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Biology

Visualisierung und Quantifizierung endonukleasebasierter ortsspezifischer DNA-Schäden

Published: August 21, 2021 doi: 10.3791/62175
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Institute of Pathology, Faculty of Medicine, University of Szeged
* These authors contributed equally

Summary

Dieser Artikel stellt wesentliche Schritte der Immunfärbung und Chromatin-Immunpräzipitation vor. Diese Protokolle werden häufig verwendet, um DNA-schädigende zelluläre Prozesse zu untersuchen und die Rekrutierung von Proteinen, die an der DNA-Reparatur beteiligt sind, zu visualisieren und zu quantifizieren.

Abstract

Zellen sind kontinuierlich verschiedenen DNA-schädigenden Wirkstoffen ausgesetzt, die unterschiedliche zelluläre Reaktionen hervorrufen. Die Anwendung biochemischer und genetischer Ansätze ist unerlässlich, um zelluläre Ereignisse aufzudecken, die mit der Rekrutierung und Montage von DNA-Reparaturkomplexen an der Stelle von DNA-Schäden verbunden sind. In den letzten Jahren wurden mehrere leistungsfähige Werkzeuge entwickelt, um ortsspezifische DNA-Schäden zu induzieren. Darüber hinaus ermöglichen uns neuartige bahnbrechende Techniken, diese Prozesse auf der Ebene der Einzelzellauflösung sowohl mit festen als auch mit lebenden Zellen zu untersuchen. Obwohl diese Techniken zur Untersuchung verschiedener biologischer Prozesse eingesetzt wurden, stellen wir hier die am weitesten verbreiteten Protokolle auf dem Gebiet der DNA-Reparatur, des Fluoreszenzimmunfärbungs (IF) und der Chromatinimmunpräzipitation (ChIP) vor, die es in Kombination mit endonukleasebasierten ortsspezifischen DNA-Schäden ermöglichen, die genomische Belegung von DNA-Reparaturfaktoren gezielt und reguliert zu visualisieren und zu quantifizieren. beziehungsweise. Diese Techniken bieten den Forschern leistungsfähige Werkzeuge, um neuartige Proteine zu identifizieren, die an den beschädigten genomischen Locus gebunden sind, sowie ihre post-translationalen Modifikationen, die für ihre Feinabstimmung während der DNA-Reparatur erforderlich sind.

Introduction

Unser Genom wird ständig durch verschiedene DNA-schädigende Wirkstoffe herausgefordert. Diese Angriffe können von Umweltquellen wie UV-Licht oder Bestrahlung sowie von endogenen Quellen wie metabolischen Nebenprodukten, die durch oxidativen Stress oder Replikationsfehler verursacht werden, stammen1,2. Diese Läsionen können die Integrität eines oder beider DNA-Stränge beeinträchtigen, und wenn die erzeugten Fehler persistent werden, führt dies häufig zu Translokationen und Genominstabilität, was zu Tumorgenese führen kann3,4. Um die Integrität des Genoms zu erhalten, wurden während der Evolution mehrere Reparatursysteme entwickelt. Entsprechend den chemischen und physikalischen Eigenschaften bestimmter Arten von DNA-Schäden können mehrere Reparaturmechanismen aktiviert werden. Mismatches, abasic stellen, Einzelstrangbrüche und 8-Oxoguanin (8-OxoG) können entweder durch Mismatch-Reparatur oder Base-Exzisions-Reparaturweg5,6entfernt werden. Läsionen, die durch UV-induzierte Photoprodukte und sperrige Addukte verursacht werden, können entweder durch Nukleotid-Exzisionsreparatur (NER) oder DNA-Doppelstrangbruchreparatur (DSBR) repariert werden7,8. NER besteht aus zwei Hauptsubwegen: transkriptionsgekoppeltes NER (TC-NER) und globales genomisches NER (GG-NER). In Bezug auf die Zellzyklusphase können nach der DNA-Doppelstrangbruchinduktion zwei Subwege aktiviert werden: nicht-homologe Endfügung (NHEJ) und homologe Rekombination (HR)1,9. NHEJ, der dominante Weg in ruhenden Zellen, kann in allen Zellzyklusphasen aktiviert werden und stellt einen schnelleren, aber fehleranfälligen Weg dar10. Auf der anderen Seite ist HR ein fehlerfreier Weg, bei dem die DSBs basierend auf der Sequenz-Homologie-Suche der Schwesterchromatiden repariert werden, daher ist es hauptsächlich in den S- und G2-Zellzyklusphasen11vorhanden. Darüber hinaus ist das mikrohomologievermittelte Endfügen (MMEJ) ein weiterer DSB-Reparaturmechanismus, der sich von den oben genannten unterscheidet und auf einer KU70/80- und RAD51-unabhängigen Art der Religatur von zuvor resezierten mikrohomologen Sequenzen basiert, die die gebrochenen DNA-Enden flankieren. Daher gilt MMEJ als fehleranfällig und sehr mutagen12. Während der DNA-Reparatur können DSBs die DNA-Schadensreaktion (DDR) induzieren, was zur Aktivierung von Checkpoint-Kinasen führt, die den Zellzyklus während der Reparatur stoppen13,14,15. Die DDR wird als Reaktion auf die Rekrutierung und extensive Verbreitung von Initiator-Schlüsselakteuren des Reparaturprozesses um die Läsionen aktiviert und trägt zur Bildung eines Reparaturfokus bei. In dieser frühen Signalkaskade spielt die ATM-Kinase (Ataxia Telangiectasia Mutated) eine zentrale Rolle, indem sie die Phosphorylierung der Histonvariante H2AX bei Ser139 (γH2AX genannt) um die Läsion16katalysiert. Dieses frühe Ereignis ist verantwortlich für die Rekrutierung zusätzlicher Reparaturfaktoren und die Initiierung nachgelagerter Reparaturprozesse. Obwohl die genaue Funktion der rekrutierten Proteine im Reparaturfokus noch nicht vollständig charakterisiert ist, wurden die Bildung und die Dynamik von Reparaturherden von mehreren Laboren untersucht. Diese Marker werden ausgiebig verwendet, um die Reparaturkinetik zu verfolgen, aber ihre genaue Rolle während des Reparaturprozesses bleibt schwer fassbar. Aufgrund der großen Bedeutung, aber des schlechten Verständnisses von DNA-Reparatur-bezogenen zellulären Prozessen wurden bisher mehrere Methoden entwickelt, um die DDR zu induzieren und zu visualisieren.

Verschiedene Methoden und Systeme wurden etabliert, um die gewünschte Art von DNA-Schäden zu induzieren. Zum Beispiel können einige Wirkstoffe [wie Neocarzinostatin (NCS), Phleomycin, Bleomycin, γ-Bestrahlung, UV] eine große Anzahl von zufälligen DNA-Brüchen an nicht prädiktiven genomischen Positionen induzieren, während andere (Endonukleasen wie AsiSI, I-PpoI oder I-SceI sowie Laser striping) DNA-Brüche an bekannten genomischen Loci17,18,19,20,21induzieren können . Hier konzentrieren wir uns auf die endonukleasebasierten Techniken, die derzeit zur Untersuchung der DDR in Säugetier- und Hefezellen verwendet werden. Abgesehen davon, dass wir die Prinzipien dieser Techniken hervorheben, betonen wir sowohl ihre Vor- als auch Nachteile.

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Protocol

1. Immundetektion spezifischer Proteine

  1. Vorbereitung der Zellkultur und des Versuchsaufbaus
    1. Halten Sie U2OS-Zellen in Monoschichten in DMEM-Kulturmedium, ergänzt mit 10% fetalem Kälberserum, 2 mM Glutamin und 1% antibiotisch-antimykotischer Lösung.
      HINWEIS: Verwenden Sie für die Induktion von DNA-Schäden auf Endonukleasebasis holzkohlebehandeltes oder steroidfreies Medium, um Systemleckagen zu vermeiden.
    2. Züchten Sie Zellen in einer befeuchteten 5% CO2 Umgebung bei 37 °C bis 80% Konfluenz, wobei das Medium alle 2-3 Tage erneuert wird.
    3. Saugen Sie das Medium an und waschen Sie die Zellen mit 1x PBS. Zellen mit Trypsin-EDTA-Lösung lösen. Wenn sich die Zellen lösen, stoppen Sie die Trypsinaktivität, indem Sie den Zellen Kulturmedium hinzufügen, wodurch eine Zellsuspension ergibt wird.
    4. Zählen Sie die Zellen mit einer Zellzählkammer. Platte 2 x 104 Zellen/ml/Vertiefung auf einer 24-Well-Platte, mit sterilen 12 mm runden Abdeckschichten in jeder Vertiefung.
    5. Inkubieren Sie die Zellen für 24 h bei 37 °C in einer befeuchteten 5% CO2-Atmosphäre, um die Befestigung an den Abdecklippen zu ermöglichen.
    6. Behandeln Sie die Zellen mit 10 ng/ ml Neocarzinostatin (NCS), indem Sie das schädigende Mittel direkt auf das kultivierte Medium pipettieren. Inkubieren Sie die Zellen 15 minuten lang mit dem NCS-haltigen Medium, waschen Sie sie dann mit 1x PBS und fügen Sie den Zellen frisches, ergänztes Kulturmedium hinzu. Andernfalls verwenden Sie ein geeignetes Mittel (d. h. 4-OHT), um DSBs über endonukleasebasierte Systeme zu induzieren, ohne das Medium22 aufzufrischen.
      HINWEIS: Alternativ können Sie Bestrahlung verwenden, um DNA-Schäden zu induzieren, die von 30 minuten bis zu 8 h Erholungszeit reichen, indem Sie den Neutronenfluss zwischen 2-20 Gy23verwenden.
    7. Inkubieren Sie die Zellen für 1-8 h bei 37 °C in einer befeuchteten 5% CO2-Atmosphäre, um der Kinetik der DNA-Reparatur zu folgen.
  2. Fixierung von Zellen
    HINWEIS: 300-500 μL Lösungen/Vertiefung sollten in den folgenden Schritten (Schritte 1.2-1.5) verwendet werden, um alle Zellen angemessen abzudecken. Jeder Inkubations- und Waschschritt (mit Ausnahme der Antikörperinkubation) sollte auf einem Orbitalschüttler mit sanftem Rühren durchgeführt werden.
    1. Nach DSB-Induktion und Inkubation der Zellen das Medium aus den angeschlossenen Zellen entfernen und die Zellen einmal mit 1x PBS waschen.
    2. Fixieren Sie Zellen mit 4% Formaldehyd-PBS-Lösung für 20 min bei 25 °C.
  3. Permeabilisierung von Zellen
    1. Entfernen Sie die Befestigungslösung und waschen Sie die Zellen dreimal mit 1x PBS für jeweils 5 min.
    2. Entfernen Sie das PBS und fügen Sie 0,2% Triton X-100 in PBS gelöst hinzu. Inkubieren Sie die Proben für 20 Min.
  4. Blockieren von unspezifischen Bindungsseiten
    1. Waschen Sie die Zellen dreimal mit 1x PBS.
    2. Blockieren Sie unspezifische Bindungsstellen mit 5% BSA (Bovine Serum Fraction V Albumin), verdünnt in PBST (1x PBS ergänzt mit 0,1% Tween-20), und inkubieren Sie die permeabilisierten Proben für mindestens 20 Minuten.
  5. Immunfluoreszenzfärbung
    1. Fügen Sie die richtige Menge an primärem Antikörper (d. H. Anti-γH2AX, Anti-DNA-PKcs) hinzu, der in 1% iger BSA-PBST-Lösung verdünnt ist. Legen Sie jeden Coverlip kopfüber auf einen Paraffinfilm über einem 10 μL-Tröpfchen des verdünnten Anti-γH2AX-Antikörpers.
      HINWEIS: Im Falle einer Co-Immunfärbung verdünnen Sie beide Antikörper angemessen in derselben 1% igen BSA-PBST-Lösung.
    2. Inkubieren Sie die Proben in einer Feuchtkammer für 1,5 h bei 4 °C.
      HINWEIS: Die Inkubation kann auch bei 4 °C über Nacht durchgeführt werden.
    3. Legen Sie die Abdecklappen wieder seitlich nach oben in die 24-Well-Platte und waschen Sie sie dreimal für 5 min mit 1x PBS.
    4. Fügen Sie die richtige Menge an sekundärem Antikörper hinzu, der in 1% BSA-PBST verdünnt ist. Legen Sie jeden Coverlip kopfüber auf einen Paraffinfilm über einem 10 μL-Tröpfchen des verdünnten Antikörpers.
    5. Inkubieren Sie die Proben in einer Feuchtigkeitskammer bei 4 °C für 1 h.
    6. Legen Sie die Abdecklappen wieder seitlich nach oben in die 24-Well-Platte und waschen Sie sie dreimal für 5 min mit 1x PBS.
    7. Bevor Sie die letzte PBS-Waschlösung entfernen, nehmen Sie die Abdeckfolien vorsichtig mit einer Pinzette und einer Nadel heraus und legen Sie sie dann kopfüber auf Glasobjektträger mit Tröpfchen Montagemedium (ergänzt mit DAPI).
      HINWEIS: Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen. Wenn das Montagemedium trocknet, wird empfohlen, die Kanten der Abdecklippen mit Nagellack zu versiegeln, um ein Schrumpfen der Proben zu verhindern.

2. Chromatin-Immunpräzipitation

  1. Zellsammlung, Vernetzung, Zell- und Kernlyse und DNA-Fragmentierung
    1. Für jede Probe ca. 5 x10 6 Zellen/ml in einer 150 mm Schüssel anprossen.
    2. Entfernen Sie das Kulturmedium und waschen Sie die Zellen zweimal mit eiskaltem 1x PBS.
    3. Fixieren Sie die Zellen mit 1% Formaldehyd-PBS-Lösung, legen Sie die Platten auf einen Orbitalschüttler und rühren Sie sie 20 Minuten lang vorsichtig.
      HINWEIS: Formaldehyd ist flüchtig; Bereiten Sie immer eine frische Arbeitslösung vor. In einigen Fällen enthält die Formaldehydlösung Methanol, um es zu stabilisieren, aber es ist besser, eine methanolfreie Lösung zu verwenden, um Interferenzen mit nachgeschalteten Reaktionen zu vermeiden.
    4. Stoppen Sie die Fixierung mit 125 mM Glycin und inkubieren Sie auf einem Orbitalschüttler mit sanftem Rühren für 5 min bei 25 °C.
    5. Legen Sie die Platten auf Eis und waschen Sie sie zweimal mit eiskaltem 1x PBS.
    6. Kratzen Sie die Zellen in eiskaltem 1x PBS und übertragen Sie sie in 15 mL konische Röhrchen.
    7. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 2.500 x g für 5 min bei 4 °C.
    8. Den Überstand vorsichtig absaugen und das Pellet in 2 mL Zelllysepuffer [5 mM PIPES pH 8,0, 85 mM KCl, 0,5% NP-40, 1x PIC (Protease-Inhibitor-Cocktail)] resuspendieren und 10 min auf Eis inkubieren.
    9. Zentrifuge die Zellsuspension bei 2.500 x g für 5 min bei 4 °C.
    10. Entsorgen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 500-1.500 μL Kernlysepuffer (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM EDTA pH 8,0, 0,8% SDS, 1x PIC) und inkubieren Sie auf Eis für 30-60 min. Das Lysat wird in ein konisches Polystyrolrohr überführen, das für die Beschallung geeignet ist.
      HINWEIS: Da der Kernlysepuffer SDS enthält, fällt er auf Eis aus und die Lösung wird weiß. Die Lösung sollte nach der Beschallung transparent werden.
    11. Beschallen Sie das Lysat, um DNA auf eine durchschnittliche Fragmentgröße von 300-1.000 bp zu scheren.
      HINWEIS: Die entsprechenden Beschallungszyklen und -bedingungen sollten entsprechend dem Zelltyp und der Beschallungsanlage eingestellt werden. Fragmente kleiner als 200 bp sind für ChIP nicht geeignet, da die Nukleosom-DNA-Interaktionen gestört werden können.
  2. Umkehrung der Vernetzung, Bestimmung von beschallten Fragmentgrößen
    1. Nehmen Sie 100 μL der beschallten Probe heraus, um die Fragmentgröße des beschallten Chromatins zu überprüfen. Das restliche Chromatin sollte bei −80 °C gelagert werden.
    2. Zu jeder 100 μL der Probe werden 0,5 mg/ml RNase A hinzugefügt und bei 37 °C für 20 min inkubiert, um die RNase zu aktivieren.
    3. Inkubieren Sie die Proben bei 65 °C über Nacht.
    4. Am nächsten Tag 500 μg/ml Proteinase K und 0,5% SDS hinzufügen und die Proben bei 50 °C für 3 h inkubieren.
    5. Jeder Probe werden 0,5 Volumen Phenol und 0,5 Volumen Chloroform-Isoamylalkohol -Mischung (24:1) zugeführt.
    6. Wirbel für 1 Min.
    7. Zentrifuge bei 13.000 x g für 10 min.
    8. Übertragen Sie die obere wässrige Phase in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen.
    9. Zu jeder Probe wird 1 Volumen Chloroform-Isoamyl-Alkohol-Mischung (24:1) hinzugefügt.
    10. Wirbel für 1 Min.
    11. Zentrifuge bei 13.000 x g für 10 min.
    12. Übertragen Sie die obere wässrige Phase in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen.
    13. Fügen Sie 2,5 Volumina von 96% Ethanol und 0,1 Volumen von 3 M Na-Acetat pH 5,2 hinzu.
    14. Mindestens 20 min bei −80 °C inkubieren.
    15. Zentrifuge die Proben bei 13.000 x g für 10 min bei 4 °C.
    16. Entfernen Sie das Ethanol und waschen Sie das Pellet mit 400 μL 70% Ethanol.
    17. Zentrifuge die Proben bei 13.000 x g für 10 min bei 4 °C.
    18. Ethanol entfernen und Pellet an der Luft trocknen.
    19. Das Pellet wird in 10 μL TE resuspendiert.
    20. Führen Sie die Proben mit einem 0,8% igen Agarosegel aus. Die beschallte Chromatingröße sollte etwa 500 bp betragen.
      HINWEIS: Verwenden Sie Bromphenolblau-freien Ladepuffer, da die Größe dieses Farbstoffs ungefähr 500 bp beträgt, was die ordnungsgemäße Erkennung von Chromatinfragmenten stören kann. Stattdessen wird empfohlen, einen Ladepuffer zu verwenden, der mit Xylol-Cyanol ergänzt wird, was etwa 3.000 bp entspricht.
    21. Wenn die Chromatingröße akzeptabel ist, verdünnen Sie die gefrorenen Chromatinproben aus Schritt 2.1. in 3 Volumina Verdünnungspuffer (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,5 mM EGTA pH 8,0, 1% Triton X-100, 140 mM NaCl, 1x PIC) und die Proben per Rotation für 10 min bei 4 °C mischen.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist notwendig, um das im Kernlysepuffer vorhandene SDS zu verdünnen, um Interferenzen mit nachgeschalteten Reaktionen, einschließlich der Messung der Chromatinkonzentration, zu vermeiden.
    22. Messen Sie die DNA-Konzentration der Chromatinproben bei 260/280 nm mit einem Spektralphotometer.
  3. Herstellung von Perlen, Pre-Clearing und Immunpräzipitation
    1. Bereiten Sie Perlen (Schaf-Anti-Kaninchen- oder Maus-IgG) für die Vorreinigungs- und Immunpräzipitationsschritte vor. Perlen zweimal für 10 min bei 4 °C mit RIPA-Puffer waschen (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA pH 8,0, 1% Triton X-100, 0,1% Na-DOC, 0,1% SDS, 150 mM NaCl und 1X PIC).
    2. Stellen Sie die Perlen im gleichen RIPA-Puffervolumen wie in Schritt 2.3.1 wieder ein.
    3. Vorklarieren Sie 25-30 μg Chromatin jeder Probe mit 4 μL der Perlen durch Rotation für 1-2 h bei 4 °C.
      HINWEIS: Fügen Sie jeder Chromatinprobe einen RIPA-Puffer mit bis zu 500 μL Endvolumen hinzu, damit sich die Proben unter Rotation richtig mischen können. Vergessen Sie nicht, Chromatin für NAC (No Antibody Control) und TIC (Total Input Control) bei jedem Probensatz herauszunehmen. TICs benötigen nur ein Endvolumen von bis zu 200 μL.
    4. Die Perlen mit einem Magneten ausfälzen und den Überstand in ein neues Mikrozentrifugenrohr überführen.
    5. Fügen Sie jeder Chromatinprobe (außer NAC und TIC) die entsprechende Menge an Antikörper hinzu und drehen Sie sie über Nacht bei 4 °C.
    6. Am nächsten Tag 40 μL gewaschene Perlen zu jeder Probe (außer TIC) geben und sie über Nacht bei 4 °C rotieren.
  4. Waschen
    1. Einmal mit 300 μL Low Salt Puffer (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8,0, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 1x PIC) 10 min durch Rotation bei 4 °C waschen.
    2. Einmal mit 300 μL High Salt Puffer (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 300 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8,0, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 1x PIC) 10 min durch Rotation bei 4 °C waschen.
    3. Einmal mit 300 μL LiCl-Puffer (250 mM LiCl, 1% NP-40, 1% Na-DOC, 1 mM EDTA pH 8,0, 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1x PIC) für 10 min durch Rotation bei 4 °C waschen.
    4. Zweimal mit 300 μL TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA pH 8,0) 10 min durch Rotation waschen, für die erste Wäsche bei 4 °C und die zweite Wäsche bei 25 °C.
  5. Elution
    1. 200 μL des Elutionspuffers (1% SDS und 100 mM NaHCO3)in die Perlen geben und bei 65 °C in einem Thermoschüttler 15 min unter kontinuierlichem Schütteln (ca. 400 U/min) inkubieren. Den Überstand in ein neues Röhrchen geben und die Perlen in 200 μL Elutionspuffer erneut eluieren. Kombinieren Sie Eluate (400 μL Endvolumen).
    2. NaCl wird zu einer Endkonzentration von 200 mM in jeder Probe hinzugefügt. Ergänzen Sie die TIC-Proben mit 200 μL Elutionspuffer und fügen Sie auch NaCl hinzu.
      HINWEIS: Ab diesem Schritt sollte TIC unter den gleichen Bedingungen wie die anderen Proben gehandhabt werden.
    3. Inkubieren Sie die Proben bei 65 °C (ohne Schütteln) für mindestens 6 h.
    4. Fügen Sie jeder Probe 1 ml kaltes 100% Ethanol hinzu, drehen Sie die Röhrchen zweimal, um sie zu mischen, und fallen Sie die DNA über Nacht bei −80 °C aus.
    5. Am nächsten Tag Zentrifuge für 30 min bei 13.000 x g bei 4 °C.
    6. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet mit 70% EtOH.
    7. Zentrifuge die Proben bei 13.000 x g für 10 min bei 4 °C.
    8. Entsorgen Sie den Überstand und trocknen Sie die Pellets an der Luft.
    9. Die Pellets werden in 100 μL TE resuspendiert und jeder Probe 0,5 mg/ml RNase A zugefügigt. Bei 37 °C 20 min inkubieren, um die RNase zu aktivieren.
  6. Umkehrung der Vernetzung
    1. Fügen Sie 500 μg / ml Proteinase K und 0,5% SDS hinzu und inkubieren Sie die Proben dann bei 50 °C für 2 h.
      HINWEIS: Wenn Sie mit ChIP-seq fortfahren, vermeiden Sie die Phenol-Chloroform-Extraktion, da sie den nachgelagerten NGS-Prozess hemmt. Stattdessen wird empfohlen, ein handelsübliches Kit zu verwenden (siehe Materialtabelle).
    2. Jeder Probe werden 0,5 Volumen Phenol und 0,5 Volumen Chloroform-Isoamylalkohol-Mischung (24:1) zugeführt.
    3. Wirbel für 1 Min.
    4. Zentrifuge bei 13.000 x g für 10 min.
    5. Übertragen Sie die obere wässrige Phase in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen.
    6. Fügen Sie jeder Probe 1 Volumen Chloroform-Isoamyl-Alkoholmischung (24:1) hinzu.
    7. Wirbel für 1 Min.
    8. Zentrifuge bei 13.000 x g für 10 min.
    9. Übertragen Sie die obere wässrige Phase in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen.
  7. DNA-Extraktion
    1. Fügen Sie 2,5 Volumina von 96% Ethanol und 0,1 Volumen von 3 M Na-Acetat pH 5,2 hinzu.
    2. Mindestens 20 min bei −80 °C inkubieren.
    3. Zentrifuge die Proben bei 13.000 x g für 10 min bei 4 °C.
    4. Entfernen Sie das Ethanol und waschen Sie das Pellet mit 400 μL 70% Ethanol.
    5. Zentrifuge die Proben bei 13.000 x g für 10 min bei 4 °C.
    6. Ethanol entfernen und Pellet an der Luft trocknen.
    7. Das Pellet wird in 50 μL TE resuspendiert.

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Representative Results

Die Untersuchung ortsgerichteter DSB-induzierter Reparaturprozesse in Zellen kann entweder durch stabile oder transiente Transfektion erreicht werden. Es ist jedoch zu beachten, dass eine stabile Transfektion eine homogene Zellpopulation gewährleistet, die eine einheitliche und damit zuverlässigere zelluläre Reaktion ergibt. Bei der transienten Transfektion nimmt nur ein kleiner Teil der Zellpopulation das Plasmid auf und erhält es, was Diversität in das Experiment einführt. Die Etablierung von ER-I-PpoI- oder ER-AsiSI-Endonuklease-basierten Zellsystemen erfordert eine 50% konfluente Zellpopulation, die effektiver mit Plasmiden transfiziert wird, die die Endonuklease kodieren. Für die Transfektion können auch handelsübliche Transfektionsreagenzien oder auf Virusinfektionen basierende Methoden verwendet werden. Soll eine mikroskopische Visualisierungstechnik angewendet werden und eine transiente Transfektion erforderlich sein, können die gerichteten DSBs durch 4-OHT-Addition 24 h nach der Transfektion induziert werden, die an die ER-verschmolzenen Endonukleasen bindet und die kerne Translokation und DSB-Induktion ermöglicht. Um die am besten geeigneten Zeitpunkte zu bestimmen, können Immunfluoreszenz-basierte Mikroskopie und Western-Blot-Nachweis von γH2AX zu verschiedenen Zeitpunkten nach 4-OHT-Behandlung durchgeführt werden. Unter physiologischen Bedingungen können maximal 10-15 γH2AX-Herde pro Zelle nachgewiesen werden, und die Bildung starker Reparaturherde kann durch Endonukleasen (oder verschiedene andere Techniken, die hier nicht besprochen werden, z. B. Lasermikrostrahlung) ausgelöst werden. Eine typische I-PpoI-Endonuklease führt zur Bildung erhöhter γH2AX-Signale um den Nukleolus herum, indem DSBs an ribosomaler DNA (rDNA) induziert werden. Wenn die Brüche von NHEJ oder HR repariert werden, nimmt die Anzahl der Reparaturherde mit der Zeit ab. Aus diesem Grund werden repräsentative Zeitpunkte bei 0 h, 30 min, 1, 2, 4 und 8 h nach 4-OHT-Behandlungen empfohlen. Um DNA-Reparaturprozesse zu verfolgen, ist die am häufigsten verwendete Zelllinie U2OS, da alle bekannten Reparaturwege in diesen Zellen voll funktionsfähig sind. Bei der Untersuchung mehrerer Proteine in denselben Zellen kann die Colokalisierung durch die Kombination von Antikörpern untersucht werden, die mit verschiedenen Fluorophoren mit unterschiedlichen Emissionswellenlängen konjugiert sind, die bei verschiedenen Tierarten gezüchtet wurden, wie in Abbildung 1gezeigt. Darin wird die Induktion von DSBs über eine induzierbare stabile Zelllinie dargestellt, die auf der mit Hämagglutinin-Tag (HA) verschmolzenen ER-AsiSI-Restriktionsendonuklease basiert. Doxycyclin kann die Expression und Sequestrierung von HA-ER-AsiSI im Zytoplasma induzieren, die mit einem Antikörper gegen HA verfolgt werden kann(Abbildung 1. dritte Säule, zweite roh). Die Inkubation für 4 h mit 4 OHT, 24 h nach Doxycyclin-Addition, kann eine hohe Anzahl von DSBs induzieren, da die Endonuklease in den Kern transloziert wurde(Abbildung 1. dritte Säule, dritte rohe und zweite Säule, dritte roh). DSBs können mit einem Antikörper visualisiert werden, der γH2AX erkennt.

Figure 1
Abbildung 1: Die Immunfluoreszenzmikroskopie wird verwendet, um γH2AX in kultivierten Zellen nachzuweisen, die HA-ER-AsiSI exprimieren. DoX (Doxycyclin) Addition aktiviert die zytoplasmatische Expression von HA-ER-AsiSI und 4-OHT (4-Hydroxytamoxifen) (4 h) induziert die kerne Translokation des Fusionsproteins, was zur Induktion von DSBs an bekannten genomischen Positionen führt. Die HA (Hämagglutinin)-Färbung (Anti-HA-Antikörper) stellt das HA-ER-AsiSI-Fusionsprotein in Grün dar, und die Induktion von Brüchen wird durch γH2AX-Färbung (Anti-γH2AX-Antikörper) in Rot bestätigt. Maßstabsbalken stellen 20 μm dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Co-Lokalisation von Reparaturproteinen an der Schadensstelle deutet darauf hin, dass sie an derselben DNA-Läsionsstelle rekrutiert werden, aber sie interagieren nicht unbedingt miteinander. Die Auflösung der konfokalen Mikroskopie beträgt ca. 300 nm; Um das Bindungsmuster spezifischer Reparaturproteine an der Bruchstelle zu bestimmen, wird stattdessen die hochauflösende Mikroskopie (STORM) empfohlen 24. Diese Methode erfordert jedoch teure mikroskopische Geräte und einen erfahrenen Forscher. Alternativ kann das Bindungsmuster der Reparaturproteine durch Chromatin-Immunpräzipitation mit stabilen DIvA- oder U2OS-pEP15-Zelllinien untersucht werden, die AsiSI- und I-PpoI-Endonukleasen reguliert exprimieren können, bzw.17,21. Bei 4-OHT-Addition können beide Endonukleasen die DNA sequenzspezifisch schneiden, was uns die Möglichkeit bietet, locusspezifische Primer für die erwarteten Bruchstellen und ihre umgebenden genomischen Regionen zu entwerfen. Durch die Anwendung des γH2AX-Antikörpers im Immunpräzipitationsteil des ChIP können wir die DNA-Reparaturkinetik unter verschiedenen Bedingungen (z. B. Stummschaltung oder Hemmung bestimmter Reparaturfaktoren von Interesse, z. B. DNA-PKcs) zeitlich verfolgen. Ein typisches experimentelles Ergebnis, das mit ChIP-qPCR erzielt wurde, ist in Abbildung 2dargestellt. Darin wird die zeitliche Anreicherung von γH2AX als Reaktion auf I-PpoI-induzierte DNA-Schäden nachgewiesen. Im linken Teil des Bildes wird das rechtzeitig detektierte γH2AX-Signal an der Bruchstelle gezeigt, während im rechten Teil die γH2AX-Verteilung in einer Kontrollgenregion dargestellt wird, in der DSBs nicht induziert wurden.

Figure 2
Abbildung 2: Zeitliche Anreicherung von γH2AX, bestimmt durch Chromatin-Immunpräzipitation als Reaktion auf I-PpoI-induzierte DNA-Schäden. Links, γH2AX-Signal an der Pausenstelle; rechts, γH2AX-Verteilung in einer Kontrollregion, in der DSBs nicht induziert wurden (Anti-γH2AX-Antikörper). Die dargestellten Ergebnisse stammen aus einem biologischen Experiment, und Fehlerbalken zeigen die Variationen der entsprechenden Probenreplikate an. N=3. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Obwohl die DNA-Reparatur ein relativ neues Forschungsgebiet ist, erweitert sich unser Wissen mit Hilfe verschiedener biochemischer und mikroskopischer Methoden rasant. Die Erhaltung der genetischen Information ist für Zellen von entscheidender Bedeutung, da Mutationen, die in Genen auftreten, die an Reparaturprozessen beteiligt sind, zu den Hauptursachen für Tumorgenese gehören und daher die Aufklärung der wichtigsten Schritte von DNA-Reparaturwegen unerlässlich ist.

Biochemische Techniken (z.B. Western Blot, Immunpräzipitation, Massenspektrometrie etc.) erfordern eine große Anzahl von Zellen und die untersuchten Reparaturprozesse stellen eine Momentaufnahme der gewünschten Zellpopulation dar. Die Durchführung von ChIP-Experimenten ist mühsam, mühsam und viele Überlegungen müssen bei der Entwicklung eines spezifischen Experiments berücksichtigt werden, um den Prozess der DSB-Reparatur zu untersuchen. Die folgenden Schritte sind einige Beispiele: (I) Zellen sollten richtig lysiert werden; Es wird dringend empfohlen, ein zweistufiges Lysationsverfahren unter Verwendung eines separaten Zell- und Kernlysepuffers anzuwenden, um eine höhere Zugänglichkeit zur Chromatinfraktion (II) zu gewährleisten. Die geeigneten Beschallungsbedingungen sollten für jeden Zelltyp vorher optimiert werden (III) die geeignete Menge an gereinigtem Antikörper sollte bestimmt werden, da Antikörper gegen dasselbe Protein aus verschiedenen Unternehmen nicht identische Eigenschaften aufweisen (IV) für die effiziente Immunpräzipitation, 25-30 ug Anfangschromatin sollte in jeder Bedingung verwendet werden (V) der geeignete Zeitpunkt der Fixierung sollte optimiert werden, Da eine Überfixierung durch Vernetzung der entfernten Proteinkomplexe zu falsch positiven Ergebnissen führen kann und eine Unterfixierung die ordnungsgemäße Vernetzung zwischen DNA und dem gewünschten Protein (VI) auf der Grundlage des angewendeten Antikörpers verhindern kann, sollte die Art der Perlen (Protein A oder G) während der Waschschritte sorgfältig bestimmt werden (VII), die Reihenfolge der Waschpuffer sollte gründlich eingehalten werden, um die Freisetzung des Antikörpers aus den Perlen (VIII) während der DNA-Extraktion zu vermeiden. Phenolspuren sollten ordnungsgemäß eliminiert werden, um eine Verringerung der Effizienz der weiteren nachgelagerten Reaktionen zu vermeiden. Da diese Methode die Ausbeute an wiedergewonnener DNA reduziert, ist unser persönlicher Rat, lieber ein spezifisches DNA-Reinigungskit zu verwenden. Wenn alle kritischen Punkte richtig adressiert sind, kann ChIP wertvolle Daten für die Belegung des gewünschten Proteins an verschiedenen genomischen Loci liefern und kritische Schritte in DNA-Reparaturprozessen entschlüsseln.

ChIP in Kombination mit qPCR ist jedoch ein indirekter Ansatz zur Untersuchung der Proteinverteilung in ausgewählten genomischen Regionen und erlaubt es nicht, die DNA-Bindungsstelle spezifisch zu erkennen oder die Funktion des Proteins direkt zu untersuchen. Mono- oder polyklonale Antikörper, die zur Erfassung der Protein-DNA-Komplexe verwendet werden, können auch mit anderen Proteinen kreuzreagieren, was zu falsch-positiven Daten führt, und daher sollten die in dieser Technik verwendeten Antikörper ChIP-grad und hochspezifisch gegen das interessierende Protein sein. ChIP ist jedoch eine weit verbreitete Technik und es wurden weitere darauf basierende Ansätze entwickelt, wie ChIP-on-Chip und ChIP-seq. Ersteres beruht auf der Hybridisierung der immunpräzipitierten und gereinigten DNA-Fragmente auf einem Microarray mit einer Vielzahl kleiner zufälliger DNA-Sequenzen, die die geglühten Sequenzen weiter amplifizieren und wertvolle Informationen über Proteinbindungsstellen liefern. ChIP-seq hat sich jedoch als attraktiver alternativer Ansatz herausgestellt, da es eine genomweite Kartierung von Protein-DNA-Komplexen mit höherer Auflösung als ChIP-on-Chip und Hochdurchsatz-Genomsequenzierung bietet. ChIP-seq hat das Gebiet der DNA-Reparatur revolutioniert, indem es DNA-Bindungsstellen verschiedener Transkriptionsfaktoren offenlegen hat, die Einblicke in die Genregulation und die Entschlüsselung von Chromatinlandschaften in einer genomweiten Skala bieten25. Demnach hat der Bereich der DNA-Reparatur enorm von ChIP-seq profitiert, da diese Daten eine entscheidende Rolle bei verschiedenen Krankheiten und biologischen Signalwegen wie dem Fortschreiten von Krebs spielen. Nichtsdestotrotz wurden verschiedene Modifikationen der ChIP-Methode entwickelt, wie HaloChIP, das keine spezifischen Antikörper gegen das interessierende Protein benötigt, sondern Sequenzen verwendet, die für mit HaloTag verschmolzene DNA-bindende Proteine kodieren, die zu Zellen transfiziert werden und anschließend die gewünschten Protein-DNA-Komplexe mit HaloLink-Harz erfasst werden können. Diese Technik beruht jedoch auf überexpression und nicht auf dem endogenen Niveau der gewünschten Proteine, was zu falsch interpretierten Daten führen kann26.

Darüber hinaus liefern mikroskopische Techniken wertvolle Informationen über die raumzeitliche Verfolgung der DNA-Schadensreparatur, auch auf Einzelzellebene. Die schnelle Verbesserung von Antikörpern, die gegen spezifische Reparaturproteine gebildet werden, hat zu einem tieferen Verständnis des Mechanismus der NER- und DSBR-Subwege sowie ihrer post-translationalen Regulation geführt. Das mikroskopische Feld wurde durch hochauflösende Techniken wie die hochauflösende Mikroskopie revolutioniert, die die Visualisierung von DNA-schädigend induzierten zellulären Prozessen auf nukleosomaler Ebene sowie die genaue Kartierung der Protein-Co-Lokalisation ermöglicht24. Es sollte jedoch beachtet werden, dass die Varianz in den Zelllinien während des Experiments berücksichtigt werden muss, da die Reparaturrate divergieren kann, was die Interpretation der Ergebnisse erschweren kann. In Anbetracht der rasanten Entwicklung der Fluoreszenzbildgebung und der bewussten Gestaltung des Versuchsaufbaus ist eine wertvolle Gelegenheit, die DNA-schädigenden zellulären und molekularen Reaktionen bei einer einzigen Proteinauflösung auf Einzelzellebene zu untersuchen, auf dem Weg zur Perfektion.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Kombination aus hochauflösender Mikroskopie und Einzelzellsequenzierungsmethodik unser Verständnis des DNA-Reparaturfeldes erheblich verbessern kann.

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Disclosures

Nichts

Acknowledgments

Diese Forschung wurde durch das National Research, Development and Innovation Office Grant GINOP-2.3.2-15-2016-00020, GINOP-2.3.2-15-2016-00036, GINOP-2.2.1-15-2017-00052, EFOP 3.6.3-VEKOP-16-2017-00009, NKFI-FK 132080, das János Bolyai Research Scholarship der Ungarischen Akademie der Wissenschaften BO/27/20, ÚNKP-20-5-SZTE-265, EMBO Short-Term Fellowship 8513 und die Tempus Foundation finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-OHT Sigma Aldrich H7904
Agarose Lonza 50004
Antibiotic-Antimycotic Solution (100×), Stabilized Sigma Aldrich A5955
Anti-gamma H2A.X (phospho S139) antibody Abcam ab26350
Bovine Serum Fraction V albumin Biosera PM-T1725
TrackIt™ Cyan/Yellow Loading Buffer Thermo Fisher Scientific 10482035
DMEM with 1.0 g/L Glucose, without L-Glutamine Lonza 12-707F
Doxycycline Sigma Aldrich D9891
Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Mouse IgG Invitrogen 11202D
Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Rabbit IgG Invitrogen 11204D
EDTA Sigma Aldrich E6758
EGTA Sigma Aldrich E3889
Ethanol Molar Chemicals 02910-101-340
Fetal Bovine Serum (South America Origin), EU-approved Gibco ECS0180L
Formaldehyde 37% solution free from acid Sigma Aldrich 1.03999
GlutaMAX™ Supplement Thermo Fisher Scientific 35050038
Glycine Sigma Aldrich 50046
IPure kit v2 Diagenode C03010015
Isoamyl alcohol Sigma Aldrich W205702
LiCl Sigma Aldrich L9650
NaCl Sigma Aldrich S5886
Na-DOC Sigma Aldrich D6750
NaHCO3 Sigma Aldrich S5761
Neocarzinostatin from Streptomyces carzinostaticus Sigma Aldrich N9162
NP-40 Sigma Aldrich I8896
PBS Powder without Ca2+, Mg2+ Sigma Aldrich L182-50-BC
Phenol Sigma Aldrich P4557
PIPES Sigma Aldrich P1851
Polysorbate 20 (Tween 20) Molar Chemicals 09400-203-190
KCl Sigma Aldrich P5405
ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI Thermo Fisher Scientific P36935
Protease Inhibitor Cocktail Set I Roche 11873580001
Proteinase K Sigma Aldrich P2308
P-S2056 DNAPKcs antibody Abcam ab18192
RNase A Roche 10109169001
CH3COONa Sigma Aldrich S2889
SDS Sigma Aldrich L3771
Tris Acetate-EDTA buffer Sigma Aldrich T6025
Tris-HCl Sigma Aldrich 91228
TRITON X-100 Molar Chemicals 09370-006-340
Trypsin from porcine pancreas Sigma Aldrich T4799
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red Gibco 15400054

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References

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Biologie Ausgabe 174 DNA-Reparatur Chromatin-Immunpräzipitation Fluoreszenzmikroskopie ortsspezifische DSBs Immunfärbung
Visualisierung und Quantifizierung endonukleasebasierter ortsspezifischer DNA-Schäden
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Pantazi, V., Berzsenyi, I., Borsos, B. N., Pankotai, T. Visualizing and Quantifying Endonuclease-Based Site-Specific DNA Damage. J. Vis. Exp. (174), e62175, doi:10.3791/62175 (2021).

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