Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تصور وقياس الأضرار التي لحقت بالحمض النووي الخاصة بالموقع القائم على الإندونوكليز

Published: August 21, 2021 doi: 10.3791/62175
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Institute of Pathology, Faculty of Medicine, University of Szeged
* These authors contributed equally

Summary

تقدم هذه المقالة الخطوات الأساسية لتثبيط المناعة والكروماتين المناعي. وتستخدم هذه البروتوكولات عادة لدراسة العمليات الخلوية المرتبطة بتلف الحمض النووي ولتصور وقياس تجنيد البروتينات المتورطة في إصلاح الحمض النووي.

Abstract

تتعرض الخلايا باستمرار لمختلف العوامل الضارة بالحمض النووي، مما يؤدي إلى استجابات خلوية مختلفة. تطبيق النهج الكيميائية الحيوية والجينية أمر ضروري في الكشف عن الأحداث الخلوية المرتبطة بتوظيف وتجميع مجمعات إصلاح الحمض النووي في موقع تلف الحمض النووي. في السنوات القليلة الماضية، تم تطوير العديد من الأدوات القوية للحث على تلف الحمض النووي الخاص بالموقع. وعلاوة على ذلك، تسمح لنا التقنيات الأساسية الجديدة بدراسة هذه العمليات على مستوى دقة الخلية الواحدة باستخدام الخلايا الثابتة والحية على حد سواء. على الرغم من أن هذه التقنيات قد استخدمت لدراسة العمليات البيولوجية المختلفة، وهنا نقدم البروتوكولات الأكثر استخداما في مجال إصلاح الحمض النووي، والتأني المناعي الفلوري (IF) وChromatin Immunoprecipitation (ChIP)، والتي في تركيبة مع تلف الحمض النووي الموقع القائم على الإنتونوكليز تجعل من الممكن تصور وقياس الإشغال الجينومي لعوامل إصلاح الحمض النووي بطريقة موجهة ومنظمة، على التوالي. توفر هذه التقنيات أدوات قوية للباحثين لتحديد البروتينات الجديدة المرتبطة بالجراد الجينومي التالف بالإضافة إلى تعديلاتها اللاحقة للترجمة اللازمة لتنظيمها الدقيق أثناء إصلاح الحمض النووي.

Introduction

الجينوم لدينا هو باستمرار تواجه تحديا من قبل مختلف العوامل الضارة الحمض النووي. ويمكن أن تستمد هذه الاعتداءات من مصادر بيئية، مثل الأشعة فوق البنفسجية أو الإشعاع، وكذلك من مصادر داخلية، مثل المنتجات الثانوية الأيضية الناجمة عن الإجهاد التأكسدي أو أخطاء النسخ المتماثل1،2. يمكن أن تؤثر هذه الآفات على سلامة أحد أو كل من خيوط الحمض النووي ، وإذا أصبحت الأخطاء المتولدة مستمرة ، فإنها تؤدي في كثير من الأحيان إلى عمليات النقل وعدم استقرار الجينوم ، مما قد يؤدي إلى تكوين الورم3،4. للحفاظ على سلامة الجينوم، تم تطوير أنظمة إصلاح متعددة أثناء التطور. وفقا للخصائص الكيميائية والفيزيائية لأنواع محددة من تلف الحمض النووي ، يمكن تنشيط آليات إصلاح متعددة. عدم التطابق، والمواقع abasic، فواصل حبلا واحد، و 8-oxoguanine (8-oxoG) يمكن إزالتها إما عن طريق إصلاح عدم التطابق أو قاعدة الختان إصلاح المسار5،6. الآفات الناجمة عن المنتجات الضوئية الناجمة عن الأشعة فوق البنفسجية والإضافات الضخمة يمكن إصلاحها إما عن طريق إصلاح النيوكليوتيدات الختان (NER) أو إصلاح كسر الحمض النووي المزدوج حبلا (DSBR) عملية7،8. يتكون NER من مسارين فرعيين رئيسيين: NER المقترن بالنص (TC-NER) وNER الجينوم العالمي (GG-NER). فيما يتعلق بمرحلة دورة الخلية، بعد التعريفي كسر حبلا مزدوجة الحمض النووي، يمكن تنشيط مسارين فرعيين: غير متجانسة نهاية الانضمام (NHEJ) وإعادة التركيب متجانسة (HR)1،9. يمكن تنشيط NHEJ ، وهو المسار المهيمن في الخلايا يستريح ، في جميع مراحل دورة الخلية ، مما يمثل مسارا أسرع ولكن عرضة للخطأ10. من ناحية أخرى، الموارد البشرية هو مسار خالية من الأخطاء، والتي يتم إصلاح DSBs على أساس البحث تسلسل التماثل من الكروماتيدات الشقيقة، وبالتالي فهو موجود أساسا في مراحل دورة الخلية S و G211. وعلاوة على ذلك، فإن الانضمام إلى نهاية الميكروهوميكولوجيا بوساطة (MMEJ) هو آلية إصلاح أخرى ل DSB، تختلف عن تلك المذكورة أعلاه، استنادا إلى طريقة KU70/80-وRAD51 المستقلة لإعادة ربط تسلسلات microhomologous التي تم استئصالها سابقا والتي تحيط بنهايات الحمض النووي المكسورة. لذلك، يعتبر MMEJ أن تكون عرضة للخطأ ومطفرة للغاية12. أثناء إصلاح الحمض النووي، DSBs يمكن أن تحفز استجابة تلف الحمض النووي (DDR)، مما يؤدي إلى تفعيل kinases نقطة التفتيش التي توقف دورة الخلية أثناء إصلاح13،14،15. يتم تنشيط DDR كرد فعل على التوظيف والانتشار الواسع النطاق للاعبين الرئيسيين البادئين في عملية الإصلاح حول الآفات ، مما يساهم في تشكيل تركيز الإصلاح. في هذه السلسلة الإشارات المبكرة، وM ATM (Ataxia Telangiectasia تحور) كيناز يلعب دورا محوريا من خلال تحفيز الفوسفور من البديل الهستون H2AX في Ser139 (يشار إليها باسم γH2AX) حول الآفة16. هذا الحدث المبكر هو المسؤول عن توظيف عوامل إصلاح إضافية وبدء عمليات الإصلاح المصب. على الرغم من أن الوظيفة الدقيقة للبروتينات المجندة في محور الإصلاح لم يتم توصيفها بالكامل بعد ، فقد تم التحقيق في تشكيل وديناميات بؤر الإصلاح من قبل العديد من المختبرات. وتستخدم هذه العلامات على نطاق واسع لمتابعة الحركية إصلاح، ولكن دورها الدقيق خلال عملية الإصلاح لا يزال بعيد المنال. نظرا للأهمية الكبيرة ولكن سوء فهم العمليات الخلوية ذات الصلة إصلاح الحمض النووي، وقد وضعت عدة طرق حتى الآن للحث وتصور DDR.

وقد تم إنشاء أساليب ونظم مختلفة للحث على النوع المطلوب من تلف الحمض النووي. على سبيل المثال، بعض العوامل [مثل نيوكارزينوستاتين (NCS)، phleomycin، bleomycin، γ الإشعاع، الأشعة فوق البنفسجية] يمكن أن تحفز أعدادا كبيرة من فواصل الحمض النووي العشوائي في المواقف الجينومية غير التنبؤية، في حين أن الآخرين (endonucleases، مثل AsiSI، I-PpoI أو I-SceI، فضلا عن شريط الليزر) يمكن أن تحفز فواصل الحمض النووي في loci الجينوم المعروفة17،18،19،20،21. هنا، ونحن نركز على التقنيات القائمة على الإندونوكليز المستخدمة حاليا لدراسة DDR في الثدييات وخلايا الخميرة. وبصرف النظر عن تسليط الضوء على مبادئ هذه التقنيات، ونحن نؤكد على كل من مزاياها وعيوبها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. الشفط المناعي لبروتينات محددة

  1. إعداد ثقافة الخلية والإعداد التجريبي
    1. الحفاظ على خلايا U2OS في monolayers في DMEM الثقافة المتوسطة تكملها 10٪ مصل العجل الجنيني، 2 mM الجلوتامين، و 1٪ محلول مضاد للمضادات الحيوية.
      ملاحظة: للحصول على تحريض تلف الحمض النووي القائم على الإندونوكليز، استخدم وسيطا معالجا بالفحم أو خاليا من الستيرويد لتجنب تسرب النظام.
    2. تنمو الخلايا في بيئة رطبة 5٪ CO2 في 37 درجة مئوية حتى 80٪ التقاء، وتجديد المتوسطة كل 2-3 أيام.
    3. يستنشق المتوسط ويغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1x. فصل الخلايا مع حل تريبسين-EDTA. عندما تنفصل الخلايا، أوقف نشاط التريبسين بإضافة وسيط ثقافي إلى الخلايا، مما يؤدي إلى تعليق الخلية.
    4. عد الخلايا باستخدام غرفة عد الخلايا. لوحة 2 × 104 خلايا / مل / جيدا على لوحة 24 جيدا، مع العقيمة 12 ملم جولة coverslips في كل بئر.
    5. احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية في جو رطب 5٪ CO2 للسماح المرفق على coverlips.
    6. علاج الخلايا مع 10 نانوغرام / مل من neocarzinostatin (NCS) عن طريق الأنابيب مباشرة وكيل الضارة إلى المتوسطة المستزرعة. احتضان الخلايا مع المتوسطة التي تحتوي على NCS لمدة 15 دقيقة، ثم غسلها مع برنامج تلفزيوني 1x وإضافة الطازجة، وتكملة متوسطة الثقافة إلى الخلايا. خلاف ذلك ، استخدم العامل المناسب (أي 4-OHT) لحث DSBs عبر الأنظمة القائمة على الإندونوكليز دون تحديث المتوسط22.
      ملاحظة: بدلا من ذلك، استخدم التشعيع للحث على تلف الحمض النووي، بدءا من 30 دقيقة حتى 8 ساعة من وقت الاسترداد باستخدام تدفق النيوترون بين 2-20 Gy23.
    7. احتضان الخلايا لمدة 1-8 ساعة في 37 درجة مئوية في الغلاف الجوي5٪ CO 2 المرطب لمتابعة حركية إصلاح الحمض النووي.
  2. تثبيت الخلايا
    ملاحظة: يجب استخدام 300-500 ميكرولتر من الحلول/البئر في الخطوات التالية (الخطوات 1.2-1.5) لتغطية كافة الخلايا بشكل كاف. يجب إجراء كل خطوة حضانة وغسل (باستثناء حضانة الأجسام المضادة) على شاكر مداري مع هياج لطيف.
    1. بعد التعريفي DSB واحتضان الخلايا، وإزالة المتوسطة من الخلايا المرفقة وغسل الخلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1x.
    2. إصلاح الخلايا مع 4٪ حل الفورمالديهايد-PBS لمدة 20 دقيقة في 25 درجة مئوية.
  3. إعادة الخلايا إلى ما قبل الخلايا
    1. إزالة حل تحديد وغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1x لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    2. إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 0.2 ٪ تريتون العاشر - 100 حلها في برنامج تلفزيوني. احتضان العينات لمدة 20 دقيقة.
  4. حظر مواقع الربط غير المحددة
    1. غسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1x.
    2. كتلة مواقع ملزمة غير محددة مع 5٪ BSA (مصل البقر كسر الخامس الألبومين) المخفف في PBST (1x PBS تكملها 0.1٪ توين-20)، واحتضان العينات permeabilized لمدة 20 دقيقة على الأقل.
  5. تلطيخ الفلورة المناعية
    1. إضافة الكمية المناسبة من الأجسام المضادة الأولية (أي المضادة γH2AX، المضادة للحمض النووي-PKcs) المخفف في 1٪ BSA-PBST الحل. ضع كل غطاء رأسا على عقب على فيلم بارافين على قطرة 10 ميكرولتر من الأجسام المضادة المخففة المضادة ل γH2AX.
      ملاحظة: في حالة وجود نقص المناعة المشتركة تمييع بشكل مناسب على حد سواء الأجسام المضادة في نفس الحل 1٪ BSA-PBST.
    2. احتضان العينات في غرفة الرطوبة لمدة 1.5 ساعة في 4 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن أيضا إجراء الحضانة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
    3. وضع coverlips مرة أخرى يجري الجانب حتى في لوحة 24 جيدا وغسل ثلاث مرات لمدة 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني 1x.
    4. إضافة الكمية المناسبة من الأجسام المضادة الثانوية المخففة في 1٪ BSA-PBST. ضع كل غطاء رأسا على عقب على فيلم البارافين على قطرة 10 ميكرولتر من الجسم المضاد المخفف.
    5. احتضان العينات في غرفة الرطوبة في 4 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
    6. وضع coverlips مرة أخرى يجري الجانب حتى في لوحة 24 جيدا وغسل ثلاث مرات لمدة 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني 1x.
    7. قبل إزالة آخر حل الغسيل PBS، تأخذ بلطف من coverlips باستخدام ملاقط وإبرة ومن ثم وضعها رأسا على عقب على الشرائح الزجاجية مع قطرات من المتوسطة المتصاعدة (تستكمل مع DAPI).
      ملاحظة: تجنب تشكيل فقاعات الهواء. عندما يجف المتوسط المتصاعد ، يوصى بختم حواف الأغطية بطلاء الأظافر لمنع تذبل العينات.

2. التكفير المناعي الكروماتين

  1. جمع الخلايا، والربط المتبادل، والتحلل الخلوي والنووية، وتفتيت الحمض النووي
    1. ثقافة ما يقرب من 5 ×10 6 خلايا / مل في طبق 150 ملم لكل عينة.
    2. إزالة ثقافة المتوسطة وغسل الخلايا مرتين مع الجليد الباردة 1x PBS.
    3. إصلاح الخلايا مع 1٪ حل الفورمالديهايد-PBS، ووضع لوحات على شاكر المدارية، والتحريض بلطف لمدة 20 دقيقة.
      ملاحظة: الفورمالديهايد متقلب; إعداد حل عمل جديد دائما. في بعض الحالات ، يحتوي محلول الفورمالديهايد على الميثانول لتثبيته ، ولكن من الأفضل استخدام محلول خال من الميثانول لتجنب التداخل مع ردود الفعل المصب.
    4. وقف التثبيت مع 125 mM الجليسين واحتضان على شاكر المداري مع التحريض لطيف لمدة 5 دقائق في 25 °C.
    5. وضع لوحات على الجليد وغسل مرتين مع الجليد الباردة 1x PBS.
    6. كشط الخلايا في الجليد الباردة 1x PBS ونقلها إلى أنابيب مخروطية 15 مل.
    7. طرد الخلايا في 2500 س غ لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية.
    8. يستنشق بعناية supernatant وإعادة إنفاق بيليه في 2 مل من العازلة تحلل الخلية [5 mM PIPES pH 8.0، 85 MM KCl، 0.5٪ NP-40، 1x PIC (كوكتيل مثبطات البروتيز)] واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة.
    9. الطرد المركزي تعليق الخلية في 2500 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية.
    10. تجاهل بعناية supernatant وإعادة إنفاق بيليه في 500-1500 ميكرولتر من العازلة تحلل النووية (50 mM تريس-HCl pH 8.0، 10 M EDTA درجة الحموضة 8.0، 0.8٪ SDS، 1x PIC) واحتضان على الجليد لمدة 30-60 دقيقة. نقل الليسترات إلى أنبوب البوليسترين المخروطية مناسبة ل sonication.
      ملاحظة: بما أن المخزن المؤقت للتحلل النووي يحتوي على SDS، فإنه سيعجل على الجليد، وسوف يتحول الحل إلى اللون الأبيض. يجب أن يتحول الحل شفافا بعد sonication.
    11. Sonicate lysate لقص الحمض النووي إلى متوسط حجم جزء من 300-1000 نقطة أساس.
      ملاحظة: يجب تعيين دورات sonication المناسبة والشروط وفقا لنوع الخلية ومعدات sonication. شظايا أصغر من 200 نقطة أساس ليست مناسبة لChIP، لأن التفاعلات بين الحمض النووي والنوكليوسوم يمكن أن تتعطل.
  2. عكس الوصلات المتقاطعة ، وتحديد أحجام شظايا sonicated
    1. إخراج 100 ميكرولتر من العينة سونيكاتيد للتحقق من حجم جزء من الكروماتين سونيكاتيد. يجب تخزين الكروماتين المتبقي عند -80 درجة مئوية.
    2. إضافة 0.5 ملغم / مل RNase A إلى كل 100 ميكرولتر من العينة واحتضانها في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لتنشيط RNase.
    3. احتضان العينات عند 65 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    4. في اليوم التالي، إضافة 500 ميكروغرام / مل من البروتين K و 0.5٪ SDS، واحتضان العينات في 50 درجة مئوية لمدة 3 ساعة.
    5. إضافة 0.5 حجم الفينول و 0.5 حجم الكلوروفورم isoamyl مزيج الكحول (24:1) إلى كل عينة.
    6. دوامة لمدة دقيقة واحدة.
    7. جهاز طرد مركزي عند 13,000 x g لمدة 10 دقائق.
    8. نقل المرحلة المائية العليا إلى أنبوب جديد للطرد المركزي الدقيق.
    9. إضافة 1 حجم الكلوروفورم isoamyl مزيج الكحول (24:1) إلى كل عينة.
    10. دوامة لمدة دقيقة واحدة.
    11. جهاز طرد مركزي عند 13,000 x g لمدة 10 دقائق.
    12. نقل المرحلة المائية العليا إلى أنبوب جديد للطرد المركزي الدقيق.
    13. إضافة 2.5 أحجام من الإيثانول 96٪ وحجم 0.1 من 3 M Na-خلات الأسيتات الأسكتية 5.2.
    14. حضانة لمدة 20 دقيقة على الأقل في −80 درجة مئوية.
    15. طرد مركزي العينات في 13،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية.
    16. إزالة الإيثانول وغسل بيليه مع 400 ميكرولتر من الإيثانول 70٪.
    17. طرد مركزي العينات في 13،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية.
    18. إزالة الإيثانول والهواء الجاف بيليه.
    19. Resuspend بيليه في 10 ميكرولتر من TE.
    20. تشغيل العينات على هلام agarose 0.8٪. يجب أن يكون حجم الكروماتين سونيكاتيد حوالي 500 نقطة أساس.
      ملاحظة: استخدام بروموفينول الأزرق خالية تحميل العازلة لأن حجم هذه الصبغة هو ما يقرب من 500 نقطة أساس، والتي يمكن أن تزعج الكشف السليم من شظايا الكروماتين. بدلا من ذلك، فمن المستحسن استخدام تحميل المخزن المؤقت تكملها xylene-سيانول، وهو ما يقرب من 3،000 نقطة أساس.
    21. إذا كان حجم الكروماتين مقبولا، قم بتخفيف عينات الكروماتين المجمدة من الخطوة 2.1. في 3 مجلدات من تخفيف العازلة (10 mM تريس-HCl pH 8.0، 0.5 mM EGTA pH 8.0، 1٪ تريتون X-100، 140 mM NaCl، 1x PIC) وخلط العينات عن طريق التناوب لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية.
      ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية لتخفيف SDS الموجودة في العازلة تحلل النووية لتجنب التداخل مع ردود الفعل المصب، بما في ذلك قياس تركيز الكروماتين.
    22. قياس تركيز الحمض النووي لعينات الكروماتين في 260/280 نانومتر باستخدام مطياف.
  3. إعداد الخرز، ما قبل التطهير، و سرعة المناعة
    1. إعداد الخرز (الأغنام المضادة للأرنب أو الماوس IgG) لخطوات ما قبل التطهير والمناعة. غسل الخرز مرتين لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية مع RIPA العازلة (50 mM تريس-HCl pH 8.0، 1 mM EDTA pH 8.0، 1٪ تريتون X-100، 0.1٪ Na-DOC، 0.1٪ SDS، 150 mM NaCl و 1X PIC).
    2. Resuspend الخرز في نفس وحدة التخزين من المخزن المؤقت RIPA كما في الخطوة 2.3.1.
    3. واضحة مسبقا 25-30 ميكروغرام كروماتين من كل عينة مع 4 ميكرولتر من الخرز عن طريق التناوب لمدة 1-2 ساعة في 4 درجة مئوية.
      ملاحظة: إضافة RIPA المخزن المؤقت لكل عينة كروماتين تصل إلى 500 ميكرولتر من حجم النهائي للسماح للنماذج مزيج بشكل صحيح تحت دوران. لا تنسى أن تأخذ بها الكروماتين لNAC (لا تحكم الأجسام المضادة) وTIC (التحكم في إجمالي المدخلات) في حالة كل مجموعة عينة. تتطلب TICs فقط حجم نهائي يصل إلى 200 ميكرولتر.
    4. عجل الخرز مع المغناطيس ونقل supernatant إلى أنبوب جديد microcentrife.
    5. إضافة كمية مناسبة من الأجسام المضادة لكل عينة الكروماتين (باستثناء NAC وTIC) وتدوير بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
    6. في اليوم التالي، أضف 40 ميكرولتر من الخرز المغسول إلى كل عينة (باستثناء TIC) واحتضانها بين عشية وضحاها، بالتناوب عند 4 درجات مئوية.
  4. غسل
    1. غسل مرة واحدة مع 300 ميكرولتر من الملح المنخفض العازلة (20 mM تريس-HCl درجة الحموضة 8.0، 150 mM NaCl، 2 mM EDTA درجة الحموضة 8.0، 1٪ تريتون X-100، 0.1٪ SDS، 1x PIC) لمدة 10 دقيقة عن طريق التناوب في 4 درجة مئوية.
    2. غسل مرة واحدة مع 300 ميكرولتر من العازلة الملح العالي (20 mM تريس-HCl درجة الحموضة 8.0، 300 م م NaCl، 2 mM EDTA درجة الحموضة 8.0، 1٪ تريتون X-100، 0.1٪ SDS، 1x PIC) لمدة 10 دقيقة عن طريق التناوب في 4 درجة مئوية.
    3. غسل مرة واحدة مع 300 ميكرولتر من العازلة LiCl (250 mM LiCl، 1٪ NP-40، 1٪ Na-DOC، 1 mM EDTA pH 8.0، 10 mM Tris-HCl pH 8.0، 1x PIC) لمدة 10 دقائق عن طريق الدوران عند 4 درجة مئوية.
    4. اغسل مرتين مع 300 ميكرولتر من TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0، 1 mM EDTA pH 8.0) لمدة 10 دقائق عن طريق الدوران، للغسل الأول عند 4 درجات مئوية، والغسيل الثاني عند 25 درجة مئوية.
  5. إلوتيون
    1. إضافة 200 ميكرولتر من العازلة elution (1٪ SDS و 100 mM NaHCO3) إلى الخرز واحتضان في 65 درجة مئوية في شاكر الحرارية لمدة 15 دقيقة مع اهتزاز مستمر (حوالي 400 دورة في الدقيقة). نقل supernatant إلى أنبوب جديد والخرز elute مرة أخرى في 200 ميكرولتر من العازلة Elution. الجمع بين eluates (400 ميكرولتر الحجم النهائي).
    2. أضف NaCl إلى تركيز نهائي قدره 200 mM في كل عينة. تكملة عينات TIC مع 200 ميكرولتر من العازلة Elution وإضافة NaCl كذلك.
      ملاحظة: من هذه الخطوة، يجب معالجة TIC تحت نفس الشروط مثل العينات الأخرى.
    3. احتضان العينات عند 65 درجة مئوية (دون اهتزاز) لمدة 6 ساعة على الأقل.
    4. أضف 1 مل من الإيثانول البارد بنسبة 100٪ إلى كل عينة، وتناوب الأنابيب مرتين لخلطها، وعجل الحمض النووي بين عشية وضحاها عند −80 درجة مئوية.
    5. في اليوم التالي، الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة في 13،000 × ز في 4 درجة مئوية.
    6. تجاهل supernatant وغسل بيليه مع 70٪ EtOH.
    7. طرد مركزي العينات في 13،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية.
    8. تجاهل supernatant والهواء الجاف الكريات.
    9. Resuspend الكريات في 100 ميكرولتر من TE وإضافة 0.5 ملغم / مل من RNase A إلى كل عينة. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لتنشيط RNase.
  6. عكس الربط المتداخل
    1. إضافة 500 ميكروغرام / مل من البروتين K و 0.5٪ SDS ثم احتضان العينات في 50 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
      ملاحظة: إذا الشروع في ChIP-seq، تجنب استخراج الفينول الكلوروفورم، كما أنه يمنع عملية NGS المصب. وبدلا من ذلك، يوصى باستخدام مجموعة أدوات متاحة تجاريا (انظر جدول المواد).
    2. إضافة 0.5 حجم الفينول و 0.5 حجم مزيج الكحول الكلوروفورم isoamyl (24:1) إلى كل عينة.
    3. دوامة لمدة دقيقة واحدة.
    4. جهاز طرد مركزي عند 13,000 x g لمدة 10 دقائق.
    5. نقل المرحلة المائية العليا إلى أنبوب جديد للطرد المركزي الدقيق.
    6. أضف 1 حجم من مزيج الكحول الكلوروفورم isoamyl (24:1) إلى كل عينة.
    7. دوامة لمدة دقيقة واحدة.
    8. جهاز طرد مركزي عند 13,000 x g لمدة 10 دقائق.
    9. نقل المرحلة المائية العليا إلى أنبوب جديد للطرد المركزي الدقيق.
  7. استخراج الحمض النووي
    1. إضافة 2.5 أحجام من الإيثانول 96٪ وحجم 0.1 من 3 M Na-خلات الأسيتات الأسكتية 5.2.
    2. حضانة لمدة 20 دقيقة على الأقل في −80 درجة مئوية.
    3. طرد مركزي العينات في 13،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية.
    4. إزالة الإيثانول وغسل بيليه مع 400 ميكرولتر من الإيثانول 70٪.
    5. طرد مركزي العينات في 13،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية.
    6. إزالة الإيثانول والهواء الجاف بيليه.
    7. Resuspend بيليه في 50 ميكرولتر من TE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يمكن تحقيق دراسة عمليات الإصلاح التي يسببها DSB الموجهة من الموقع في الخلايا عن طريق العدوى المستقرة أو العابرة. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن العدوى المستقرة تضمن وجود مجموعة خلايا متجانسة ، مما يعطي استجابة خلوية موحدة وبالتالي أكثر موثوقية. في حالة العدوى العابرة ، فإن نسبة صغيرة فقط من سكان الخلية تأخذ وتحافظ على البلازميد ، الذي يدخل التنوع في التجربة. إنشاء أنظمة الخلايا القائمة على ER-I-PpoI أو ER-AsiSI المستندة إلى الإندونوكلياز تتطلب 50٪ من مجموعة خلايا التقاء، والتي يتم تحويلها بشكل أكثر فعالية مع البلازميدات ترميز الإندونوكليز. وبالنسبة للإصابة بالعدوى، يمكن أيضا استخدام الكواشف العابرة المتاحة تجاريا أو الطرق القائمة على العدوى الفيروسية. إذا كان لا بد من تطبيق تقنية التصور المجهرية ومطلوب نقل عابر، يمكن أن يكون سبب DSBs الموجهة من قبل 4-OHT إضافة 24 ساعة بعد العدوى، الذي يربط إلى الإندونوكليات تنصهر ER ويسمح النقل النووي والتعريف DSB. لتحديد أنسب النقاط الزمنية، يمكن إجراء الفحص المجهري القائم على المناعة والكشف عن البقع الغربية ل γH2AX في نقاط زمنية مختلفة بعد العلاج 4-OHT. في ظل الظروف الفسيولوجية ، يمكن الكشف عن بؤر 10-15 γH2AX كحد أقصى لكل خلية ، ويمكن أن يتم تكوين بؤر إصلاح قوية عن طريق الإنتونوكلياس (أو تقنيات أخرى مختلفة لم تتم مناقشتها هنا على سبيل المثال ، الميكرونيرريديشن بالليزر). نموذجي I-PpoI إندونوكليز يؤدي إلى تشكيل إشارات γH2AX مرتفعة حول النيوكليولوس عن طريق حث DSBs في الحمض النووي ريبوسومال (rDNA). إذا تم إصلاح فواصل من قبل NHEJ أو الموارد البشرية، وعدد من بؤر الإصلاح يقلل مع مرور الوقت. لهذا السبب، ينصح بنقاط زمنية تمثيلية عند 0 ساعة و30 دقيقة و1 و2 و4 و8 ساعة بعد علاجات 4-OHT. لتتبع عمليات إصلاح الحمض النووي ، فإن خط الخلية الأكثر استخداما هو U2OS ، حيث تعمل جميع مسارات الإصلاح المعروفة بشكل كامل في هذه الخلايا. عند التحقيق في العديد من البروتينات في نفس الخلايا، يمكن دراسة التوطين المشترك من خلال الجمع بين الأجسام المضادة المقترنة مع الفلوروفورات المختلفة مع أطوال موجية مختلفة للانبعاثات التي أثيرت في أنواع حيوانية مختلفة كما هو موضح في الشكل 1. وهنا، يتم تمثيل تحريض DSBs عبر خط خلية مستقرة لا يمكن التوصل إليها والذي يستند إلى تقييد ER-AsiSI الإندونوكليا تنصهر مع علامة hemagglutinin (HA). Doxycycline يمكن أن تحفز التعبير وعزل HA-ER-AsiSI في السيتوبلازم التي يمكن تعقبها باستخدام الأجسام المضادة ضد HA (الشكل 1. العمود الثالث, الخام الثاني). حضانة ل 4 ح مع 4-OHT, 24 ح بعد إضافة دوكسيسيكلين, يمكن أن تحفز على عدد كبير من DSBs منذ تم نقل الإندونوكليوز إلى النواة (الشكل 1. العمود الثالث, العمود الخام الثالث والثاني, الخام الثالث). يمكن تصور DSBs باستخدام الأجسام المضادة التعرف على γH2AX.

Figure 1
الشكل 1:يستخدم المجهر المناعي للكشف عن γH2AX في الخلايا المستزرعة التي تعبر عن HA-ER-AsiSI. DOX (دوكسيسيكلين) إضافة ينشط التعبير السيتوبلازمي من HA-ER-AsiSI و 4-OHT (4-هيدروكسيتاموكسيفين) (4 ح) يحفز النقل النووي للبروتين الانصهار, مما يؤدي إلى تحريض DSBs في المواقف الجينومية المعروفة. HA (hemagglutinin) تلطيخ (المضادة للها الأجسام المضادة) يمثل بروتين الانصهار HA-ER-AsiSI باللون الأخضر، ويتم التحقق من تحريض فواصل بواسطة تلطيخ γH2AX (المضادة γH2AX) باللون الأحمر. تمثل أشرطة المقياس 20 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يشير التوطين المشترك لبروتينات الإصلاح في موقع الضرر إلى أنها يتم تجنيدها في نفس موقع آفة الحمض النووي ، ولكنها لا تتفاعل بالضرورة مع بعضها البعض. قرار المجهر confocal هو ما يقرب من 300 نانومتر. لتحديد نمط الربط من البروتينات إصلاح محددة في موقع كسر، سوبر الدقة المجهرية (العاصفة) وبدلا من ذلك ينصح 24. ومع ذلك ، تتطلب هذه الطريقة معدات مجهرية باهظة الثمن وباحث خبير. بدلا من ذلك، يمكن فحص نمط الربط من البروتينات إصلاح عن طريق الاختزال المناعي الكروماتين باستخدام DIvA أو U2OS-pEP15 خطوط الخلايا مستقرة، والتي يمكن أن تعبر عن AsiSI وI-PpoI endonucleases بطريقة منظمة، على التوالي17،21. عند إضافة 4-OHT ، يمكن لكلا الإندونوكلياس قطع الحمض النووي بطريقة محددة التسلسل مما يتيح لنا الفرصة لتصميم التمهيديات محددة للجراد لمواقع الاستراحة المتوقعة والمناطق الجينومية المحيطة بها. من خلال تطبيق الأجسام المضادة γH2AX في الجزء المناعي من ChIP ، يمكننا اتباع حركة إصلاح الحمض النووي مؤقتا على ظروف مختلفة (مثل إسكات أو تثبيط بعض عوامل الإصلاح ذات الأهمية ، أي الحمض النووي - PKcs). يتم تمثيل نتيجة تجريبية نموذجية تم الحصول عليها باستخدام ChIP-qPCR في الشكل 2. وهنا، يظهر الإثراء الزمني ل γH2AX كاستجابة لتلف الحمض النووي الناجم عن I-PpoI. في الجزء الأيسر من الصورة، تظهر إشارة γH2AX المكتشفة في الوقت المناسب في موقع الاستراحة بينما في الجزء الأيمن، يتم تمثيل توزيع γH2AX في منطقة جين التحكم التي لم يتم فيها تحريض DSBs.

Figure 2
الشكل 2:الإثراء الزمني ل γH2AX كما يحدده الترسب المناعي الكروماتين استجابة لتلف الحمض النووي الناجم عن I-PpoI. اليسار، γH2AX إشارة في موقع الاستراحة؛ الحق، توزيع γH2AX في منطقة التحكم حيث لم يتم حث DSBs (المضادة γH2AX). وتستمد النتائج الممثلة من تجربة بيولوجية واحدة، وتشير أشرطة الخطأ إلى تباينات النسخ المتماثلة للعينة المقابلة. N = 3. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

على الرغم من أن إصلاح الحمض النووي هو مجال بحثي حديث نسبيا ، إلا أن معرفتنا تتوسع بسرعة بمساعدة طرق كيميائية حيوية ومجههرية مختلفة. الحفاظ على المعلومات الوراثية أمر بالغ الأهمية للخلايا لأن الطفرات التي تحدث في الجينات المشاركة في عمليات الإصلاح هي من بين الأسباب الرئيسية لنشأة الورم وبالتالي توضيح الخطوات الرئيسية لمسارات إصلاح الحمض النووي أمر ضروري.

التقنيات الكيميائية الحيوية (أي، لطخة الغربية، والمناعة، وقياس الطيف الكتلي، الخ) تتطلب عددا كبيرا من الخلايا وعمليات الإصلاح المدروسة تمثل لمحة عن السكان الخلية المطلوبة. أداء تجارب ChIP هو العمل، مزعجة والعديد من الاعتبارات يجب أن تؤخذ في الاعتبار عند تصميم تجربة محددة لدراسة عملية إصلاح DSB. الخطوات التالية هي بعض الأمثلة: (I) يجب أن يتم lysed الخلايا بشكل صحيح; فمن المستحسن جدا لتطبيق أسلوب التحلل خطوتين باستخدام الخلية منفصلة وخلايا تحلل العازلة لضمان إمكانية الوصول إلى أعلى كروماتين كسر (II) لا ينبغي أن يكون أكثر أو أقل من نسبة؛ وينبغي تحسين الظروف المناسبة من سونيكيشن لكل نوع الخلية مسبقا (III) وينبغي تحديد الكمية المناسبة من الأجسام المضادة المنقى منذ الأجسام المضادة ضد البروتين نفسه من شركات مختلفة تظهر خصائص غير متطابقة (IV) لوقاية فعالة، 25-30 ميكروغرام الكروماتين الأولي ينبغي أن تستخدم في كل حالة (V) ينبغي تحسين الوقت المناسب للتثبيت، كما overfixation يمكن أن يؤدي إلى نتائج إيجابية كاذبة عن طريق ربط عبر مجمعات البروتين البعيدة والتبليب يمكن أن تمنع الربط السليم بين الحمض النووي والبروتين المطلوب (السادس) على أساس الأجسام المضادة التطبيقية، ونوع الخرز (البروتين A أو G) ينبغي أن تحدد بعناية (السابع) أثناء خطوات الغسيل، وينبغي الحفاظ على ترتيب مخازن الغسيل بدقة لتجنب الإفراج عن الأجسام المضادة من الخرز (الثامن) أثناء استخراج الحمض النووي، وينبغي القضاء على آثار الفينول بشكل صحيح لتجنب خفض كفاءة ردود الفعل المصب مزيد. وبما أن هذه الطريقة تقلل من إنتاج الحمض النووي المسترد، فإن نصيحتنا الشخصية هي استخدام مجموعة محددة لتنقية الحمض النووي. عندما يتم معالجة جميع النقاط الحرجة بشكل صحيح ، يمكن أن يوفر ChIP بيانات قيمة لإشغال البروتين المطلوب في loci الجينومية المختلفة ويمكن أن يكشف الخطوات الحاسمة في عمليات إصلاح الحمض النووي.

ومع ذلك، فإن ChIP جنبا إلى جنب مع qPCR هو نهج غير مباشر لدراسة توزيع البروتين في مناطق الجينوم المختارة ولا يسمح بالتعرف على موقع ربط الحمض النووي على وجه التحديد أو فحص وظيفة البروتين مباشرة. يمكن للأجسام المضادة أحادية أو متعددة النسيلة المستخدمة لالتقاط مجمعات البروتين والحمض النووي أيضا التفاعل مع البروتينات الأخرى مما يؤدي إلى بيانات إيجابية كاذبة ، وبالتالي ، يجب أن تكون الأجسام المضادة المستخدمة في هذه التقنية من درجة ChIP ومحددة للغاية ضد البروتين المثير للاهتمام. ومع ذلك ، ChIP هو تقنية تستخدم على نطاق واسع ، وتم تطوير المزيد من النهج على أساس هذا ، مثل ChIP-on-chip و ChIP-seq. الأول يعتمد على تهجين شظايا الحمض النووي المنقية والمنقية المناعية على microarray مع مجموعة كبيرة ومتنوعة من تسلسل الحمض النووي العشوائي الصغير الذي يزيد من تضخيم التسلسلات الصلبة التي توفر معلومات قيمة حول مواقع ربط البروتين. ومع ذلك، برز ChIP-seq كنهج بديل جذاب لأنه يوفر رسم خرائط على نطاق الجينوم لمجمعات البروتين والحمض النووي بدقة أعلى من تسلسل الجينوم عالي الإنتاجية على رقاقة ChIP.on-chip. ChIP-seq أحدثت ثورة في مجال إصلاح الحمض النووي من خلال الكشف عن مواقع ربط الحمض النووي من مختلف عوامل النسخ توفير رؤى في تنظيم الجينات وكشف المناظر الطبيعية الكروماتين في نطاق الجينوم على نطاقواسع 25. ووفقا لهذا، فإن مجال إصلاح الحمض النووي قد استفاد بشكل كبير من ChIP-seq لأن هذه البيانات تلعب دورا حاسما في مختلف الأمراض والمسارات البيولوجية، مثل تطور السرطان. ومع ذلك ، تم تطوير تعديلات مختلفة لطريقة ChIP مثل HaloChIP ، والتي لا تتطلب وجود أجسام مضادة محددة ضد البروتين المثير للاهتمام ولكنها تستخدم تسلسلا ترميز البروتينات الملزمة للحمض النووي المنصهرة مع HaloTag ، والتي يتم تحويلها إلى خلايا وبعد ذلك إلى الربط المتبادل ، يمكن التقاط مجمعات البروتين والحمض النووي المطلوبة باستخدام HaloLink Resin. ومع ذلك، تعتمد هذه التقنية على التعبير المفرط وليس المستوى الداخلي للبروتينات المطلوبة التي يمكن أن تؤدي إلى سوء تفسير البيانات26.

وعلاوة على ذلك، توفر التقنيات المجهرية معلومات قيمة حول التتبع الصدغي غير المتزامن لإصلاح تلف الحمض النووي، حتى على مستوى الخلية الواحدة. وقد أدى التحسن السريع للأجسام المضادة التي أثيرت ضد بروتينات إصلاح محددة إلى فهم أعمق لآلية المسارات الفرعية NER و DSBR ، فضلا عن تنظيمها بعد الترجمة. وقد أحدثت ثورة في هذا المجال المجهري من خلال تقنيات عالية الدقة، مثل المجهر فائق الدقة، والذي يسمح بتصور العمليات الخلوية الناجمة عن تلف الحمض النووي على المستوى النووي، فضلا عن ضمان رسم خرائط دقيقة لتوطين البروتين المشترك24. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن التباين في أنساب الخلايا يجب أن يؤخذ في الاعتبار أثناء التجربة حيث يمكن أن يتباعد معدل الإصلاح ، مما قد يجعل من الصعب تفسير النتائج. وبالنظر إلى التطور السريع لمنهجية التصوير الفلوري والتصميم المتعمد للإعداد التجريبي ، فإن فرصة ثمينة للتحقيق في الاستجابات الخلوية والجزيئية الناجمة عن تلف الحمض النووي بدقة بروتين واحدة على مستوى خلية واحدة في طريقها إلى الكمال.

في الختام، يمكن أن يؤدي الجمع بين الفحص المجهري فائق الدقة ومنهجية تسلسل الخلية الواحدة إلى تحسين فهمنا لحقل إصلاح الحمض النووي بشكل كبير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

اي

Acknowledgments

تم تمويل هذا البحث من قبل منحة المكتب الوطني للبحوث والتطوير والابتكار GINOP-2.3.2-15-2016-00020، GINOP-2.3.2-15-2016-00036، GINOP-2.2.1-15-2017-00052، EFOP 3.6.3-VEKOP-16-2017-00009، NKFI-FK 132080، منحة أبحاث يانوس بولياي التابعة للأكاديمية المجرية للعلوم BO/27/20، ÚNKP-20-5-SZTE-265، زمالة إمبو قصيرة الأجل 8513، ومؤسسة تيمبوس.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-OHT Sigma Aldrich H7904
Agarose Lonza 50004
Antibiotic-Antimycotic Solution (100×), Stabilized Sigma Aldrich A5955
Anti-gamma H2A.X (phospho S139) antibody Abcam ab26350
Bovine Serum Fraction V albumin Biosera PM-T1725
TrackIt™ Cyan/Yellow Loading Buffer Thermo Fisher Scientific 10482035
DMEM with 1.0 g/L Glucose, without L-Glutamine Lonza 12-707F
Doxycycline Sigma Aldrich D9891
Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Mouse IgG Invitrogen 11202D
Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Rabbit IgG Invitrogen 11204D
EDTA Sigma Aldrich E6758
EGTA Sigma Aldrich E3889
Ethanol Molar Chemicals 02910-101-340
Fetal Bovine Serum (South America Origin), EU-approved Gibco ECS0180L
Formaldehyde 37% solution free from acid Sigma Aldrich 1.03999
GlutaMAX™ Supplement Thermo Fisher Scientific 35050038
Glycine Sigma Aldrich 50046
IPure kit v2 Diagenode C03010015
Isoamyl alcohol Sigma Aldrich W205702
LiCl Sigma Aldrich L9650
NaCl Sigma Aldrich S5886
Na-DOC Sigma Aldrich D6750
NaHCO3 Sigma Aldrich S5761
Neocarzinostatin from Streptomyces carzinostaticus Sigma Aldrich N9162
NP-40 Sigma Aldrich I8896
PBS Powder without Ca2+, Mg2+ Sigma Aldrich L182-50-BC
Phenol Sigma Aldrich P4557
PIPES Sigma Aldrich P1851
Polysorbate 20 (Tween 20) Molar Chemicals 09400-203-190
KCl Sigma Aldrich P5405
ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI Thermo Fisher Scientific P36935
Protease Inhibitor Cocktail Set I Roche 11873580001
Proteinase K Sigma Aldrich P2308
P-S2056 DNAPKcs antibody Abcam ab18192
RNase A Roche 10109169001
CH3COONa Sigma Aldrich S2889
SDS Sigma Aldrich L3771
Tris Acetate-EDTA buffer Sigma Aldrich T6025
Tris-HCl Sigma Aldrich 91228
TRITON X-100 Molar Chemicals 09370-006-340
Trypsin from porcine pancreas Sigma Aldrich T4799
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red Gibco 15400054

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Ubiquitylation-Mediated Fine-Tuning of DNA Double-Strand Break Repair. Cancers (Basel). 12 (6), (2020).
  2. Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Emerging Roles of Post-Translational Modifications in Nucleotide Excision Repair. Cells. 9 (6), (2020).
  3. Stephens, P. J., et al. The landscape of cancer genes and mutational processes in breast cancer. Nature. 486 (7403), 400-404 (2012).
  4. Turnbull, C., et al. Gene-gene interactions in breast cancer susceptibility. Human Molecular Genetics. 21 (4), 958-962 (2012).
  5. Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. 8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18877-18882 (2008).
  6. Jiricny, J. The multifaceted mismatch-repair system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (5), 335-346 (2006).
  7. Hanawalt, P. C., Spivak, G. Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (12), 958-970 (2008).
  8. Kanaar, R., Wyman, C., Rothstein, R. Quality control of DNA break metabolism: in the 'end', it's a good thing. EMBO Journal. 27 (4), 581-588 (2008).
  9. Lemaitre, C., et al. Nuclear position dictates DNA repair pathway choice. Genes & Development. 28 (22), 2450-2463 (2014).
  10. Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annual Review of Biochemistry. 79, 181-211 (2010).
  11. Lambert, S., Lopez, B. S. Characterization of mammalian RAD51 double strand break repair using non-lethal dominant-negative forms. EMBO Journal. 19 (12), 3090-3099 (2000).
  12. Xu, S., et al. p300-mediated acetylation of histone demethylase JMJD1A prevents its degradation by ubiquitin ligase STUB1 and enhances its activity in prostate cancer. Cancer Research. , (2020).
  13. Kastan, M. B., Bartek, J. Cell-cycle checkpoints and cancer. Nature. 432 (7015), 316-323 (2004).
  14. Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nature Reviews Cancer. 12 (1), 68-78 (2011).
  15. Krenning, L., vanden Berg, J., Medema, R. H. Life or Death after a Break: What Determines the Choice. Molecular Cell. 76 (2), 346-358 (2019).
  16. Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. Journal of Biological Chemistry. 273 (10), 5858-5868 (1998).
  17. Caron, P., et al. WWP2 ubiquitylates RNA polymerase II for DNA-PK-dependent transcription arrest and repair at DNA breaks. Genes & Development. 33 (11-12), 684-704 (2019).
  18. Caron, P., et al. Cohesin protects genes against gammaH2AX Induced by DNA double-strand breaks. PLoS Genetics. 8 (1), 1002460 (2012).
  19. Berkovich, E., Monnat, R. J., Kastan, M. B. Assessment of protein dynamics and DNA repair following generation of DNA double-strand breaks at defined genomic sites. Nature Protocols. 3 (5), 915-922 (2008).
  20. Paques, F., Duchateau, P. Meganucleases and DNA double-strand break-induced recombination: perspectives for gene therapy. Current Gene Therapy. 7 (1), 49-66 (2007).
  21. Pankotai, T., Bonhomme, C., Chen, D., Soutoglou, E. DNAPKcs-dependent arrest of RNA polymerase II transcription in the presence of DNA breaks. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (3), 276-282 (2012).
  22. Iacovoni, J. S., et al. High-resolution profiling of gammaH2AX around DNA double strand breaks in the mammalian genome. EMBO Journal. 29 (8), 1446-1457 (2010).
  23. Poinsignon, C., et al. Phosphorylation of Artemis following irradiation-induced DNA damage. European Journal of Immunology. 34 (11), 3146-3155 (2004).
  24. Varga, D., Majoros, H., Ujfaludi, Z., Erdelyi, M., Pankotai, T. Quantification of DNA damage induced repair focus formation via super-resolution dSTORM localization microscopy. Nanoscale. 11 (30), 14226-14236 (2019).
  25. Kim, J. A., Kruhlak, M., Dotiwala, F., Nussenzweig, A., Haber, J. E. Heterochromatin is refractory to gamma-H2AX modification in yeast and mammals. Journal of Cell Biology. 178 (2), 209-218 (2007).
  26. Daniels, D. L., Urh, M. Isolation of intracellular protein--DNA complexes using HaloCHIP, an antibody-free alternative to chromatin immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 977, 111-124 (2013).

Tags

علم الأحياء، العدد 174، إصلاح الحمض النووي، التكبر المناعي للكروماتين، المجهر الفلوري، DSBs الخاص بالموقع، التصبغ المناعي
تصور وقياس الأضرار التي لحقت بالحمض النووي الخاصة بالموقع القائم على الإندونوكليز
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pantazi, V., Berzsenyi, I., Borsos,… More

Pantazi, V., Berzsenyi, I., Borsos, B. N., Pankotai, T. Visualizing and Quantifying Endonuclease-Based Site-Specific DNA Damage. J. Vis. Exp. (174), e62175, doi:10.3791/62175 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter