Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Visualisation et quantification des dommages à l’ADN spécifiques au site à base d’endonucléase

Published: August 21, 2021 doi: 10.3791/62175
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Institute of Pathology, Faculty of Medicine, University of Szeged
* These authors contributed equally

Summary

Cet article présente les étapes essentielles de immunoprecipitation d’immunostaining et de chromatine. Ces protocoles sont couramment utilisés pour étudier les processus cellulaires liés aux dommages à l’ADN et pour visualiser et quantifier le recrutement des protéines impliquées dans la réparation de l’ADN.

Abstract

Les cellules sont continuellement exposées à divers agents dommageables de l’ADN, induisant différentes réponses cellulaires. L’application d’approches biochimiques et génétiques est essentielle pour révéler les événements cellulaires associés au recrutement et à l’assemblage de complexes de réparation de l’ADN sur le site des dommages à l’ADN. Au cours des dernières années, plusieurs outils puissants ont été développés pour induire des dommages à l’ADN spécifiques au site. De plus, de nouvelles techniques séminales nous permettent d’étudier ces processus au niveau de résolution unicellulaire en utilisant à la fois des cellules fixes et vivantes. Bien que ces techniques aient été utilisées pour étudier divers processus biologiques, nous présentons ici les protocoles les plus largement utilisés dans le domaine de la réparation de l’ADN, de l’immunomarquage par fluorescence (IF) et de l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP), qui, en combinaison avec les dommages à l’ADN spécifiques au site à base d’endonucléase, permettent de visualiser et de quantifier l’occupation génomique des facteurs de réparation de l’ADN de manière dirigée et régulée, respectivement. Ces techniques fournissent aux chercheurs des outils puissants pour identifier de nouvelles protéines liées au locus génomique endommagé ainsi que leurs modifications post-traductionnelles nécessaires à leur régulation fine lors de la réparation de l’ADN.

Introduction

Notre génome est constamment mis à l’épreuve par divers agents nuisibles à l’ADN. Ces agressions peuvent provenir de sources environnementales, telles que la lumière UV ou l’irradiation, ainsi que de sources endogènes, telles que les sous-produits métaboliques causés par le stress oxydatif ou les erreurs de réplication1,2. Ces lésions peuvent affecter l’intégrité d’un ou des deux brins d’ADN, et si les erreurs générées deviennent persistantes, cela conduit fréquemment à des translocations et à une instabilité du génome, ce qui peut entraîner une tumorigenèse3,4. Pour maintenir l’intégrité du génome, de multiples systèmes de réparation ont été développés au cours de l’évolution. Selon les propriétés chimiques et physiques de types spécifiques de dommages à l’ADN, de multiples mécanismes de réparation peuvent être activés. Des non-concordances, des emplacements d’abase, des ruptures monocaténaires, et de la 8-oxoguanine (8-oxoG) peuvent être enlevées par la réparation de disparité ou la voie de réparation de base-excision5,6. Les lésions provoquées par des photoproduits induits par les UV et des adduits encombrants peuvent être réparées soit par la réparation d’excision de nucléotides (NER), soit par le procédé de réparation de rupture double brin de l’ADN (DSBR)7,8. Le NER se compose de deux sous-voies principales : le NER couplé à la transcription (TC-NER) et le NER génomique global (GG-NER). En ce qui concerne la phase du cycle cellulaire, suite à l’induction de rupture double brin de l’ADN, deux sous-voies peuvent être activées : l’joignantage d’extrémité non homologue (NHEJ) et la recombinaison homologue (HR)1,9. Nhej, qui est la voie dominante dans les cellules au repos, peut être activé dans toutes les phases du cycle cellulaire, ce qui représente une voie plus rapide mais sujette aux erreurs10. D’autre part, HR est une voie sans erreur, dans laquelle les DSB sont réparés sur la base de la recherche d’homologie de séquence des chromatides sœurs, donc il est principalement présent dans les phases de cycle cellulaire S et G211. En outre, l’assemblage d’extrémité microhomologie-négocié (MMEJ) est un autre mécanisme de réparation DSB, distinct de ceux mentionnés ci-dessus, basé sur un KU70/80- et RAD51-indépendant de la re-ligature des séquences microhomologous précédemment réséquées flanquant les extrémités brisées d’ADN. Par conséquent, MMEJ est considéré comme sujet aux erreurs et hautement mutagène12. Lors de la réparation de l’ADN, les DSB peuvent induire la réponse aux dommages à l’ADN (DDR), ce qui entraîne l’activation des points de contrôle kinases qui arrêtent le cycle cellulaire pendant la réparation13,14,15. Le DDR est activé en réponse au recrutement et à la diffusion étendue des acteurs clés initiateurs du processus de réparation autour des lésions, contribuant à la formation d’un centre de réparation. Dans cette cascade de signalisation précoce, la kinase ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated) joue un rôle pivot en catalysant la phosphorylation de la variante histone H2AX à Ser139 (appelée γH2AX) autour de la lésion16. Cet événement précoce est responsable du recrutement de facteurs de réparation supplémentaires et du lancement de processus de réparation en aval. Bien que la fonction exacte des protéines recrutées au centre de réparation n’ait pas encore été entièrement caractérisée, la formation et la dynamique des foyers de réparation ont été étudiées par plusieurs laboratoires. Ces marqueurs sont largement utilisés pour suivre la cinétique de réparation, mais leur rôle précis pendant le processus de réparation reste insaisissable. En raison de la grande importance mais de la mauvaise compréhension des processus cellulaires liés à la réparation de l’ADN, plusieurs méthodes ont été développées jusqu’à présent pour induire et visualiser le DDR.

Diverses méthodes et systèmes ont été mis en place pour induire le type souhaité de dommages à l’ADN. Par exemple, certains agents [tels que la néocarzinostatine (NCS), la phléomycine, la bléomycine, l’irradiation γ, les UV] peuvent induire un grand nombre de cassures d’ADN aléatoires à des positions génomiques non prédictives, tandis que d’autres (endonucléases, telles que AsiSI, I-PpoI ou I-SceI, ainsi que le striping au laser) peuvent induire des ruptures d’ADN à des loci génomiques connus17,18,19,20,21. Ici, nous nous concentrons sur les techniques à base d’endonucléase actuellement utilisées pour étudier le DDR dans les cellules de mammifères et de levures. En plus de souligner les principes de ces techniques, nous soulignons à la fois leurs avantages et leurs inconvénients.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Immunodétection de protéines spécifiques

  1. Préparation de la culture cellulaire et installation expérimentale
    1. Maintenez les cellules d’U2OS dans des monocouches dans le milieu de culture de DMEM complété avec du sérum foetal de veau de 10%, de la glutamine de 2 mM, et de la solution antibiotique-antimycotique de 1%.
      REMARQUE: Pour l’induction de dommages à l’ADN à base d’endonucléase, utilisez un milieu traité au charbon de bois ou sans stéroïdes pour éviter les fuites du système.
    2. Cultiver les cellules dans un environnement humidifié à 5% deCO2 à 37 °C jusqu’à 80% de confluence, en renouvelant le milieu tous les 2-3 jours.
    3. Aspirer le milieu et laver les cellules avec 1x PBS. Détachez les cellules avec une solution de trypsine-EDTA. Lorsque les cellules se détachent, arrêtez l’activité de la trypsine en ajoutant un milieu de culture aux cellules, ce qui donne une suspension cellulaire.
    4. Comptez les cellules à l’aide d’une chambre de comptage de cellules. Plaque 2 x 104 cellules/mL/puits sur une plaque de 24 puits, avec des lamelle ronde stériles de 12 mm dans chaque puits.
    5. Incuber les cellules pendant 24 h à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % deCO2 pour permettre leur fixation sur les lamelle.
    6. Traiter les cellules avec 10 ng/mL de néocarzinostatine (NCS) en canalisant directement l’agent nocif vers le milieu cultivé. Incuber les cellules avec le milieu contenant du NCS pendant 15 min, puis les laver avec 1x PBS et ajouter du milieu de culture frais et complété aux cellules. Sinon, utilisez l’agent approprié (c’est-à-dire, 4-OHT) pour induire des DSB via des systèmes à base d’endonucléase sans rafraîchir le milieu22.
      REMARQUE: Alternativement, utiliser l’irradiation pour induire des dommages à l’ADN, allant de 30 min à 8 h de temps de récupération en utilisant un flux de neutrons entre 2-20 Gy23.
    7. Incuber les cellules pendant 1-8 h à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % deCO2 pour suivre la cinétique de la réparation de l’ADN.
  2. Fixation des cellules
    NOTA : 300 à 500 μL de solutions/puits doivent être utilisés dans les étapes suivantes (étapes 1.2 à 1.5) pour couvrir toutes les cellules de manière adéquate. Chaque étape d’incubation et de lavage (à l’exception de l’incubation d’anticorps) doit être effectuée sur un agitateur orbital avec une agitation douce.
    1. Après l’induction dsb et l’incubation des cellules, retirez le milieu des cellules attachées et lavez les cellules une fois avec 1x PBS.
    2. Fixer les cellules avec une solution de formaldéhyde-PBS à 4 % pendant 20 min à 25 °C.
  3. Perméabilisation des cellules
    1. Retirez la solution de fixation et lavez les cellules trois fois avec 1x PBS pendant 5 min chacune.
    2. Retirer le PBS et ajouter 0,2 % de Triton X-100 dissous dans du PBS. Incuber les échantillons pendant 20 min.
  4. Blocage de sites de liaison non spécifiques
    1. Lavez les cellules trois fois avec 1x PBS.
    2. Bloquer les sites de liaison non spécifiques avec 5% BSA (albumine de fraction Sérique bovine V) dilué dans du PBST (1x PBS complété par 0,1% Tween-20), et incuber les échantillons perméabilisés pendant au moins 20 min.
  5. Coloration par immunofluorescence
    1. Ajouter la quantité appropriée d’anticorps primaires (c.-à-d. anti-γH2AX, anti-ADN-PKcs) dilué dans une solution de BSA-PBST à 1 %. Placer chaque lamelle à l’envers sur un film de paraffine sur une gouttelette de 10 μL de l’anticorps anti-γH2AX dilué.
      REMARQUE: En cas de co-immuno-coloration diluer de manière appropriée les deux anticorps dans la même solution BSA-PBST à 1%.
    2. Incuber les échantillons dans une chambre d’humidité pendant 1,5 h à 4 °C.
      REMARQUE: L’incubation peut également être effectuée à 4 ° C pendant la nuit.
    3. Placez les lamaux de couverture en arrière étant côté vers le haut dans la plaque de 24 puits et lavez trois fois pendant 5 min avec 1x PBS.
    4. Ajouter la quantité appropriée d’anticorps secondaires dilués dans 1 % de BSA-PBST. Placer chaque lamelle à l’envers sur un film de paraffine sur une gouttelette de 10 μL de l’anticorps dilué.
    5. Incuber les échantillons dans une chambre d’humidité à 4 °C pendant 1 h.
    6. Placez les lamaux de couverture en arrière étant côté vers le haut dans la plaque de 24 puits et lavez trois fois pendant 5 min avec 1x PBS.
    7. Avant de retirer la dernière solution de lavage PBS, retirez délicatement les lamules à l’aide d’une pince à épiler et d’une aiguille, puis placez-les à l’envers sur des lames de verre avec des gouttelettes de support de montage (complétées par du DAPI).
      REMARQUE: Évitez la formation de bulles d’air. Lorsque le support de montage sèche, il est recommandé de sceller les bords des lamelles avec du vernis à ongles pour éviter le ratatinement des échantillons.

2. Immunoprécipitation de la chromatine

  1. Collecte cellulaire, réticulation, lyse cellulaire et nucléaire et fragmentation de l’ADN
    1. Culture d’environ 5 x 106 cellules/mL dans une boîte de 150 mm pour chaque échantillon.
    2. Retirer le milieu de culture et laver les cellules deux fois avec du PBS 1x glacé.
    3. Fixer les cellules avec une solution de formaldéhyde-PBS à 1%, placer les plaques sur un agitateur orbital et agiter doucement pendant 20 min.
      NOTA : Le formaldéhyde est volatil; préparez toujours une nouvelle solution de travail. Dans certains cas, la solution de formaldéhyde contient du méthanol pour la stabiliser, mais il est préférable d’utiliser une solution sans méthanol pour éviter toute interférence avec les réactions en aval.
    4. Arrêter la fixation avec de la glycine de 125 mM et incuber sur un agitateur orbital avec agitation douce pendant 5 min à 25 °C.
    5. Placez les plaques sur de la glace et lavez-les deux fois avec du PBS 1x glacé.
    6. Grattez les cellules dans du PBS 1x glacé et transférez-les dans des tubes coniques de 15 mL.
    7. Centrifuger les cellules à 2 500 x g pendant 5 min à 4 °C.
    8. Aspirer soigneusement le surnageant et ressusciter le culot dans 2 mL de tampon de lyse cellulaire [5 mM PIPES pH 8,0, 85 mM KCl, 0,5% NP-40, 1x PIC (cocktail inhibiteur de protéase)] et incuber sur de la glace pendant 10 min.
    9. Centrifuger la suspension cellulaire à 2 500 x g pendant 5 min à 4 °C.
    10. Jetez soigneusement le surnageant et ressuscitez la pastille dans 500-1 500 μL de tampon de lyse nucléaire (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM EDTA pH 8,0, 0,8% SDS, 1x PIC) et incuber sur la glace pendant 30-60 min. Transférer le lysat dans un tube conique en polystyrène adapté à la sonication.
      NOTA : Puisque le tampon de lyse nucléaire contient une FDS, il précipitera sur la glace et la solution deviendra blanche. La solution doit devenir transparente après la sonication.
    11. Soniquez le lysat pour ciselé l’ADN à une taille moyenne de fragment de 300-1 000 pb.
      REMARQUE: Les cycles et les conditions de sonication appropriés doivent être réglés en fonction du type de cellule et de l’équipement de sonication. Les fragments inférieurs à 200 pb ne conviennent pas au ChIP, car les interactions nucléosome-ADN peuvent être perturbées.
  2. Inversion de la réticulation, détermination de la taille des fragments sonés
    1. Prélever 100 μL de l’échantillon sonique pour vérifier la taille du fragment de la chromatine sonée. La chromatine restante doit être conservée à −80 °C.
    2. Ajouter 0,5 mg/mL de RNase A à chaque 100 μL de l’échantillon et les incuber à 37 °C pendant 20 min pour activer la RNase.
    3. Incuber les échantillons à 65 °C pendant la nuit.
    4. Le lendemain, ajouter 500 μg/mL de protéinase K et 0,5 % de FDS, et incuber les échantillons à 50 °C pendant 3 h.
    5. Ajouter 0,5 volume de phénol et 0,5 volume de mélange d’alcool chloroforme-isoamylique (24:1) à chaque échantillon.
    6. Vortex pendant 1 min.
    7. Centrifuger à 13 000 x g pendant 10 min.
    8. Transférer la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube à microcentrifugation.
    9. Ajouter 1 volume de mélange d’alcool chloroforme-isoamylique (24:1) à chaque échantillon.
    10. Vortex pendant 1 min.
    11. Centrifuger à 13 000 x g pendant 10 min.
    12. Transférer la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube à microcentrifugation.
    13. Ajouter 2,5 volumes d’éthanol à 96 % et 0,1 volume d’acétate de Na 3 M pH 5,2.
    14. Incuber pendant au moins 20 min à −80 °C.
    15. Centrifuger les échantillons à 13 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
    16. Retirer l’éthanol et laver la pastille avec 400 μL d’éthanol à 70 %.
    17. Centrifuger les échantillons à 13 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
    18. Retirez l’éthanol et séchez le culot à l’air.
    19. Ressusciter la pastille dans 10 μL de TE.
    20. Exécutez les échantillons sur un gel d’agarose à 0,8%. La taille de la chromatine sonée devrait être d’environ 500 pb.
      REMARQUE: Utilisez un tampon de chargement sans bleu de bromophénol car la taille de ce colorant est d’environ 500 pb, ce qui peut perturber la détection correcte des fragments de chromatine. Au lieu de cela, il est recommandé d’utiliser un tampon de chargement complété par du xylène-cyanole, qui est d’environ 3 000 pb.
    21. Si la taille de la chromatine est acceptable, diluer les échantillons de chromatine congelés de l’étape 2.1. dans 3 volumes de tampon de dilution (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,5 mM EGTA pH 8,0, 1% Triton X-100, 140 mM NaCl, 1x PIC) et mélanger les échantillons par rotation pendant 10 min à 4 °C.
      NOTA : Cette étape est nécessaire pour diluer la FDS présente dans le tampon de lyse nucléaire afin d’éviter toute interférence avec les réactions en aval, y compris la mesure de la concentration de chromatine.
    22. Mesurer la concentration d’ADN des échantillons de chromatine à 260/280 nm à l’aide d’un spectrophotomètre.
  3. Préparation des perles, pré-nettoyage et immunoprécipitation
    1. Préparez des perles (IgG anti-lapin de mouton ou de souris) pour les étapes de pré-nettoyage et d’immunoprécipitation. Laver les billes deux fois pendant 10 min à 4 °C avec un tampon RIPA (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA pH 8,0, 1% Triton X-100, 0,1% Na-DOC, 0,1% SDS, 150 mM NaCl et 1X PIC).
    2. Ressuscitez les billes dans le même volume de tampon RIPA qu’à l’étape 2.3.1.
    3. Chromatine pré-claire de 25-30 μg de chaque échantillon avec 4 μL de billes par rotation pendant 1-2 h à 4 °C.
      REMARQUE: Ajoutez un tampon RIPA à chaque échantillon de chromatine jusqu’à 500 μL de volume final pour laisser les échantillons se mélanger correctement en rotation. N’oubliez pas de retirer la chromatine pour nac (No Antibody Control) et TIC (Total Input Control) dans le cas de chaque ensemble d’échantillons. Les CATI n’ont besoin que d’un volume final allant jusqu’à 200 μL.
    4. Précipitez les perles avec un aimant et transférez le surnageant dans un nouveau tube à microcentrifugation.
    5. Ajouter la quantité appropriée d’anticorps à chaque échantillon de chromatine (sauf nac et TIC) et tourner pendant la nuit à 4 °C.
    6. Le lendemain, ajoutez 40 μL de billes lavées à chaque échantillon (sauf tic) et incuber pendant la nuit, en tournant à 4 °C.
  4. Lavage
    1. Laver une fois avec 300 μL de tampon à faible teneur en sel (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8,0, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 1x PIC) pendant 10 min par rotation à 4 °C.
    2. Laver une fois avec 300 μL de tampon à haute teneur en sel (20 mM Tris-HCl pH 8,0, NaCl 300 mM, 2 mM EDTA pH 8,0, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 1x PIC) pendant 10 min par rotation à 4 °C.
    3. Laver une fois avec 300 μL de tampon LiCl (250 mM LiCl, 1% NP-40, 1% Na-DOC, 1 mM EDTA pH 8,0, 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1x PIC) pendant 10 min par rotation à 4 °C.
    4. Laver deux fois avec 300 μL d’ET (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA pH 8,0) pendant 10 min par rotation, pour le premier lavage à 4 °C, et le second lavage à 25 °C.
  5. Élution
    1. Ajouter 200 μL du tampon d’élution (1 % de FDS et 100 mM deNaHCO3)aux billes et incuber à 65 °C dans un thermo-agitateur pendant 15 min avec secousse continue (environ 400 tr/min). Transférer à nouveau le surnageant dans un nouveau tube et éluer des billes dans 200 μL de tampon d’élution. Combiner les éluats (volume final de 400 μL).
    2. Ajouter naCl à une concentration finale de 200 mM dans chaque échantillon. Complétez les échantillons TIC avec 200 μL de tampon d’élution et ajoutez également du NaCl.
      Remarque : à partir de cette étape, TIC doit être manipulé dans les mêmes conditions que les autres échantillons.
    3. Incuber les échantillons à 65 °C (sans secouer) pendant au moins 6 h.
    4. Ajouter 1 mL d’éthanol froid à 100 % à chaque échantillon, faire pivoter les tubes deux fois pour les mélanger et précipiter l’ADN pendant la nuit à −80 °C.
    5. Le lendemain, centrifuger pendant 30 min à 13 000 x g à 4 °C.
    6. Jetez le surnageant et lavez le culot avec 70% d’EtOH.
    7. Centrifuger les échantillons à 13 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
    8. Jetez le surnageant et séchez les granulés à l’air.
    9. Ressusciter les pastilles dans 100 μL d’ET et ajouter 0,5 mg/mL de RNase A à chaque échantillon. Incuber à 37 °C pendant 20 min pour activer la RNase.
  6. Inversion de la réticulation
    1. Ajouter 500 μg/mL de protéinase K et 0,5 % de FDS, puis incuber les échantillons à 50 °C pendant 2 h.
      REMARQUE: Si vous passez à ChIP-seq, évitez l’extraction phénol-chloroforme, car elle inhibe le processus NGS en aval. Au lieu de cela, il est recommandé d’utiliser un kit disponible dans le commerce (voir la table des matériaux).
    2. Ajouter 0,5 volume de phénol et 0,5 volume de mélange d’alcool chloroforme-isoamylique (24:1) à chaque échantillon.
    3. Vortex pendant 1 min.
    4. Centrifuger à 13 000 x g pendant 10 min.
    5. Transférer la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube à microcentrifugation.
    6. Ajouter 1 volume de mélange d’alcool chloroforme-isoamylique (24:1) à chaque échantillon.
    7. Vortex pendant 1 min.
    8. Centrifuger à 13 000 x g pendant 10 min.
    9. Transférer la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube à microcentrifugation.
  7. Extraction de l’ADN
    1. Ajouter 2,5 volumes d’éthanol à 96 % et 0,1 volume d’acétate de Na 3 M pH 5,2.
    2. Incuber pendant au moins 20 min à −80 °C.
    3. Centrifuger les échantillons à 13 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
    4. Retirer l’éthanol et laver la pastille avec 400 μL d’éthanol à 70 %.
    5. Centrifuger les échantillons à 13 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
    6. Retirez l’éthanol et séchez le culot à l’air.
    7. Ressusciter la pastille dans 50 μL de TE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

L’étude des processus causés par l’ORD dirigés vers le site dans les cellules peut être réalisée par l’intermédiaire de la transfection stable ou transitoire. Cependant, il convient de noter que la transfection stable assure une population cellulaire homogène, ce qui donne une réponse cellulaire unifiée et donc plus fiable. Dans le cas d’une transfection transitoire, seule une petite proportion de la population cellulaire occupe et maintient le plasmide, ce qui introduit de la diversité dans l’expérience. L’établissement de systèmes cellulaires à base d’endonucléase ER-I-PpoI ou ER-AsiSI nécessite une population de cellules confluentes de 50%, qui est plus efficacement transfectée avec des plasmides codant pour l’endonucléase. Pour la transfection, des réactifs de transfection disponibles dans le commerce ou des méthodes basées sur les infections virales peuvent également être utilisés. Si une technique de visualisation microscopique doit être appliquée et que la transfection passagère est exigée, les DSB dirigés peuvent être induits par l’addition de 4-OHT 24 h après transfection, qui se lie aux endonucléases ER-fusionnées et permet la translocation nucléaire et l’induction DSB. Pour déterminer les points temporels les plus appropriés, il est possible d’effectuer une microscopie à base d’immunofluorescence et une détection par transfert western de γH2AX à différents moments après le traitement par 4-OHT. Dans des conditions physiologiques, un maximum de 10-15 foyers γH2AX par cellule peut être détecté, et la formation de foyers de réparation forts peut être déclenchée par des endonucléases (ou diverses autres techniques non abordées ici, par exemple, la microirradiation laser). Une endonucléase I-PpoI typique conduit à la formation de signaux γH2AX élevés autour du nucléole en induisant des DSB au niveau de l’ADN ribosomique (ADNr). Si les ruptures sont réparées par NHEJ ou HR, le nombre de foyers de réparation diminue avec le temps. Pour cette raison, des points de temps représentatifs à 0 h, 30 min, 1, 2, 4, et 8 h suivant des traitements 4-OHT sont recommandés. Pour suivre les processus de réparation de l’ADN, la lignée cellulaire la plus couramment utilisée est U2OS, car toutes les voies de réparation connues sont entièrement fonctionnelles dans ces cellules. Lors de l’étude de plusieurs protéines dans les mêmes cellules, la co-localisation peut être étudiée en combinant des anticorps conjugués avec différents fluorophores avec différentes longueurs d’onde d’émission élevées chez différentes espèces animales comme le montre la figure 1. Là, l’induction des DSB via une lignée cellulaire stable inductible est représentée qui est basée sur l’endonucléase de restriction ER-AsiSI fusionnée avec l’étiquette d’hémagglutinine (HA). La doxycycline peut induire l’expression et la séquestration de HA-ER-AsiSI dans le cytoplasme qui peut être suivi à l’aide d’un anticorps contre l’HA(figure 1.troisième colonne, deuxième cru). L’incubation pendant 4 h avec 4-OHT, 24 h après l’addition de doxycycline, peut induire un nombre élevé de DSB puisque l’endonucléase a été translocalée au noyau(figure 1.troisième colonne, troisième brute et deuxième colonne, troisième brute). Les DSB peuvent être visualisés à l’aide d’un anticorps reconnaissant γH2AX.

Figure 1
Figure 1: La microscopie à immunofluorescence est utilisée pour détecter le γH2AX dans les cellules cultivées exprimant HA-ER-AsiSI. L’addition de DOX (doxycycline) active l’expression cytoplasmique de HA-ER-AsiSI et de 4-OHT (4-hydroxytamoxifène) (4 h) induit la translocation nucléaire de la protéine de fusion, ce qui conduit à l’induction de DSB à des positions génomiques connues. La coloration HA (hémagglutinine) (anticorps anti-HA) représente la protéine de fusion HA-ER-AsiSI en vert, et l’induction des ruptures est vérifiée par coloration γH2AX (anticorps anti-γH2AX) en rouge. Les barres d’échelle représentent 20 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La co-localisation des protéines de réparation sur le site de dommage indique qu’elles sont recrutées sur le même site de lésion d’ADN, mais qu’elles n’interagissent pas nécessairement les unes avec les autres. La résolution de la microscopie confocale est d’environ 300 nm; pour déterminer le modèle de liaison des protéines de réparation spécifiques au site de rupture, la microscopie à super-résolution (STORM) est plutôt recommandée 24. Cependant, cette méthode nécessite un équipement microscopique coûteux et un chercheur expert. Alternativement, le schéma de liaison des protéines de réparation peut être examiné par immunoprécipitation de la chromatine à l’aide de lignées cellulaires stables DIvA ou U2OS-pEP15, qui peuvent exprimer les endonucléases AsiSI et I-PpoI de manière régulée, respectivement17,21. Lors de l’ajout de 4-OHT, les deux endonucléases peuvent couper l’ADN d’une manière spécifique à la séquence, ce qui nous donne l’occasion de concevoir des amorces spécifiques au locus pour les sites de rupture attendus et leurs régions génomiques environnantes. En appliquant de l’anticorps γH2AX dans la partie immunoprécipitation du ChIP, nous pouvons suivre temporellement la cinétique de réparation de l’ADN dans différentes conditions (telles que le silence ou l’inhibition de certains facteurs de réparation d’intérêt, c’est-à-dire l’ADN-PKcs). Un résultat expérimental typique obtenu à l’aide de ChIP-qPCR est représenté à la figure 2. Là, l’enrichissement temporel de γH2AX est démontré comme une réponse aux dommages causés par l’ADN par I-PpoI. Sur la partie gauche de l’image, le signal γH2AX détecté en temps opportun est montré sur le site de rupture tandis que sur la partie droite, la distribution γH2AX est représentée à une région de gène de contrôle à laquelle les DSB n’ont pas été induits.

Figure 2
Figure 2: Enrichissement temporel de l’γH2AX tel que déterminé par immunoprécipitation de la chromatine en réponse à des dommages à l’ADN induits par l’I-PpoI. À gauche, signal γH2AX sur le site de la rupture; à droite, distribution γH2AX dans une région de contrôle où les DSB n’ont pas été induits (anticorps anti-γH2AX). Les résultats représentés sont dérivés d’une expérience biologique, et les barres d’erreur indiquent les variations des répétitions d’échantillon correspondantes. N=3. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bien que la réparation de l’ADN soit un domaine de recherche relativement récent, nos connaissances s’étendent rapidement à l’aide de diverses méthodes biochimiques et microscopiques. La préservation de l’information génétique est cruciale pour les cellules puisque les mutations survenant dans les gènes impliqués dans les processus de réparation sont parmi les principales causes de la tumorigenèse et, par conséquent, il est essentiel d’élucider les étapes clés des voies de réparation de l’ADN.

Les techniques biochimiques (c.-à-d. western blot, immunoprécipitation, spectrométrie de masse, etc.) exigent un grand nombre de cellules et les processus de réparation étudiés représentent un instantané de la population cellulaire désirée. Effectuer des expériences ChIP est laborieux, gênant et de nombreuses considérations doivent être prises en compte lors de la conception d’expériences spécifiques pour étudier le processus de réparation DSB. Les étapes suivantes sont quelques exemples: (I) les cellules doivent être correctement lysées; il est fortement recommandé d’appliquer une méthode de lysation en deux étapes en utilisant un tampon de lyse cellulaire et nucléaire séparé pour assurer une plus grande accessibilité à la fraction de chromatine (II) la chromatine ne doit pas être sur- ou sous-onicated; les conditions appropriées de sonication doivent être optimisées pour chaque type de cellule au préalable (III) la quantité appropriée d’anticorps purifiés doit être déterminée car les anticorps dirigés contre la même protéine provenant de différentes sociétés présentent des caractéristiques non identiques (IV) pour l’immunoprécipitation efficace, 25-30 ug de chromatine initiale doivent être utilisés dans chaque condition (V) le moment approprié de fixation doit être optimisé, comme la surfixation peut entraîner des résultats faussement positifs en réticulation des complexes protéiques éloignés et que la sous-fixation peut empêcher la réticulation appropriée entre l’ADN et la protéine désirée (VI) en fonction de l’anticorps appliqué, le type de billes (protéine A ou G) doit être soigneusement déterminé (VII) pendant les étapes de lavage, l’ordre des tampons de lavage doit être soigneusement maintenu pour éviter la libération de l’anticorps des perles (VIII) lors de l’extraction de l’ADN, des traces de phénol devraient être correctement éliminées pour éviter de diminuer l’efficacité des réactions en aval plus loin. Étant donné que cette méthode réduit le rendement en ADN récupéré, notre conseil personnel est d’utiliser plutôt un kit de purification d’ADN spécifique. Lorsque tous les points critiques ont été correctement traités, ChIP peut fournir des données précieuses pour l’occupation de la protéine souhaitée à différents loci génomiques et peut démêler les étapes critiques dans les processus de réparation de l’ADN.

Cependant, le ChIP combiné avec le qPCR est une approche indirecte pour étudier la distribution des protéines dans des régions génomiques sélectionnées et ne permet pas de reconnaître spécifiquement le site de liaison à l’ADN ou d’examiner directement la fonction de la protéine. Les anticorps monoclonaux ou polyclonaux utilisés pour capturer les complexes protéine-ADN peuvent également réagir de manière croisée avec d’autres protéines conduisant à des données faussement positives et, par conséquent, les anticorps utilisés dans cette technique doivent être de qualité ChIP et très spécifiques contre la protéine d’intérêt. Cependant, chIP est une technique largement utilisée et d’autres approches basées sur cela ont été développées, telles que ChIP-on-chip et ChIP-seq. Le premier repose sur l’hybridation des fragments d’ADN immunoprécipités et purifiés sur un microréseau avec une grande variété de petites séquences d’ADN aléatoires qui amplifient davantage les séquences recuites fournissant des informations précieuses sur les sites de liaison aux protéines. Cependant, ChIP-seq est apparu comme une approche alternative attrayante car il fournit une cartographie à l’échelle du génome des complexes protéine-ADN avec une résolution plus élevée que chIP-sur puce et le séquençage du génome à haut débit. ChIP-seq a révolutionné le domaine de la réparation de l’ADN en divulguant des sites de liaison à l’ADN de divers facteurs de transcription fournissant des informations sur la régulation des gènes et démêlant les paysages de chromatine à l’échelle du génome25. Selon cela, le domaine de la réparation de l’ADN a énormément profité de ChIP-seq puisque ces données jouent un rôle crucial dans diverses maladies et voies biologiques, telles que la progression du cancer. Néanmoins, diverses modifications de la méthode ChIP ont été développées telles que HaloChIP, qui ne nécessite pas d’anticorps spécifiques contre la protéine d’intérêt mais utilise plutôt des séquences codant pour des protéines de liaison à l’ADN fusionnées avec HaloTag, qui sont transfectées aux cellules et par la suite à la réticulation, les complexes protéine-ADN souhaités peuvent être capturés en utilisant halolink resin. Cependant, cette technique repose sur la surexpression et non sur le niveau endogène des protéines souhaitées ce qui peut entraîner une mauvaise interprétation des données26.

En outre, les techniques microscopiques fournissent des informations précieuses sur le suivi spatio-temporel de la réparation des dommages à l’ADN, même au niveau unicellulaire. L’amélioration rapide des anticorps élevés contre des protéines de réparation spécifiques a conduit à une compréhension plus approfondie du mécanisme des sous-voies NER et DSBR, ainsi que de leur régulation post-traductionnelle. Le champ microscopique a été révolutionné par des techniques à haute résolution, telles que la microscopie à super-résolution, qui permet la visualisation des processus cellulaires induits par les dommages à l’ADN au niveau nucléosomique, ainsi que d’assurer la cartographie précise de la co-localisation des protéines24. Cependant, il convient de noter que la variance dans les lignées cellulaires doit être prise en compte au cours de l’expérience car le taux de réparation peut diverger, ce qui peut rendre les résultats difficiles à interpréter. Compte tenu de l’évolution rapide de la méthodologie d’imagerie par fluorescence et de la conception délibérée de la configuration expérimentale, une occasion précieuse d’étudier les réponses cellulaires et moléculaires induites par les dommages à l’ADN à une résolution de protéine unique au niveau unicellulaire est en voie d’atteindre la perfection.

En conclusion, la combinaison de la microscopie à super-résolution et de la méthodologie de séquençage unicellulaire peut améliorer considérablement notre compréhension du domaine de réparation de l’ADN.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Aucun

Acknowledgments

Cette recherche a été financée par la subvention GINOP-2.3.2-2-15-2016-2016-00020, GINOP-2.3.2-15-2016-00036, GINOP-2.2.1-15-2017-00052, EFOP 3.6.3-VEKOP-16-2017-00009, NKFI-FK 132080, la bourse de recherche János Bolyai de l’Académie hongroise des sciences BO/27/20, ÚNKP-20-5-SZTE-265, la bourse de courte durée EMBO 8513 et la Fondation Tempus.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-OHT Sigma Aldrich H7904
Agarose Lonza 50004
Antibiotic-Antimycotic Solution (100×), Stabilized Sigma Aldrich A5955
Anti-gamma H2A.X (phospho S139) antibody Abcam ab26350
Bovine Serum Fraction V albumin Biosera PM-T1725
TrackIt™ Cyan/Yellow Loading Buffer Thermo Fisher Scientific 10482035
DMEM with 1.0 g/L Glucose, without L-Glutamine Lonza 12-707F
Doxycycline Sigma Aldrich D9891
Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Mouse IgG Invitrogen 11202D
Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Rabbit IgG Invitrogen 11204D
EDTA Sigma Aldrich E6758
EGTA Sigma Aldrich E3889
Ethanol Molar Chemicals 02910-101-340
Fetal Bovine Serum (South America Origin), EU-approved Gibco ECS0180L
Formaldehyde 37% solution free from acid Sigma Aldrich 1.03999
GlutaMAX™ Supplement Thermo Fisher Scientific 35050038
Glycine Sigma Aldrich 50046
IPure kit v2 Diagenode C03010015
Isoamyl alcohol Sigma Aldrich W205702
LiCl Sigma Aldrich L9650
NaCl Sigma Aldrich S5886
Na-DOC Sigma Aldrich D6750
NaHCO3 Sigma Aldrich S5761
Neocarzinostatin from Streptomyces carzinostaticus Sigma Aldrich N9162
NP-40 Sigma Aldrich I8896
PBS Powder without Ca2+, Mg2+ Sigma Aldrich L182-50-BC
Phenol Sigma Aldrich P4557
PIPES Sigma Aldrich P1851
Polysorbate 20 (Tween 20) Molar Chemicals 09400-203-190
KCl Sigma Aldrich P5405
ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI Thermo Fisher Scientific P36935
Protease Inhibitor Cocktail Set I Roche 11873580001
Proteinase K Sigma Aldrich P2308
P-S2056 DNAPKcs antibody Abcam ab18192
RNase A Roche 10109169001
CH3COONa Sigma Aldrich S2889
SDS Sigma Aldrich L3771
Tris Acetate-EDTA buffer Sigma Aldrich T6025
Tris-HCl Sigma Aldrich 91228
TRITON X-100 Molar Chemicals 09370-006-340
Trypsin from porcine pancreas Sigma Aldrich T4799
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red Gibco 15400054

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Ubiquitylation-Mediated Fine-Tuning of DNA Double-Strand Break Repair. Cancers (Basel). 12 (6), (2020).
  2. Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Emerging Roles of Post-Translational Modifications in Nucleotide Excision Repair. Cells. 9 (6), (2020).
  3. Stephens, P. J., et al. The landscape of cancer genes and mutational processes in breast cancer. Nature. 486 (7403), 400-404 (2012).
  4. Turnbull, C., et al. Gene-gene interactions in breast cancer susceptibility. Human Molecular Genetics. 21 (4), 958-962 (2012).
  5. Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. 8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18877-18882 (2008).
  6. Jiricny, J. The multifaceted mismatch-repair system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (5), 335-346 (2006).
  7. Hanawalt, P. C., Spivak, G. Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (12), 958-970 (2008).
  8. Kanaar, R., Wyman, C., Rothstein, R. Quality control of DNA break metabolism: in the 'end', it's a good thing. EMBO Journal. 27 (4), 581-588 (2008).
  9. Lemaitre, C., et al. Nuclear position dictates DNA repair pathway choice. Genes & Development. 28 (22), 2450-2463 (2014).
  10. Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annual Review of Biochemistry. 79, 181-211 (2010).
  11. Lambert, S., Lopez, B. S. Characterization of mammalian RAD51 double strand break repair using non-lethal dominant-negative forms. EMBO Journal. 19 (12), 3090-3099 (2000).
  12. Xu, S., et al. p300-mediated acetylation of histone demethylase JMJD1A prevents its degradation by ubiquitin ligase STUB1 and enhances its activity in prostate cancer. Cancer Research. , (2020).
  13. Kastan, M. B., Bartek, J. Cell-cycle checkpoints and cancer. Nature. 432 (7015), 316-323 (2004).
  14. Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nature Reviews Cancer. 12 (1), 68-78 (2011).
  15. Krenning, L., vanden Berg, J., Medema, R. H. Life or Death after a Break: What Determines the Choice. Molecular Cell. 76 (2), 346-358 (2019).
  16. Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. Journal of Biological Chemistry. 273 (10), 5858-5868 (1998).
  17. Caron, P., et al. WWP2 ubiquitylates RNA polymerase II for DNA-PK-dependent transcription arrest and repair at DNA breaks. Genes & Development. 33 (11-12), 684-704 (2019).
  18. Caron, P., et al. Cohesin protects genes against gammaH2AX Induced by DNA double-strand breaks. PLoS Genetics. 8 (1), 1002460 (2012).
  19. Berkovich, E., Monnat, R. J., Kastan, M. B. Assessment of protein dynamics and DNA repair following generation of DNA double-strand breaks at defined genomic sites. Nature Protocols. 3 (5), 915-922 (2008).
  20. Paques, F., Duchateau, P. Meganucleases and DNA double-strand break-induced recombination: perspectives for gene therapy. Current Gene Therapy. 7 (1), 49-66 (2007).
  21. Pankotai, T., Bonhomme, C., Chen, D., Soutoglou, E. DNAPKcs-dependent arrest of RNA polymerase II transcription in the presence of DNA breaks. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (3), 276-282 (2012).
  22. Iacovoni, J. S., et al. High-resolution profiling of gammaH2AX around DNA double strand breaks in the mammalian genome. EMBO Journal. 29 (8), 1446-1457 (2010).
  23. Poinsignon, C., et al. Phosphorylation of Artemis following irradiation-induced DNA damage. European Journal of Immunology. 34 (11), 3146-3155 (2004).
  24. Varga, D., Majoros, H., Ujfaludi, Z., Erdelyi, M., Pankotai, T. Quantification of DNA damage induced repair focus formation via super-resolution dSTORM localization microscopy. Nanoscale. 11 (30), 14226-14236 (2019).
  25. Kim, J. A., Kruhlak, M., Dotiwala, F., Nussenzweig, A., Haber, J. E. Heterochromatin is refractory to gamma-H2AX modification in yeast and mammals. Journal of Cell Biology. 178 (2), 209-218 (2007).
  26. Daniels, D. L., Urh, M. Isolation of intracellular protein--DNA complexes using HaloCHIP, an antibody-free alternative to chromatin immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 977, 111-124 (2013).

Tags

Biologie Numéro 174 Réparation de l’ADN immunoprécipitation de la chromatine microscopie fluorescente DSB spécifiques au site immunomarquage
Visualisation et quantification des dommages à l’ADN spécifiques au site à base d’endonucléase
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pantazi, V., Berzsenyi, I., Borsos,… More

Pantazi, V., Berzsenyi, I., Borsos, B. N., Pankotai, T. Visualizing and Quantifying Endonuclease-Based Site-Specific DNA Damage. J. Vis. Exp. (174), e62175, doi:10.3791/62175 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter