerebral14.
  4. Prepare la cámara de montaje tomando la tapa de la placa de Petri de 35 mm de diámetro, voltee la tapa boca abajo y coloque una cubierta de vidrio cuadrada (24 x 24 mm) en la parte inferior de la tapa. Consulte la Figura 1 (parte superior) para obtener una descripción esquemática de estos pasos. La superficie más lisa del vidrio evita el deslizamiento del bloque de agarosa, que contiene las larvas durante el procedimiento de apertura del cráneo.
  5. Alícute la cantidad de ACSF necesaria para el día en un vial apropiado (por ejemplo, tubo de 50 ml, precipitado, botella de Schott, etc.) y oxigenarlo con carbógeno (5% CO2,95% O2). Si solo se toma imágenes de la morfología (por ejemplo, patrones de fluorescencia), el ACSF sigue siendo necesario para garantizar la integridad del cerebro y que las células no estén influenciadas negativamente por los efectos de la osmolaridad, pero no se necesita la oxigenación del ACSF. Este paso solo debe realizarse cuando la actividad cerebral completa es necesaria para obtener imágenes.
    NOTA: Para una saturación óptima de oxígeno del medio, agregue una piedra de aire al extremo del tubo de carbógeno. Para garantizar un nivel de oxígeno suficientemente alto, es necesario intercambiar el ACSF en las cámaras de imágenes con ACSF recién oxigenado cada 20-60 minutos, dependiendo del número y la edad de las larvas incrustadas en la misma cámara de imágenes (por ejemplo, para una sola larva incrustada, el intercambio de ACSF cada hora es suficiente. Para seis larvas mayores de 14 dpf incrustadas en paralelo, es necesario intercambiar ACSF cada 20 minutos), así que planifique la cantidad necesaria de ACSF saturado de oxígeno de acuerdo con el experimento planificado.

3. Incrustación de las larvas

  1. Transfiera las larvas completamente anestesiadas con una pipeta Pasteur de plástico a la cámara de montaje preparada (en el paso 2.4). Luego, retire cuidadosamente el exceso de medio para evitar la dilución de la LM-agarosa. Todos los siguientes pasos deben realizarse bajo un microscopio estereoscópico con suficiente aumento.
    NOTA: Inclinar la cámara de montaje puede ayudar a retirar completamente el medio.
  2. Proceda inmediatamente al siguiente paso, agregando una gota de LM-agarosa suficientemente grande sobre las larvas (alrededor de 1 ml, dependiendo del tamaño de las larvas) para proteger a los animales de la desecación y reducir el estrés innecesario.
  3. Oriente las larvas en posición antes de que la agarosa se solidifique. Asegúrese de que la parte dorsal de las larvas se dirija hacia arriba. Además, asegúrese de incrustar las larvas lo más cerca posible de la superficie de la agarosa.
    NOTA: Dependiendo del tamaño y el número de larvas planificadas para incrustar al mismo tiempo, es posible ajustar la concentración de agarosa. Por ejemplo, para 1-3 larvas que tienen 30 dpf de edad, se recomienda una concentración de 1.8% -2% LM-agarosa. Para 1-4 larvas que tienen 7 dpf de edad, es más factible usar 2.5% LM-agarosa, mientras que, para 5-8 larvas, 2% es más adecuado. Si se requiere un cerebro completamente activo, se recomienda incrustar solo tres peces al mismo tiempo para reducir el tiempo necesario para operar las larvas. En general, se recomienda utilizar concentraciones más bajas (1,8%-2%) cuanto más viejas sean las larvas o más larvas se planee incrustar al mismo tiempo.
  4. Si las imágenes se graban con un microscopio invertido, recorte el bloque de agarosa que contiene las larvas en una pequeña forma cuboide. Esto es importante para transferir las larvas a la cámara de imágenes más adelante. Si se utiliza un microscopio vertical, dicho recorte no es necesario, ya que la cámara de montaje también se puede utilizar como cámara de imágenes. En la Figura 1 (parte superior), se puede encontrar una descripción esquemática de estos pasos.

4. Exponer el cerebro

NOTA: Todos los siguientes pasos deben realizarse con el mayor cuidado para no dañar innecesariamente las larvas. Si se requiere un cerebro completamente activo para el experimento, tenga en cuenta que con cada segundo que pasa, mientras que el pez todavía está completamente montado en agarosa y tiene un cráneo abierto sin ACSF oxigenado, el cerebro sufrirá de falta de oxígeno y también se secará. Los efectos de la deficiencia de oxígeno se volverán aún más dramáticos, cuanto más viejas sean las larvas incrustadas. Por lo tanto, es importante realizar la cirugía no solo en el menor tiempo posible, sino también con la máxima precisión para no evocar daño cerebral mecánico con la aguja. Cuando se entrena, los pasos 4.2-4.4 no deben tomar más de 30 s por pez.

  1. Comience la cirugía tan pronto como la agarosa se haya solidificado. Primero, recorte todo el exceso de agarosa por encima de la región cerebral de interés para obtener acceso libre a la cabeza y un espacio de trabajo despejado. Si la parte dorsal de la cabeza ya está sobresaliendo de la agarosa, omita este paso.
  2. Dependiendo de la región de interés, elija un lugar para comenzar con la cirugía. Tome la aguja de vidrio y haga una pequeña incisión a través de la piel, pero sin penetrar demasiado profundamente en el tejido. Este será el punto de partida para pelar la piel superpuesta.
    NOTA: Para obtener resultados óptimos, nunca comience directamente por encima de la región de interés para reducir el riesgo de dañar estructuras importantes. Si es necesario, es posible incluso comenzar detrás del cerebro posterior y desde allí trabajar hacia adelante hasta que el área no deseada de la piel se despegue.
  3. Continúe con cortes muy pequeños a lo largo de la parte de la piel con el objetivo de eliminar apenas moviendo la aguja justo debajo de la superficie. La mayoría de las veces no es necesario moverse completamente alrededor del cerebro y cortar un pedazo de piel y cráneo en forma de círculo, sino simplemente hacer dos incisiones a lo largo de la cabeza y luego empujar la piel hacia uno u otro lado. La Figura 2 muestra una representación esquemática de la estrategia de corte óptima para obtener libre acceso al cerebelo.
    NOTA: Esta microquirugía es un procedimiento delicado y lo más probable es que necesite un poco de entrenamiento para eliminar perfectamente la piel sin dañar el cerebro subyacente. También se recomienda averiguar la estrategia de corte óptima para la región cerebral de interés y seguir con ella durante el período del experimento.
  4. Inmediatamente después de eliminar la piel de todas las larvas incrustadas, proceda vertiendo ACSF (oxigenado) sobre la agarosa para inundar las partículas no deseadas de la piel y la sangre y para mantener el cerebro completamente activo y protegerlo de la resequedad.
    NOTA: Si se necesita un cerebro sano para el experimento, se recomienda ir por un máximo de tres peces a la vez.
  5. Si usa un microscopio vertical, comience directamente con las imágenes.
    1. Cuando utilice un microscopio invertido, deslice una pequeña espátula debajo del bloque de agarosa cuboide (paso 3.4).
    2. Agregue una pequeña gota de LM-agarosa al fondo de la cámara de imágenes (por ejemplo, plato con fondo de vidrio) e inmediatamente voltee el bloque de agarosa que contiene las larvas con la espátula durante 180 ° y empuje suavemente hacia el fondo de la cámara de imágenes, mientras que la gota de agarosa líquida actúa como pegamento.
    3. Cuando la agarosa se haya solidificado, llene la cámara de imágenes con ACSF (oxigenado) y luego comience a obtener imágenes. Consulte la Figura 1 (parte inferior) para obtener una descripción esquemática.
  6. Cuando se requiera actividad cerebral completa para el experimento, siempre asegúrese de que el ACSF en la cámara de imágenes tenga un nivel de oxígeno suficientemente alto. Para garantizar esto, intercambie el medio cuidadosamente con ACSF recién oxigenado cuando sea posible cada 20-60 minutos (dependiendo del número y tamaño del pez, el tamaño y la superficie de la cámara de imágenes y la duración de la imagen).

Figure 1
Figura 1: Procedimiento esquemático para la preparación de pez cebra de cráneo abierto para imágenes in vivo de manera escalonada. Las instrucciones de trabajo para los diferentes pasos se pueden encontrar en el propio gráfico. Gráfico diseñado por Florian Hetsch y adaptado por Paul Schramm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Representación esquemática detallada de la microquirugía realizada para extirpar trozos de piel y cráneo por encima de la región cerebral de interés. El círculo rojo marca el lugar donde se debe hacer el primer corte. La línea de puntos rojos delinea el camino óptimo para cortar junto con la aguja para obtener acceso libre al cerebelo sin dañarlo. La flecha verde marca la dirección en la que la piel excesiva y las piezas del cráneo se pueden alejar fácilmente. Asegúrese de nunca penetrar en el tejido cerebral durante todo el procedimiento. Después de despegar con éxito la piel, la región cerebral de interés (aquí, cerebelo) será de libre acceso para cualquier tipo de imagen in vivo de alta resolución. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Representative Results

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Figura 3A,C muestran una larva de 14 dpf de la línea transgénica Tg[-7.5Ca8:GFP]bz12[15] con el cráneo aún intacto. Las células pigmentarias en la piel superpuesta se distribuyen por toda la cabeza y están interfiriendo con la señal de fluorescencia en la región de interés (aquí, cerebelo). Con la larva en esta condición, no es posible obtener imágenes de alta resolución del cerebro. Figura 3B muestra una larva de la misma línea transgénica después de realizar la cirugía de cráneo abierto. El área de interés ahora es de libre acceso para que el láser de excitación y la luz de fluorescencia emitida penetren en el tejido sin dispersarse y reflejarse. Las imágenes grabadas de esta larva darán como resultado imágenes detalladas de alta resolución (Figura 3D), comparable con imágenes de un cerebro aislado, pero con la ventaja de que el cerebro todavía está completamente activo. Además, el cerebro no está perdiendo ninguna intensidad de fluorescencia que normalmente sería causada por la fijación con para-formaldehído, como sería el caso de un cerebro fijo y explantado. En una larva con un cráneo abierto y, por lo tanto, un cerebro de libre acceso con neuronas completamente activas, que aún posee todas las conexiones fisiológicas y recibe información normal del sistema sensorial, también será posible observar eventos a corto plazo, por ejemplo, sinaptogénesis, crecimiento de la columna vertebral, migración dendrítica / axonal o expresión local de ARNm.16 en condiciones fisiológicas. Otra ventaja de este método es que es adecuado para la aplicación de diferentes sustancias farmacológicas para investigar los efectos en la larva viva sin los problemas de difusión causados por la piel y el cráneo o la barrera hematoencefálica, lo que normalmente dificultaría que las sustancias penetren en el cerebro (Figura 3E). Para demostrarlo, se incubó una larva de 14 dpf con un cráneo abierto con Hoechst-33342 (5 μg/mL en ACSF) durante 10 min y luego se tomaron imágenes (Figura 3F-Yo). Figura 4A,B muestran larvas viejas de 30 dpf antes y después de abrir el cráneo. Es el punto de tiempo más avanzado probado hasta ahora para este método. Incluso en esta etapa de desarrollo de la larva, es posible obtener imágenes de alta resolución de neuronas individuales y también compartimentos subcelulares utilizando el método descrito aquí (Figura 4C,D). Estas larvas viejas de 30 dpf no mostraban déficits de actividad después de 1 h de imagen. Este método también se utiliza para el análisis electrofisiológico de pinzas de parche de larvas viejas de 30 dpf y no hay signos de pérdida de actividad neuronal en las células de Purkinje (sin embargo, las células cercanas a la superficie son delicadas y vulnerables) durante los primeros 60 minutos de estar incrustadas con un cráneo abierto. Al inspeccionar regularmente la cantidad de flujo sanguíneo, es posible validar que la larva todavía está en un estado saludable. Este estado se puede mantener, intercambiando u oxigenando regularmente ACSF durante la grabación de imágenes a largo plazo. Por lo tanto, es bastante simple validar si una larva todavía es adecuada para estudios cerebrales funcionales. Para demostrar, que no se dañan vasos sanguíneos importantes durante la microcirugía y también para demostrar que este método permite una penetración mucho más profunda de la luz láser de excitación en el tejido cerebral y la emisión reducida de fotones por reflexión, una larva vieja de 10 dpf de la cepa transgénica Tg (flk1: mCherry)y206Tg17 fue analizado por este método. Estos peces contienen una vasculatura fluorescente en el cerebro debido a la expresión de la proteína fluorescente roja mCherry en las células endoteliales. Una proyección de máxima intensidad de una pila de imágenes que cubre 245 μm de profundidad revela la intrincada red de los vasos sanguíneos que serpentean a través del mesencéfalo y el cerebro posterior (Figura 5A). Además, la codificación por colores de los valores de profundidad de la pila de imágenes demuestra que incluso los vasos sanguíneos profundamente enterrados en el cerebro a casi 250 μm son claramente visibles y trazables (Figura 5B). Video complementario 1A muestra un cerebro sano con suficiente suministro de sangre, mientras que Video complementario 1B muestra un cerebro con flujo sanguíneo comprometido debido a la falta de intercambio de ACSF y la falta de oxigenación media.

Figure 3
Figura 3:El peeling de la piel en larvas de pez cebra proporciona un acceso óptimo para las imágenes cerebrales in vivo. Análisis de microscopía confocal de larvas de 14 dpf de Tg(-7.5ca8:GFP]bz12 de edad. Descripción general del mesencéfalo medio y posterior de especímenes sin pelar(A, C)y pelados(B, D)con un aumento de 20x y 40x respectivamente. En este último, la falta de pigmento mejora claramente la calidad de la imagen y permite el registro detallado de imágenes de células fluorescentes de Purkinje en el cerebelo. Las imágenes subcelulares y la facilidad de administración de compuestos al cerebro se demuestran mediante un período de incubación de 10 minutos con la tinción fluorescente de ácido nucleico utilizando Hoechst-33342 (5 μg / ml en ACSF). Mientras que solo las células de la piel incorporan este tinte en larvas no peladas(E),los especímenes con piel levantada muestran un etiquetado intenso de sus núcleos en todo el cerebro(F),lo que permite visualizar núcleos individuales(G)de neuronas de Purkinje fluorescentes GFP(H,imagen fusionada que se muestra en I,63x aumento óptico y 4x digital). Barras de escala: A-F: 100 μm, G-I: 5 μm. Las larvas estaban incrustadas con la cabeza a la izquierda, dorsal está arriba. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4:El peeling de la piel extiende el acceso de imágenes cerebrales in vivo a los peces cebra juveniles. Análisis de microscopía confocal de 30 dpf de t transgénicos antiguos Tg(-7.5ca8:GFP]bz12Tg juveniles. Descripción general sobre el cerebro medio y posterior de especímenes no pelados (A) y pelados de la piel a 10x (B) y 40x (C) y 63x aumento óptico con zoom digital 4x (D), respectivamente. La eliminación de la piel pigmentada permite la visualización de la organización celular de la capa celular cerebelosa continua de Purkinje y representar proyecciones de neuronas individuales(D,flechas blancas). Barras de escala: A-C: 100 μm, D: 5 μm. Las larvas estaban incrustadas con la cabeza a la izquierda, dorsal está arriba. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5:La eliminación de la piel permite la reconstrucción de la vasculatura cerebral a profundidad extendida en una larva de pez cebra Tg(flk1:mCherry)y206Tg de 10 dpf de edad. (A) La proyección de intensidad máxima de una pila de imágenes (245 imágenes de un grosor de 1 μm a una distancia total de 245 μm, aumento óptico de 20x) muestra una red continua de vasos sanguíneos en todas estas áreas del cerebro. (B) La codificación de colores de profundidad revela que esta red de vasos sanguíneos se puede monitorear a una profundidad de 200 μm y más. Para eliminar la autofluorescencia y la reflexión, los ojos estaban enmascarados por el color negro. Barra de escala: 100 μm. Las larvas estaban incrustadas con la cabeza a la izquierda, dorsal está arriba. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1:Agujas hechas de capilares de vidrio. (A) Se muestran dos tipos de agujas obtenidas de dos extracdores de agujas diferentes. Es importante que la punta no sea demasiado larga para dotarla de suficiente estabilidad y evitar su rotura al entrar en contacto con la piel/cráneo. Sin embargo, se necesita una nitidez suficiente para permitir hacer cortes con bordes limpios. (B) Se muestra una imagen del capilar que se carga en los tiradores de agujas. La barra de escala es de 250 μm. Longitud capilar: 100 mm; OD: 1,5 mm: ID: 0,84 mm; filamento: sí. Haga clic aquí para descargar esta figura.

Video complementario 1: Imágenes de larva vieja de 7dpf. (A) Grabación de películas en tiempo real (30 fps) de una larva vieja de 7 dpf 10 minutos después de que se haya eliminado la piel por encima del cerebro. El flujo sanguíneo vívido indica un estado saludable con suficiente suministro de sangre. (B) Grabación de película en tiempo real (30 fps) de la misma larva vieja de 7 dpf que se muestra en el video complementario 1A, 2 h después de la microcirugía sin intercambio de ACSF y falta de oxigenación media. Barra de escala: 100 μm. Haga clic aquí para descargar este video.

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Discussion

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El método presentado proporciona un enfoque alternativo para el aislamiento cerebral o el tratamiento de larvas de pez cebra con productos farmacéuticos que inhiben la pigmentación para registrar imágenes de alta resolución de neuronas en su entorno in vivo. La calidad de las imágenes grabadas con este método es comparable a las imágenes de cerebros explantados, pero en condiciones naturales.

Además, se evita una pérdida de intensidad de fluorescencia, ya que no hay necesidad de tratamiento con fijadores18. Además, este método no es tan invasivo como aislar un cerebro y solo consiste en un paso crucial que podría conducir al fracaso, por lo que las posibilidades de una preparación exitosa son mayores en comparación con la explantación cerebral. La ventaja más importante es que este método es adecuado para la grabación de imágenes in vivo. Siempre que la apertura del cráneo se realice de manera precisa, rápida y exitosa, y la saturación de oxígeno de ACSF se controle regularmente, el cerebro debe ser completamente funcional y viable durante horas. Sobre la base de los registros electrofisiológicos, la circulación sanguínea, la respiración y la supervivencia de los peces durante días adicionales, consideramos probable que la extirpación de la piel y el cráneo no sea muy perjudicial para la salud en general. Por lo tanto, este método se puede utilizar para obtener imágenes en tiempo real de procesos celulares y subcelulares en un cerebro sano y funcional sin pigmentación perturbadora de imágenes. Este método es un procedimiento estándar utilizado para los registros electrofisiológicos de la actividad neuronal in vivo en nuestro laboratorio y también está bien establecido en otros laboratorios de electrofisiología de todo el mundo19,20,21,22,lo que demuestra que la función del cerebro no se ve afectada por la microcirugía. Una desventaja que debe mencionarse es que este enfoque solo es adecuado para obtener imágenes de las regiones dorsales y laterales del cerebro y no se puede realizar repetidamente con la misma muestra.

Sin embargo, si se necesita un cerebro completamente funcional para el experimento, la saturación de oxígeno debe monitorearse permanentemente y, si es necesario, el ACSF en la cámara de imágenes debe intercambiarse con ACSF recién oxigenado. Esto significa que, para las grabaciones a largo plazo, debe haber una opción para intercambiar el ACSF utilizado con ACSF saturado de oxígeno sin perturbar el procedimiento de imagen que podría abordarse utilizando una bomba en miniatura.

Cabe destacar que si la microcirugía no se realiza correctamente o de manera imprecisa, provocará una lesión cerebral o hemorragia cerebral que resultará en una fisiología cerebral comprometida. Además, una baja saturación de oxígeno en el ACSF (ver Video Complementario 1)o demasiado estrés para las larvas durante todo este procedimiento puede afectar negativamente al cerebro23,24. Por lo tanto, este método no es adecuado para el análisis de alto rendimiento, sino más bien para el registro de imágenes longitudinales o altamente detalladas de solo unas pocas larvas por punto de tiempo. Por lo tanto, este método no debe estar dirigido a la detección de fármacos a alto rendimiento, pero podría usarse para caracterizar o validar compuestos farmacológicos prometedores en detalle, donde las imágenes de alta resolución son informativas y necesarias. Para garantizar un estado de salud cerebral adecuado, se recomienda no exceder el número de tres larvas por ensayo.

A través del cráneo abierto, incluso es posible aplicar directamente sustancias al tejido cerebral sin que pasen a través de la barrera hematoencefálica. En general, el método aquí descrito, actualmente aplicado para la electrofisiología in vivo, es una técnica con un alto potencial en un campo muy amplio de imágenes cerebrales in vivo y optogenética en larvas y juveniles de pez cebra y puede combinarse con enfoques neurofarmacológicos.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos especialmente a Timo Fritsch por el excelente cuidado de los animales y a Hermann Döring, Mohamed Elsaey, Sol Pose-Méndez, Jakob von Trotha, Komali Valishetti y Barbara Winter por su útil apoyo. También estamos agradecidos a todos los demás miembros del laboratorio de Köster por sus comentarios. El proyecto fue financiado en parte por el proyecto de la Fundación Alemana de Investigación (DFG, KO1949/7-2) 241961032 (a RWK) y el Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF; Era-Net NEURON II CIPRESS proyecto 01EW1520 a JCM) es reconocido.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Calcium chloride Roth A119.1
Confocal Laser scanning microscope Leica TCS SP8
d-Glucose Sigma G8270-1KG
d-Tubocurare Sigma-Aldrich T2379-100MG
Glass Capillary type 1 WPI 1B150F-4
Glass Capillary type 2 Harvard Apparatus GC100F-10
Glass Coverslip deltalab D102424
HEPES Roth 9105.4
Hoechst 33342 Invitrogen (Thermo Fischer) H3570
Imaging chamber Ibidi 81156
Potassium chloride Normapur 26764298
LM-Agarose Condalab 8050.55
Magnesium chloride (Hexahydrate) Roth A537.4
Microscope Camera Leica DFC9000 GTC
Needle-Puller type 1 NARISHIGE Model PC-10
Needle-Puller type 2 Sutter Instruments Model P-2000
Pasteur-Pipettes 3ml A.Hartenstein 20170718
Sodium chloride Roth P029.2
Sodium hydroxide Normapur 28244262
Tricain Sigma-Aldrich E10521-50G
Waterbath Phoenix Instrument WB-12
35 mm petri dish Sarstedt 833900
90 mm petri dish Sarstedt 821473001

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References

  1. Hill, M. A. Embryology. Zebrafish Development. Available from: https://embryology.med.unsw.edu.au/embryology/index.php/Zebrafish_Development (2020).
  2. Sassen, W. A., Köster, R. W. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. Dove Medical Press. 2015, (5), 151-163 (2015).
  3. Singh, A. P., Nüsslein-Volhard, C. Zebrafish stripes as a model for vertebrate colour pattern formation. Current Biology. 25, (2), 81-92 (2015).
  4. Kalueff, A. V., et al. Time to recognize zebrafish 'affective' behavior. Brill: Behaviour. 149, (10-12), 1019-1036 (2012).
  5. Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. -E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology. 3, 522-527 (2001).
  6. Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling. PloS One. 6, 22991 (2011).
  7. Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development Genes and Evolution. 212, 593-598 (2003).
  8. Baumann, L., Ros, A., Rehberger, K., Neuhauss, S. C. F., Segner, H. Thyroid disruption in zebrafish (Danio rerio) larvae: Different molecular response patterns lead to impaired eye development and visual functions. Aquatic Toxicology. 172, 44-55 (2016).
  9. White, R., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
  10. Antinucci, P., Hindges, R. A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging. Scientific Reports. 6, 29490 (2016).
  11. Burr, S. A., Leung, Y. L. Curare (d-Tubocurarine). Encyclopedia of Toxicology (3rd Edition). 1088-1089 (2014).
  12. Gesler, H. M., Hoppe, J. 3,6-bis(3-diethylaminopropoxy) pyridazine bismethiodide, a long-acting neuromuscular blocking agent. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 118, (4), 395-406 (1956).
  13. Furman, B. Alpha Bungarotxin. Reference Module in Biomedical Sciences. (2018).
  14. Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction. PLoS One. 9, (8), 103751 (2014).
  15. Namikawa, K., et al. Modeling neurodegenerative spinocerebellar ataxia type 13 in zebrafish using a Purkinje neuron specific tunable coexpression system. Journal of Neuroscience. 39, (20), 3948-3969 (2019).
  16. Hennig, M. Theoretical models of synaptic short term plasticity. Frontiers in Computational Neuroscience. 7, (45), (2013).
  17. Wang, Y., et al. Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis. Development. 137, 3119-3128 (2010).
  18. Hobro, A., Smith, N. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
  19. Knogler, L. D., Kist, A. M., Portugues, R. Motor context dominates output from purkinje cell functional regions during reflexive visuomotor behaviours. eLife. 8, 42138 (2019).
  20. Hsieh, J., Ulrich, B., Issa, F. A., Wan, J., Papazian, D. M. Rapid development of Purkinje cell excitability, functional cerebellar circuit, and afferent sensory input to cerebellum in zebrafish. Frontier in Neural Circuits. 8, (147), (2014).
  21. Scalise, K., Shimizu, T., Hibi, M., Sawtell, N. B. Responses of cerebellar Purkinje cells during fictive optomotor behavior in larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 116, (5), 2067-2080 (2016).
  22. Harmon, T. C., Magaram, U., McLean, D. L., Raman, I. M. Distinct responses of Purkinje neurons and roles of simple spikes during associative motor learning in larval zebrafish. eLife. 6, 22537 (2017).
  23. Zehendner, C. M., et al. Moderate hypoxia followed by reoxygenation results in blood-brain barrier breakdown via oxidative stress-dependent tight-junction protein disruption. PLoS One. 8, (12), 82823 (2013).
  24. Dhabhar, F. S. The short-term stress response - mother nature's mechanism for enhancing protection and performance under conditions of threat, challenge, and opportunity. Frontiers of Neuroendocrinology. 49, 175-192 (2018).
Imágenes in vivo de tejido cerebral completamente activo en larvas y juveniles de pez cebra despiertos mediante la extirpación del cráneo y la piel
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Schramm, P., Hetsch, F., Meier, J. C., Köster, R. W. In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal. J. Vis. Exp. (168), e62166, doi:10.3791/62166 (2021).More

Schramm, P., Hetsch, F., Meier, J. C., Köster, R. W. In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal. J. Vis. Exp. (168), e62166, doi:10.3791/62166 (2021).

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