Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Visualisera och kvantifiera endonukleasbaserade platsspecifika DNA-skador

Published: August 21, 2021 doi: 10.3791/62175
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Institute of Pathology, Faculty of Medicine, University of Szeged
* These authors contributed equally

Summary

Denna artikel introducerar väsentliga steg av immunostaining och kromatin immunoprecipitation. Dessa protokoll används ofta för att studera DNA-skaderelaterade cellulära processer och för att visualisera och kvantifiera rekryteringen av proteiner som är inblandade i DNA-reparation.

Abstract

Celler utsätts kontinuerligt för olika DNA-skadliga medel, vilket inducera olika cellulära svar. Att tillämpa biokemiska och genetiska metoder är avgörande för att avslöja cellulära händelser i samband med rekrytering och montering av DNA-reparationskomplex på platsen för DNA-skador. Under de senaste åren har flera kraftfulla verktyg utvecklats för att inducera platsspecifika DNA-skador. Dessutom tillåter nya seminaltekniker oss att studera dessa processer på encellsupplösningsnivå med hjälp av både fasta och levande celler. Även om dessa tekniker har använts för att studera olika biologiska processer, presenterar vi häri de mest använda protokollen inom DNA-reparation, Fluorescens Immunostaining (IF) och Chromatin Immunoprecipitation (ChIP), som i kombination med endonukleasbaserad platsspecifik DNA-skada gör det möjligt att visualisera och kvantifiera den genomiska beläggningen av DNA-reparationsfaktorer på ett riktat och reglerat sätt, respektive. Dessa tekniker ger kraftfulla verktyg för forskarna att identifiera nya proteiner som är bundna till den skadade genomiska locus samt deras post-translationella modifieringar som är nödvändiga för deras finjusterade reglering under DNA-reparation.

Introduction

Vårt genom utmanas ständigt av olika DNA-skadliga medel. Dessa angrepp kan härröra från miljökällor, såsom UV-ljus eller bestrålning, liksom från endogena källor, såsom metaboliska biprodukter orsakade av oxidativ stress eller replikeringsfel1,2. Dessa skador kan påverka integriteten hos antingen en eller båda DNA-strängarna, och om de genererade felen blir ihållande leder det ofta till flyttningar och genominstabilitet, vilket kan resultera i tumorigenesis3,4. För att upprätthålla genomintegriteten har flera reparationssystem utvecklats under evolutionen. Enligt de kemiska och fysiska egenskaperna hos specifika typer av DNA-skador kan flera reparationsmekanismer aktiveras. Missmatchningar, abasiska platser, ensträngsbrytningar och 8-oxoguanin (8-oxoG) kan tas bort antingen genom reparation av felmatchning eller reparationsväg5,6. Lesioner orsakade av UV-inducerade fotoprodukter och skrymmande adducts kan repareras antingen genom nukleotid-excision reparation (NER) eller DNA dubbelsträngsbrott reparation (DSBR) process7,8. NER består av två huvudsakliga undervägar: transkriptionskoppling NER (TC-NER) och global genomisk NER (GG-NER). När det gäller cellcykelfasen, efter DNA dubbelsträngad induktion, kan två undervägar aktiveras: icke-homolog end joining (NHEJ) och homolog rekombination (HR)1,9. NHEJ, som är den dominerande vägen i vilande celler, kan aktiveras i alla cellcykelfaser, vilket representerar en snabbare men felbenägen väg10. Å andra sidan är HR en felfri väg, där DSB repareras baserat på sekvens-homologisökning av systerkromatiderna, därför är den huvudsakligen närvarande i S- och G2-cellcykelfaser11. Dessutom är mikrohomologimedierad slutfogning (MMEJ) en annan DSB-reparationsmekanism, skild från de ovan nämnda, baserad på ett KU70/80- och RAD51-oberoende sätt att omdi ligatera tidigare resected mikrohomologous sekvenser flankerar de trasiga DNA-ändarna. Därför anses MMEJ vara felbenäget och mycket mutagena12. Under DNA-reparation kan DSB inducera DNA-skaderespons (DDR), vilket resulterar i aktivering av kontrollpunktskinaser som stoppar cellcykeln under reparation13,14,15. DDR aktiveras som ett svar på rekryteringen och omfattande spridning av initiativtagare nyckelspelare i reparationsprocessen runt skadorna, vilket bidrar till bildandet av ett reparationsfokus. I denna tidiga signal kaskad spelar ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated) kinas en central roll genom att katalysera fosforylering av histonvarianten H2AX vid Ser139 (kallad γH2AX) runt lesion16. Denna tidiga händelse är ansvarig för rekryteringen av ytterligare reparationsfaktorer och inledandet av reparationsprocesser nedströms. Även om den exakta funktionen hos de rekryterade proteinerna vid reparationsfokus ännu inte har karakteriserats fullt ut, har bildandet och dynamiken i reparationsfoci undersökts av flera laboratorier. Dessa markörer används i stor utsträckning för att följa reparationskinetiken, men deras exakta roll under reparationsprocessen är fortfarande svårfångad. På grund av den stora betydelsen men ändå dålig förståelse för DNA-reparationsrelaterade cellulära processer har flera metoder utvecklats hittills för att inducera och visualisera DDR.

Olika metoder och system har fastställts för att inducera önskad typ av DNA-skador. Till exempel vissa medel [såsom neocarzinostatin (NCS), phleomycin, bleomycin, γ-bestrålning, UV] kan inducera ett stort antal slumpmässiga DNA-brott vid icke-prediktiva genomiska positioner, medan andra (endonukleaser, såsom AsiSI, I-PpoI eller I-SceI, liksom laserborttagning) kan inducera DNA-brott vid känd genomisk lokus17,18,19,20,21. Här fokuserar vi på de endonukleasebaserade tekniker som för närvarande används för att studera DDR i däggdjurs- och jästceller. Förutom att lyfta fram principerna för dessa tekniker betonar vi både deras fördelar och nackdelar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Immundetection av specifika proteiner

  1. Förberedelse av cellkultur och experimentell installation
    1. Underhåll U2OS-celler i monolager i DMEM odling medium kompletterat med 10% fetala kalv serum, 2 mM glutamin och 1% antibiotiska-antimycotic lösning.
      OBS: För endonukleasbaserad DNA-skada induktion, använd kolbehandlat eller steroidfritt medium för att undvika systemläckage.
    2. Odla celler i en fuktad 5% CO2-miljö vid 37 °C tills 80% sammanflöde, förnya medium var 2-3: e dag.
    3. Aspirera mediet och tvätta cellerna med 1x PBS. Lösgör celler med Trypsin-EDTA-lösning. När cellerna lossar stoppar du trypsinaktiviteten genom att lägga till odlingsmedium i cellerna, vilket ger en cellfjädring.
    4. Räkna cellerna med hjälp av en cellräkningskammare. Platta 2 x 104 celler/ml/brunn på en 24-brunnsplatta, med sterila 12 mm runda täcken i varje brunn.
    5. Inkubera celler i 24 timmar vid 37 °C i en fuktad 5% CO2-atmosfär för att möjliggöra fastsättning på täckglasen.
    6. Behandla cellerna med 10 ng/ml neocarzinostatin (NCS) genom att direkt leda det skadliga medlet till det odlade mediet. Inkubera cellerna med det NCS-innehållande mediet i 15 min, tvätta dem sedan med 1x PBS och tillsätt färskt, kompletterat odlingsmedium till cellerna. I annat fall, använd lämpligt medel (dvs. 4-OHT) för att inducera DSB via endonukleasbaserade system utan att uppdateramediet 22.
      OBS: Alternativt kan du använda bestrålning för att inducera DNA-skador, från 30 min upp till 8 h återhämtningstid genom att använda neutronflöde mellan 2-20 Gy23.
    7. Inkubera celler i 1-8 timmar vid 37 °C i en fuktad 5% CO2-atmosfär för att följa kinetiken för DNA-reparation.
  2. Fixering av celler
    OBS: 300-500 μL lösningar/brunn bör användas i följande steg (steg 1.2-1.5) för att täcka alla celler på ett tillfredsställande sätt. Varje inkubations- och tvättsteg (utom antikroppsinkubationen) bör utföras på en orbital shaker med mild omrörning.
    1. Efter DSB-induktion och inkubation av celler, ta bort mediet från de bifogade cellerna och tvätta cellerna en gång med 1x PBS.
    2. Fixera celler med 4% formaldehyd-PBS-lösning i 20 min vid 25 °C.
  3. Permeabilisering av celler
    1. Ta bort fixeringslösningen och tvätta cellerna tre gånger med 1x PBS i 5 minuter vardera.
    2. Ta bort PBS och tillsätt 0,2% Triton X-100 upplöst i PBS. Inkubera proverna i 20 minuter.
  4. Blockering av icke-specifika bindningsplatser
    1. Tvätta cellerna tre gånger med 1x PBS.
    2. Blockera icke-specifika bindningsställen med 5% BSA (Bovine Serum Fraction V albumin) utspädd i PBST (1x PBS kompletterad med 0,1% interpolering-20) och inkubera de permeabiliserade proverna i minst 20 min.
  5. Immunofluorescens färgning
    1. Tillsätt rätt mängd primär antikropp (dvs. anti-γH2AX, anti-DNA-PKcs) utspädd i 1% BSA-PBST-lösning. Placera varje täckglas upp och ner på en paraffinfilm över en 10 μL droppe av den utspädda anti-γH2AX-antikroppen.
      OBS: Vid samimmunsering späd ut båda antikropparna på lämpligt sätt i samma 1% BSA-PBST-lösning.
    2. Inkubera proverna i en fuktighetskammare i 1,5 timmar vid 4 °C.
      OBS: Inkubation kan också utföras vid 4 °C över natten.
    3. Placera täckglasen tillbaka som sida upp i 24-brunnsplattan och tvätta tre gånger i 5 min med 1x PBS.
    4. Tillsätt rätt mängd sekundär antikropp utspädd i 1% BSA-PBST. Placera varje täckglas upp och ner på en paraffinfilm över en droppe på 10 μL av den utspädda antikroppen.
    5. Inkubera proverna i en fuktighetskammare vid 4 °C i 1 timme.
    6. Placera täckglasen tillbaka som sida upp i 24-brunnsplattan och tvätta tre gånger i 5 min med 1x PBS.
    7. Innan du tar bort den sista PBS-tvättlösningen, ta försiktigt ut täckena med en pincett och nål och placera dem sedan upp och ner på glasrutschbanor med droppar av monteringsmedium (kompletterat med DAPI).
      OBS: Undvik att bilda luftbubblor. När monteringsmediet torkar rekommenderas att man förseglar kanterna på täckena med nagellack för att förhindra skrumpning av proverna.

2. Kromatinimmunprecipitation

  1. Cellsamling, korslänkning, cell- och nukleär lys och DNA-fragmentering
    1. Odling ca 5 x 106 celler/ml i en 150 mm skål för varje prov.
    2. Ta bort odlingsmediet och tvätta cellerna två gånger med iskall 1x PBS.
    3. Fixera cellerna med 1% formaldehyd-PBS-lösning, placera plattorna på en orbital shaker och omrör försiktigt i 20 min.
      OBS: Formaldehyd är flyktig; alltid förbereda en fräsch arbetslösning. I vissa fall innehåller formaldehydlösningen metanol för att stabilisera den, men det är bättre att använda en metanolfri lösning för att undvika störningar i nedströmsreaktioner.
    4. Stoppa fixeringen med 125 mM glycin och inkubera på en orbital shaker med mild omrörning i 5 min vid 25 °C.
    5. Placera plattorna på is och tvätta två gånger med iskall 1x PBS.
    6. Skrapa cellerna i iskallt 1x PBS och överför dem till 15 ml koniska rör.
    7. Centrifugera cellerna vid 2 500 x g i 5 min vid 4 °C.
    8. Aspirera försiktigt supernatanten och återanvänd pelleten i 2 ml celllysbuffert [5 mM PIPES pH 8,0, 85 mM KCl, 0,5% NP-40, 1x PIC (proteashämmarcocktail)] och inkubera på is i 10 min.
    9. Centrifugera cellupphängningen vid 2 500 x g i 5 min vid 4 °C.
    10. Kassera försiktigt supernatanten och återanvänd pelleten i 500-1 500 μL kärnlysbuffert (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM EDTA pH 8,0, 0,8% SDS, 1x PIC) och inkubera på is i 30-60 min. Överför lysatet till ett polystyrenkoniskt rör som lämpar sig för ultraljudsbehandling.
      OBS: Eftersom kärnlysbufferten innehåller SDS kommer den att fällas ut på is och lösningen blir vit. Lösningen bör bli transparent efter ultraljudsbehandling.
    11. Sonicate lysatet att savda DNA till en genomsnittlig fragmentstorlek på 300-1,000 bp.
      OBS: Lämpliga ultraljudsbehandling cykler och villkor bör ställas in enligt celltyp och ultraljudsbehandling utrustning. Fragment som är mindre än 200 bp är inte lämpliga för ChIP, eftersom nukleosom-DNA-interaktionerna kan störas.
  2. Återföring av korslänkning, bestämning av soniska fragmentstorlekar
    1. Ta ut 100 μL av det sonikerade provet för att verifiera fragmentstorleken på det soniserade kromatinet. Resterande kromatin ska förvaras vid −80 °C.
    2. Tillsätt 0,5 mg/ml RNase A till varje 100 μL av provet och inkubera dem vid 37 °C i 20 minuter för att aktivera RNase.
    3. Inkubera proverna vid 65 °C över natten.
    4. Nästa dag tillsätt 500 μg/ml Proteinase K och 0,5% SDS och inkubera proverna vid 50 °C i 3 timmar.
    5. Tillsätt 0,5 volym fenol och 0,5 volym kloroform-isoamylalkoholblandning (24:1) till varje prov.
    6. Virvel i 1 minut.
    7. Centrifugera vid 13 000 x g i 10 min.
    8. Överför den övre vattenfasen till ett nytt mikrocentrifugrör.
    9. Tillsätt 1 volym kloroform-isoamylalkoholblandning (24:1) till varje prov.
    10. Virvel i 1 minut.
    11. Centrifugera vid 13 000 x g i 10 min.
    12. Överför den övre vattenfasen till ett nytt mikrocentrifugrör.
    13. Tillsätt 2,5 volymer 96% etanol och 0,1 volym på 3 M Na-Acetate pH 5,2.
    14. Inkubera i minst 20 minuter vid −80 °C.
    15. Centrifugera proverna vid 13 000 x g i 10 min vid 4 °C.
    16. Ta bort etanolen och tvätta pelleten med 400 μL 70% etanol.
    17. Centrifugera proverna vid 13 000 x g i 10 min vid 4 °C.
    18. Ta bort etanolen och lufttorka pelleten.
    19. Återanvänd pelleten i 10 μL TE.
    20. Kör proverna på en 0,8% agarose gel. Den sonikerade kromatinstorleken bör vara cirka 500 bp.
      OBS: Använd bromophenol blåfri lastbuffert eftersom storleken på detta färgämne är cirka 500 bp, vilket kan störa korrekt detektion av kromatinfragment. Istället rekommenderas att använda lastbuffert kompletterad med xylencyanol, vilket är cirka 3 000 bp.
    21. Om kromatinstorleken är godtagbar, späd ut de frysta kromatinproverna från steg 2.1. i 3 volymer utspädningsbuffert (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,5 mM EGTA pH 8,0, 1% Triton X-100, 140 mM NaCl, 1x PIC) och blanda proverna via rotation i 10 min vid 4 °C.
      OBS: Detta steg är nödvändigt för att späda ut sds som finns i kärnlysbufferten för att undvika interferens med nedströmsreaktioner, inklusive mätning av kromatinkoncentration.
    22. Mät DNA-koncentrationen av kromatinproverna vid 260/280 nm med hjälp av en spektrofotometer.
  3. Beredning av pärlor, pre-clearing och immunprecipitation
    1. Förbered pärlor (får antikanin eller mus IgG) för för-clearing och immunoprecipitation steg. Tvätta pärlor två gånger i 10 min vid 4 °C med RIPA-buffert (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA pH 8,0, 1% Triton X-100, 0,1% Na-DOC, 0,1% SDS, 150 mM NaCl och 1X PIC).
    2. Återanvänd pärlorna i samma volym RIPA-buffert som i steg 2.3.1.
    3. Förklarera 25-30 μg kromatin i varje prov med 4 μL av pärlorna via rotation i 1-2 h vid 4 °C.
      OBS: Tillsätt RIPA-buffert till varje kromatinprov upp till 500 μL slutlig volym för att låta proverna blandas ordentligt under rotation. Glöm inte att ta ut kromatin för NAC (No Antibody Control) och TIC (Total Input Control) för varje provuppsättning. TIC kräver endast en slutlig volym på upp till 200 μL.
    4. Fäll ut pärlorna med en magnet och överför supernaten till ett nytt mikrocentrifugrör.
    5. Tillsätt lämplig mängd antikroppar till varje kromatinprov (utom NAC och TIC) och rotera över natten vid 4 °C.
    6. Tillsätt nästa dag 40 μL tvättade pärlor till varje prov (utom TIC) och inkubera dem över natten och rotera vid 4 °C.
  4. Tvätt
    1. Tvätta en gång med 300 μL låg saltbuffert (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8,0, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 1x PIC) i 10 min via rotation vid 4 °C.
    2. Tvätta en gång med 300 μL hög saltbuffert (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 300 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8,0, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 1x PIC) i 10 min via rotation vid 4 °C.
    3. Tvätta en gång med 300 μL LiCl-buffert (250 mM LiCl, 1% NP-40, 1% Na-DOC, 1 mM EDTA pH 8,0, 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1x PIC) i 10 min via rotation vid 4 °C.
    4. Tvätta två gånger med 300 μL TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA pH 8.0) i 10 min via rotation, för den första tvätten vid 4 °C och den andra tvätten vid 25 °C.
  5. Elution (eluering)
    1. Tillsätt 200 μL elueringsbuffert (1% SDS och 100 mM NaHCO3)till pärlorna och inkubera vid 65 °C i en termoskakapparat i 15 minuter med kontinuerlig skakning (ca 400 RPM). Överför supernaten till ett nytt rör och eluera pärlor igen i 200 μL elueringsbuffert. Kombinera eluater (400 μL slutlig volym).
    2. Tillsätt NaCl till en slutlig koncentration på 200 mM i varje prov. Komplettera TIC-proverna med 200 μL elueringsbuffert och tillsätt även NaCl.
      OBS: Från detta steg bör TIC hanteras under samma förhållanden som de andra proverna.
    3. Inkubera proverna vid 65 °C (utan skakningar) i minst 6 timmar.
    4. Tillsätt 1 ml kall 100% etanol till varje prov, rotera rören två gånger för att blanda och fäll ut DNA över natten vid −80 °C.
    5. Nästa dag, centrifug i 30 min vid 13 000 x g vid 4 °C.
    6. Kassera supernatanten och tvätta pelleten med 70% EtOH.
    7. Centrifugera proverna vid 13 000 x g i 10 min vid 4 °C.
    8. Kassera supernaten och lufttorka pelletsen.
    9. Återanvänd pelletsen i 100 μL TE och tillsätt 0,5 mg/ml RNase A till varje prov. Inkubera vid 37 °C i 20 minuter för att aktivera RNase.
  6. Återföring av korslänkning
    1. Tillsätt 500 μg/ml Proteinas K och 0,5 % SDS och inkubera sedan proverna vid 50 °C i 2 timmar.
      OBS: Om du fortsätter till ChIP-seq, undvik fenolkloridextraktion, eftersom det hämmar NGS-processen nedströms. I stället rekommenderas att använda ett kommersiellt tillgängligt kit (se Materialförteckning ).
    2. Tillsätt 0,5 volym fenol och 0,5 volym kloroform-isoamylalkoholblandning (24:1) till varje prov.
    3. Virvel i 1 minut.
    4. Centrifugera vid 13 000 x g i 10 min.
    5. Överför den övre vattenfasen till ett nytt mikrocentrifugrör.
    6. Tillsätt 1 volym kloroform-isoamylalkoholblandning (24:1) till varje prov.
    7. Virvel i 1 minut.
    8. Centrifugera vid 13 000 x g i 10 min.
    9. Överför den övre vattenfasen till ett nytt mikrocentrifugrör.
  7. DNA-extraktion
    1. Tillsätt 2,5 volymer 96% etanol och 0,1 volym på 3 M Na-Acetate pH 5,2.
    2. Inkubera i minst 20 minuter vid −80 °C.
    3. Centrifugera proverna vid 13 000 x g i 10 min vid 4 °C.
    4. Ta bort etanolen och tvätta pelleten med 400 μL 70% etanol.
    5. Centrifugera proverna vid 13 000 x g i 10 min vid 4 °C.
    6. Ta bort etanolen och lufttorka pelleten.
    7. Återanvänd pelleten i 50 μL TE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Att studera platsstyrda DSB-inducerade reparationsprocesser i celler kan uppnås genom antingen stabil eller övergående transfektion. Det bör dock noteras att stabil transfection säkerställer en homogen cellpopulation, vilket ger en enhetlig och därmed mer tillförlitlig cellulär respons. Vid övergående transfection tar endast en liten del av cellpopulationen upp och upprätthåller plasmiden, som introducerar mångfald i experimentet. Upprättandet av ER-I-PpoI- eller ER-AsiSI-endonukleasbaserade cellsystem kräver en 50% sammanflödescellpopulation, som mer effektivt transfekteras med plasmider som kodar endonukleasen. För transfection kan kommersiellt tillgängliga transfection reagenser eller virusinfektionsbaserade metoder också användas. Om en mikroskopisk visualiseringsteknik ska tillämpas och tillfällig transfektion krävs, kan de riktade DSB: erna induceras genom 4-OHT-tillägg 24 h efter transfection, som binder till ER-smälta endonukleaser och möjliggör nukleär flyttning och DSB-induktion. För att bestämma de lämpligaste tidpunkterna kan immunofluorescensbaserad mikroskopi och western blot-detektion av γH2AX vid olika tidpunkter efter 4-OHT-behandling utföras. Under fysiologiska förhållanden kan maximalt 10-15 γH2AX foci per cell detekteras, och bildandet av starka reparationsfoci kan utlösas av endonukleaser (eller olika andra tekniker som inte diskuteras här, t.ex. lasermikroirradiation). En typisk I-PpoI endonuclease leder till bildandet av förhöjda γH2AX signaler runt kärnan genom att inducera DSB vid ribosomal DNA (rDNA). Om brotten repareras av NHEJ eller HR minskar antalet reparationsfoci med tiden. Av denna anledning rekommenderas representativa tidpunkter vid 0 h, 30 min, 1, 2, 4 och 8 h efter 4-OHT behandlingar. För att spåra DNA-reparationsprocesser är den vanligaste cellinjen U2OS, eftersom alla kända reparationsvägar är fullt funktionella i dessa celler. Vid undersökning av flera proteiner i samma celler kan samlokalisering studeras genom att kombinera antikroppar konjugerade med olika fluorforer med olika utsläppsvåglängder uppvuxna i olika djurarter som visas i figur 1. Däri representeras induktion av DSB via en inducerbar stabil cellinje som baseras på ER-AsiSI-begränsningen endonukleas som smälts samman med hemagglutinin tag (HA). Doxycyklin kan framkalla uttryck och beslagtagande av HA-ER-AsiSI i cytoplasman som kan spåras med hjälp av en antikropp mot HA (figur 1. tredje kolumnen, andra rå). Inkubation i 4 timmar med 4-OHT, 24 timmar efter doxycyklintillsats, kan inducera ett stort antal DSB eftersom endonukleasen har överförts till kärnan (figur 1. tredje kolumnen, tredje råa och andra kolumnen, tredje rå). DSB kan visualiseras med hjälp av en antikropp som känner igen γH2AX.

Figure 1
Figur 1: Immunofluorescensmikroskopi används för att detektera γH2AX i odlade celler som uttrycker HA-ER-AsiSI. DOX (doxycyklin) tillägg aktiverar det cytoplasma uttrycket av HA-ER-AsiSI och 4-OHT (4-hydroxytamoxifen) (4 h) inducerar nukleära flyttning av fusion proteinet, vilket leder till induktion av DSB vid kända genomiska positioner. HA (hemagglutinin) färgning (anti-HA antikroppar) representerar HA-ER-AsiSI fusion protein i grönt, och induktion av pauser verifieras genom γH2AX färgning (anti-γH2AX antikroppar) i rött. Skalstänger representerar 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Samlokalisering av reparationsproteiner på skadeplatsen indikerar att de rekryteras till samma DNA-lesionsplats, men de interagerar inte nödvändigtvis med varandra. Upplösningen av den konfokala mikroskopin är ca 300 nm; för att bestämma bindningsmönstret för specifika reparationsproteiner på rastplatsen rekommenderas istället superupplösningsmikroskopi (STORM) 24. Denna metod kräver dock dyr mikroskopisk utrustning och en expertforskare. Alternativt kan bindningsmönstret för reparationsproteinerna undersökas genom kromatinimmunprecipitation med hjälp av DIvA- eller U2OS-pEP15-stabila cellinjer, som kan uttrycka AsiSI- och I-PpoI-endonukleaser på ett reglerat sätt,respektive 17,21. Vid 4-OHT-tillägg kan båda endonukleaserna skära DNA på ett sekvensspecifikt sätt som ger oss möjlighet att designa johannesbrödsspecifika primers till de förväntade brytplatserna och deras omgivande genomiska regioner. Genom att applicera γH2AX-antikroppar i immunprecipitationsdelen av ChIP kan vi tidsmässigt följa DNA-reparationskinetiken på olika villkor (såsom tystning eller hämning av vissa reparationsfaktorer av intresse, dvs DNA-PKcs). Ett typiskt experimentellt resultat som erhålls med ChIP-qPCR finns representerat i figur 2. Däri visas den tidsmässiga anrikningen av γH2AX som ett svar på I-PpoI-inducerad DNA-skada. Till vänster på bilden visas den tidsdeekterade γH2AX-signalen vid rastplatsen medan γH2AX-fördelningen på höger del representeras i en kontrollgenregion där DSB inte har inducerats.

Figure 2
Figur 2:Temporal berikning av γH2AX enligt kromatinimmunprecipitation som svar på I-PpoI-inducerad DNA-skada. Vänster, γH2AX-signal vid rastplatsen; γH2AX-distribution i ett kontrollområde där DSB inte inducerades (anti-γH2AX-antikroppar). De representerade resultaten härleds från ett biologiskt experiment, och felstaplar anger variationerna i motsvarande provrelikat. N=3. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Även om DNA-reparation är ett relativt nytt forskningsområde expanderar vår kunskap snabbt med hjälp av olika biokemiska och mikroskopiska metoder. Att bevara genetisk information är avgörande för celler eftersom mutationer som förekommer i gener som är involverade i reparationsprocesser är bland de främsta orsakerna till tumorigenesis och därför är det viktigt att klargöra de viktigaste stegen i DNA-reparationsvägar.

Biokemiska tekniker (dvs. western blot, immunoprecipitation, masspektrometri, etc.) kräver ett stort antal celler och de studerade reparationsprocesserna representerar en ögonblicksbild av den önskade cellpopulationen. Att utföra ChIP-experiment är arbete, besvärligt och många överväganden måste beaktas vid utformningen av specifika experiment för att studera processen för DSB-reparation. Följande steg är några exempel: (I) celler ska lysas ordentligt; Det rekommenderas starkt att tillämpa en tvåstegs lysningsmetod genom att använda separat cell- och nukleär lysbuffert för att säkerställa högre tillgänglighet till kromatinfraktionen (II) kromatin bör inte över- eller underljudsbestämas. Lämpliga villkor för ultraljudsbehandling bör optimeras till varje celltyp i förväg (III) lämplig mängd renad antikropp bör fastställas eftersom antikroppar mot samma protein från olika företag uppvisar icke-identiska egenskaper (IV) för effektiv immunprecipitation, 25-30 ug initial kromatin bör användas i varje tillstånd (V) lämplig tidpunkt för fixering bör optimeras. Eftersom överfixering kan resultera i falska positiva resultat genom korskoppling av avlägsna proteinkomplex och underfixering kan förhindra korrekt korskoppling mellan DNA och önskat protein (VI) baserat på den applicerade antikroppen, bör typen av pärlor (protein A eller G) bestämmas noggrant (VII) under tvättsteg, tvättbuffertarna bör hållas noggrant för att undvika frisättning av antikroppen från pärlor (VIII) under extraktionen AV DNA, Fenolspår bör elimineras ordentligt för att undvika att effektiviteten hos de ytterligare nedströmsreaktionerna minskar. Eftersom denna metod minskar utbytet av återvunnet DNA är vårt personliga råd att snarare använda specifika DNA-reningskit. När alla kritiska punkter har åtgärdats korrekt kan ChIP tillhandahålla värdefulla data för beläggning av önskat protein vid olika genomiska lokus och kan lösa kritiska steg i DNA-reparationsprocesser.

ChIP i kombination med qPCR är dock ett indirekt tillvägagångssätt för att studera proteinfördelningen i utvalda genomiska regioner och tillåter inte att specifikt känna igen DNA-bindningsstället eller direkt undersöka proteinens funktion. Mono- eller polyklonala antikroppar som används för att fånga protein-DNA-komplexen kan också korsreagera med andra proteiner som leder till falskt positiva data och därför bör antikropparna som används i denna teknik vara ChIP-klass och mycket specifika mot proteinet av intresse. ChIP är dock en allmänt använd teknik och ytterligare metoder baserade på detta har utvecklats, såsom ChIP-on-chip och ChIP-seq. Den förstnämnda förlitar sig på att hybridisera de immunoprecipiterade och renade DNA-fragmenten på en mikroarray med ett stort antal små slumpmässiga DNA-sekvenser som ytterligare förstärker de glödgade sekvenserna som ger värdefull information om proteinbindningsställen. ChIP-seq har dock dykt upp som ett attraktivt alternativt tillvägagångssätt eftersom det ger genomomfattande kartläggning av protein-DNA-komplex med högre upplösning än ChIP-on-chip och hög genomströmning genomsekvensering. ChIP-seq har revolutionerat området DNA-reparation genom att avslöja DNA-bindande platser av olika transkriptionsfaktorer som ger insikter om genregleringen och nysta upp kromatinlandskap i en genomomfattande skala25. Enligt detta har området DNA-reparation oerhört tjänat på ChIP-seq eftersom dessa data spelar en avgörande roll i olika sjukdomar och biologiska vägar, såsom cancerprogression. Icke desto mindre har olika modifieringar av ChIP-metoden utvecklats såsom HaloChIP, som inte kräver specifik antikropp mot proteinet av intresse utan snarare använder sekvenser som kodar DNA-bindande proteiner smälta med HaloTag, som transfecteras till celler och därefter korslänkning, de önskade protein-DNA-komplexen kan fångas med hjälp av HaloLink Resin. Denna teknik förlitar sig dock på överuttryck och inte den endogena nivån av önskade proteiner som kan resultera i feltolkade data26.

Dessutom ger mikroskopiska tekniker värdefull information om spatiotemporal spårning av DNA-skador reparation, även i en encellig nivå. Den snabba förbättringen av antikroppar som lyfts mot specifika reparationsproteiner har lett till en djupare förståelse för mekanismen för NER- och DSBR-undervägar, liksom deras post-translationella reglering. Det mikroskopiska fältet har revolutionerats av högupplösta tekniker, såsom superupplösningsmikroskopi, som möjliggör visualisering av DNA-skadeinducerade cellulära processer på nukleosomnivå, samt säkerställer noggrann kartläggning av proteinsamlokalisering24. Det bör dock noteras att variansen i cell härstamningar måste beaktas under experimentet eftersom reparationshastigheten kan avvika, vilket kan göra resultaten svåra att tolka. Med tanke på den snabba utvecklingen av fluorescensavbildningsmetodik och den avsiktliga utformningen av den experimentella installationen är en värdefull möjlighet att undersöka DNA-skadeinducerade cellulära och molekylära svar på en enda proteinupplösning på en encellsnivå på väg till perfektion.

Sammanfattningsvis kan kombinationen av superupplösningsmikroskopi och encellig sekvenseringsmetodik avsevärt förbättra vår förståelse av DNA-reparationsfältet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen

Acknowledgments

Denna forskning finansierades av National Research, Development and Innovation Office grant GINOP-2.3.2-15-2016-00020, GINOP-2.3.2-15-2016-00036, GINOP-2.2.1-15-2017-00052, EFOP 3.6.3-VEKOP-16-2017-00009, NKFI-FK 132080, János Bolyai Research Scholarship of the Hungarian Academy of Sciences BO/27/20, ÚNKP-20-5-SZTE-265, EMBO short-term fellowship 8513 och Tempus Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-OHT Sigma Aldrich H7904
Agarose Lonza 50004
Antibiotic-Antimycotic Solution (100×), Stabilized Sigma Aldrich A5955
Anti-gamma H2A.X (phospho S139) antibody Abcam ab26350
Bovine Serum Fraction V albumin Biosera PM-T1725
TrackIt™ Cyan/Yellow Loading Buffer Thermo Fisher Scientific 10482035
DMEM with 1.0 g/L Glucose, without L-Glutamine Lonza 12-707F
Doxycycline Sigma Aldrich D9891
Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Mouse IgG Invitrogen 11202D
Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Rabbit IgG Invitrogen 11204D
EDTA Sigma Aldrich E6758
EGTA Sigma Aldrich E3889
Ethanol Molar Chemicals 02910-101-340
Fetal Bovine Serum (South America Origin), EU-approved Gibco ECS0180L
Formaldehyde 37% solution free from acid Sigma Aldrich 1.03999
GlutaMAX™ Supplement Thermo Fisher Scientific 35050038
Glycine Sigma Aldrich 50046
IPure kit v2 Diagenode C03010015
Isoamyl alcohol Sigma Aldrich W205702
LiCl Sigma Aldrich L9650
NaCl Sigma Aldrich S5886
Na-DOC Sigma Aldrich D6750
NaHCO3 Sigma Aldrich S5761
Neocarzinostatin from Streptomyces carzinostaticus Sigma Aldrich N9162
NP-40 Sigma Aldrich I8896
PBS Powder without Ca2+, Mg2+ Sigma Aldrich L182-50-BC
Phenol Sigma Aldrich P4557
PIPES Sigma Aldrich P1851
Polysorbate 20 (Tween 20) Molar Chemicals 09400-203-190
KCl Sigma Aldrich P5405
ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI Thermo Fisher Scientific P36935
Protease Inhibitor Cocktail Set I Roche 11873580001
Proteinase K Sigma Aldrich P2308
P-S2056 DNAPKcs antibody Abcam ab18192
RNase A Roche 10109169001
CH3COONa Sigma Aldrich S2889
SDS Sigma Aldrich L3771
Tris Acetate-EDTA buffer Sigma Aldrich T6025
Tris-HCl Sigma Aldrich 91228
TRITON X-100 Molar Chemicals 09370-006-340
Trypsin from porcine pancreas Sigma Aldrich T4799
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red Gibco 15400054

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Ubiquitylation-Mediated Fine-Tuning of DNA Double-Strand Break Repair. Cancers (Basel). 12 (6), (2020).
  2. Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Emerging Roles of Post-Translational Modifications in Nucleotide Excision Repair. Cells. 9 (6), (2020).
  3. Stephens, P. J., et al. The landscape of cancer genes and mutational processes in breast cancer. Nature. 486 (7403), 400-404 (2012).
  4. Turnbull, C., et al. Gene-gene interactions in breast cancer susceptibility. Human Molecular Genetics. 21 (4), 958-962 (2012).
  5. Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. 8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18877-18882 (2008).
  6. Jiricny, J. The multifaceted mismatch-repair system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (5), 335-346 (2006).
  7. Hanawalt, P. C., Spivak, G. Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (12), 958-970 (2008).
  8. Kanaar, R., Wyman, C., Rothstein, R. Quality control of DNA break metabolism: in the 'end', it's a good thing. EMBO Journal. 27 (4), 581-588 (2008).
  9. Lemaitre, C., et al. Nuclear position dictates DNA repair pathway choice. Genes & Development. 28 (22), 2450-2463 (2014).
  10. Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annual Review of Biochemistry. 79, 181-211 (2010).
  11. Lambert, S., Lopez, B. S. Characterization of mammalian RAD51 double strand break repair using non-lethal dominant-negative forms. EMBO Journal. 19 (12), 3090-3099 (2000).
  12. Xu, S., et al. p300-mediated acetylation of histone demethylase JMJD1A prevents its degradation by ubiquitin ligase STUB1 and enhances its activity in prostate cancer. Cancer Research. , (2020).
  13. Kastan, M. B., Bartek, J. Cell-cycle checkpoints and cancer. Nature. 432 (7015), 316-323 (2004).
  14. Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nature Reviews Cancer. 12 (1), 68-78 (2011).
  15. Krenning, L., vanden Berg, J., Medema, R. H. Life or Death after a Break: What Determines the Choice. Molecular Cell. 76 (2), 346-358 (2019).
  16. Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. Journal of Biological Chemistry. 273 (10), 5858-5868 (1998).
  17. Caron, P., et al. WWP2 ubiquitylates RNA polymerase II for DNA-PK-dependent transcription arrest and repair at DNA breaks. Genes & Development. 33 (11-12), 684-704 (2019).
  18. Caron, P., et al. Cohesin protects genes against gammaH2AX Induced by DNA double-strand breaks. PLoS Genetics. 8 (1), 1002460 (2012).
  19. Berkovich, E., Monnat, R. J., Kastan, M. B. Assessment of protein dynamics and DNA repair following generation of DNA double-strand breaks at defined genomic sites. Nature Protocols. 3 (5), 915-922 (2008).
  20. Paques, F., Duchateau, P. Meganucleases and DNA double-strand break-induced recombination: perspectives for gene therapy. Current Gene Therapy. 7 (1), 49-66 (2007).
  21. Pankotai, T., Bonhomme, C., Chen, D., Soutoglou, E. DNAPKcs-dependent arrest of RNA polymerase II transcription in the presence of DNA breaks. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (3), 276-282 (2012).
  22. Iacovoni, J. S., et al. High-resolution profiling of gammaH2AX around DNA double strand breaks in the mammalian genome. EMBO Journal. 29 (8), 1446-1457 (2010).
  23. Poinsignon, C., et al. Phosphorylation of Artemis following irradiation-induced DNA damage. European Journal of Immunology. 34 (11), 3146-3155 (2004).
  24. Varga, D., Majoros, H., Ujfaludi, Z., Erdelyi, M., Pankotai, T. Quantification of DNA damage induced repair focus formation via super-resolution dSTORM localization microscopy. Nanoscale. 11 (30), 14226-14236 (2019).
  25. Kim, J. A., Kruhlak, M., Dotiwala, F., Nussenzweig, A., Haber, J. E. Heterochromatin is refractory to gamma-H2AX modification in yeast and mammals. Journal of Cell Biology. 178 (2), 209-218 (2007).
  26. Daniels, D. L., Urh, M. Isolation of intracellular protein--DNA complexes using HaloCHIP, an antibody-free alternative to chromatin immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 977, 111-124 (2013).

Tags

Biologi Utgåva 174 DNA-reparation kromatinimmunprecipitation fluorescerande mikroskopi platsspecifika DSB immunostaining
Visualisera och kvantifiera endonukleasbaserade platsspecifika DNA-skador
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pantazi, V., Berzsenyi, I., Borsos,… More

Pantazi, V., Berzsenyi, I., Borsos, B. N., Pankotai, T. Visualizing and Quantifying Endonuclease-Based Site-Specific DNA Damage. J. Vis. Exp. (174), e62175, doi:10.3791/62175 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter