Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Fluorescensbaserede målinger af fosfatylserin/Fosfatylinositol 4-fosfatudveksling mellem membraner

Published: March 14, 2021 doi: 10.3791/62177
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Université Côte d’Azur, Centre National de la Recherche Scientifique, Institut de Pharmacologie Moléculaire et Cellulaire
* These authors contributed equally

Summary

Her beskriver vi protokoller ved hjælp af fluorescerende lipidsensorer og liposomer for at afgøre, om et protein ekstrakter og transporterer fosfattidylserin eller fosfattidylinositol 4-fosfat in vitro.

Abstract

Flere medlemmer af den evolutionært bevarede oxysterolbindende protein (OSBP)-relaterede proteiner(ORP)/OSBP homologs (Osh) familie har for nylig vist sig at repræsentere en ny lipidoverførselsproteingruppe (LTP) i gær og menneskelige celler. De overfører fosfattidylserin (PS) fra endoplasmisk reticulum (ER) til plasmamembranen (PM) via PS/fosphatidylinositol 4-fosfat (PI(4)P) udvekslingscyklusser. Dette fund giver en bedre forståelse af, hvordan PS, som er afgørende for signalprocesser, fordeles i hele cellen og undersøgelsen af forbindelsen mellem denne proces og fosfoinositide (PIP) metabolisme. Udviklingen af nye fluorescensbaserede protokoller har været medvirkende til opdagelsen og karakteriseringen af denne nye cellulære mekanisme in vitro på molekylært niveau. Dette papir beskriver produktionen og brugen af to fluorescerende mærket lipid sensorer, NBD-C2Lact og NBD-PHFAPP, at måle evne til et protein til at udtrække PS eller PI(4)P og til at overføre disse lipider mellem kunstige membraner. For det første beskriver protokollen, hvordan man producerer, mærker og opnår prøver med høj renhed af disse to konstruktioner. For det andet forklarer dette papir, hvordan man bruger disse sensorer med en fluorescens mikropladelæser til at afgøre, om et protein kan udtrække PS eller PI(4)P fra liposomer ved hjælp af Osh6p som et casestudie. Endelig viser denne protokol, hvordan man præcist måler kinetikken i PS/PI(4)P-udvekslingen mellem liposomer af defineret lipidsammensætning og til at bestemme lipidoverførselshastigheder ved fluorescens resonansenergioverførsel (FRET) ved hjælp af et standard fluorometer.

Introduction

Den præcise fordeling af lipider mellem forskellige membraner og inden for membranerne i eukaryote celler1,2 har dybe biologiske konsekvenser. Dekryptering af, hvordan LTP'er fungerer, er et vigtigt emne i cellebiologi3,4,5,6og in vitro-tilgange er af stor værdi i forbindelse med håndteringen af dette problem7,8,9,10,11. Her præsenteres en in vitro, fluorescensbaseret strategi, der har været medvirkende til at fastslå, at flere ORP /Osh proteiner effekt PS / PI(4)P udveksling mellem cellemembraner12 og dermed udgør en ny klasse af LTPs. PS er en anionisk glycerophospholipid, der repræsenterer 2-10% af den samlede membran lipider i eukaryote celler13,14,16. Det fordeles langs en gradient mellem ER og PM, hvor det repræsenterer henholdsvis 5-7% og op til 30% af glycerofoflipider, henholdsvis17,18,19. Desuden er PS hovedsagelig koncentreret i pm'ens cytosoliske folder. Denne opbygning og den ujævne partition af PS i PM er afgørende for cellulære signalprocesser19. På grund af den negative ladning af PS-molekyler er pm'ens cytosoliske folder meget mere anionisk end den cytosoliske folder af andre organeller1,2,19,20. Dette gør det muligt at rekruttere, via elektrostatiske kræfter, af signalering proteiner såsom myristoyleret alanin-rige C-kinase substrat (MARCKS)21, sarkom (Src)22, Kirsten-rotte sarkom viral onkogen (K-Ras)23, og Ras-relaterede C3 botulinum toksin substrat 1 (Rac1)24, der indeholder en strækning af positivt ladede aminosyrer og en lipidisk hale.

PS er også anerkendt af konventionelle protein kinase C i en stereovalgiv måde via en C2 domæne25. PS er dog syntetiseret i ER26, hvilket indikerer, at det skal eksporteres til PM, før det kan spille sin rolle. Det var ikke kendt, hvordan dette blev opnået19 indtil konstateringen af, at i gær, Osh6p og Osh7p overføre PS fra ER til PM27. Disse LTPs tilhører en evolutionært bevaret familie i eukaryoter, hvis stiftende medlem er OSBP, og som indeholder proteiner (ORPs i menneskelige, Osh proteiner i gær) integrere en OSBP-relaterede domæne (ORD) med en lomme til at være vært for en lipid molekyle. Osh6p og Osh7p består kun af en ORD, hvis strukturelle egenskaber er tilpasset til specifikt at binde PS og overføre det mellem membraner. Ikke desto mindre var det uklart, hvordan disse proteiner retningsvis overførte PS fra skadestuen til statsministeren. Osh6p og Osh7p kan fælde PI(4)P som en alternativ lipid ligand12. I gær syntetiseres PI(4)P fra fosfattidylinositol (PI) i Golgi og PM af pi 4-kinaser, Pik1p og Stt4p. I modsætning hertil er der ingen PI(4)P i ER-membranen, da denne lipid hydrolyseres til PI af Sac1p fosfatase. Der findes derfor et PI(4)P-forløb på både ER/Golgi- og ER/PM-grænsefladerne. Osh6p og Osh7p overfører PS fra skadestuen til PM via PS/PI(4)P-udvekslingscyklusser ved hjælp af den PI(4)P-gradient, der findes mellem disse to membraner12.

Inden for en cyklus udvinder Osh6p PS fra skadestuen, ombytter PS for PI(4)P ved pm og overfører PI(4)P tilbage til skadestuen for at udtrække et andet PS-molekyle. Osh6p/Osh7p interagerer med Ist2p28, et af de få proteiner, der forbinder og bringer ER-membranen og PM i nærheden af hinanden for at skabe ER-PM kontaktsteder i gær29,30,31. Derudover bliver sammenslutningen af Osh6p med negativt ladede membraner svag, så snart proteinet ekstraherer en af sine lipid ligander på grund af en kropsbygningsændring, der ændrer dens elektrostatiske egenskaber32. Dette hjælper Osh6p ved at forkorte sin membran opholdstid, og dermed opretholde effektiviteten af sin lipid overførsel aktivitet. Kombineret med bindingen til Ist2p kan denne mekanisme gøre det muligt for Osh6p/7p både hurtigt og præcist at udføre lipidudveksling på ER / PM-grænsefladen. I humane celler udfører ORP5- og ORP8-proteiner PS/PI(4)P-udveksling på ER-PM kontaktsteder via forskellige mekanismer33. De har en central ORD, beslægtet med Osh6p, men er direkte forankret til SKADESTUEN via en C-terminal transmembrane segment33 og dock i PM via en N-terminal Pleckstrin homology (PH) domæne, der anerkender PI (4)P og PI(4,5) P233,34,35. ORP5/8 bruger PI(4)P til at overføre PS, og det har vist sig, at ORP5/8 desuden regulerer PM PI(4,5)P2-niveauer og formodentlig modulerer signalveje. Til gengæld sænker et fald i PI(4)P og PI(4,5)P2 niveauer ORP5/ORP8-aktiviteten, da disse proteiner forbinder med PM på en PIP-afhængig måde. Unormalt høj PS syntese, hvilket fører til Lenz-Majewski syndrom, påvirker PI(4)P niveauer gennem ORP5/836. Når aktiviteten af begge proteiner er blokeret, ps bliver mindre rigelige ved PM, sænke oncogenic kapacitet signalering proteiner37.

Omvendt, ORP5 overekspression synes at fremme kræft celle invasion og metastatiske processer38. Således kan ændringer til ORP5/8 aktivitet alvorligt ændre cellulær adfærd gennem ændringer i lipid homøostase. Endvidere besætter ORP5 og ORP8 ER-mitokondrier kontaktsteder og bevarer nogle mitokondriefunktioner, muligvis ved at levere PS39. Derudover lokaliserer ORP5 til ER-lipid droplet kontakt sites til at levere PS til lipid dråber af PS / PI (4) P udveksling40. Den strategi, der er beskrevet heri for at måle (i) PS og PI(4)P udvinding fra liposomer og (ii) PS og PI(4)P transport mellem liposomer er blevet udtænkt til at etablere og analysere PS / PI(4)P udveksling aktivitet Osh6p/ Osh7p12,32 og anvendes af andre grupper til at analysere aktiviteten af ORP5/ORP835 og andre LTPs10, 41. Den er baseret på brugen af en fluorescenspladelæser, et standard spektrofluorometer i L-format og to fluorescerende sensorer, NBD-C2Lact og NBD-PHFAPP, der kan registrere henholdsvis PS og PI(4)P.

NBD-C2Lact svarer til C2-domænet for glycoproteinet lactadherin, der blev omlagt til at omfatte en unik opløsningsmiddeludlagt cystein nær det formodede PS-bindingssted. en polaritetsfølsom NBD (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol) fluorophore er kovalent forbundet med denne rest (figur 1A)12. For at være mere præcis blev C2-domænet lactadherin (Bos taurus, UniProt: Q95114,restprodukter 270-427) klonet til en pGEX-4T3 vektor, der skal udtrykkes i fusion med glutathion S-transferase (GST) i Escherichia coli. C2Lact-sekvensen blev derefter muteret for at erstatte to opløsningsmiddeltilgængelige cysteinrester (C270, C427) med alaninrester og for at indføre en cysteinrester i et område nær det putative PS-bindingssted (H352C-mutation), der efterfølgende kan mærkes med N,N'-dimethyl-N-(iodoacetyl)-N'-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl) ethylendiamin (IANBD) 12. Et kavalergangssted for thrombin er til stede mellem GST-proteinet og N-terminus af C2-domænet. En stor fordel er , at dette domæne selektivt anerkender PS på en Ca2+-uafhængig måde i modsætning til andre kendte C2-domæner eller Annexin A542. NBD-PHFAPP er afledt af PH-domænet for det humane firephosphat-adapterprotein 1 (FAPP1), som blev reengineered til at omfatte en enkelt opløsningsmiddeleksponeret cystein, der kan mærkes med en NBD-gruppe i nærheden af PI(4)P bindingsstedet (Figur 1A)43. Nukleotidsekvensen af PH-domænet for det humane FAPP-protein (UniProt: Q9HB20, segment [1-100]) er blevet klonet til en pGEX-4T3 vektor, der skal udtrykkes sammen med et GST-tag. PHFAPP-sekvensen er blevet ændret for at indsætte en unik cysteinrest iproteinets membranbindende grænseflade 43. Desuden er der indført en ni-rest linker mellem thrombin kavalergangsstedet og N-terminus af PH-domænet for at sikre adgang til protease.

For at måle PS-ekstraktion fra liposomer blandes NBD-C2Lact med liposomer lavet af fosfatylcholin (PC), der indeholder spormængder af PS. På grund af dets affinitet for PS binder denne konstruktion sig til liposomer, og NBD fluorophore oplever en ændring i polariteten, da den kommer i kontakt med membranens hydrofobiske miljø, hvilket fremkalder et blåt skift og en stigning i fluorescens. Hvis PS udvindes næsten fuldstændigt af en stoichiometrisk mængde LTP, forbinder sonden ikke med liposomer, og NBD-signalet er lavere (Figur 1B)32. Denne forskel i signal bruges til at afgøre, om en LTP (f.eks Osh6p) udtrækker PS. En lignende strategi anvendes sammen med NBD-PHFAPP til måling af PI(4)P -udvinding (figur 1B), som beskrevet tidligere12,32. To FRET-baserede analyser var designet til (i) at måle PS-transport fra LA til LB liposomer, som efterligner henholdsvis ER-membranen og PM og (ii) PI(4)P-transport i den modsatte retning. Disse analyser udføres under de samme betingelser (dvs. samme buffer, temperatur og lipidkoncentration) for at måle PS/PI(4)P-udveksling. For at måle PS transport blandes NBD-C2Lact med LA liposomer bestående af PC og dopet med 5 mol% PS og 2 mol% af en fluorescerende rhodamin-mærket fosfatylethanolamin (Rhod-PE)-og LB liposomer, der indeholder 5 mol% PI(4)P.

På tid nul slukker FRET med Rhod-PE NBD fluorescens. Hvis PS transporteres fra LA til LB liposomer (f.eks. ved injektion af Osh6p), opstår der en hurtig dequenching på grund af translokationen af NBD-C2Lact-molekyler fra LA til LB liposomer (Figur 1C). I betragtning af mængden af tilgængelige PS forbliver NBD-C2Lact hovedsagelig i en membranbundet tilstand i løbet af eksperimentet12. Således korrelerer intensiteten af NBD-signalet direkte med fordelingen af NBD-C2Lact mellem LA og LB liposomer og kan let normaliseres for at bestemme, hvor meget PS overføres. For at måle overførslen af PI(4)P i den modsatte retning blandes NBD-PHFAPP med LA- og L B-liposomer. da det kun binder sig til LB liposomer, der indeholder PI(4)P, men ikke Rhod-PE, er dens fluorescens høj. Hvis PI(4)P overføres til L A-liposomer, translokerer det til disse liposomer, og signalet falder på grund af FRET med Rhod-PE (Figur 1C). Signalet normaliseres for at bestemme, hvor meget PI(4)P der overføres43.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Rensning af NBD-C2Lact

BEMÆRK: Selv om denne protokol beskriver brugen af en celleforstyrrende til at bryde bakterier, kan den ændres til at bruge andre lysisstrategier (f.eks. en fransk presse). I begyndelsen af rensningen er det obligatorisk at bruge buffer, der er frisk afgasset, filtreret og suppleret med 2 mM dithiothreitol (DTT) for at forhindre oxidation af cystein. For proteinmærkningstrinnet er det imidlertid afgørende helt at fjerne DTT. Mange trin skal udføres på is eller i et koldt rum for at undgå proteinforringelse. Prøver af 30 μL-volumen skal indsamles på forskellige trin i protokollen for at udføre en analyse ved natrium dodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) ved hjælp af en 15% acrylamidgel for at kontrollere rensningens forløb. Bland nok denaturerende Laemmli-prøvebuffer med hver aliquot, og varm blandingen ved 95 °C. Frys og opbevar rørene ved -20 °C indtil analysen.

  1. Udtryk for GST-C2Lact i Escherichia coli
    1. Bland 20 μL AF BL21 Guld kompetente celler med 18 μL steriliseret vand. Bland derefter 2 μL pGEX-C2Lact plasmid (ved ~ 65 ng/μL) med bakterierne, og transformer dem ved elektroporation. Resuspend bakterierne med 150 μL autoklavet Lennox Lysogeny-Bouillon (LB) medium (10 g/L tryptone, 5 g/L gær ekstrakt, 5 g/L NaCl i deioniseret vand, glukose-fri). Lad bakterierne vokse ved 37 °C i 1 time i et 2 mL snap-cap mikrocentrifuge rør.
    2. Pod 25 mL LB medium, suppleret med 50 μg/mL ampicillin, med 150 μL bakteriel suspension i en 125 mL steril Erlenmeyer kolbe. Læg kolben i en orbital shaker ved 37 °C, og lad bakterierne vokse natten over med omrøring ved 185 omdrejninger.
    3. Fyld to sterile 2 L Erlenmeyer kolber med 500 mL LB medium suppleret med 50 μg/mL ampicillin, og tilsæt 5 mL af prækultur suspension. Lad bakterierne vokse ved 37 °C med omrøring ved 220 omdrejninger.
    4. Mål regelmæssigt suspensionens optiske tæthed (OD) ved en bølgelængde (λ) på 600 nm. Når OD når en værdi på ~ 0,6-0,7, tilsættes 500 μL af en bestandsopløsning på 1 M isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) til hver kolbe for at indlede udtrykket GST-C2Lact. Kolberne rystes ved 185 omdrejninger i 4 timer ved 37 °C.
    5. Indholdet af hver kolbe overføres til en polypropylencentrifugeflaske. Centrifugere de to flasker i 30 min ved 4600 × g ved 4 °C for at pille bakterierne. Kassér supernatanten, og genbrug hver pille i 50 mL kold fosfat-buffered saltvand.
    6. Overfør bakterieaffjedringen i hver flaske til et 50 mL konisk centrifugerør. Centrifugere de to rør i 30 min ved 2300 × g ved 4 °C. Fjern supernatanten, og opbevar rørene, som hver indeholder en bakteriel pellet, ved -20 °C.
  2. Rensning af C2Lact
    1. På is fyldes to 50 mL koniske centrifugalrør med 50 mL buffer, der indeholder 50 mM Tris-HCl, pH 7,4 og 150 mM NaCl (i det følgende kaldet TN buffer), tidligere filtreret og afgasset af membranstøvsugerfiltrering.
    2. For at forberede lysis buffer i hvert rør, opløse en tablet af ethylendiamin tetraacetisk syre-fri protease hæmmer cocktail i TN buffer ved mild sonikering eller hvirvlen. Tilsættes andre antiproteaser (10 μM bestatin, 1 μg/ml pepstatin A og 10 μM fosforamidon). Det er vigtigt, at bufferen suppleres med 2 mM DTT.
    3. Fyld de to rør, der indeholder bakteriepillerne, der er fremstillet i trin 1.1.6, med lysisbuffer for at opnå et endeligt volumen på 30 mL i hvert rør og afrim langsomt pellets på is i 10 min. Knus hver pille med en spatel i rustfrit stål, og genbrug dem ved at hvirvle rørene og/eller ved at pipettere affjedringen frem og tilbage med en pipettecontroller og en 25 mL pipette, indtil der opnås en homogen affjedring.
    4. Udfør lysis ved hjælp af en forkølet celleforstyrrende (se materialetabellen) ved at læsse 30 gtL af prøven inde i reservoiret og køre en brudcyklus i kontinuerlig tilstand med et tryk på 1,6 bar. Lysatet opsamles i samme rør, hold røret på is, og tilsæt straks 250 μL fra en lageropløsning på 200 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), der er fremstillet i isopropanol.
    5. Lyse den anden prøve efter samme procedure. Brug resten af lysisbufferen til at vaske celleforstyrrenderen, og saml vasken for at justere lydstyrken på hvert lysat (~30 mL) til et endeligt volumen på 50 gtL.
    6. Suppler hvert lysat med 5 mM MgCl2,og tilsæt 20 μg/mL DNAse I for at fragmentere DNA'et og dermed reducere prøvens viskositet. Inkuber på is i 30 min. Saml en prøve til gelanalyse.
    7. Overfør hvert 50 mL lysat til et præchilled polycarbonat ultracentrifugerør (to i alt, se materialetabellen). Centrifuge ved 186.000 × g ved 4 °C i mindst 1 time ved hjælp af en ultracentrifuge.
    8. Parallelt med centrifugeringstrinnet dispenseres 1,4 mL af en gylle indeholdende glutathion kombineret med 4% agaroseperler i to 50 mL koniske centrifugalrør, der tilsættes 20 mL TN-buffer suppleret med 1 mM DTT (TND buffer) til hvert rør, centrifuge ved 1200 × g i 5 min, og kassér supernatanten. Gentag dette vasketrin to gange.
    9. Efter centrifugeringen af bakterielyset skal du fjerne en 30 μL-prøve fra supernatanten og overføre supernatanten fra hvert ultracentrifugerør til et tilsvarende 50 mL konisk centrifugerør, der indeholder rene perler. Til gelanalyse skal resterne pilles i et af ultracentrifugerørene med 50 mL TND-buffer og opsamle en 30 μL-prøve.
    10. Rør på en rotator i 3-4 timer ved 4 °C for at opnå en homogen perleaffjedring. Pulje perle suspensioner i en tom 25 mL kromatografi kolonne. Lad perlerne dekantere, og fjern bufferen og ubundne proteiner ved tyngdekraften flyde. Tag en prøve fra eluatet til analyse.
    11. Resuspend perlerne med 20 mL TND buffer, og indsamle eluate af tyngdekraften flow. Gentag dette trin to gange for helt at vaske perlerne. Pulje de indsamlede eluater, og opbevare en 30 μL prøve til yderligere analyse.
      BEMÆRK: Efter en kort dekantering, et volumen på ~ 2 mL perle suspension, som GST-C2Lact er knyttet, sedimenter i bunden af kolonnen.
    12. Der tilsættes 1 mL perleaffjedring til to 2 mL snap-cap mikrocentrifugerør. Fyld hvert rør med TND-buffer til et endeligt volumen på 1.970 mL. Tag en 30 μL-prøve fra et rør til yderligere analyse (B1-prøve). Der tilsættes 10 μL 10 mM CaCl2 opløsning og 25 μL fra en bestandsopløsning af human thrombin proteaseopløsning ved 0,02 U/μL.
    13. Anbring de to rør på en rotator ved 4 °C natten over, så thrombin kan kløve GST-mærket fra C2Lact-domænet. Den næste dag blandes 10 μL 200 mM PMSF-opløsning i hvert rør med perleaffjedringen for at hæmme trombinhandlingen.
    14. Centrifuge rørene på 700 × g i 5 min, og indsamle supernatant, som indeholder opløselige C2Lact domæne, fra hvert rør, uden at tage perlerne. Pool supernatanterne i et 2 mL snap-cap mikrocentrifugerør (E 1 eluate), der holdes på is.
    15. Tilsæt 1 mL TND buffer til hvert rør for at genbruge perlerne, og vask dem; gentag trin 1.2.14. Udfør dette trin tre gange mere for at genvinde en maksimal mængde protein. Hver gang samles de indsamlede supernatants i et nyt 2 mL-rør (E2, E3, E4 og E5) og tager en aliquot til yderligere analyse. I slutningen af vasketrin skal du tage en aliquot fra perleaffjedringen (aliquot B2).
    16. Analyser de 30 μL-prøver, der blev indsamlet på de forskellige trin i rensningsprotokollen ved SDS-PAGE-adskillelse på en 15% acrylamidgel.
    17. Fjern potentielle kontaminerende perler ved at samle alle supernatants(dvs.~ 10 mL) indsamlet i trin 1.2.14 og 1.2.15 i en 10 mL kromatografi kolonne. Saml eluate af tyngdekraften flow, og bevare perlerne i bunden af kolonnen.
    18. Koncentrer C2Lact-prøven ved hjælp af en centrifugalfilterenhed med en molekylvægtsnedskæring (MWCO) på 3 kDa og en centrifugeringshastighed på 2300 × g. Stop koncentrationsproceduren, når proteinprøvens volumen er ~1 mL.
  3. Forberedelse og rensning af NBD-C2Lact
    1. Ekvilibrere en afsaltningskolonne (se materialetabellen) med TN-buffer. Læg kolonnen med 1 mL koncentreret C2Lact-prøve. Lad prøven komme helt ind i gelbeden, tilsæt 1,5 mL friskafgaset DTT-fri TN-buffer til kolonnen, og saml eluatet ved tyngdekraften strømmer ind i et 2 mL snap-cap mikrocentrifugerør.
    2. Fortynd 50 μL eluate i et sidste volumen på 300 μL TN buffer, og registrer et absorbansspektrum fra 230 til 450 nm ved hjælp af ren TN-buffer som tom. Bestem C2Lact-koncentrationen baseret på absorbansen målt ved 280 nm, i betragtning af en udryddelseskoefficient ε lig med 44.920 M-1.cm-1.
    3. For at mærke C2Lact-konstruktionen med en NBD fluorophore blandes proteinet med et ti ganget molaroverskud af N,N'-dimethyl-N-(iodoacetyl)-N'-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)ethylenediamin (IANBD amide).
      1. 1 mg IANBD opløses i vandfri dimethylformamid (DMF), idet der skal være et 1 mg DMF, der anvendes til mærkning af C2Lact-konstruktionen, ikke må overstige 5 % (v/v) af proteinprøvevolumenet.
      2. For at bestemme mængden af DMF (VDMF) til at opløse IANBD skal du først beregne den nødvendige mængde IANBD (m, udtrykt i mg) for at mærke proteinet ved hjælp af formel 1.
        m = 10.000 × C × V × MWIANBD (1)
        hvor C er koncentrationen af C2Lact målt i trin 1.3.2, er V volumenet påC2-Lact-prøven, og MWIANBD er fluorophorens molekylvægt (420 g/mol).
      3. Beregn VDMF ved hjælp af formel 2 (med m0=1) og 3.
        VDMF= (m0/m) × VIANBD (2)
        VIANBD=0,05 × V (3)
        Hvor m0 er mængden af IANBD pulver i mg, og VIANBD er mængden af IANBD-opløsning, der skal tilsættes til C2Lact-prøven.
      4. Volumen VIANBD af den frisklavede IANBD-opløsning til C2Lact-prøven tilsættes, og reaktionsblandingen rystes ved 800-900 omdr./min. Lad reaktionen fortsætte i 90 minutter på is. I mellemtiden skal du rengøre en centrifugalfilterenhed (MWCO= 3 kDa) med 10 mL TN-buffer.
    4. Tilsæt L-cystein (i 10-fold molar overskydende til IANBD) til reaktionsblandingen for at inaktivere gratis IANBD.
    5. Føj 15 mL TN-bufferen til NBD-C2 Lact-opløsningen, og overfør NBD-C2Lact-opløsningen til centrifugalfilterenheden. Prøven koncentreres til 2 mL for at adskille det meste af den frie NBD fra proteinet ved centrifugering ved 2300 × g. Gentag dette vasketrin to gange. Prøven centrifugeres i et 2 mL snap-cap centrifugerør i 10 min ved 19.000 × g ved 4 °C for at pille potentielle aggregater og opsamle supernatanten.
    6. Fortynd 50 μL eluate i et sidste volumen på 300 μL TN-buffer. Absorbansspektret registreres fra 230 til 650 nm ved hjælp af den eluate, der opsamles under koncentrationsproceduren, som en tom. Bestem NBD-C2Lact-koncentrationen ved hjælp af den maksimale absorbans ved λ=280 og 495 nm og udryddelseskoefficienter ε= 44.920 M-1.cm-1 (protein) og 25.000 M-1.cm-1 (NBD fluorophor).
      BEMÆRK: Hvis de to koncentrationsværdier er ens, indikerer dette, at C2Lact-konstruktionen er mærket med et 1:1-forhold med NBD-gruppen.
    7. Hvis nbd-C2Lact-koncentrationen, der skønnes ved måling af NBD-absorbans, overstiger den koncentration, der skønnes at absorbere tryptofan (Trp)-rester, gentages trin 1.3.5 for yderligere at fjerne gratis NBD.
    8. Prøven tilsættes glycerol for at opnå en endelig koncentration på 10 % (v/v) for at beskytte NBD-C2Lact-konstruktionen under flashfrysning. Mål den endelige proteinkoncentration.
    9. Der fremstilles 50 μL aliquots protein i 0,5 mL snap-cap mikrocentrifugerør. Flash-fryse rørene i flydende nitrogen, og opbevar dem ved -80 °C.

2. Rensning af NBD-PHFAPP

BEMÆRK: Proceduren for fremstilling og mærkning af PHFAPP er identisk med proceduren for NBD-C2Lact indtil overførslen af NBD-C2Lact-opløsning til en centrifugalfilterenhed i trin 1.3.4. Følg den protokol, der er beskrevet nedenfor, fra dette trin og fremefter.

  1. Efter koncentrationstrinnet skal 2 mL NBD-PHFAPP holdes ved 4 °C i mørke i højst 1 dag, før der udføres størrelsesudelukkende kromatografi. Før kromatografi med størrelsesudelukkelse skal det kontrolleres, at der ikke er nogen orange deponering (sammenlægning under koncentration) i bunden af røret. Hvis dette er tilfældet, centrifugere prøven ved 540.000 × g i 10 min ved 4 °C, og rense supernatanten ved størrelsesudelukkende kromatografi.
    BEMÆRK: Størrelsesekskludografi udføres på en kolonne fyldt med krydslinket dextran-acrylamid copolymer (se materialetabellen), der tidligere er ekvilibreret med TND-buffer, ved hjælp af et hurtigt proteinvæskekromatografisystem (se materialetabellen). Søjlen skal være beskyttet mod lys. Der blev anvendt en strømningshastighed på 1 mL/min,og udløsningen af NBD-PHFAPP-konstruktionen blev efterfulgt af registrering af absorbansen ved λ=280 (protein) og 480 nm (NBD) ved kolonneafgangen.
    1. Indsprøjt NBD-PHFAPP-prøven, der er indlæst i en 2 mL-injektionssløjfe, på kolonnen, og saml straks 2,5 mL fraktioner eluate.
  2. Analysere alle de fraktioner, der svarer til de vigtigste peak opdaget ved 280 og 480 nm på en 15% SDS-PAGE gel. Der blandes en 25 μL-prøve af hver brøk med 15 μL Laemmli-prøvebuffer, inden gelen opvarmes og lastes.
    BEMÆRK: En hovedtop, som samtidig registreres ved λ= 280 og 480 nm, vises, når en volumen på ~ 150 ml buffer er passeret gennem kolonnen.
  3. Pulje de fraktioner, der udelukkende indeholder NBD-PHFAPP protein (~ 12,2 kDa), og tilsæt glycerol i en endelig koncentration på 10% (v / v). Koncentrer prøven ved hjælp af en centrifugalfilterenhed med en MWCO på 3 kDa til et endeligt volumen på 1 mL ved hjælp af en centrifugeringshastighed på 2300 × g.
  4. Forbered aliquots, og registrere en absorbans spektrum som beskrevet for NBD-C2Lact. Brug en udryddelseskoefficient ε= 29.450 M-1.cm-1 til at bestemme proteinets koncentration baseret på absorbansen målt ved λ=280 nm.

3. Fremstilling af liposomer til PS og PI(4)P ekstraktions- eller overførselsanalyser

BEMÆRK: Udfør alle trin ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet. Håndter organiske opløsningsmidler, rotavapor og flydende nitrogen med forsigtighed.

  1. Forbered frisk, filtreret og afgasset 50 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinehanesulfonsyre (HEPES)-kaliumhydroxid (KOH), pH 7,4, 120 mM kaliumacetat (HK) buffer.
  2. For hver type liposom skal du tage præcise mængder af forskellige lipider fra lageropløsninger og blande dem i en 25 mL pæreformet glaskolbe (tabel 1). Tilsæt ren kloroform for at justere mængden af hver blanding til 1 mL. Mærk hver kolbe med liposomnavnet. Wrap kolber indeholdende lipid blanding doped med Rhod-PE med aluminiumsfolie.
  3. Læg kolben på en roterende fordamper. Lipiderne tørres under vakuum og ved 25 °C i mindst 30 min ved en rotationshastighed på 500 omdrejninger. For lipidfilm, der indeholder PI(4)P, forvarmes kolben ved 32-34 °C i 5 min, under blid rotation, for at blande PI(4)P korrekt med de andre lipider, før der skabes vakuum i kolben for at fjerne opløsningsmidlet, som vil efterlade en film af tørre lipider på kolbevæggen.
  4. Afbryd kolben fra fordamperen, og læg den i et vakuumkammer i 45 minutter for at fjerne eventuelle resterende spor af opløsningsmiddel. Fyld kolben med 2 mL HK buffer, og tilsæt et par glasperler med en diameter på 4 mm til opløsningen. Hvirv forsigtigt kolben i 2 min for at genbruge lipider og forberede multilamellar lipid vesikler (MLVs) med en lipid koncentration på 4 mM. Der fremstilles 0,5 mlv'er med 0,5 ml'er i 1,5 ml skruedæksel mikrocentrifugerør.
  5. Opfrysning af rørene 5x (ved hjælp af flydende nitrogen og et vandbad ved henholdsvis 37 °C). Udstøm liposomer eller opbevar dem ved -20 °C.
  6. Brug en mini ekstruder til at forberede liposomer (dvs. store unilamellar vesikler) fra MLVs i henhold til producentens retningslinjer. Brug et polycarbonatfilter med ensartede cylindriske porer med en diameter på 200 nm.
  7. For at forberede hver type liposom skal de ekstruderes mindst 250 μL af den tilsvarende suspension af MLV'er. Opbevar de ekstruderede liposomer ved 4 °C og i mørke, hvis de indeholder Rhod-PE. Brug liposomer inden for 2 dage.
Lipid sammensætning (mol/mol) Lipid
Liposom navn DOPC
(25 mg/mL)		 POPPER
(10 mg/mL)		 16:0 Liss Rhod-PE
(1 mg/mL)		 C16:0/C16:0-PI(4)P
(1 mg/mL)
Ekstraktionsanalyser Liposom 2 mol% PS PC/PS 98/2 247 μL 12,5 μL
Liposom 2 mol% PI(4)P PC/PI(4)P 98/2 247 μL 153 μL
PC liposom PC 100 252 μL
Transportanalyser LA  PC/PS/Rhod-PE 93/5/2 234 μL 31,4 μL 200 μL
LA uden PS PC/Rhod-PE 98/2 247 μL 200 μL
LB  PC/PI(4)P 95/5 237 μL 383 μL
LB uden PI(4)P PC 100 252 μL
LA-Eq PC/PS/PI(4)P/Rhod-PE 93/2.5/2.5/2 234 μL 15,7 μL 200 μL 191 μL
LB-Eq PC/PS/PI(4)P 95/2.5/2.5 239 μL 15,7 μL 191 μL

Tabel 1: Mængder af lipid lageropløsninger, der skal blandes til liposompræparat. Forkortelser: PS= fosfattidylserine; PC = fosfattidylcholin; PI(4)P = fosphatidylinositol 4-fosfat; Rhod-PE = rhodaminmærket fosfatylethanolamin; DOPC = dioleoylphosphatidylcholin; POPS= 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfo-L-serin; 16:0 Liss Rhod-PE = 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamin-N-(lissamin rhodamin B sulfonyl).

4. Måling af PS- eller PI(4)P-udvinding

BEMÆRK: Målinger skal udføres ved hjælp af en sort 96-brønds plade og en fluorescenspladelæser udstyret med monokrome: en til fluorescens excitation og en til emission med en variabel båndbredde.

  1. Forbered frisk, filtreret og afgasset HK buffer suppleret med 1 mM MgCl2 (HKM buffer). Forbered rene pc-liposomer og pc-liposomer dopet med 2 mol% PS eller 2 mol% PI(4)P (4 mM endelige lipidkoncentration, se tabel 1).
    BEMÆRK: Hold rørene fyldt med suspension af ekstruderede liposomer ved stuetemperatur under hele eksperimentet, og hold proteinerne på is. Derudover skal du beskytte lipidsensorerne mod lys.
  2. Til PS-ekstraktionsanalysen blandes liposomer med 2 mol% PS (80 μM slut lipidkoncentration, 0,8 μM tilgængelig PS-koncentration) med NBD-C2Lact (250 nM endelig koncentration) i et endeligt volumen på 100 μL. Fyld en anden brønd med samme mængde liposom (80 μM, 2 mol% PS) og NBD-C2Lact (250 nM) blandet med 3 μM LTP (Osh6p som en positiv kontrol eller et protein af interesse).
    BEMÆRK: En inkubationstid på 5 min er tilstrækkelig til, at Osh6p kan opnå lipidudtrækning.
  3. Fyld en tredje brønd med NBD-C2Lact (250 nM) blandet med rene pc-liposomer (80 μM). Fyld kun en fjerde brønd med rene pc-liposomer (80 μM). Gentag trin 4.2-4.3 for at forberede yderligere tre serier af fire brønde.
  4. For hver brønd skal du optage et NBD-spektrum fra 505 til 650 nm (båndbredde 5 nm) ved excitation ved 490 nm (båndbredde 5 nm) ved 25 °C. For hver serie trækkes spektret registreret med kun liposomer fra det andet spektre.
    BEMÆRK: F og Fmax svarer til intensiteten ved 536 nm målt med PS-holdige liposomer i henholdsvis nærvær eller fravær af LTP, mens F0 er intensiteten ved samme bølgelængde med rene pc-liposomer. For hver serie angives den procentdel af tilgængelig PS, der ekstraheres af proteinet, ved hjælp af følgende formel.
    100 × (1-((F-F0)/(Fmax-F0))) (4)
  5. Til PI(4)P-ekstraktionsanalysen forberedes liposomer med 2 mol% PI(4)P, og der foretages målinger med NBD-PH FAPP-sonden. Udfør kontroleksperimenter, og bestem udvindingsprocenten på samme måde som beskrevet ovenfor.
    BEMÆRK: Fedtosom- og proteinkoncentrationen er identiske med dem, der anvendes i PS-ekstraktionsanalysen.

5. Realtidsmåling af PS-transport

BEMÆRK: Et standardfluorimeter (90° format) udstyret med en temperaturstyret celleholder og en magnetisk omrører bruges til at registrere lipidoverførsels kinetikere. For nøjagtigt at indsamle data er det vigtigt permanent at opretholde prøven ved samme temperatur (indstillet mellem 25 og 37 °C afhængigt af proteinets oprindelse (f.eks.gær eller menneske)) og konstant røre den. Den nedenfor beskrevne protokol er til måling af lipidtransport i en 600 μL-prøve i en cylindrisk kvartscelle.

  1. Forbered frisk afgassede og filtrerede HKM buffer. Hold rørene, der indeholder ekstruderede liposomer, ved stuetemperatur. Wrap rør, der indeholder liposomer med Rhod-PE i aluminiumsfolie, og / eller gemme dem i en uigennemsigtig boks for at forhindre enhver fotobleaching.
  2. Juster excitation og emission monokromatorer ved λ = 460 nm (med en kort båndbredde (1-3 nm)) og ved λ = 530 nm (med en stor båndbredde (≥ 10 nm)), henholdsvis. Indstil anskaffelsestiden til 25 min med en tidsopløsning ≤ 1 s.
  3. I kvarts cuvette fortyndes 30 μL af L A-liposomaffjedringen og et volumen NBD-C2Lact-lageropløsning i præwarmed HKM-buffer til fremstilling af en 570 μL-prøve, der indeholder 200 μM samlede lipider og 250 nM NBD-C2Lact. Tilsæt en lille magnetisk omrøringsstang, og placer cuvette i fluorometerholderen.
  4. Når prøven er termisk ekvilibreret (efter 3-5 min), udløses målingen. Efter 1 min tilsættes 30 μL LB liposomaffjedring (endelig koncentration på 200 μM samlede lipider) til prøven. Efter 3 min skal LTP injiceres i prøven, så den endelige koncentration af LTP er 200 nM, og indhent signalet i de resterende 21 min.
  5. Udfør et parallelt eksperiment for at normalisere NBD-signalet. Bland 30 μL LA-Eq liposomaffjedring med 250 nM NBD-C2Lact i HKM-buffer (sidste volumen på 570 μL). Efter 1 min injiceres 30 μL LB-Eq liposomaffjedring.
    BEMÆRK: Lipidsammensætningen af LA-Eq og LB-Eq liposomer svarer til LA- og L B-liposomer, der anvendes i overførselsanalysen, bortset fra at hver af dem indeholder 2,5 mol% PS og 2,5 mol% PI(4)P. Som følge heraf svarer NBD-signalet, der måles, benævnt FEq, til det signal, der skal måles, hvis PS var fuldt ekvilibreret mellem LA og LB liposomer ved en overførselsproces.
  6. Konverter de kinetiske kurver målt med en LTP af interesse for at bestemme mængden af PS (i μM), der overføres fra LA til LB liposomer over tid. Normaliser hvert datapunkt (F) i kurven ved hjælp af følgende formel.
    FNorm = (F-F0)/(FEq-F0) (5)
    hvor F0 svarer til NBD-signalet lige før tilsætning af en LTP, og FEq er signalet målt i trin 5.5.
    BEMÆRK: Mængden af PS (i μM), der overføres fra LA til L B-liposomer, svarer til 2,5 × FNorm, i betragtning af at ligevægten svarer til en situation, hvor halvdelen af tilgængelige PS-molekyler, der er indeholdt i den ydre folder i LA-liposomer (dvs.svarende til 5 mol % af 0,5 × 200 μM samlede lipider) er blevet overført til L B-liposomer.

6. Realtidsmåling af PI(4)P-transport

  1. Indstil fluorimeter (excitation og emission bølgelængde, båndbredde, erhvervelse tid, tidsopløsning) som gjort for PS overførsel assay. Ligeledes skal du bruge den samme buffer, cuvette og liposomer til at udføre eksperimenterne under konstant omrøring ved samme temperatur.
  2. I cuvette blandes 30 μL LB liposome suspension og NBD-PHFAPP med forvarm HKM buffer for at opnå et endeligt volumen på 570 μL (200 μM samlede lipider, 250 nM NBD- PHFAPP). Når prøvens termiske ækvilibrering er nået, skal målingen startes, og efter 1 min injiceres 30 μL L A-mundosomaffjedring. Efter 3 min, injicere LTP af interesse (endelig koncentration af 200 nM), og registrere signalet.
  3. Udfør et andet eksperiment for at normalisere NBD-signalet. Bland 30 μL LB-Eq liposomaffjedring med 250 nM NBD-PHFAPP i 570 μL HKM buffer. Efter 1 min injiceres 30 μL LA-Eq liposomaffjedring.
    BEMÆRK: Her svarer NBD-signalet, benævnt FEq,til det, der skal måles, hvis PI(4)P var fuldt ekvilibreret mellem LA- og L B-liposomer.
  4. Konverter de kinetiske kurver for at bestemme mængden af PI(4)P (i μM), der overføres fra LB til L A-liposomer over tid. Hvert datapunkt (F) normaliseres ved hjælp af formel 5, hvor F0 svarer til NBD-signalet før tilsætning af en LTP, og FEq er signalet målt i trin 6.3.
    BEMÆRK: Mængden af PI(4)P (i μM), der overføres fra LB til L A-liposomer, svarer til 2,5 × FNorm, i betragtning af at ligevægten svarer til en situation, hvor den ene halvdel af PI(4)P, der er indeholdt i den ydre folder i LB-liposomer (dvs. 0,5 × 5 μM) er blevet overført i LA-liposomer.

7. Analyse af kinetikakurver

  1. Kvantificer, i hvilket omfang en LTP er effektiv ved at bestemme den hastighed, hvormed denne LTP overfører lipider fra den ene liposompopulation til den anden i de første sekunder efter injektionen til cuvette.
    1. Udfør en lineær regression af de første datapunkter i overførsels kinetika for at opnå en hældning. Del hældningsværdien med LTP-koncentrationen i reaktionsblandingen for at bestemme antallet af lipidmolekyler overført pr. protein pr. tidsenhed (min eller s).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figure 1
Figur 1: Beskrivelse af fluorescerende lipidsensorer og in vitro-analyser. (A) Tredimensionelle modeller af NBD-C2Lact og NBD-PHFAPP baseret på krystalstrukturen i C2-domænet for kvæginactadherin (FBF ID: 3BN648) og NMR-strukturen af PH-domænet for det menneskelige FAPP1-protein (PDB ID: 2KCJ46). En N,N'-dimethyl-N-(thioacetyl)-N'-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)ethylendiamin moiety, bygget manuelt og energisk minimeret, blev podet på thiolfunktionen C352 (NBD-C2Lact) og C13 (NBD-PHFAPP)rester (repræsenteret som kugler, med kulstof i grøn, nitrogen i blå, ilt i rødt, svovl i gult og hydrogen i hvidt). Overfladen af lipid-bindende stedet for hver sonde var farvet i blåt. (B) Ekstraktionsanalyser. I PS-ekstraktionsanalysen blev PC/PS-liposomer (98/2 mol/mol) inkuberet med 250 nM NBD-C2Lact. I mangel af ekstraktion, sonden stærkt bundet til liposomer, hvilket resulterer i en blå skift af NBD fluorescens og en stigning i dens emissionsintensitet. Hvis PS ekstraktion fandt sted i overværelse af en LTP (f.eks Osh6p), sonden adskilt fra liposomer, og dens fluorescens var lavere. I PI(4)P-ekstraktionsanalysen blev liposomer dopet med 2 mol% PI(4)P, og der blev anvendt 250 nM NBD-PHFAPP. (C) FRET-baserede lipid transport assays. I PS-transportanalysen blev PC/PS/Rhod-PE liposomer (93/5/2 mol/mol, LA)inkuberet med 250 nM NBD-C2Lact. PC-liposomer (LB), dopede eller ej med 5 mol% PI(4)P, og Osh6p blev fortløbende tilsat ved henholdsvis t = 1 min og t = 4 min. Hvis PS transport opstår, fremkalder dette en dequenching af NBD-signalet svarende til translokationen af NBD-C2Lact fra LA til LB liposomer. I PI(4)P-transportanalysen blev L B-liposomer med 5 mol% PI(4)P inkuberet med 250 nM NBD-PHFAPP. PC liposomer (LA)dopet eller ej med 5 mol% PS blev tilføjet. Hvis PI(4)P transport opstår, forårsager dette en slukning af NBD-signalet på grund af translokationen af NBD-PHFAPP fra LB til LA liposomer. Forkortelser: NBD = 7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol fluorophore; NMR = nuklear magnetisk resonans; FAPP1 = protein med fire fosfatadapter 1 FBF = Protein Data Bank; PS= fosfattidylserine; PC = fosfattidylcholin; LTP = lipid overførsel protein; Osh6p = oxysterol-bindende protein (OSBP) homolog 6 protein; PI(4)P = fosphatidylinositol 4-fosfat; FRET = fluorescens resonans energioverførsel; Rhod-PE = rhodaminmærket fosfatylethanolamin; LA liposomer = liposomer bestående af pc, dopet med 2 mol% Rhod-PE, og indeholder eller ikke 5 mol% PS; LB liposomer = liposomer indarbejde 5 mol% PI(4)P. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2A viser en SDS-PAGE analyse af produkterne fra forskellige trin, der fører til rensning af C2Lact. Bane 1 viser proteinprofilen af de lysede bakterier, der udtrykker GST-C2Lact (~ 44,8 kDa), mens henholdsvis vognbane 2 og 3 viser proteinprofilerne for supernatant- og bakterieaffald efter ultracentrifugering. Sammenligningen af disse baner viser, at GST-C2Lact er blevet genvundet i supernatanten og dermed kan isoleres ved hjælp af glutathion-linkede agaroseperler. Bane 4 og 5 viser supernatantens proteinprofiler efter inkubation med perler og vasker genvundet af tyngdekraftsflow, mens bane 6 viser profilen af proteiner, der er bevaret på perlerne. En analyse af disse baner viser, at næsten alle GST-C2Lact er blevet genvundet fra perlerne.

Lanes 8-12 viser tilstedeværelsen af et større bånd svarende til C2Lact (~ 17,9 kDa) i supernatanterne genvundet gennem successive vasker af perlerne efter thrombin behandling. Lane 13 angiver, at ikke-spaltede GST-C2Lact, sammen med GST (~ 26,9 kDa), forblev bundet til perler efter denne behandling. Sammenligningen af disse baner viser, at kavalergangsproceduren, om end ikke 100% effektiv, gav C2Lact, som derefter var fluorescerende mærket. Figur 2B viser et ultraviolet (UV)-synligt absorbansspektrum af C2Lact mærket med NBD. Da konstruktionen er 100% ren, bekræfter disse resultater, at alle C2Lact-molekyler blev mærket med en NBD-gruppe baseret på den optiske tæthed målt ved 280 nm (Trp) og 495 nm (NBD). Renheden af NBD-C2Lact og dens fluorescens blev bestemt ved SDS-PAGE-analyse (Figur 2C).

Figure 2
Figur 2: NBD-C2Lact rensning. (A) SDS-PAGE analyse blev brugt til at kontrollere tilstedeværelsen af proteinet på forskellige trin i rensningsproceduren før mærkning. Pilespidserne angiver placeringen af C2Lact-domænet (rød pilespids), for GST alene (grå pilespids) og GST-C2Lact-konstruktionen (den sorte pilespids). b) UV-synligt absorbansspektrum af NBD-C2Lact. (C) SDS-PAGE analyse af den rensede NBD-C2Lact. Det første billede blev erhvervet under UV-belysning uden farvning og afslører tilstedeværelsen af NBD-C2Lact konstruktion, da det udsender fluorescens. Det andet billede viser den samme gel efter en proteinfarvningsprocedure (se materialetabellen). Forkortelser: NBD = 7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol fluorophore; NBD-C2Lact = N,N'-dimethyl-N-(thioacetyl)-N'-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)ethylendiamin moiety knyttet til thiolfunktionen af C352-restkoncentrationer af en reengineered version af C2-domænet for kvæginactadherin (PDB ID: 3BN648); FBF = Protein Data Bank; SDS-PAGE = natrium dodecylsulat polyacrylamidgelelektroforese; GST = glutathion S-transferase; MW = molekylvægtstørrelsesmarkør; UV = ultraviolet. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3 viser resultaterne fra PS- og PI(4)P-ekstraktionsanalyser ved hjælp af Osh6p. Når det kun inkuberes med liposomer, der indeholder 2 mol% PS, fluorescens af NBD-C2Lact var maksimal som NBD fluorophore blev indsat i membranen (dvs. en hydrofob sammenhæng), hvilket indikerer, at sensoren var membran-bundet. I nærværelse af Osh6p var fluorescensen lavere og sammenlignelig med den, der blev målt med rene pc-liposomer (Figur 3A). Normaliseringen af intensitetsværdier ved 536 nm indikerede, at ~75% af tilgængelig PS blev udvundet. I den anden analyse blev NBD-PHFAPP blandet med liposomer indeholdende 2 mol% PI(4)P. NBD-signalet var højt uden Osh6p, men lavt, når Osh6p var til stede og svarede til det, der blev målt med PI(4)P-fri liposomer (Figur 3B). En analyse af intensiteten viste, at ~100 % af den tilgængelige PI(4)P blev udvundet af LTP.

Figure 3
Figur 3: Ekstraktionsanalyser. (A) Fluorescensspektre af NBD-C2Lact (250 nM) målt ved excitation ved 460 nm i nærvær af liposomer (80 μM, 2 mol% PS) i mangel eller tilstedeværelse af 3 μM Osh6p. Referencespektre blev registreret med rene pc-liposomer inkuberet eller ej med NBD-C2Lact (venstre panel). Flere spektre blev registreret fra forskellige serier af brønde, korrigeret ved at trække baggrunden spredning signal fra DOPC liposomer alene og gennemsnit (n = 4, ± SEM). Den procentdel af tilgængelig PS, der blev udvundet, er angivet (højre panel). (B) Fluorescensspekttra af NBD-PHFAPP (250 nM) blandet med liposomer (80 μM, 2 mol% PI(4)P) i mangel eller tilstedeværelse på 3 μM Osh6p. Referencespektre optaget med pc-liposomer i sensorens tilstedeværelse og fravær vises (venstre panel). Flere spektre blev registreret fra forskellige serier af brønde, korrigeret ved at trække baggrunden spredning signal fra DOPC liposomer alene og gennemsnit (n = 4, ± SEM). Den procentdel af tilgængelig PI(4)P, der blev udvundet, er angivet (højre panel). Forkortelser: NBD = 7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol fluorophore; NBD-C2Lact = N,N'-dimethyl-N-(thioacetyl)-N'-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)ethylendiamin moiety knyttet til thiolfunktionen af C352-restkoncentrationer af en reengineered version af C2-domænet for kvæginactadherin (PDB ID: 3BN648); FBF = Protein Data Bank; PS= fosfattidylserine; PC = fosfattidylcholin; DOPC = dioleoylphosphatidylcholin; Osh6p = oxysterol-bindende protein (OSBP) homolog 6 protein; PI(4)P = fosphatidylinositol 4-fosfat; SEM = standardfejl i middelværdien; a.u. = vilkårlige enheder. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4A viser typiske resultater fra en PS overførsel assay ved hjælp af Osh6p som en LTP. Ved tid nul blev NBD-C2Lact blandet med L A-liposomer, der indeholdt 5 mol% 16:0/18:1-PS (POPS) og 2 mol% Rhod-PE i et volumen på 570 μL HKM buffer ved 30 °C. Som sonden bundet tilLA liposomer, dens signal blev slukket på grund af FRET med Rhod-PE til stede i disse liposomer. Efter et minut blev Rhod-PE-fri LB liposomer (30 μL) tilføjet; dette forventedes kun at fremkalde en mindre ændring i signalet på grund af lysspredning fra denne anden liposomepopulation og/eller en fortyndingseffekt. Signalintensiteten efter tilsætning af L B-liposomer svarer til F0. Injektionen af et par μL af en bestand løsning af Osh6p (typisk 40 μM) til at fortynde 200 nM af proteinet i reaktion mix fremkaldte en langsom stigning i NBD signal på grund af afbøjning af fluorophore som PS blev transporteret fra LA til LB liposomer, og dermed fremme translokation af NBD-C2Lact.

Når LB liposomer indeholdt 5 mol% PI(4)P, var dequenching meget hurtigere, da PS blev overført hurtigere af Osh6p til LB liposomer på grund af modeksandering af PS med PI(4)P af LTP (anden kurve). Den tredje kurve svarer til et eksperiment, hvor NBD-C2Lact blev blandet med lige store mængder LA-Eq og LB-Eq liposomer. Signalet var højere end F0 og svarede til en situation, hvor sonden var jævnt bundet til LA og LB liposomer, hvilket afspejler en situation, hvor PS var fuldt ekvilibreret mellem de to populationer af liposomer. FEq blev beregnet ved i gennemsnit værdien af det signal, der blev målt i de sidste 5 min af forsøget.

Figure 4
Figur 4: Typiske PS-transport kinetik målt med Osh6p og referencekurve. (A) LB liposomer uden PI(4)P (200 μM samlede lipider) og Osh6p (200 nM) blev sekventielt tilsat til et cuve indeholdende NBD-C2Lact (250 nM) og LA liposomer (200 μM) dopet med 5 mol% PS og 2 mol% Rhod-PE (venstre kurve). Det samme eksperiment blev udført med LB liposomer dopet med 5 mol% PI(4)P (midterste kurve). For at bestemme FEqblev NBD-C2Lact (250 nM) forblandet med LA-Eq liposomer; derefter blev LB-Eq liposomer tilføjet (højre kurve). (B) Gennemsnitlige PS-transportkurver bestemmes efter normaliseringen af flere målinger udført ved hjælp af L B-liposomer med eller uden PI(4)P (gennemsnit ± SEM, n=3). (C) Indledende PS-overførselssatser (gennemsnit ± SEM, n=3). Forkortelser: NBD = 7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol fluorophore; NBD-C2Lact = N,N'-dimethyl-N-(thioacetyl)-N'-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)ethylendiamin moiety knyttet til thiolfunktionen af C352-restkoncentrationer af en reengineered version af C2-domænet for kvæginactadherin (PDB ID: 3BN648); FBF = Protein Data Bank; PS= fosfattidylserine; Osh6p = oxysterol-bindende protein (OSBP) homolog 6 protein; PI(4)P = fosphatidylinositol 4-fosfat; Rhod-PE = rhodaminmærket fosfatylethanolamin; LA liposomer = liposomer bestående af fosfatylcholin, prikpet med 2 mol% Rhod-PE, og indeholder eller ikke 5 mol% PS; LB liposomer = liposomer med 5 mol% PI(4)P; F = fluorescens; F0 = fluorescens svarende til NBD før tilsætning af Osh6p; FEq = fluorescenssignal, hvis PS er fuldt ekvilibreret mellem LA og LB liposomer ved en overførselsproces; SEM = standardfejl i middelværdien. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4B viser gennemsnitlige kinetiske kurver for PS-overførsel fra L A-liposomer til LB-liposomer, dopet eller ikke dopet med PI(4)P efter normaliseringen af F-data ved hjælp af F0 og FEq som referenceværdier. Den oprindelige transporthastighed for hvert forsøg blev beregnet ved at montere de oprindelige datapunkter målt efter injektionen af proteinet med en lineær funktion. Figur 4C viser den gennemsnitlige indledende PS-transporthastighed, der er bestemt ud fra tre forskellige forsøg med L B-liposomer med eller uden PI(4)P. Når LB liposomer indeholdt 0 og 5 mol% PI(4)P, var satserne henholdsvis lig med 1,4 og 15,8 PS.min-1 pr Osh6p-molekyle. Figur 5A viser typiske resultater fra en PI(4)P-overførselsanalyse med Osh6p som LTP, som blev udført med de samme materialer og betingelser som dem, der blev anvendt til PS-transportanalysen.

Figure 5
Figur 5: Typiske PI(4)P transport kinetik målt med Osh6p og referencekurve. (A) PS-frie liposomer indeholdende 2 mol% Rhod-PE (LA,200 μM samlede lipider) og Osh6p (200 nM) blev sekventielt tilsat til et cuvette indeholdende NBD-PHFAPP (250 nM) og LB liposomer (200 μM) doped med 5 mol% PI(4)P (venstre kurve). Det samme eksperiment blev udført med LA liposomer dopet med 5 mol% PS (midterste kurve). For at bestemme FEqblev NBD-PHFAPP (250 nM) forblandet med LB-Eq liposomer; derefter blev LA-Eq liposomer tilføjet (højre kurve). (B) PI(4)P overførsels kinetiker bestemt efter normalisering af flere målinger af LA liposomer med eller uden PS (gennemsnit ± SEM, n=3). (C) Indledende PI(4)P-overførselssatser (gennemsnit ± SEM, n=3). Forkortelser: NBD = 7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol fluorophore; NBD-PH FAPP = PLECKStrin-homologidomæne med NBD-PHFAPP = PLECKStrin-homologidomæne med mærket Pleckstrin for det humane protein med fire fosfatadapter 1 (FAPP1, UniProt: Q9HB20, segment [1-100]); PS= fosfattidylserine; Osh6p = oxysterol-bindende protein (OSBP) homolog 6 protein; PI(4)P = fosphatidylinositol 4-fosfat; Rhod-PE = rhodaminmærket fosfatylethanolamin; LA liposomer = liposomer bestående af fosfatylcholin, prikpet med 2 mol% Rhod-PE, og indeholder eller ikke 5 mol% PS; LB liposomer = liposomer med 5 mol% PI(4)P; F = fluorescens; F0 = fluorescens svarende til NBD før tilsætning af Osh6p; FEq = fluorescenssignal, hvis PI(4)P er fuldt eklibreret mellem LA- og L B-liposomer ved en overførselsproces; SEM = standardfejl i middelværdien. Klik her for at se en større version af dette tal.

På tid nul blev NBD-PHFAPP blandet med LB liposomer indeholdende 5 mol% PI(4)P i et volumen på 570 μL HKM buffer. Fordi NBD-PHFAPP var bundet til LB liposomer, var signalet højt. Efter et minut blev LA liposomer (30 μL) tilføjet, hvilket forventedes kun at fremkalde en lille ændring i signalet. Intensiteten svarede derefter til F0. Indsprøjtning osh6p (200 nM endelig koncentration) i reaktion mix udløste en slukning af NBD signal på grund af translokation af NBD-PHFAPP molekyler til LA liposomer som PI(4)P blev overført fra LB liposomer til LA liposomer. Når LA liposomer indeholdt 5 mol% POPS, var dequenching meget hurtigere på grund af en hurtigere PI(4)P overførsel som følge af PS / PI(4)P udveksling. Den tredje kurve svarer til et eksperiment, hvor NBD-PHFAPP blev blandet med lige store mængder LA-Eq og LB-Eq liposomer.

Signalet var lavere end F0, da det svarede til en situation, hvor sonden var ensartet bundet til LA og LB liposomer, hvilket indikerer en fuldstændig ekvilibrering af PI(4)P mellem liposomer. FEq blev beregnet ved i gennemsnit værdien af det signal, der blev målt i de sidste 5 min af forsøget. Figur 5B, C viser gennemsnitlige kinetikakurver opnået efter signal normalisering og gennemsnitlige PI(4)P indledende overførselshastigheder målt med LA liposomer, der var dopet eller ikke dopet med 5 mol% PS. Her er det værd at bemærke, at begge lipid ligands blev transporteret hurtigere og med lignende hastigheder, når hver lipid oprindeligt var til stede i HENHOLDSVISL A og LB membraner, hvilket indikerer, at Osh6p er en PS / PI (4) P veksler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Resultaterne af disse analyser direkte stole på signalerne fra fluorescerende lipid sensorer. Således er rensningen af disse sonder mærket på en 1:1 forhold med NBD og uden gratis NBD fluorophore forurening er et kritisk skridt i denne protokol. Det er også obligatorisk at kontrollere, om den undersøgte LTP er korrekt foldet og ikke aggregeret. Den mængde LTP, der testes i ekstraktionsanalyserne, skal være lig med eller højere end mængden af tilgængelige PS- eller PI(4)P-molekyler for at måle, om denne LTP effektivt udvinder disse lipider. Nbd-C2Lact og NBD-PHFAPP binder sig faktisk til henholdsvis PS og PI(4)P efter en klassisk mætningsbindingskurve. I betragtning af deres respektive tilhørsforhold til PS og PI(4)P forbliver disse sonder stort set bundet til liposomer, selvom liposomer indeholder resterende spor af disse ligands. Dette kan føre til den fejlagtige konklusion, at en LTP ikke effektivt udtrække disse lipider. Protokollen er afhængig af standard- og kommercielt tilgængelige pc-, PS- og PI(4)P-underarter, der er henholdsvis 18:1/18:1-PC, 16:0/18:1-PS og 16:0/16:0-PI(4)P. Udførelse af forsøg ved hjælp af lipidarter med andre acylkæder kan give forskellige resultater, som tidligere rapporteret12,35.

Hvis masselipidsammensætningen (der ikke tages i betragtning af PS eller PI(4)P) af LA- og L B-liposomer, skal ændres, er det i forbindelse med overførselsanalyserne afgørende, at der også udføres kontroleksperimenter ved hjælp af LA-Eq og LB-Eq liposomer med en bulksammensætning svarende til LA- og LB-liposomer henholdsvis. Det samme princip gælder for ekstraktionsanalyserne. Genetisk kodede fluorescerende lipidbindende domæner bruges bredt til at analysere lipidfordeling inde i cellerne44. Forsigtighed anbefales, når man analyserer sådanne eksperimenter som foreningen af disse lipidsonder med membranen, selvom det primært er drevet af tilstedeværelsen af den målrettede lipid, kan påvirkes af andre parametre (tæthed af anioniske lipider, lipidpakning), der varierer mellem cellerum. I disse in vitro-analyser er sammensætningen af liposomer meget enklere end cellemembranernes: de er for det meste lavet af pc, en zwitterionisk lipid og udsætter derved en temmelig inaktiv overflade, der ikke påvirker, hvordan PS og PI(4)P genkendes af deres tilsvarende sensor. PHFAPP kan anvendes i nærværelse af anioniske lipider, såsom PS, fosfatidsyre (PA) og PI32, og C2Lact genkender ikke PI(4)P12; begge disse bemærkninger gør det muligt at foretage upartiske målinger af PS/PI(4)P-udveksling. NBD-PHFAPP er ikke påvirket af sterol43.

Det vides dog ikke, om disse sonder, især NBD-C2Lact, kan bruges sammen med liposomer med ekstreme funktioner(f.eks. meget lav eller høj lipidpakning, meget negativt ladet overflade, tilstedeværelse af lipiddomæner). På trods af denne potentielle begrænsning med hensyn til liposom sammensætning, disse overførsel assays baseret på fluorescerende sensorer har enorme fordele i forhold til andre metoder. For det første er de ikke afhængige af fluorescerende mærket PS og PI(4)P, der bærer en ekstra voluminøse gruppe og sandsynligvis ikke er korrekt indkvarteret af den bindende lomme af LTP'er. For det andet giver disse analyser langt bedre tidsopløsning end metoder baseret på liposomadskillelse (radioaktivitetsbaserede assays45 eller massespektrometri33), og det skal bemærkes, at radiolabeled PI(4)P og PS ikke er kommercielt tilgængelige. Et proteins evne til at overføre PS eller PI(4)P påvirkes ikke af sammenhængen mellem fluorescerende sensorer med liposomer. Hvis man overvejer mængden af NBD-C2Lact eller NBD-PHFAPP og ps' og PI(4)P's i den ydre folder af liposomer, der er tilgængelige for LTP,, er kun 5 % af PS eller PI(4)P forbundet med sonde under en kinetikamåling.

Desuden er kun 0,55-0,86% af membranoverfladen dækket af sonden, i betragtning af den samlede overflade af liposomer (LA+LB liposomer; 5,1 × 1016 nm2 med et areal på 0,7 nm2 pr. lipid), den membranoverflade, som et enkelt C2- eller PH-molekyle kan optage (henholdsvis ≈3,1 og 4,8 nm2, anslået ud fra reference46, 47,48) og deres koncentration (250 nM). De principper, der ligger til grund for disse analyser, er således tilpasset til korrekt analyse af de kinetiske og mekanistiske aspekter af LTP'er. Som nævnt i indledningen kan ændringer i AKTIVITETEN AF ORP5/8 føre til cellulære dysfunktioner49. For eksempel, invasivitet af kræft i bugspytkirtlen celler synes at stole på niveauet af ORP5 udtryk. Desuden, en kausalitet eksisterer mellem høje niveauer af ORP5 udtryk og den dårlige prognose for human kræft i bugspytkirtlen. Et højt niveau af ORP5 udtryk er også påvist i lungetumor væv, og især, i metastatiske tilfælde. Interessant nok kan ORP5's evne til at overføre lipider forklare, hvorfor det fremmer cellespredning og migration.

ORP5 upregulates pattedyr mål rapamycin kompleks 1 (mTORC1) kompleks, som spiller en central rolle i celle overlevelse og spredning, sandsynligvis fordi det øger aktiviteten af Akt, en upstream aktivator af mTORC1, ved at forsyne PM med PS. Samlet, disse observationer tyder på, at ORP5 kan være en interessant farmakologisk mål, og at disse in vitro assays kan tjene til at screene molekyler, der er i stand til at hæmme sin aktivitet. Denne analyse kan også bidrage til bedre at definere, om andre medlemmer af ORP / Osh familien er PS / PI (4) P vekslere. Det blev især konstateret, at ORP10 indkapslede PS in vitro og overførte PS på ER-Golgi-kontaktwebsteder27,50, men det er stadig uvist, om det fungerer som EN PS/PI(4)P-veksler. Desuden kan disse protokoller tjene til at udforske muligheden for LTPs tilhører andre familier til at transportere PI(4)P, som det for nylig blev vist med steroidogene akut regulatoriske overførsel-lignende proteiner10, eller PS. Derudover, NBD-PHFAPP er blevet brugt til at følge evne LTP til at transportere PI(4,5)P2 mellem liposomer, da det anerkender denne PIP10, 35. Endelig kan denne strategi tilpasses til at måle andre ekstraktions- eller transportprocesser in vitro ved hjælp af andre lipidbindende domæner (f.eks. en ikke-katalytisk PI-PLC til påvisning af PI51, sporulationsspecifikt protein 20-fragment til påvisning af PA52, domæne 4 (D4) af perfringolysin O til påvisning af sterol53).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi er Dr. A. Cuttriss taknemmelige for hendes omhyggelige korrekturlæsning af manuskriptet. Dette arbejde er finansieret af det franske nationale forskningsagentur grant ExCHANGE (ANR-16-CE13-0006) og af CNRS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 L-cysteine ≥97 % (FG)  Sigma W326305-100G Prepare a 10 mM L-cysteine stock solution in water. Aliquots are stored at -20 °C
2 mL Amber Vial, PTFE/Rub Lnr, for lipids storage in CHCL3 Wheaton W224681
4 mm-diameter glass beads Sigma Z265934-1EA
50 mL conical centrifuge tube Falcon
ÄKTA purifier GE healthcare FPLC
Aluminium foil
Amicon Ultra-15 with a MWCO of 3 and 10 kDa Merck UFC900324, UFC901024
Amicon Ultra-4 with a MWCO of 3 and 10 kDa Merck UFC800324, UFC801024
Ampicillin Prepare a 50 mg/mL stock solution with filtered and sterilized water and store it at -20 °C.
Bestatin Sigma B8385-10mg
BL21 Gold Competent Cells Agilent
C16:0 Liss  (Rhod-PE) in CHCl3 (1 mg/mL) Avanti Polar Lipids 810158C-5MG
C16:0/C16:0-PI(4)P   Echelon Lipids P-4016-3 Dissolve 1 mg of C16:0/C16:0-PI(4)P powder in 250 µL of MeOH and 250 µL of CHCl3. Then complete with CHCl3 to 1 mL. The solution must become clear.
C16:0/C18:1-PS (POPS) in CHCl3 (10 mg/mL) Avanti Polar Lipids 840034C-25mg
C18:1/C18:1-PC (DOPC) in CHCl3 (25 mg/mL) Avanti Polar Lipids 850375C-500mg
CaCl2  Sigma Prepare 10 mM CaCl2 stock solution in water.
Cell Disruptor Constant Dynamics
Chloroform (CHCl3) RPE-ISO Carlo Erba 438601
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail Roche 5056489001
Deionized (Milli-Q) water
Dimethylformamide (DMF), anhydrous, >99% pure
DNAse I Recombinant, RNAse free, in powder Roche 10104159001
DTT Euromedex EU0006-B Prepare 1 M DTT stock solution in Milli-Q water.  Prepare 1 mL aliquots and store them at -20 °C. 
Econo-Pac chromatography columns (1.5 × 12 cm). Biorad 7321010
Electroporation cuvette 2 mm Ozyme EP102
Electroporator Eppendorf 2510 Eppendorf
Fixed-Angle Rotor Ti45 and Ti45 tubes Beckman Spinning the batcerial lysates
Glass-syringes (10, 25, and 50 µL) for fluorescence experiment Hamilton
Glass-syringes (25 , 100, 250, 500, and 1000 µL) to handle lipid stock solutions Hamilton 1702RNR, 1710RNR, 1725RNR, 1750RN type3, 1001RN
Glutathione Sepharose 4B beads GE Healthcare 17-0756-05
Glycerol (99% pure) Sigma G5516-500ML
Hemolysis tubes with a cap
HEPES , >99 % pure Sigma H3375-500G
Illustra NAP 10 desalting column GE healthcare GE17-0854-02
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)  Euromedex EU0008-B Prepare 1 M IPTG stock solution in Milli-Qwater. Prepare 1 mL aliquots and store them at -20 °C. 
K-Acetate Prolabo 26664.293
Lennox LB Broth medium without glucose Prepared with milli-Q water and autoclaved.
Liquid nitrogen Linde
Methanol (MeOH) ≥99.8% VWR 20847.24
MgCl2 Sigma Prepare a 2 M MgCl2 solution. Filter the solution using a 0.45 µm filter. 
Microplate 96 Well PS F-Botom Black Non-Binding Greiner Bio-one 655900
Mini-Extruder with two 1 mL gas-tight Hamilton syringes Avanti Polar Lipids 610023
Monochromator-based fluorescence plate reader TECAN M1000 Pro
N,N'-Dimethyl-N-(Iodoacetyl)-N'-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Ethylenediamine) (IANBD Amide) Molecular Probes Dissolve 25 mg of IANBD in 2.5 mL of dimethylsulfoxide (DMSO) and prepare 25 aliquot of 100 µL in 1.5 mL screw-cap tubes. Do not completely screw the cap. Then, remove DMSO in a freeze-dryer to obtain 1 mg of dry IANBD per tube. Tubes are closed and stored at -20 °C in the dark.  
NaCl Sigma S3014-1KG
PBS 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM NaH2PO4, 1.8 mM KH2PO4, autoclaved and stored at 4 °C.
Pear-shaped glass flasks (25 mL, 14/23, Duran glass) Duran Group
Pepstatin Sigma p5318-25mg
pGEX-C2LACT  plasmid Available on request from our lab
pGEX-PHFAPP plasmid Available on request from our lab
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) ≥98.5% (GC) Sigma P7626-25g Prepare a 200 mM PMSF stock solution in isopropanol
Phosphoramidon Sigma R7385-10mg
Polycarbonate filters (19 mm in diameter) with pore size of 0.2 µm Avanti Polar Lipids 610006
Poly-Prep chromatography column (with a 0-2 mL bed volume and a 10 mL reservoir) Biorad 7311550
Prefilters (10 mm in diameter). Avanti Polar Lipids 610014
PyMOL http://pymol.org/ Construction of the 3D models of the proteins (Figure 1A)
Quartz cuvette for UV/visible fluorescence (minimum volume of 600 µL) Hellma
Quartz cuvettes Hellma
Refrigerated centrifuge  Eppendorf 5427R Eppendorf
Rotary evaporator Buchi B-100
Screw-cap microcentriguge tubes (1.5 mL) Sarsted
Small magnetic PFTE stirring bar (5 × 2 mm)
Snap-cap microcentriguge tubes (0.5, 1, and 2 mL) Eppendorf
SYPRO orange fluorescent stain to detect protein in SDS-PAGE gel
Thermomixer Starlab
THROMBIN, FROM HUMAN PLASMA Sigma 10602400001 Dissolve 20 units in 1 mL of milli-Q water and prepare 25 µL aliquots in 0.5 mL Eppendorf tubes. Then freeze and store at -80 °C.
Tris, ultra pure MP 819623
Ultracentrifuge L90K Beckman
UV/Visible absorbance spectrophotometer SAFAS
UV/visible spectrofluorometer with a temperature-controlled cell holder and stirring device Jasco or Shimadzu Jasco FP-8300 or Shimadzu RF-5301PC
Vacuum chamber
Water bath Julabo
XK 16/70 column packed with Sephacryl S200HR GE healthcare

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Drin, G. Topological regulation of lipid balance in cells. Annual Review of Biochemistry. 83, 51-77 (2014).
  2. Bigay, J., Antonny, B. Curvature, lipid packing, and electrostatics of membrane organelles: defining cellular territories in determining specificity. Developmental Cell. 23 (5), 886-895 (2012).
  3. Prinz, W. A. Lipid trafficking sans vesicles: where, why, how. Cell. 143 (6), 870-874 (2010).
  4. Holthuis, J. C., Menon, A. K. Lipid landscapes and pipelines in membrane homeostasis. Nature. 510 (7503), 48-57 (2014).
  5. Wong, L. H., Copic, A., Levine, T. P. Advances on the transfer of lipids by lipid transfer proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 516-530 (2017).
  6. Wong, L. H., Gatta, A. T., Levine, T. P. Lipid transfer proteins: the lipid commute via shuttles, bridges and tubes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (2), 85-101 (2019).
  7. Iaea, D. B., Dikiy, I., Kiburu, I., Eliezer, D., Maxfield, F. R. STARD4 membrane interactions and sterol binding. Biochemistry. 54 (30), 4623-4636 (2015).
  8. Wilhelm, L. P., et al. STARD3 mediates endoplasmic reticulum-to-endosome cholesterol transport at membrane contact sites. The EMBO Journal. 36 (10), 1412-1433 (2017).
  9. Bian, X., Saheki, Y., De Camilli, P. Ca(2+) releases E-Syt1 autoinhibition to couple ER-plasma membrane tethering with lipid transport. The EMBO Journal. 37 (2), 219-234 (2018).
  10. Horenkamp, F. A., Valverde, D. P., Nunnari, J., Reinisch, K. M. Molecular basis for sterol transport by StART-like lipid transfer domains. The EMBO Journal. 37 (6), 98002 (2018).
  11. Jentsch, J. A., et al. Structural basis of sterol binding and transport by a yeast StARkin domain. The Journal of Biological Chemistry. 293 (15), 5522-5531 (2018).
  12. Moser von Filseck, J., et al. INTRACELLULAR TRANSPORT. Phosphatidylserine transport by ORP/Osh proteins is driven by phosphatidylinositol 4-phosphate. Science. 349 (6246), 432-436 (2015).
  13. Daum, G., et al. Systematic analysis of yeast strains with possible defects in lipid metabolism. Yeast. 15 (7), 601-614 (1999).
  14. Ejsing, C. S., et al. Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).
  15. Leidl, K., Liebisch, G., Richter, D., Schmitz, G. Mass spectrometric analysis of lipid species of human circulating blood cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1781 (10), 655-664 (2008).
  16. Sampaio, J. L., et al. Membrane lipidome of an epithelial cell line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (5), 1903-1907 (2011).
  17. Vance, J. E., Steenbergen, R. Metabolism and functions of phosphatidylserine. Progress in Lipid Research. 44 (4), 207-234 (2005).
  18. Zinser, E., et al. Phospholipid synthesis and lipid composition of subcellular membranes in the unicellular eukaryote Saccharomyces cerevisiae. Journal of Bacteriology. 173 (6), 2026-2034 (1991).
  19. Leventis, P. A., Grinstein, S. The distribution and function of phosphatidylserine in cellular membranes. Annual Review of Biophysics. 39, 407-427 (2010).
  20. Yeung, T., et al. Membrane phosphatidylserine regulates surface charge and protein localization. Science. 319 (5860), 210-213 (2008).
  21. Kim, J., Shishido, T., Jiang, X., Aderem, A., McLaughlin, S. Phosphorylation, high ionic strength, and calmodulin reverse the binding of MARCKS to phospholipid vesicles. Journal of Biological Chemistry. 269 (45), 28214-28219 (1994).
  22. Sigal, C. T., Zhou, W., Buser, C. A., McLaughlin, S., Resh, M. D. Amino-terminal basic residues of Src mediate membrane binding through electrostatic interaction with acidic phospholipids. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (25), 12253-12257 (1994).
  23. Gal Bivona, T., et al. PKC regulates a farnesyl-electrostatic switch on K-Ras that promotes its association with Bcl-XL on mitochondria and induces apoptosis. Molecular Cell. 21 (4), 481-493 (2006).
  24. Finkielstein, C. V., Overduin, M., Capelluto, D. G. Cell migration and signaling specificity is determined by the phosphatidylserine recognition motif of Rac1. The Journal of Biological Chemistry. 281 (37), 27317-27326 (2006).
  25. Bolsover, S. R., Gomez-Fernandez, J. C., Corbalan-Garcia, S. Role of the Ca2+/Phosphatidylserine Binding Region of the C2 Domain in the Translocation of Protein Kinase Cα to the Plasma Membrane. Journal of Biological Chemistry. 278 (12), 10282-10290 (2003).
  26. Vance, J. E., Tasseva, G. Formation and function of phosphatidylserine and phosphatidylethanolamine in mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1831 (3), 543-554 (2013).
  27. Maeda, K., et al. Interactome map uncovers phosphatidylserine transport by oxysterol-binding proteins. Nature. 501 (7466), 257-261 (2013).
  28. D'Ambrosio, J. M., et al. Osh6 requires Ist2 for localization to ER-PM contacts and efficient phosphatidylserine transport in budding yeast. Journal of Cell Science. 133 (11), 243733 (2020).
  29. Manford, A. G., Stefan, C. J., Yuan, H. L., Macgurn, J. A., Emr, S. D. ER-to-plasma membrane tethering proteins regulate cell signaling and ER morphology. Developmental Cell. 23 (6), 1129-1140 (2012).
  30. Collado, J., et al. Tricalbin-mediated contact sites control ER curvature to maintain plasma membrane integrity. Developmental Cell. 51 (4), 476-487 (2019).
  31. Hoffmann, P. C., et al. Tricalbins contribute to cellular lipid flux and form curved ER-PM contacts that are bridged by rod-shaped structures. Developmental Cell. 51 (4), 488-502 (2019).
  32. Lipp, N. F., et al. An electrostatic switching mechanism to control the lipid transfer activity of Osh6p. Nature Communications. 10 (1), 3926 (2019).
  33. Chung, J., et al. INTRACELLULAR TRANSPORT. PI4P/phosphatidylserine countertransport at ORP5- and ORP8-mediated ER-plasma membrane contacts. Science. 349 (6246), 428-432 (2015).
  34. Sohn, M., et al. PI(4,5)P2 controls plasma membrane PI4P and PS levels via ORP5/8 recruitment to ER-PM contact sites. The Journal of Cell Biology. 217 (5), 1797-1813 (2018).
  35. Ghai, R., et al. ORP5 and ORP8 bind phosphatidylinositol-4, 5-biphosphate (PtdIns(4,5)P 2) and regulate its level at the plasma membrane. Nature Communications. 8 (1), 757 (2017).
  36. Sohn, M., et al. Lenz-Majewski mutations in PTDSS1 affect phosphatidylinositol 4-phosphate metabolism at ER-PM and ER-Golgi junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4314-4319 (2016).
  37. Kattan, W. E., et al. Targeting plasma membrane phosphatidylserine content to inhibit oncogenic KRAS function. Life Science Alliance. 2 (5), 00431 (2019).
  38. Du, X., Turner, N., Yang, H. The role of oxysterol-binding protein and its related proteins in cancer. Seminars in Cell & Developmental Biology. 81, 149-153 (2018).
  39. Galmes, R., et al. ORP5/ORP8 localize to endoplasmic reticulum-mitochondria contacts and are involved in mitochondrial function. EMBO reports. 17 (6), 800-810 (2016).
  40. Du, X., et al. ORP5 localizes to ER-lipid droplet contacts and regulates the level of PI(4)P on lipid droplets. The Journal of Cell Biology. 219 (1), 201905162 (2020).
  41. Wang, H., et al. ORP2 delivers cholesterol to the plasma membrane in exchange for phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PI(4,5)P2). Molecular Cell. 73 (3), 458-473 (2019).
  42. Kay, J. G., Grinstein, S. Sensing phosphatidylserine in cellular membranes. Sensors (Basel). 11 (2), 1744-1755 (2011).
  43. Moser von Filseck, J., Vanni, S., Mesmin, B., Antonny, B., Drin, G. A phosphatidylinositol-4-phosphate powered exchange mechanism to create a lipid gradient between membranes. Nature Communications. 6, 6671 (2015).
  44. Wills, R. C., Goulden, B. D., Hammond, G. R. V. Genetically encoded lipid biosensors. Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1526-1532 (2018).
  45. Raychaudhuri, S., Im, Y. J., Hurley, J. H., Prinz, W. A. Nonvesicular sterol movement from plasma membrane to ER requires oxysterol-binding protein-related proteins and phosphoinositides. The Journal of Cell Biology. 173 (1), 107-119 (2006).
  46. Lenoir, M., et al. Structural basis of wedging the Golgi membrane by FAPP pleckstrin homology domains. EMBO reports. 11 (4), 279-284 (2010).
  47. Liu, Y., Kahn, R. A., Prestegard, J. H. Interaction of Fapp1 with Arf1 and PI4P at a membrane surface: an example of coincidence detection. Structure. 22 (3), 421-430 (2014).
  48. Shao, C., Novakovic, V. A., Head, J. F., Seaton, B. A., Gilbert, G. E. Crystal structure of lactadherin C2 domain at 1.7A resolution with mutational and computational analyses of its membrane-binding motif. The Journal of Biological Chemistry. 283 (11), 7230-7241 (2008).
  49. Lipp, N. F., Ikhlef, S., Milanini, J., Drin, G. Lipid exchangers: cellular functions and mechanistic links with phosphoinositide metabolism. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 663 (2020).
  50. Venditti, R., et al. Molecular determinants of ER-Golgi contacts identified through a new FRET-FLIM system. The Journal of Cell Biology. 218 (3), 1055-1065 (2019).
  51. Pemberton, J. G., et al. Defining the subcellular distribution and metabolic channeling of phosphatidylinositol. The Journal of Cell Biology. 219 (3), (2020).
  52. Nakanishi, H., de los Santos, P., Neiman, A. M. Positive and negative regulation of a SNARE protein by control of intracellular localization. Molecular Biology of the Cell. 15 (4), 1802-1815 (2004).
  53. Maekawa, M., Yang, Y., Fairn, G. D. Perfringolysin O theta toxin as a tool to monitor the distribution and inhomogeneity of cholesterol in cellular membranes. Toxins. 8 (3), 67 (2016).

Tags

Biokemi Udgave 169 lipidoverførselsprotein OSBP-relateret protein fosfattidylserin fosfatylinositol 4-fosfat fluorescens rekombinant protein liposom
Fluorescensbaserede målinger af fosfatylserin/Fosfatylinositol 4-fosfatudveksling mellem membraner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ikhlef, S., Lipp, N. F., Magdeleine, … More

Ikhlef, S., Lipp, N. F., Magdeleine, M., Drin, G. Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes. J. Vis. Exp. (169), e62177, doi:10.3791/62177 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter