Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Fluorescentie-gebaseerde metingen van fosfatidylserine / fosfatidylinositol 4-fosfaatuitwisseling tussen membranen

Published: March 14, 2021 doi: 10.3791/62177
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Université Côte d’Azur, Centre National de la Recherche Scientifique, Institut de Pharmacologie Moléculaire et Cellulaire
* These authors contributed equally

Summary

Hier beschrijven we protocollen met behulp van fluorescerende lipidesensoren en liposomen om te bepalen of een eiwit fosfatidylserine of fosfatidylinositol 4-fosfaat in vitroextraheert en transporteert .

Abstract

Verschillende leden van de evolutionair geconserveerde oxysterol-bindend eiwit (OSBP) -gerelateerde eiwitten (ORP) / OSBP-homologen (Osh) -familie zijn onlangs gevonden om een nieuwe lipide transfer eiwit (LTP) -groep in gist en menselijke cellen te vertegenwoordigen. Ze brengen fosfatidylserine (PS) over van het endoplasmatisch reticulum (ER) naar het plasmamembraan (PM) via PS/fosfatidylinositol 4-fosfaat (PI(4)P) uitwisselingscycli. Deze bevinding maakt een beter begrip mogelijk van hoe PS, dat van cruciaal belang is voor signaleringsprocessen, door de cel wordt verdeeld en het onderzoek naar het verband tussen dit proces en het fosfoinositide (PIP) metabolisme. De ontwikkeling van nieuwe op fluorescentie gebaseerde protocollen heeft een belangrijke rol gespeeld bij de ontdekking en karakterisering van dit nieuwe cellulaire mechanisme in vitro op moleculair niveau. Dit artikel beschrijft de productie en het gebruik van twee fluorescerend gelabelde lipidesensoren, NBD-C2Lact en NBD-PHFAPP, om het vermogen van een eiwit te meten om PS of PI(4)P te extraheren en deze lipiden over te brengen tussen kunstmatige membranen. Ten eerste beschrijft het protocol hoe u zeer zuivere monsters van deze twee constructies kunt produceren, labelen en verkrijgen. Ten tweede legt dit artikel uit hoe deze sensoren met een fluorescentiemicroplaatlezer kunnen worden gebruikt om te bepalen of een eiwit PS of PI(4)P uit liposomen kan extraheren, met behulp van Osh6p als casestudy. Ten slotte laat dit protocol zien hoe de kinetiek van PS/ PI(4)P-uitwisseling tussen liposomen met gedefinieerde lipidesamenstelling nauwkeurig kan worden gemeten en hoe lipideoverdrachtssnelheden kunnen worden bepaald door fluorescentieresonantie-energieoverdracht (FRET) met behulp van een standaard fluorometer.

Introduction

De precieze verdeling van lipiden tussen verschillende membranen en binnen de membranen van eukaryote cellen1,2 heeft diepgaande biologische implicaties. Het decoderen van hoe LTP's functioneren is een belangrijke kwestie in de celbiologie3,4,5,6,en in vitro benaderingen zijn van grote waarde bij het aanpakken van dit probleem7,8,9,10,11. Hier wordt een op in vitro,fluorescentie gebaseerde strategie gepresenteerd die een belangrijke rol heeft gespeeld bij het vaststellen dat verschillende ORP / Osh-eiwitten PS / PI (4) P-uitwisseling tussen celmembranen12 beïnvloeden en daardoor een nieuwe klasse LTP's vormen. PS is een anionisch glycerofosfolipide dat 2-10% van de totale membraanlipiden in eukaryote cellenvertegenwoordigt 13,14,16. Het wordt verdeeld langs een gradiënt tussen de ER en de PM, waar het 5-7% en tot 30% van de glycerofosfolipiden vertegenwoordigt, respectievelijk17,18,19. Bovendien is PS in wezen geconcentreerd in de cytosolische bijsluiter van de PM. Deze opbouw en de ongelijke verdeling van PS in de PM zijn van cruciaal belang voor cellulaire signaleringsprocessen19. Vanwege de negatieve lading van PS-moleculen is de cytosolische bijsluiter van de PM veel anionischer dan de cytosolische folder van andere organellen1,2,19,20. Dit maakt de rekrutering mogelijk, via elektrostatische krachten, van signaaleiwitten zoals myristoylated alanine-rich C-kinase substrate (MARCKS)21, sarcoom (Src)22, Kirsten-rat sarcoom viral oncogene (K-Ras)23en Ras-gerelateerd C3 botulinetoxinesubstraat 1 (Rac1)24 die een stuk positief geladen aminozuren en een lipide staart bevatten.

PS wordt ook herkend door conventioneel eiwitkinase C op een stereoselectieve manier via een C2-domein25. PS wordt echter gesynthetiseerd in de ER26, wat aangeeft dat het naar de PM moet worden geëxporteerd voordat het zijn rol kan spelen. Het was niet bekend hoe dit werd bereikt19 tot de bevinding dat, in gist, Osh6p en Osh7p PS overbrengen van de ER naar de PM27. Deze LTP's behoren tot een evolutionair geconserveerde familie in eukaryoten waarvan het stichtende lid OSBP is en die eiwitten bevat (ORP's in de mens, Osh-eiwitten in gist) die een OSBP-gerelateerd domein (ORD) integreren met een pocket om een lipidemolecuul te hosten. Osh6p en Osh7p bestaan alleen uit een ORD waarvan de structurele kenmerken zijn aangepast om PS specifiek te binden en over te brengen tussen membranen. Niettemin was onduidelijk hoe deze eiwitten PS van de ER naar de PM overdroegen. Osh6p en Osh7p kunnen PI(4)P vangen als alternatief lipideligand12. In gist wordt PI(4)P gesynthetiseerd uit fosfatidylinositol (PI) in de Golgi en de PM door respectievelijk PI 4-kinases, Pik1p en Stt4p. Daarentegen is er geen PI(4)P in het ER-membraan, omdat dit lipide door de Sac1p-fosfatase tot PI wordt gehydrolyseerd. Daarom bestaat er een PI(4)P-gradiënt op zowel de ER/Golgi- als de ER/PM-interfaces. Osh6p en Osh7p brengen PS over van de ER naar de PM via PS/PI(4)P-uitwisselingscycli met behulp van de PI(4)P-gradiënt die bestaat tussen deze twee membranen12.

Binnen één cyclus haalt Osh6p PS uit de ER, wisselt PS in voor PI(4)P bij de PM en brengt PI(4)P terug naar de ER om een ander PS-molecuul te extraheren. Osh6p / Osh7p interageren met Ist2p28, een van de weinige eiwitten die het ER-membraan en de PM in de nabijheid van elkaar brengen om ER-PM-contactsites in gist29,30, 31te creëren. Bovendien wordt de associatie van Osh6p met negatief geladen membranen zwak zodra het eiwit een van zijn lipideliganden extraheert als gevolg van een conformatieverandering die de elektrostatische kenmerken wijzigt32. Dit helpt Osh6p door de verblijftijd van het membraan te verkorten, waardoor de efficiëntie van zijn lipidenoverdrachtsactiviteit behouden blijft. In combinatie met de binding aan Ist2p zou dit mechanisme Osh6p/7p in staat kunnen stellen om zowel snel als nauwkeurig lipidenuitwisseling uit te voeren op de ER/PM-interface. In menselijke cellen voeren ORP5- en ORP8-eiwitten PS/PI(4)P-uitwisseling uit op ER-PM-contactplaatsen via verschillende mechanismen33. Ze hebben een centrale ORD, vergelijkbaar met Osh6p, maar zijn direct verankerd aan de ER via een C-terminal transmembraansegment33 en dokken in de PM via een N-terminal Pleckstrin homologie (PH) domein dat PI(4)P en PI(4,5)P233,34,35herkent. ORP5/8 gebruikt PI(4)P om PS over te dragen, en het is aangetoond dat ORP5/8 bovendien PM PI(4,5)P2-niveaus reguleert en vermoedelijk signaleringsroutes moduleert. Op zijn beurt verlaagt een afname van PI(4)P- en PI(4,5)P2-niveaus de ORP5/ORP8-activiteit omdat deze eiwitten zich op een PIP-afhankelijke manier associëren met de PM. Abnormaal hoge PS-synthese, die leidt tot het Lenz-Majewski-syndroom, beïnvloedt PI (4) P-niveaus via ORP5 / 836. Wanneer de activiteit van beide eiwitten wordt geblokkeerd, wordt PS minder overvloedig bij de PM, waardoor het oncogene vermogen van signaaleiwitten wordt verlaagd37.

Omgekeerd lijkt ORP5-overexpressie de invasie van kankercellen en gemetastaseerde processen te bevorderen38. Veranderingen in ORP5/8-activiteit kunnen dus het cellulaire gedrag ernstig veranderen door veranderingen in lipidehomeostase. Verder bezetten ORP5 en ORP8 ER-mitochondria contactplaatsen en behouden ze enkele mitochondriale functies, mogelijk door PS39te leveren . Bovendien lokaliseert ORP5 naar ER-lipidedruppelcontactplaatsen om PS aan lipidedruppels te leveren door PS / PI (4) P-uitwisseling40. De hierin beschreven strategie om (i) PS- en PI(4)P-extractie uit liposomen en (ii) PS- en PI(4)P-transport tussen liposomen te meten, is ontwikkeld om de PS/PI(4)P-uitwisselingsactiviteit van Osh6p/Osh7p12,32 vast te stellen en te analyseren en door andere groepen gebruikt om de activiteit van ORP5/ORP835 en andere LTP's te analyseren10, 41. Het is gebaseerd op het gebruik van een fluorescentieplaatlezer, een standaard L-formaat spectrofluorometer en twee fluorescerende sensoren, NBD-C2Lact en NBD-PHFAPP, die respectievelijk PS en PI (4) P kunnen detecteren.

NBD-C2Lact komt overeen met het C2-domein van het glycoproteïne, lactadherine, dat opnieuw werd ontworpen om een uniek aan oplosmiddel blootgesteld cysteïne in de buurt van de veronderstelde PS-bindingsplaats te omvatten; een polariteitsgevoelige NBD (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol) fluorofoor is covalent gekoppeld aan dit residu (figuur 1A)12. Om preciezer te zijn, werd het C2-domein van lactadherine (Bos taurus, UniProt: Q95114, residuen 270-427) gekloond tot een pGEX-4T3-vector om te worden uitgedrukt in fusie met glutathion S-transferase (GST) in Escherichia coli. De C2Lact-sequentie werd vervolgens gemuteerd om twee oplosmiddeltoegankelijke cysteïneresiduen (C270, C427) te vervangen door alanineresiduen en om een cysteïneresidu in te brengen in een gebied in de buurt van de vermeende PS-bindingsplaats (H352C-mutatie) dat vervolgens kan worden gelabeld met N,N'-dimethyl-N-(joodacetyl)-N'-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl) ethyleendiamine (IANBD) 12. Een splitsingsplaats voor trombine is aanwezig tussen het GST-eiwit en de N-terminus van het C2-domein. Een groot voordeel is dat dit domein PS selectief herkent op een Ca2+-onafhankelijke manier in tegenstelling tot andere bekende C2-domeinen of Annexin A542. NBD-PHFAPP is afgeleid van het PH-domein van het menselijke vierfosfaat-adaptoreiwit 1 (FAPP1), dat opnieuw is ontworpen om een enkele aan oplosmiddelen blootgestelde cysteïne te bevatten die kan worden gelabeld met een NBD-groep in de buurt van de PI(4)P-bindingsplaats (Figuur 1A)43. De nucleotidesequentie van het PH-domein van het menselijke FAPP-eiwit (UniProt: Q9HB20, segment [1-100]) is gekloond tot een pGEX-4T3-vector die samen met een GST-tag tot expressie wordt gebracht. De PHFAPP-sequentie is aangepast om een uniek cysteïneresidu in te brengen in de membraanbindende interface van het eiwit43. Bovendien is een negenresidu-linker geïntroduceerd tussen de trombinesplitsingsplaats en de N-terminus van het PH-domein om de toegankelijkheid van het protease te waarborgen.

Om PS-extractie uit liposomen te meten, wordt NBD-C2Lact gemengd met liposomen gemaakt van fosfatidylcholine (PC) met sporenhoeveelheden PS. Vanwege de affiniteit voor PS bindt dit construct aan de liposomen en de NBD-fluorofoor ervaart een verandering in polariteit als het in contact komt met de hydrofobe omgeving van het membraan, wat een blauwverschuiving en een toename van fluorescentie opwekkendt. Als PS bijna volledig wordt geëxtraheerd door een stoichiometrische hoeveelheid LTP, associeert de sonde zich niet met liposomen en is het NBD-signaal lager (Figuur 1B)32. Dit verschil in signaal wordt gebruikt om te bepalen of een LTP(bijvoorbeeld Osh6p) PS extraheert. Een vergelijkbare strategie wordt gebruikt met NBD-PHFAPP om PI(4)P extractie te meten(Figuur 1B), zoals eerder beschreven12,32. Twee fret-gebaseerde assays werden ontworpen om (i) PS-transport van LA naar LB liposomen te meten, die respectievelijk het ER-membraan en de PM nabootsen, en (ii) PI(4)P-transport in de omgekeerde richting. Deze testen worden uitgevoerd onder dezelfde omstandigheden(d.w.z. dezelfde buffer, temperatuur en lipidenconcentratie) om PS / PI (4) P-uitwisseling te meten. Om ps-transport te meten, wordt NBD-C2lact gemengd met LA liposomen samengesteld uit PC en gedopeerd met 5 mol% PS en 2 mol% van een fluorescerende rhodamine-gelabelde fosfatidylethanolamine (Rhod-PE) - en LB liposomen met 5 mol% PI (4) P.

Op tijdstip nul dooft FRET met Rhod-PE de NBD-fluorescentie. Als PS wordt getransporteerd van LA naar LB liposomen(bijvoorbeeld bij het injecteren van Osh6p), treedt een snelle dequenching op als gevolg van de translocatie van NBD-C2Lactmoleculen van LA naar LB liposomen(Figuur 1C). Gezien de hoeveelheid toegankelijke PS blijft NBD-C2Lact in wezen in een membraangebonden toestand in de loop van het experiment12. De intensiteit van het NBD-signaal correleert dus direct met de verdeling van NBD-C2Lact tussen LA- en L B-liposomen en kan gemakkelijk worden genormaliseerd om te bepalen hoeveel PS wordt overgedragen. Om de overdracht van PI(4)P in de tegenovergestelde richting te meten, wordt NBD-PHFAPP gemengd met LA- en L B-liposomen; aangezien het alleen bindt aan L B-liposomen die PI(4)P bevatten, maar niet aan Rhod-PE, is de fluorescentie hoog. Als PI(4)P wordt overgebracht naar LA liposomen, transloceert het naar deze liposomen en neemt het signaal af als gevolg van FRET met Rhod-PE(Figuur 1C). Het signaal wordt genormaliseerd om te bepalen hoeveel PI(4)P wordt overgedragen43.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Zuivering van NBD-C2Lact

OPMERKING: Hoewel dit protocol het gebruik van een celverstoorder beschrijft om bacteriën te breken, kan het worden gewijzigd om andere lysisstrategieën te gebruiken(bijvoorbeeld een Franse pers). Aan het begin van de zuivering is het verplicht om buffer te gebruiken die vers wordt ontgast, gefilterd en aangevuld met 2 mM dithiothreitol (DTT) om de oxidatie van cysteïne te voorkomen. Voor de stap voor eiwitetikettering is het echter cruciaal om DTT volledig te verwijderen. Veel stappen moeten worden uitgevoerd op ijs of in een koude ruimte om eiwitafbraak te voorkomen. Monsters van 30 μL volume moeten worden verzameld in verschillende stappen van het protocol om een analyse uit te voeren door natriumdodecylssulfaat-polyacrylamide gel elektroforese (SDS-PAGE) met behulp van een 15% acrylamidegel om de voortgang van de zuivering te controleren. Meng voldoende denaturerend Laemmli-monsterbuffer met elke aliquot en verwarm het mengsel op 95 °C. Vries de buizen in en bewaar ze bij -20 °C tot de analyse.

  1. Expressie van GST-C2Lact in Escherichia coli
    1. Meng 20 μL BL21 Gold competente cellen met 18 μL gesteriliseerd water. Meng vervolgens 2 μL pGEX-C2Lactplasmide (bij ~ 65 ng / μL) met de bacteriën en transformeer ze door elektroporatie. Resuspend de bacteriën met 150 μL geautoclaveerd Lennox Lysogeny-Bouillon (LB) medium (10 g/L trypton, 5 g/L gistextract, 5 g/L NaCl in gedeïoniseerd water, glucosevrij). Laat de bacteriën groeien bij 37 °C gedurende 1 uur in een 2 ml snap-cap microcentrifugebuis.
    2. Ent 25 ml LB-medium, aangevuld met 50 μg/ml ampicilline, met 150 μl bacteriële suspensie in een steriele Erlenmeyer van 125 ml. Plaats de kolf in een orbitale shaker bij 37 °C en laat de bacteriën een nacht groeien met roeren bij 185 tpm.
    3. Vul twee steriele erlenmeyers van 2 l met 500 ml medium van LB, aangevuld met ampicilline van 50 μg/ml, en voeg 5 ml voorcultuursuspensie toe. Laat de bacteriën groeien bij 37 °C met agitatie bij 220 rpm.
    4. Meet periodiek de optische dichtheid (OD) van de suspensie bij een golflengte (λ) van 600 nm. Wanneer de OD een waarde van ~0,6-0,7 bereikt, voegt u aan elke kolf 500 μL van een stamoplossing van 1 M isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) toe om de expressie van GST-C2Lactte starten. Schud de kolven gedurende 4 uur bij 37 °C bij 185 tpm.
    5. Breng de inhoud van elke kolf over in een polypropyleen centrifugefles. Centrifugeer de twee flessen gedurende 30 minuten bij 4600 × g bij 4 °C om de bacteriën te pelletiseren. Gooi het supernatant weg en resuspend elke pellet in 50 ml koude fosfaat-gebufferde zoutoplossing.
    6. Breng de bacteriële suspensie in elke fles over in een conische centrifugebuis van 50 ml. Centrifugeer de twee buizen gedurende 30 minuten bij 2300 × g bij 4 °C. Verwijder het supernatant en bewaar de buisjes, die elk een bacteriële pellet bevatten, bij -20 °C.
  2. Zuivering van C2Lact
    1. Vul op ijs twee conische centrifugaalbuizen van 50 ml met 50 ml buffer met 50 mM Tris-HCl, pH 7,4 en 150 mM NaCl (hierna TN-buffer genoemd), eerder gefilterd en ontgast door membraanvacuümfiltratie.
    2. Om de lysisbuffer in elke buis te bereiden, lost u een tablet ethyleendiaminetetra-azijnzuurvrije proteaseremmercocktail op in de TN-buffer door milde ultrasoonapparaat of vortexing. Voeg andere antiproteasen toe (10 μM bestatine, 1 μg/ml pepstatine A en 10 μM fosforamidon). Belangrijk is om de buffer aan te vullen met 2 mM DTT.
    3. Vul de twee buizen die de bacteriële pellets bevatten die in stap 1.1.6 zijn bereid, met lysisbuffer om een eindvolume van 30 ml in elke buis te verkrijgen en ontdooi de pellets langzaam op ijs gedurende 10 minuten. Plet elke pellet met een roestvrijstalen spatel en resuspendeert ze door de buizen te vortexen en/of door de suspensie heen en weer te pipetteren met een pipetregelaar en een pipet van 25 ml totdat een homogene suspensie is verkregen.
    4. Voer lysis uit met behulp van een voorgekoelde celverstoorder (zie de tabel met materialen) door 30 ml van het monster in het reservoir te laden en een breukcyclus uit te voeren in continue modus met een druk van 1,6 bar. Verzamel het lysaat in dezelfde buis, houd de buis op ijs en voeg onmiddellijk 250 μL toe uit een stamoplossing van 200 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) bereid in isopropanol.
    5. Lyse het andere monster volgens dezelfde procedure. Gebruik de rest van de lysisbuffer om de celverstoorder te wassen en verzamel de was om het volume van elk lysaat (~ 30 ml) aan te passen aan een eindvolume van 50 ml.
    6. Vul elk lysaat aan met 5 mM MgCl2en voeg 20 μg/ml DNAse I toe om het DNA te fragmenteren en zo de viscositeit van het monster te verminderen. Incubeer op ijs gedurende 30 min. Verzamel een monster voor gelanalyse.
    7. Breng elke 50 ml lysaat over in een voorgechilleerde polycarbonaat ultracentrifugebuis (twee in totaal, zie de tabel met materialen). Centrifugeer bij 186.000 × g bij 4 °C gedurende ten minste 1 uur met behulp van een ultracentrifuge.
    8. Geef parallel aan de centrifugatiestap 1,4 ml van een slurry met glutathion gekoppeld aan 4% agaroseparels in twee conische centrifugaalbuizen van 50 ml, voeg 20 ml TN-buffer aangevuld met 1 mM DTT (TND-buffer) toe aan elke buis, centrifugeer bij 1200 × g gedurende 5 minuten en gooi het supernatant weg. Herhaal deze wasstap twee keer.
    9. Verwijder na de centrifugering van het bacteriële lysaat een monster van 30 μL uit het supernatant en breng het supernatant over van elke ultracentrifugebuis naar een overeenkomstige conische centrifugebuis van 50 ml die schone kralen bevat. Voor gelanalyse resuspenseert u de vuilkorrel in een van de ultracentrifugebuizen met 50 ml TND-buffer en verzamelt u een monster van 30 μL.
    10. Plaats de buizen gedurende 3-4 uur bij 4 °C op een rotator om een homogene kraalsuspensie te verkrijgen. Bundel de kraalsuspensies in een lege chromatografiekolom van 25 ml. Laat de kralen decanteren en verwijder de buffer en ongebonden eiwitten door de zwaartekrachtstroom. Neem een monster van het eluaat voor analyse.
    11. Resuspend de kralen met 20 ml TND-buffer en verzamel het eluaat door de zwaartekrachtstroom. Herhaal deze stap twee keer om de kralen volledig te wassen. Pool de verzamelde eluaten en bewaar een monster van 30 μL voor verdere analyse.
      OPMERKING: Na een korte decantatie, een volume van ~ 2 ml kralensuspensie, waaraan GST-C2Lact is bevestigd, sedimenten aan de onderkant van de kolom.
    12. Voeg 1 ml kraalsuspensie toe aan twee microcentrifugebuizen van 2 ml met snap-cap. Vul elke buis met TND-buffer tot een eindvolume van 1.970 ml. Neem een monster van 30 μL uit één buis voor verdere analyse (B1-monster). Voeg 10 μL 10 mM CaCl2-oplossing en 25 μL uit een standaardoplossing van humane trombineproteaseoplossing toe bij 0,02 E/μL.
    13. Plaats de twee buisjes 's nachts op een rotator bij 4 °C, zodat trombine de GST-tag van het C2Lact-domein kan afsplitsen. Meng de volgende dag in elke buis 10 μL 200 mM PMSF-oplossing met de kraalsuspensie om de trombinewerking te remmen.
    14. Centrifugeer de buizen op 700 × g gedurende 5 minuten en verzamel het supernatant, dat oplosbaar C2Lact-domein bevat, uit elke buis, zonder de kralen te nemen. Bundel de supernatanten in een 2 ml snap-cap microcentrifugebuis (E1 eluate) die op ijs wordt gehouden.
    15. Voeg 1 ml TND-buffer toe aan elke buis om de kralen opnieuw te suspenseren en was ze; herhaal stap 1.2.14. Voer deze stap driemaal meer uit om een maximale hoeveelheid eiwit terug te winnen. Bundel elke keer de verzamelde supernatanten in een nieuwe buis van 2 ml (E2, E3, E4 en E5 elueert) en neem een aliquot voor verdere analyse. Neem aan het einde van de wasstappen een aliquot van de kraalsuspensie (aliquot B2).
    16. Analyseer de 30 μL monsters die werden verzameld in de verschillende stappen van het zuiveringsprotocol door SDS-PAGE scheiding op een 15% acrylamide gel.
    17. Verwijder potentiële verontreinigende kralen door alle supernatanten(d.w.z.~ 10 ml) die tijdens stap 1.2.14 en 1.2.15 zijn verzameld, te bundelen in een chromatografiekolom van 10 ml. Verzamel het eluaat door de zwaartekrachtstroom en behoud de kralen aan de onderkant van de kolom.
    18. Concentreer het C2Lact-monster met behulp van een centrifugaalfiltereenheid met een moleculaire gewichtsafsnijding (MWCO) van 3 kDa en een centrifugatiesnelheid van 2300 × g. Stop de concentratieprocedure wanneer het volume van het eiwitmonster ~ 1 ml is.
  3. Bereiding en zuivering van NBD-C2Lact
    1. Breng een ontzoutingskolom in evenwicht (zie de tabel met materialen) met TN-buffer. Laad de kolom met 1 ml geconcentreerd C2Lactmonster. Laat het monster volledig in het gelbed komen, voeg 1,5 ml vers ontgaste DTT-vrije TN-buffer toe aan de kolom en vancaveer het eluaat door de zwaartekrachtstroom in een 2 ml snap-cap microcentrifugebuis.
    2. Verdun 50 μL eluaat in een eindvolume van 300 μL TN-buffer en noteer een absorptiespectrum van 230 tot 450 nm met zuivere TN-buffer als blanco. Bepaal de C2Lact-concentratie op basis van de absorptie gemeten bij 280 nm, rekening houdend met een extinctiecoëfficiënt ε gelijk aan 44.920 M-1.cm-1.
    3. Om de C2Lact-constructie te labelen met een NBD-fluorofoor, mengt u het eiwit met een tienvoudig molair overschot van N,N'-dimethyl-N-(jodoacetyl)-N'-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)ethyleendiamine (IANBD-amide).
      1. Los 1 mg IANBD op in watervrij dimethylformamide (DMF), rekening houdend met het feit dat het uiteindelijke volume DMF dat wordt gebruikt voor het etiketteren van het C2Lact-construct niet meer dan 5% (v/v) van het eiwitmonstervolume mag bedragen.
      2. Om het volume DMF (VDMF)te bepalen om IANBD op te lossen, berekent u eerst de vereiste hoeveelheid IANBD (m, uitgedrukt in mg) om het eiwit te labelen met behulp van formule 1.
        m = 10.000 × C × V × MWIANBD (1)
        waarbij C de concentratie van C2Lact is, gemeten in stap 1.3.2, V het volume van het C2Lact-monster en MWIANBD het molecuulgewicht van de fluorofoor (420 g/mol).
      3. Bereken VDMF met behulp van formule 2 (met m0=1) en 3.
        VDMF= (m0/m) × VIANBD (2)
        VIANBD=0.05 × V (3)
        Waarbij m0 de hoeveelheid IANBD-poeder in mg is en VIANBD het volume IANBD-oplossing dat aan het C2Lact-monster moet worden toegevoegd.
      4. Voeg volume VIANBD van de vers bereide IANBD-oplossing toe aan het C2Lact-monster en schud het reactiemengsel gedurende 30 minuten bij 25 °C bij 800-900 tpm met behulp van een tegen licht beschermde thermomixer. Laat de reactie 90 minuten doorgaan op ijs. Reinig ondertussen een centrifugaalfiltereenheid (MWCO= 3 kDa) met 10 ml TN-buffer.
    4. Voeg L-cysteïne (in 10-voudige molaire overmaat aan IANBD) toe aan het reactiemengsel om vrije IANBD te inactiveren.
    5. Voeg 15 ml TN-buffer toe aan de NBD-C2Lact-oplossing en breng de NBD-C2Lact-oplossing over naar de centrifugaalfiltereenheid. Concentreer het monster tot 2 ml om het grootste deel van het vrije NBD van het eiwit te scheiden door centrifugeren bij 2300 × g. Herhaal deze wasstap twee keer. Centrifugeer het monster gedurende 10 minuten in een centrifugebuis met klikdop van 2 ml bij 19.000 × g bij 4 °C om potentiële aggregaten te pelleteren en verzamel het supernatant.
    6. Verdun 50 μL eluaat in een eindvolume van 300 μL TN-buffer. Registreer het absorptiespectrum van 230 tot 650 nm met behulp van het eluaat dat tijdens de concentratieprocedure is verzameld als een blanco. Bepaal de NBD-C2Lactconcentratie met behulp van de maximale absorptie bij λ=280 en 495 nm en extinctiecoëfficiënten ε= 44.920 M-1.cm-1 (eiwit) en 25.000 M-1.cm-1 (NBD-fluorofoor).
      OPMERKING: Als de twee concentratiewaarden gelijk zijn, geeft dit aan dat de C2Lact-constructie is gelabeld op een verhouding van 1:1 met de NBD-groep.
    7. Als de NBD-C2Lactconcentratie die wordt geschat op basis van de meting van nbd-absorptie hoger is dan de concentratie die wordt geschat op basis van de absorptie van tryptofaanresiduen (Trp), herhaalt u stap 1.3.5 om vrije NBD verder te verwijderen.
    8. Voeg glycerol toe aan het monster om een eindconcentratie van 10% (v/v) te verkrijgen om de NBD-C2Lact-constructie tijdens het invriezen cryo te beschermen. Meet de uiteindelijke eiwitconcentratie.
    9. Bereid 50 μL eiwit in 0,5 ml snap-cap microcentrifugebuizen. Vries de buisjes in vloeibare stikstof in en bewaar ze bij -80 °C.

2. Zuivering van NBD-PHFAPP

OPMERKING: De procedure voor het produceren en etiketteren van PHFAPP is identiek aan die van NBD-C2Lact totdat nbd-c2lactoplossing in stap 1.3.4 wordt overgeplaatst naar een centrifugaalfiltereenheid. Volg vanaf deze stap het protocol dat hieronder wordt beschreven.

  1. Houd na de concentratiestap 2 ml NBD-PHFAPP bij 4 °C in het donker gedurende niet meer dan 1 dag voordat de maatuitsluitingschromatografie wordt uitgevoerd. Controleer voorafgaand aan de grootte-uitsluitingschromatografie of er geen oranje afzetting (aggregatie tijdens concentratie) is aan de onderkant van de buis. Als dit het geval is, centrifugeer het monster bij 540.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C en zuiver het supernatant door middel van maatuitsluitingschromatografie.
    OPMERKING: Maatuitsluitingschromatografie wordt uitgevoerd op een kolom vol met verknoopt dextran-acrylamidecopolymeer (zie de tabel met materialen),voorheen in evenwicht gebracht met TND-buffer, met behulp van een snel eiwitvloeistofchromatografiesysteem (zie de tabel met materialen). De kolom moet worden beschermd tegen licht. Er werd een debiet van 1 ml/min gebruikt en de elutie van de NBD-PHFAPP-constructie werd gevolgd door het registreren van de absorptie bij λ=280 (eiwit) en 480 nm (NBD) bij de kolomuitgang.
    1. Injecteer het NBD-PHFAPP-monster geladen in een injectielus van 2 ml op de kolom en verzamel onmiddellijk 2,5 ml fracties eluaat.
  2. Analyseer alle fracties die overeenkomen met de hoofdpiek gedetecteerd bij 280 en 480 nm op een 15% SDS-PAGE gel. Meng een monster van 25 μL van elke fractie met 15 μL Laemmli-monsterbuffer voordat u het verwarmt en op de gel laadt.
    OPMERKING: Een hoofdpiek, die tegelijkertijd wordt gedetecteerd bij λ = 280 en 480 nm, verschijnt zodra een volume van ~ 150 ml buffer door de kolom wordt gevoerd.
  3. Pool de fracties die uitsluitend NBD-PHFAPP-eiwit bevatten (~12,2 kDa) en voeg glycerol toe in een eindconcentratie van 10% (v/v). Concentreer het monster met behulp van een centrifugaalfiltereenheid met een MWCO van 3 kDa tot een eindvolume van 1 ml met een centrifugatiesnelheid van 2300 × g.
  4. Bereid aliquots voor en noteer een absorptiespectrum zoals beschreven voor NBD-C2Lact. Gebruik een extinctiecoëfficiënt ε= 29.450 M-1.cm-1 om de concentratie van het eiwit te bepalen op basis van de absorptie gemeten bij λ=280 nm.

3. Bereiding van liposomen voor PS- en PI(4)P-extractie- of transfertests

OPMERKING: Voer alle stappen uit bij kamertemperatuur, tenzij anders aangegeven. Ga voorzichtig om met organische oplosmiddelen, rotavapor en vloeibare stikstof.

  1. Bereid vers, gefilterd en ontgast 50 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonzuur (HEPES)-kaliumhydroxide (KOH), pH 7,4, 120 mM kaliumacetaat (HK) buffer.
  2. Neem voor elk type liposoom precieze hoeveelheden verschillende lipiden uit stamoplossingen en meng ze in een peervormige glazen kolf van 25 ml(tabel 1). Voeg zuivere chloroform toe om het volume van elk mengsel aan te passen tot 1 ml. Label elke kolf met de naam liposoom. Wikkel de kolven met lipidenmengsel gedopeerd met Rhod-PE met aluminiumfolie.
  3. Plaats de kolf op een roterende verdamper. Droog de lipiden onder vacuüm en bij 25 °C gedurende ten minste 30 minuten bij een rotatiesnelheid van 500 tpm. Voor lipidenfilms die PI(4)P bevatten, verwarmt u de kolf gedurende 5 minuten bij 32-34 °C, onder zachte rotatie, om PI(4)P goed te mengen met de andere lipiden voordat u vacuüm creëert in de kolf om het oplosmiddel te verwijderen, waardoor een film van droge lipiden op de kolfwand achterblijft.
  4. Koppel de kolf los van de verdamper en plaats deze gedurende 45 minuten in een vacuümkamer om eventuele resterende sporen van oplosmiddel te verwijderen. Vul de kolf met 2 ml HK-buffer en voeg enkele glasparels met een diameter van 4 mm toe aan de oplossing. Vortex de kolf voorzichtig gedurende 2 minuten om de lipiden te resuspenderen en bereid multilamellaire lipidenblaasjes (MLV's) met een lipidenconcentratie van 4 mM. Bereid 0,5 mlv's voor in microcentrifugebuizen met schroefdop van 1,5 ml.
  5. Vries-ontdooi de buisjes 5x (met respectievelijk vloeibare stikstof en een waterbad bij 37 °C). Extrudeer de liposomen of bewaar ze bij -20 °C.
  6. Gebruik een mini-extruder om de liposomen(d.w.z. grote unilamellaire blaasjes) van de MLV's te bereiden volgens de richtlijnen van de fabrikant. Gebruik een polycarbonaatfilter met uniforme cilindrische poriën met een diameter van 200 nm.
  7. Om elk type liposoom te bereiden, extrudeert u ten minste 250 μL van de overeenkomstige suspensie van MLV's. Bewaar de geëxtrudeerde liposomen bij 4 °C en in het donker als ze Rhod-PE bevatten. Gebruik de liposomen binnen 2 dagen.
Lipide samenstelling (mol/mol) Lipide
Liposoom naam Dopc
(25 mg/ml)		 OPA
(10 mg/ml)		 16:0 Liss Rhod-PE
(1 mg/ml)		 C16:0/C16:0-PI(4)P
(1 mg/ml)
Extractie assays Liposoom 2 mol% PS PC /PS 98/2 247 μL 12,5 μL
Liposoom 2 mol% PI(4)P PC / PI (4) P 98/2 247 μL 153 μL
PC liposoom Pc 100 252 μl
Transport assays LA  PC / PS / Rhod-PE 93/5/2 234 μL 31,4 μL 200 μL
LA zonder PS PC /Rhod-PE 98/2 247 μL 200 μL
LB  PC / PI (4) P 95/5 237 μL 383 μL
LB zonder PI(4)P Pc 100 252 μl
LA-Eq PC / PS / PI (4) P / Rhod-PE 93/2.5/2.5/2 234 μL 15,7 μL 200 μL 191 μL
LB-Eq PC / PS / PI (4) P 95/2.5/2.5 239 μL 15,7 μL 191 μL

Tabel 1: Volumes lipidenvoorraadoplossingen die moeten worden gemengd voor liposoompreparaat. Afkortingen: PS= fosfatidylserine; PC = fosfatidylcholine; PI(4)P = fosfatidylinositol 4-fosfaat; Rhod-PE = rhodamine-gelabelde fosfatidylethanolamine; DOPC = dioleoylfosfatidylcholine; POPS= 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfo-L-serine; 16:0 Liss Rhod-PE = 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl).

4. Meting van PS- of PI(4)P-extractie

OPMERKING: Metingen moeten worden uitgevoerd met behulp van een zwarte 96-well plaat en een fluorescentieplaatlezer uitgerust met monochromatoren: één voor fluorescentie-excitatie en één voor emissie, met een variabele bandbreedte.

  1. Bereid verse, gefilterde en ontgaste HK-buffer aangevuld met 1 mM MgCl2 (HKM-buffer). Bereid zuivere PC liposomen en PC liposomen gedopeerd met 2 mol% PS of 2 mol% PI(4)P (4 mM uiteindelijke lipideconcentratie, zie tabel 1).
    OPMERKING: Houd de buizen gevuld met de suspensie van geëxtrudeerde liposomen bij kamertemperatuur gedurende het hele experiment en houd de eiwitten op ijs. Bescherm bovendien de lipidesensoren tegen licht.
  2. Meng voor de PS-extractietest in één put liposomen met 2 mol% PS (80 μM uiteindelijke lipideconcentratie, 0,8 μM toegankelijke PS-concentratie) met NBD-C2Lact (250 nM eindconcentratie) in een eindvolume van 100 μL. Vul een tweede put met dezelfde hoeveelheid liposoom (80 μM, 2 mol% PS) en NBD-C2Lact (250 nM) gemengd met 3 μM LTP (Osh6p als positieve controle of een eiwit van belang).
    OPMERKING: Een incubatietijd van 5 minuten is voldoende voor Osh6p om lipide-extractie te bereiken.
  3. Vul een derde putje met NBD-C2Lact (250 nM) gemengd met pure PC liposomen (80 μM). Vul een vierde putje alleen met zuivere PC-liposomen (80 μM). Herhaal stap 4.2-4.3 om drie extra series van vier putten voor te bereiden.
  4. Neem voor elke put een NBD-spectrum op van 505 tot 650 nm (bandbreedte 5 nm) bij excitatie bij 490 nm (bandbreedte 5 nm) bij 25 °C. Trek voor elke reeks het spectrum dat met alleen liposomen is geregistreerd af van de andere spectra.
    OPMERKING: F en Fmax komen overeen met de intensiteit bij 536 nm gemeten met PS-bevattende liposomen in respectievelijk de aan- of afwezigheid van LTP, terwijl F0 de intensiteit is op dezelfde golflengte met zuivere PC-liposomen. Voor elke reeks wordt het percentage toegankelijke PS dat door het eiwit wordt geëxtraheerd, gegeven met behulp van de volgende formule.
    100 × (1-((F-F0)/(Fmax-F0)))(4)
  5. Bereid voor de PI(4)P extractietest liposomen gedopeerd met 2 mol% PI(4)P en voer metingen uit met de NBD-PH FAPP-sonde. Voer controle-experimenten uit en bepaal het extractiepercentage op dezelfde manier als hierboven beschreven.
    OPMERKING: De liposoom- en eiwitconcentratie zijn identiek aan die welke worden gebruikt in de PS-extractietest.

5. Real-time meting van PS-transport

OPMERKING: Een standaard fluorimeter (90° formaat) uitgerust met een temperatuur gecontroleerde celhouder en een magnetische roerder wordt gebruikt om lipide overdracht kinetiek te registreren. Om nauwkeurig gegevens te verkrijgen, is het belangrijk om het monster permanent op dezelfde temperatuur te houden (ingesteld tussen 25 en 37 °C, afhankelijk van de oorsprong van het eiwit(bijv.Gist of mens)) en het constant te roeren. Het hieronder beschreven protocol is voor de meting van lipidentransport in een monster van 600 μL in een cilindrische kwartscel.

  1. Bereid vers ontgaste en gefilterde HKM-buffer. Bewaar de buisjes met geëxtrudeerde liposomen bij kamertemperatuur. Wikkel tubes met liposomen met Rhod-PE in aluminiumfolie en/of bewaar ze in een ondoorzichtige doos om fotobleken te voorkomen.
  2. Pas de excitatie- en emissiemonochromatoren aan bij respectievelijk λ = 460 nm (met een korte bandbreedte (1-3 nm)) en bij λ = 530 nm (met een grote bandbreedte (≥ 10 nm)). Stel de acquisitietijd in op 25 minuten met een tijdresolutie ≤ 1 s.
  3. Verdun in het kwartscuvet 30 μL van de LA liposoomsuspensie en een volume NBD-C2Lact stockoplossing in voorgewarmde HKM-buffer om een monster van 570 μL te bereiden dat 200 μM totale lipiden en 250 nM NBD-C2Lactbevat . Voeg een kleine magnetische roerstaaf toe en plaats de cuvette in de fluorometerhouder.
  4. Zodra het monster thermisch in evenwicht is (na 3-5 minuten), activeert u de meting. Voeg na 1 minuut 30 μL LB liposoomsuspensie (eindconcentratie van 200 μM totaal lipiden) toe aan het monster. Injecteer na 3 minuten LTP in het monster zodat de uiteindelijke concentratie van de LTP 200 nM is en verkrijg het signaal voor de resterende 21 minuten.
  5. Voer een parallel experiment uit om het NBD-signaal te normaliseren. Meng 30 μL LA-Eq liposoomsuspensie met 250 nM NBD-C2Lact in HKM-buffer (eindvolume van 570 μL). Injecteer na 1 minuut 30 μL LB-Eq liposoomsuspensie.
    OPMERKING: De lipidesamenstelling van LA-Eq en LB-Eq liposomen is vergelijkbaar met die van LA- en L B-liposomen die worden gebruikt in de transfertest, behalve dat elk van hen 2,5 mol% PS en 2,5 mol% PI(4)P bevat. Als gevolg hiervan komt het NBD-signaal dat wordt gemeten, aangeduid als FEq, overeen met het signaal dat moet worden gemeten als PS volledig in evenwicht was tussen LA- en L B-liposomen door een overdrachtsproces.
  6. Converteer de kinetische curven gemeten met een LTP van belang om de hoeveelheid PS (in μM) te bepalen die in de loop van de tijd van LA naar LB liposomen wordt overgedragen. Normaliseer elk gegevenspunt (F) van de curve met behulp van de volgende formule.
    FNorm = (F-F0)/(FEq-F0) (5)
    waarin F0 overeenkomt met het NBD-signaal vlak voor de toevoeging van een LTP, en FEq het signaal is dat in stap 5.5 wordt gemeten.
    OPMERKING: De hoeveelheid PS (in μM) overgedragen van LA naar LB liposomen komt overeen met 2,5 × FNorm, aangezien het evenwicht overeenkomt met een situatie waarin de helft van de toegankelijke PS-moleculen, opgenomen in de buitenste folder van de LA liposomen,(d.w.z., overeenkomend met 5 mol% van 0,5 × 200 μM totale lipiden) is overgebracht in LB liposomen.

6. Real-time meting van PI(4)P transport

  1. Stel de fluorimeter (excitatie- en emissiegolflengte, bandbreedte, acquisitietijd, tijdresolutie) in zoals gedaan voor de PS-overdrachtstest. Gebruik ook dezelfde buffer, cuvette en liposomen om de experimenten uit te voeren onder constant roeren bij dezelfde temperatuur.
  2. Meng in de cuvette 30 μL LB liposoomsuspensie en NBD-PHFAPP met voorverwarmde HKM-buffer om een eindvolume van 570 μL te verkrijgen (200 μM totale lipiden, 250 nM NBD- PHFAPP). Zodra de thermische evenwichtslibratie van het monster is bereikt, start u de meting en injecteert u na 1 minuut 30 μL LA liposoomsuspensie. Injecteer na 3 minuten de LTP van belang (eindconcentratie van 200 nM) en neem het signaal op.
  3. Voer een tweede experiment uit om het NBD-signaal te normaliseren. Meng 30 μL LB-Eq liposoom suspensie met 250 nM NBD-PHFAPP in 570 μL HKM buffer. Injecteer na 1 minuut 30 μL LA-Eq liposoomsuspensie.
    OPMERKING: Hier komt het NBD-signaal, aangeduid als FEq, overeen met het signaal dat moet worden gemeten als PI(4)P volledig in evenwicht was tussen LA- en L B-liposomen.
  4. Converteer de kinetische curven om de hoeveelheid PI(4)P (in μM) te bepalen die in de loop van de tijd van LB naar LA liposomen wordt overgebracht. Elk datapunt (F) wordt genormaliseerd met behulp van formule 5 waarin F0 overeenkomt met het NBD-signaal voorafgaand aan de toevoeging van een LTP, en FEq is het signaal gemeten in stap 6.3.
    OPMERKING: De hoeveelheid PI(4)P (in μM) overgedragen van LB naar LA liposomen komt overeen met 2,5 × FNorm, aangezien het evenwicht overeenkomt met een situatie waarin de helft van de PI(4)P in de buitenste folder van de LB liposomen(d.w.z. 0,5 × 5 μM) is overgedragen in LA liposomen.

7. Analyse van kinetische curven

  1. Kwantificeer de mate waarin een LTP efficiënt is door de snelheid te bepalen waarmee deze LTP lipiden van de ene liposoompopulatie naar de andere overbrengt in de eerste paar seconden na de injectie naar de cuvette.
    1. Voer een lineaire regressie uit van de eerste gegevenspunten van de overdrachtskinetiek om een helling te verkrijgen. Deel de hellingswaarde door de LTP-concentratie in het reactiemengsel om het aantal lipidemoleculen te bepalen dat per eiwit per tijdseenheid (min of s) wordt overgedragen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figure 1
Figuur 1: Beschrijving van de fluorescerende lipidesensoren en in vitro assays. (A) Driedimensionale modellen van NBD-C2Lact en NBD-PHFAPP op basis van de kristalstructuur van het C2-domein van runderlactadherine (PDB ID: 3BN648) en de NMR-structuur van het PH-domein van het menselijke FAPP1-eiwit (PDB ID: 2KCJ46). Een N,N'-dimethyl-N-(thioacetyl)-N'-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)ethyleendiaminegroep, handmatig en energetisch geminimaliseerd, werd geënt op de thiolfunctie van C352 (NBD-C2Lact) en C13 (NBD-PHFAPP) residuen (weergegeven als bollen, met koolstof in groen, stikstof in blauw, zuurstof in rood, zwavel in geel en waterstof in wit). Het oppervlak van de lipide-bindende plaats van elke sonde was blauw gekleurd. B)Extractietests. In de PS extractietest werden PC/PS liposomen (98/2 mol/mol) geïncubeerd met 250 nM NBD-C2Lact. Bij afwezigheid van extractie is de sonde sterk gebonden aan de liposomen, wat resulteert in een blauwe verschuiving van NBD-fluorescentie en een toename van de emissie-intensiteit. Als PS-extractie plaatsvond in de aanwezigheid van een LTP(bijv. Osh6p), dissocieerde de sonde van de liposomen en was de fluorescentie lager. In de PI(4)P extractietest werden liposomen gedopeerd met 2 mol% PI(4)P en werd 250 nM NBD-PHFAPP gebruikt. (C) Op FRET gebaseerde lipidentransporttests. In de PS-transporttest werden PC/PS/Rhod-PE liposomen (93/5/2 mol/mol, LA) geïncubeerd met 250 nM NBD-C2Lact. PC-liposomen (LB), al dan niet gedopeerd met 5 mol% PI(4)P, en Osh6p werden achtereenvolgens toegevoegd bij respectievelijk t = 1 min en t = 4 min. Als PS-transport optreedt, lokt dit een dequenching uit van het NBD-signaal dat overeenkomt met de translocatie van NBD-C2Lact van LA naar LB liposomen. In de PI(4)P transport assay werden LB liposomen gedopeerd met 5 mol% PI(4)P geïncubeerd met 250 nM NBD-PHFAPP. PC liposomen (LA) al dan niet gedopeerd met 5 mol% PS werden toegevoegd. Als PI(4)P transport optreedt, veroorzaakt dit een doven van het NBD signaal door de translocatie van NBD-PHFAPP van LB naar LA liposomen. Afkortingen: NBD = 7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol fluorofoor; NMR = kernspinresonantie; FAPP1 = vierfosfaat-adaptor eiwit 1; VOB = Eiwitdatabank; PS= fosfatidylserine; PC = fosfatidylcholine; LTP = lipide transfer eiwit; Osh6p = oxysterolbindend eiwit (OSBP) homoloog 6 eiwit; PI(4)P = fosfatidylinositol 4-fosfaat; FRET = fluorescentie resonantie energieoverdracht; Rhod-PE = rhodamine-gelabelde fosfatidylethanolamine; LA liposomen = liposomen samengesteld uit PC, gedopeerd met 2 mol% Rhod-PE, en met al dan niet 5 mol% PS; LB liposomen = liposomen met 5 mol% PI(4)P. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2A toont een SDS-PAGE analyse van de producten van verschillende stappen die leiden tot de zuivering van C2Lact. Baan 1 toont het eiwitprofiel van de gelyseerde bacteriën die GST-C2Lact tot expressie brengen (~ 44,8 kDa), terwijl rijstroken 2 en 3 respectievelijk de eiwitprofielen van het supernatant en bacterieel puin na ultracentrifugatie tonen. De vergelijking van deze rijstroken laat zien dat GST-C2Lact is teruggevonden in het supernatant en dus kan worden geïsoleerd met behulp van glutathion-gekoppelde agarose kralen. Lanes 4 en 5 tonen de eiwitprofielen van het supernatant na incubatie met kralen en wassingen die door zwaartekrachtstroom zijn teruggewonnen, terwijl baan 6 het profiel van eiwitten toont die op de kralen zijn vastgehouden. Een analyse van deze rijstroken geeft aan dat bijna alle GST-C2Lact uit de kralen is teruggevonden.

Lanes 8-12 tonen de aanwezigheid van een grote band die overeenkomt met C2Lact (~ 17,9 kDa) in de supernatanten die worden hersteld door opeenvolgende wasbeurten van de kralen na trombinebehandeling. Baan 13 geeft aan dat niet-gesplitste GST-C2Lact, samen met GST (~ 26,9 kDa), na deze behandeling gebonden bleef aan kralen. De vergelijking van deze rijstroken geeft aan dat de splitsingsprocedure, hoewel niet 100% efficiënt, wel C2Lact opleverde die vervolgens fluorescerend werd gelabeld. Figuur 2B toont een ultraviolet (UV)-zichtbaar absorptiespectrum van C2Lact gelabeld met NBD. Omdat het construct 100% zuiver is, bevestigen deze resultaten dat alle C2Lact-moleculen werden gelabeld met een NBD-groep op basis van de optische dichtheid gemeten bij 280 nm (Trp) en 495 nm (NBD). De zuiverheid van NBD-C2Lact en de fluorescentie ervan werden bepaald door SDS-PAGE analyse(Figuur 2C).

Figure 2
Figuur 2: NBD-C2Lact zuivering. (A) SDS-PAGE analyse werd gebruikt om de aanwezigheid van het eiwit te controleren in verschillende stappen van de zuiveringsprocedure voordat het werd gelabeld. De pijlpunten geven de positie aan van het C2Lact-domein (rode pijlpunt), van de GST alleen (grijze pijlpunt) en van de GST-C2Lact-constructie (zwarte pijlpunt). (B) UV-zichtbaar absorptiespectrum van NBD-C2Lact. (C) SDS-PAGE analyse van het gezuiverde NBD-C2Lact. Het eerste beeld werd verkregen onder UV-verlichting zonder kleuring en onthult de aanwezigheid van de NBD-C2Lact-constructie omdat deze fluorescentie uitzendt. De tweede afbeelding toont dezelfde gel na een eiwitkleuringsprocedure (zie de tabel met materialen). Afkortingen: NBD = 7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol fluorofoor; NBD-C2Lact = N,N'-dimethyl-N-(thioacetyl)-N'-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)ethyleendiaminegroep gekoppeld aan de thiolfunctie van C352-residu van een opnieuw ontworpen versie van het C2-domein van runderlactadherine (VOB-ID: 3BN648); VOB = Eiwitdatabank; SDS-PAGE = natriumdodecylssulfaat polyacrylamide gel elektroforese; GST = glutathion S-transferase; MW = marker voor de grootte van het molecuulgewicht; UV = ultraviolet. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3 toont de resultaten van PS- en PI(4)P-extractietests met Osh6p. Wanneer alleen geïncubeerd met liposomen die 2 mol% PS bevatten, was de fluorescentie van NBD-C2Lact maximaal omdat de NBD-fluorofoor in het membraan werd ingebracht(d.w.z. een hydrofobe context), wat aangeeft dat de sensor membraangebonden was. In aanwezigheid van Osh6p was de fluorescentie lager en vergelijkbaar met die gemeten met pure PC-liposomen (figuur 3A). De normalisatie van intensiteitswaarden bij 536 nm gaf aan dat ~75% van de toegankelijke PS werd geëxtraheerd. In de tweede test werd NBD-PHFAPP gemengd met liposomen die 2 mol% PI(4)P bevatten. Het NBD-signaal was hoog zonder Osh6p, maar laag wanneer Osh6p aanwezig was en was vergelijkbaar met dat gemeten met PI(4)P-vrije liposomen(figuur 3B). Een analyse van de intensiteit toonde aan dat ~100% van de toegankelijke PI(4)P werd geëxtraheerd door de LTP.

Figure 3
Figuur 3: Extractietests. (A) Fluorescentiespectra van NBD-C2Lact (250 nM) gemeten bij excitatie bij 460 nm in aanwezigheid van liposomen (80 μM, 2 mol% PS) bij afwezigheid of aanwezigheid van 3 μM Osh6p. Referentiespectra werden geregistreerd met zuivere PC-liposomen al dan niet geïncubeerd met NBD-C2Lact (linkerpaneel). Verschillende spectra werden geregistreerd uit verschillende reeksen putten, gecorrigeerd door het achtergrondverstrooiingssignaal van DOPC-liposomen alleen af te trekken en gemiddeld (n = 4, ± SEM). Het percentage toegankelijke PS dat is geëxtraheerd, wordt aangegeven (rechterpaneel). (B) Fluorescentiespectra van NBD-PHFAPP (250 nM) gemengd met liposomen (80 μM, 2 mol% PI(4)P) bij afwezigheid of aanwezigheid van 3 μM Osh6p. Referentiespectra geregistreerd met PC liposomen in de aan- en afwezigheid van de sensor worden getoond (linkerpaneel). Verschillende spectra werden geregistreerd uit verschillende reeksen putten, gecorrigeerd door het achtergrondverstrooiingssignaal van DOPC-liposomen alleen af te trekken en gemiddeld (n = 4, ± SEM). Het percentage toegankelijke PI(4)P dat is geëxtraheerd, wordt aangegeven (rechterpaneel). Afkortingen: NBD = 7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol fluorofoor; NBD-C2Lact = N,N'-dimethyl-N-(thioacetyl)-N'-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)ethyleendiaminegroep gekoppeld aan de thiolfunctie van C352-residu van een opnieuw ontworpen versie van het C2-domein van runderlactadherine (VOB-ID: 3BN648); VOB = Eiwitdatabank; PS= fosfatidylserine; PC = fosfatidylcholine; DOPC = dioleoylfosfatidylcholine; Osh6p = oxysterolbindend eiwit (OSBP) homoloog 6 eiwit; PI(4)P = fosfatidylinositol 4-fosfaat; SEM = standaardfout van het gemiddelde; a.u. = willekeurige eenheden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4A toont typische resultaten van een PS-overdrachtstest met Osh6p als LTP. Op tijdstip nul werd NBD-C2Lact gemengd met LA liposomen met 5 mol% 16:0/18:1-PS (POPS) en 2 mol% Rhod-PE in een volume van 570 μL HKM-buffer bij 30 °C. Omdat de sonde gebonden was aan LA liposomen, werd het signaal geblust als gevolg van FRET met Rhod-PE aanwezig in deze liposomen. Na één minuut werden Rhod-PE-vrije LB liposomen (30 μL) toegevoegd; verwacht werd dat dit slechts een lichte verandering in het signaal zou veroorzaken als gevolg van lichtdiffusie door deze tweede liposoompopulatie en/of een verdunningseffect. De signaalintensiteit na de toevoeging van de LB liposomen komt overeen met F0. De injectie van enkele μL van een voorraadoplossing van Osh6p (meestal 40 μM) om 200 nM van het eiwit in het reactiemengsel te verdunnen, lokte een langzame toename van het NBD-signaal uit als gevolg van het dequenching van de fluorofoor als PS werd getransporteerd van LA naar LB liposomen, waardoor de translocatie van NBD-C2Lactwerd bevorderd .

Toen LB liposomen 5 mol% PI(4)P bevatten, was de dequenching veel sneller, omdat PS sneller werd overgedragen door Osh6p naar LB liposomen als gevolg van de tegenuitwisseling van PS met PI(4)P door de LTP (tweede curve). De derde curve komt overeen met een experiment waarbij NBD-C2Lact werd gemengd met gelijke hoeveelheden LA-Eq en LB-Eq liposomen. Het signaal was hoger dan F0 en kwam overeen met een situatie waarin de sonde gelijkmatig gebonden was aan LA- en L B-liposomen, wat een situatie weerspiegelde waarin PS volledig in evenwicht was tussen de twee populaties van liposomen. FEq werd berekend door het gemiddelde te nemen van de waarde van het signaal gemeten in de laatste 5 minuten van het experiment.

Figure 4
Figuur 4: Typische PS-transportkinetiek gemeten met Osh6p en referentiecurve. (A) L B-liposomen zonder PI(4)P (200 μM totale lipiden) en Osh6p (200 nM) werden achtereenvolgens toegevoegd aan een cuvette met NBD-C2Lact (250 nM) en L A-liposomen (200 μM) gedopeerd met 5 mol% PS en 2 mol% Rhod-PE (linkercurve). Hetzelfde experiment werd uitgevoerd met LB liposomen gedopeerd met 5 mol% PI(4)P (middelste curve). Om FEqte bepalen, werd NBD-C2Lact (250 nM) voorgemengd met LA-Eq liposomen; vervolgens werden LB-Eq liposomen toegevoegd (rechter curve). (B) Gemiddelde PS-transportcurven bepaald na de normalisatie van verschillende metingen met L B-liposomen met of zonder PI(4)P (gemiddelde ± SEM, n=3). (C) Initiële PS-overdrachtssnelheden (gemiddelde ± SEM, n=3). Afkortingen: NBD = 7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol fluorofoor; NBD-C2Lact = N,N'-dimethyl-N-(thioacetyl)-N'-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)ethyleendiaminegroep gekoppeld aan de thiolfunctie van C352-residu van een opnieuw ontworpen versie van het C2-domein van runderlactadherine (VOB-ID: 3BN648); VOB = Eiwitdatabank; PS= fosfatidylserine; Osh6p = oxysterolbindend eiwit (OSBP) homoloog 6 eiwit; PI(4)P = fosfatidylinositol 4-fosfaat; Rhod-PE = rhodamine-gelabelde fosfatidylethanolamine; LA liposomen = liposomen samengesteld uit fosfatidylcholine, gedopeerd met 2 mol% Rhod-PE, en met al dan niet 5 mol% PS; LB liposomen = liposomen met 5 mol% PI(4)P; F = fluorescentie; F0 = fluorescentie overeenkomend met NBD vóór toevoeging van Osh6p; FEq = fluorescentiesignaal als PS volledig in evenwicht is tussen LA- en L B-liposomen door een overdrachtsproces; SEM = standaardfout van het gemiddelde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4B toont de gemiddelde kinetische curven van PS-overdracht van L A-liposomen naar LB-liposomen, al dan niet gedopeerd met PI(4)P na de normalisatie van F-gegevens met F0 en FEq als referentiewaarden. De initiële transportsnelheid voor elk experiment werd berekend door de initiële gegevenspunten gemeten na de injectie van het eiwit met een lineaire functie aan te passen. Figuur 4C toont de gemiddelde initiële PS-transportsnelheid bepaald uit drie verschillende experimenten met L B-liposomen met of zonder PI(4)P. Wanneer LB liposomen 0 en 5 mol% PI(4)P bevatten, waren de snelheden respectievelijk gelijk aan 1,4 en 15,8 PS.min-1 per Osh6p molecuul. Figuur 5A toont typische resultaten van een PI(4)P-overdrachtstest met Osh6p als LTP, die werd uitgevoerd met dezelfde materialen en omstandigheden als die welke werden gebruikt voor de PS-transporttest.

Figure 5
Figuur 5: Typische PI(4)P transportkinetiek gemeten met Osh6p en referentiecurve. (A) PS-vrije liposomen met 2 mol% Rhod-PE (LA, 200 μM totale lipiden) en Osh6p (200 nM) werden achtereenvolgens toegevoegd aan een cuvette met NBD-PHFAPP (250 nM) en LB liposomen (200 μM) gedopeerd met 5 mol% PI(4)P (linker curve). Hetzelfde experiment werd uitgevoerd met LA liposomen gedopeerd met 5 mol% PS (middelste curve). Om FEqte bepalen, werd NBD-PHFAPP (250 nM) voorgemengd met LB-Eq liposomen; vervolgens werden LA-Eq liposomen toegevoegd (rechter curve). (B) PI(4)P transferkinetiek bepaald na normalisatie van verschillende metingen van LA liposomen met of zonder PS (gemiddelde ± SEM, n=3). (C) Initiële PI(4)P-overdrachtssnelheden (gemiddelde ± SEM, n=3). Afkortingen: NBD = 7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol fluorofoor; NBD-PHFAPP = NBD-gelabeld Pleckstrin homologie domein van het menselijke vier-fosfaat-adaptor eiwit 1 (FAPP1, UniProt: Q9HB20, segment [1-100]); PS= fosfatidylserine; Osh6p = oxysterolbindend eiwit (OSBP) homoloog 6 eiwit; PI(4)P = fosfatidylinositol 4-fosfaat; Rhod-PE = rhodamine-gelabelde fosfatidylethanolamine; LA liposomen = liposomen samengesteld uit fosfatidylcholine, gedopeerd met 2 mol% Rhod-PE, en met al dan niet 5 mol% PS; LB liposomen = liposomen met 5 mol% PI(4)P; F = fluorescentie; F0 = fluorescentie overeenkomend met NBD vóór toevoeging van Osh6p; FEq = fluorescentiesignaal als PI(4)P volledig in evenwicht is tussen LA- en L B-liposomen door middel van een overdrachtsproces; SEM = standaardfout van het gemiddelde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Op tijdstip nul werd NBD-PHFAPP gemengd met L B-liposomen met 5 mol% PI(4)P in een volume van 570 μL HKM-buffer. Omdat NBD-PHFAPP gebonden was aan LB liposomen, was het signaal hoog. Na één minuut werden L A-liposomen (30 μL) toegevoegd, waarvan werd verwacht dat ze slechts een kleine verandering in het signaal zouden uitlokken. De intensiteit kwam toen overeen met F0. Het injecteren van Osh6p (200 nM eindconcentratie) in de reactiemix veroorzaakte een doving van het NBD-signaal als gevolg van de translocatie van NBD-PHFAPP-moleculen naar LA-liposomen, aangezien PI(4)P werd overgedragen van LB-liposomen naar L A-liposomen. Wanneer LA liposomen 5 mol% POPS bevatten, was de dequenching veel sneller als gevolg van een snellere PI(4)P overdracht als gevolg van PS/PI(4)P uitwisseling. De derde curve komt overeen met een experiment waarbij NBD-PHFAPP werd gemengd met gelijke hoeveelheden LA-Eq en LB-Eq liposomen.

Het signaal was lager dan F0 omdat het overeenkwam met een situatie waarin de sonde uniform gebonden was aan LA- en L B-liposomen, wat duidt op een volledige evenwichtslibratie van PI(4)P tussen de liposomen. FEq werd berekend door het gemiddelde te nemen van de waarde van het signaal gemeten in de laatste 5 minuten van het experiment. Figuur 5B(C) toont de gemiddelde kinetische curven verkregen na signaalnormalisatie en de gemiddelde PI(4)P initiële overdrachtssnelheden gemeten met LA liposomen die al dan niet gedopeerd waren met 5 mol% PS. Hier is het vermeldenswaard dat beide lipideliganden sneller en met vergelijkbare snelheden werden getransporteerd toen elk lipide aanvankelijk aanwezig was in respectievelijk LA- en L B-membranen, wat aangeeft dat Osh6p een PS / PI (4) P-wisselaar is.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De uitkomsten van deze testen zijn direct afhankelijk van de signalen van de fluorescerende lipidesensoren. De zuivering van deze sondes met een verhouding van 1:1 met NBD en zonder vrije NBD-fluorofoorverontreiniging is dus een cruciale stap in dit protocol. Het is ook verplicht om te controleren of de onderzochte LTP goed is gevouwen en niet geaggregeerd. De hoeveelheid LTP die in de extractietests wordt getest, moet gelijk zijn aan of hoger zijn dan die van toegankelijke PS- of PI(4)P-moleculen om goed te kunnen meten of deze LTP deze lipiden efficiënt extraheert. Nbd-C2Lact en NBD-PHFAPP binden inderdaad aan respectievelijk PS en PI(4)P, volgens een klassieke verzadigingsbindingscurve. Gezien hun respectieve affiniteiten voor PS en PI(4)P, blijven deze sondes grotendeels gebonden aan de liposomen, zelfs als de liposomen resterende sporen van deze liganden bevatten. Dit kan leiden tot de onjuiste conclusie dat een LTP deze lipiden niet efficiënt extraheert. Het protocol is gebaseerd op standaard en commercieel verkrijgbare PC, PS en PI(4)P ondersoorten die respectievelijk 18:1/18:1-PC, 16:0/18:1-PS en 16:0/16:0-PI(4)P zijn. Het uitvoeren van experimenten met lipidesoorten met andere acylketens kan verschillende resultaten opleveren, zoals eerder gemeld12,35.

In de overdrachtstests, als de bulklipidensamenstelling (zonder rekening te houden met PS of PI (4) P) van LA- en L B-liposomen moet worden gewijzigd, is het van cruciaal belang om ook de controle-experimenten uit te voeren met L A-Eq en LB-Eq liposomen met een bulksamenstelling die vergelijkbaar is met die van LA- en L B-liposomen, respectievelijk. Hetzelfde principe geldt voor de extractietests. Genetisch gecodeerde fluorescerende lipidebindende domeinen worden breed gebruikt om de lipidenverdeling in cellen te analyseren44. Voorzichtigheid is geboden bij het analyseren van dergelijke experimenten, zoals de associatie van deze lipidensondes met het membraan, hoewel voornamelijk aangedreven door de aanwezigheid van het beoogde lipide, kan worden beïnvloed door andere parameters (dichtheid van anionische lipiden, lipidenpakking) die verschillen tussen celcompartimenten. In deze in vitro assays is de samenstelling van liposomen veel eenvoudiger dan die van cellulaire membranen: ze zijn meestal gemaakt van PC, een zwitterionisch lipide, en leggen daardoor een nogal inert oppervlak bloot dat geen invloed heeft op hoe PS en PI (4) P worden herkend door hun overeenkomstige sensor. PHFAPP kan worden gebruikt in de aanwezigheid van anionische lipiden, zoals PS, fosfatidisch zuur (PA) en PI32,en C2Lact herkent PI(4)P12niet; beide waarnemingen maken onbevooroordeelde metingen van PS/PI(4)P-uitwisseling mogelijk. NBD-PHFAPP wordt niet beïnvloed door sterol43.

Het is echter niet bekend of deze sondes, in het bijzonder NBD-C2Lact, kunnen worden gebruikt met liposomen met extreme kenmerken(bijv. Zeer lage of hoge lipidenverpakking, zeer negatief geladen oppervlak, aanwezigheid van lipidedomeinen). Ondanks deze potentiële beperking met betrekking tot liposoomsamenstelling, hebben deze overdrachtstests op basis van fluorescerende sensoren enorme voordelen in vergelijking met andere methoden. Ten eerste vertrouwen ze niet op fluorescerend gelabelde PS en PI(4)P die een extra omvangrijke groep dragen en waarschijnlijk niet goed worden opgevangen door de bindingszak van LTP's. Ten tweede bieden deze testen een veel betere tijdresolutie dan methoden op basis van liposoomscheiding (op radioactiviteit gebaseerde assays45 of massaspectrometrie33), en opgemerkt moet worden dat radioactief gelabelde PI(4)P en PS niet commercieel beschikbaar zijn. Het vermogen van een eiwit om PS of PI(4)P over te dragen wordt niet beïnvloed door de associatie van de fluorescerende sensoren met liposomen. Inderdaad, als de hoeveelheid NBD-C2Lact of NBD-PHFAPP en die van PS en PI(4)P in de buitenste folder van liposomen die toegankelijk is voor de LTP in aanmerking wordt genomen, wordt slechts 5% van PS of PI(4)P geassocieerd met sonde tijdens een kinetische meting.

Bovendien wordt slechts 0,55-0,86% van het membraanoppervlak bedekt door de sonde, rekening houdend met het totale oppervlak van liposomen (LA+ L B-liposomen; 5,1 × 1016 nm2 met een oppervlakte van 0,7 nm 2 per lipide), hetmembraanoppervlak dat één individueel C2- of PH-molecuul kan bezetten (respectievelijk ≈3,1 en4,8nm 2 , geschat op basis van referenties46 , 47,48) en hun concentratie (250 nM). De principes die aan deze assays ten grondslag liggen, zijn dus aangepast om de kinetische en mechanistische aspecten van LTP's goed te analyseren. Zoals vermeld in de inleiding, kunnen veranderingen in de activiteit van ORP5/8 leiden tot cellulaire disfuncties49. De invasiviteit van alvleesklierkankercellen lijkt bijvoorbeeld afhankelijk te zijn van het niveau van ORP5-expressie. Bovendien bestaat er een causaliteit tussen hoge niveaus van ORP5-expressie en de slechte prognose van menselijke alvleesklierkanker. Een hoog niveau van ORP5-expressie wordt ook gedetecteerd in longtumorweefsels, en meer in het bijzonder in gemetastaseerde gevallen. Interessant is dat het vermogen van ORP5 om lipiden over te dragen kan verklaren waarom het celproliferatie en migratie bevordert.

ORP5 upreguleert het zoogdierdoel van rapamycinecomplex 1 (mTORC1) -complex, dat een centrale rol speelt bij celoverleving en proliferatie, waarschijnlijk omdat het de activiteit van Akt, een upstream-activator van mTORC1, verbetert door de PM te voorzien van PS. Over het algemeen suggereren deze waarnemingen dat ORP5 een interessant farmacologisch doelwit kan zijn en dat deze in vitro assays kunnen dienen om moleculen te screenen die in staat zijn om de activiteit ervan te remmen. Deze test kan ook helpen om beter te definiëren of andere leden van de ORP / Osh-familie PS / PI (4) P-wisselaars zijn. Met name ORP10 bleek PS in vitro in te kapselen en PS over te dragen in ER-Golgi contactsites27,50, maar het is nog steeds onbekend of het fungeert als een PS / PI (4) P-wisselaar. Bovendien kunnen deze protocollen dienen om het vermogen van LTP's van andere families om PI(4)P te transporteren te onderzoeken, zoals onlangs werd aangetoond met steroidogene acute regulerende transfer-achtige eiwitten10, of PS. Bovendien is NBD-PHFAPP gebruikt om het vermogen van LTP te volgen om PI (4,5) P2 tussen liposomen te transporteren, omdat het deze PIP10herkent, 35. Ten slotte kan deze strategie worden aangepast om andere extractie- of transportprocessen in vitro te meten door andere lipidebindende domeinen te gebruiken(bijvoorbeeld een niet-katalytische PI-PLC om PI51te detecteren, sporulatiespecifiek eiwit 20-fragment om PA52te detecteren, domein 4 (D4) van perfringolysine O om sterol53te detecteren).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.

Acknowledgments

We zijn Dr. A. Cuttriss dankbaar voor haar zorgvuldige proeflezing van het manuscript. Dit werk wordt gefinancierd door de Subsidie exCHANGE van het Franse Nationale Onderzoeksbureau (ANR-16-CE13-0006) en door het CNRS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 L-cysteine ≥97 % (FG)  Sigma W326305-100G Prepare a 10 mM L-cysteine stock solution in water. Aliquots are stored at -20 °C
2 mL Amber Vial, PTFE/Rub Lnr, for lipids storage in CHCL3 Wheaton W224681
4 mm-diameter glass beads Sigma Z265934-1EA
50 mL conical centrifuge tube Falcon
ÄKTA purifier GE healthcare FPLC
Aluminium foil
Amicon Ultra-15 with a MWCO of 3 and 10 kDa Merck UFC900324, UFC901024
Amicon Ultra-4 with a MWCO of 3 and 10 kDa Merck UFC800324, UFC801024
Ampicillin Prepare a 50 mg/mL stock solution with filtered and sterilized water and store it at -20 °C.
Bestatin Sigma B8385-10mg
BL21 Gold Competent Cells Agilent
C16:0 Liss  (Rhod-PE) in CHCl3 (1 mg/mL) Avanti Polar Lipids 810158C-5MG
C16:0/C16:0-PI(4)P   Echelon Lipids P-4016-3 Dissolve 1 mg of C16:0/C16:0-PI(4)P powder in 250 µL of MeOH and 250 µL of CHCl3. Then complete with CHCl3 to 1 mL. The solution must become clear.
C16:0/C18:1-PS (POPS) in CHCl3 (10 mg/mL) Avanti Polar Lipids 840034C-25mg
C18:1/C18:1-PC (DOPC) in CHCl3 (25 mg/mL) Avanti Polar Lipids 850375C-500mg
CaCl2  Sigma Prepare 10 mM CaCl2 stock solution in water.
Cell Disruptor Constant Dynamics
Chloroform (CHCl3) RPE-ISO Carlo Erba 438601
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail Roche 5056489001
Deionized (Milli-Q) water
Dimethylformamide (DMF), anhydrous, >99% pure
DNAse I Recombinant, RNAse free, in powder Roche 10104159001
DTT Euromedex EU0006-B Prepare 1 M DTT stock solution in Milli-Q water.  Prepare 1 mL aliquots and store them at -20 °C. 
Econo-Pac chromatography columns (1.5 × 12 cm). Biorad 7321010
Electroporation cuvette 2 mm Ozyme EP102
Electroporator Eppendorf 2510 Eppendorf
Fixed-Angle Rotor Ti45 and Ti45 tubes Beckman Spinning the batcerial lysates
Glass-syringes (10, 25, and 50 µL) for fluorescence experiment Hamilton
Glass-syringes (25 , 100, 250, 500, and 1000 µL) to handle lipid stock solutions Hamilton 1702RNR, 1710RNR, 1725RNR, 1750RN type3, 1001RN
Glutathione Sepharose 4B beads GE Healthcare 17-0756-05
Glycerol (99% pure) Sigma G5516-500ML
Hemolysis tubes with a cap
HEPES , >99 % pure Sigma H3375-500G
Illustra NAP 10 desalting column GE healthcare GE17-0854-02
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)  Euromedex EU0008-B Prepare 1 M IPTG stock solution in Milli-Qwater. Prepare 1 mL aliquots and store them at -20 °C. 
K-Acetate Prolabo 26664.293
Lennox LB Broth medium without glucose Prepared with milli-Q water and autoclaved.
Liquid nitrogen Linde
Methanol (MeOH) ≥99.8% VWR 20847.24
MgCl2 Sigma Prepare a 2 M MgCl2 solution. Filter the solution using a 0.45 µm filter. 
Microplate 96 Well PS F-Botom Black Non-Binding Greiner Bio-one 655900
Mini-Extruder with two 1 mL gas-tight Hamilton syringes Avanti Polar Lipids 610023
Monochromator-based fluorescence plate reader TECAN M1000 Pro
N,N'-Dimethyl-N-(Iodoacetyl)-N'-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Ethylenediamine) (IANBD Amide) Molecular Probes Dissolve 25 mg of IANBD in 2.5 mL of dimethylsulfoxide (DMSO) and prepare 25 aliquot of 100 µL in 1.5 mL screw-cap tubes. Do not completely screw the cap. Then, remove DMSO in a freeze-dryer to obtain 1 mg of dry IANBD per tube. Tubes are closed and stored at -20 °C in the dark.  
NaCl Sigma S3014-1KG
PBS 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM NaH2PO4, 1.8 mM KH2PO4, autoclaved and stored at 4 °C.
Pear-shaped glass flasks (25 mL, 14/23, Duran glass) Duran Group
Pepstatin Sigma p5318-25mg
pGEX-C2LACT  plasmid Available on request from our lab
pGEX-PHFAPP plasmid Available on request from our lab
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) ≥98.5% (GC) Sigma P7626-25g Prepare a 200 mM PMSF stock solution in isopropanol
Phosphoramidon Sigma R7385-10mg
Polycarbonate filters (19 mm in diameter) with pore size of 0.2 µm Avanti Polar Lipids 610006
Poly-Prep chromatography column (with a 0-2 mL bed volume and a 10 mL reservoir) Biorad 7311550
Prefilters (10 mm in diameter). Avanti Polar Lipids 610014
PyMOL http://pymol.org/ Construction of the 3D models of the proteins (Figure 1A)
Quartz cuvette for UV/visible fluorescence (minimum volume of 600 µL) Hellma
Quartz cuvettes Hellma
Refrigerated centrifuge  Eppendorf 5427R Eppendorf
Rotary evaporator Buchi B-100
Screw-cap microcentriguge tubes (1.5 mL) Sarsted
Small magnetic PFTE stirring bar (5 × 2 mm)
Snap-cap microcentriguge tubes (0.5, 1, and 2 mL) Eppendorf
SYPRO orange fluorescent stain to detect protein in SDS-PAGE gel
Thermomixer Starlab
THROMBIN, FROM HUMAN PLASMA Sigma 10602400001 Dissolve 20 units in 1 mL of milli-Q water and prepare 25 µL aliquots in 0.5 mL Eppendorf tubes. Then freeze and store at -80 °C.
Tris, ultra pure MP 819623
Ultracentrifuge L90K Beckman
UV/Visible absorbance spectrophotometer SAFAS
UV/visible spectrofluorometer with a temperature-controlled cell holder and stirring device Jasco or Shimadzu Jasco FP-8300 or Shimadzu RF-5301PC
Vacuum chamber
Water bath Julabo
XK 16/70 column packed with Sephacryl S200HR GE healthcare

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Drin, G. Topological regulation of lipid balance in cells. Annual Review of Biochemistry. 83, 51-77 (2014).
  2. Bigay, J., Antonny, B. Curvature, lipid packing, and electrostatics of membrane organelles: defining cellular territories in determining specificity. Developmental Cell. 23 (5), 886-895 (2012).
  3. Prinz, W. A. Lipid trafficking sans vesicles: where, why, how. Cell. 143 (6), 870-874 (2010).
  4. Holthuis, J. C., Menon, A. K. Lipid landscapes and pipelines in membrane homeostasis. Nature. 510 (7503), 48-57 (2014).
  5. Wong, L. H., Copic, A., Levine, T. P. Advances on the transfer of lipids by lipid transfer proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 516-530 (2017).
  6. Wong, L. H., Gatta, A. T., Levine, T. P. Lipid transfer proteins: the lipid commute via shuttles, bridges and tubes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (2), 85-101 (2019).
  7. Iaea, D. B., Dikiy, I., Kiburu, I., Eliezer, D., Maxfield, F. R. STARD4 membrane interactions and sterol binding. Biochemistry. 54 (30), 4623-4636 (2015).
  8. Wilhelm, L. P., et al. STARD3 mediates endoplasmic reticulum-to-endosome cholesterol transport at membrane contact sites. The EMBO Journal. 36 (10), 1412-1433 (2017).
  9. Bian, X., Saheki, Y., De Camilli, P. Ca(2+) releases E-Syt1 autoinhibition to couple ER-plasma membrane tethering with lipid transport. The EMBO Journal. 37 (2), 219-234 (2018).
  10. Horenkamp, F. A., Valverde, D. P., Nunnari, J., Reinisch, K. M. Molecular basis for sterol transport by StART-like lipid transfer domains. The EMBO Journal. 37 (6), 98002 (2018).
  11. Jentsch, J. A., et al. Structural basis of sterol binding and transport by a yeast StARkin domain. The Journal of Biological Chemistry. 293 (15), 5522-5531 (2018).
  12. Moser von Filseck, J., et al. INTRACELLULAR TRANSPORT. Phosphatidylserine transport by ORP/Osh proteins is driven by phosphatidylinositol 4-phosphate. Science. 349 (6246), 432-436 (2015).
  13. Daum, G., et al. Systematic analysis of yeast strains with possible defects in lipid metabolism. Yeast. 15 (7), 601-614 (1999).
  14. Ejsing, C. S., et al. Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).
  15. Leidl, K., Liebisch, G., Richter, D., Schmitz, G. Mass spectrometric analysis of lipid species of human circulating blood cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1781 (10), 655-664 (2008).
  16. Sampaio, J. L., et al. Membrane lipidome of an epithelial cell line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (5), 1903-1907 (2011).
  17. Vance, J. E., Steenbergen, R. Metabolism and functions of phosphatidylserine. Progress in Lipid Research. 44 (4), 207-234 (2005).
  18. Zinser, E., et al. Phospholipid synthesis and lipid composition of subcellular membranes in the unicellular eukaryote Saccharomyces cerevisiae. Journal of Bacteriology. 173 (6), 2026-2034 (1991).
  19. Leventis, P. A., Grinstein, S. The distribution and function of phosphatidylserine in cellular membranes. Annual Review of Biophysics. 39, 407-427 (2010).
  20. Yeung, T., et al. Membrane phosphatidylserine regulates surface charge and protein localization. Science. 319 (5860), 210-213 (2008).
  21. Kim, J., Shishido, T., Jiang, X., Aderem, A., McLaughlin, S. Phosphorylation, high ionic strength, and calmodulin reverse the binding of MARCKS to phospholipid vesicles. Journal of Biological Chemistry. 269 (45), 28214-28219 (1994).
  22. Sigal, C. T., Zhou, W., Buser, C. A., McLaughlin, S., Resh, M. D. Amino-terminal basic residues of Src mediate membrane binding through electrostatic interaction with acidic phospholipids. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (25), 12253-12257 (1994).
  23. Gal Bivona, T., et al. PKC regulates a farnesyl-electrostatic switch on K-Ras that promotes its association with Bcl-XL on mitochondria and induces apoptosis. Molecular Cell. 21 (4), 481-493 (2006).
  24. Finkielstein, C. V., Overduin, M., Capelluto, D. G. Cell migration and signaling specificity is determined by the phosphatidylserine recognition motif of Rac1. The Journal of Biological Chemistry. 281 (37), 27317-27326 (2006).
  25. Bolsover, S. R., Gomez-Fernandez, J. C., Corbalan-Garcia, S. Role of the Ca2+/Phosphatidylserine Binding Region of the C2 Domain in the Translocation of Protein Kinase Cα to the Plasma Membrane. Journal of Biological Chemistry. 278 (12), 10282-10290 (2003).
  26. Vance, J. E., Tasseva, G. Formation and function of phosphatidylserine and phosphatidylethanolamine in mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1831 (3), 543-554 (2013).
  27. Maeda, K., et al. Interactome map uncovers phosphatidylserine transport by oxysterol-binding proteins. Nature. 501 (7466), 257-261 (2013).
  28. D'Ambrosio, J. M., et al. Osh6 requires Ist2 for localization to ER-PM contacts and efficient phosphatidylserine transport in budding yeast. Journal of Cell Science. 133 (11), 243733 (2020).
  29. Manford, A. G., Stefan, C. J., Yuan, H. L., Macgurn, J. A., Emr, S. D. ER-to-plasma membrane tethering proteins regulate cell signaling and ER morphology. Developmental Cell. 23 (6), 1129-1140 (2012).
  30. Collado, J., et al. Tricalbin-mediated contact sites control ER curvature to maintain plasma membrane integrity. Developmental Cell. 51 (4), 476-487 (2019).
  31. Hoffmann, P. C., et al. Tricalbins contribute to cellular lipid flux and form curved ER-PM contacts that are bridged by rod-shaped structures. Developmental Cell. 51 (4), 488-502 (2019).
  32. Lipp, N. F., et al. An electrostatic switching mechanism to control the lipid transfer activity of Osh6p. Nature Communications. 10 (1), 3926 (2019).
  33. Chung, J., et al. INTRACELLULAR TRANSPORT. PI4P/phosphatidylserine countertransport at ORP5- and ORP8-mediated ER-plasma membrane contacts. Science. 349 (6246), 428-432 (2015).
  34. Sohn, M., et al. PI(4,5)P2 controls plasma membrane PI4P and PS levels via ORP5/8 recruitment to ER-PM contact sites. The Journal of Cell Biology. 217 (5), 1797-1813 (2018).
  35. Ghai, R., et al. ORP5 and ORP8 bind phosphatidylinositol-4, 5-biphosphate (PtdIns(4,5)P 2) and regulate its level at the plasma membrane. Nature Communications. 8 (1), 757 (2017).
  36. Sohn, M., et al. Lenz-Majewski mutations in PTDSS1 affect phosphatidylinositol 4-phosphate metabolism at ER-PM and ER-Golgi junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4314-4319 (2016).
  37. Kattan, W. E., et al. Targeting plasma membrane phosphatidylserine content to inhibit oncogenic KRAS function. Life Science Alliance. 2 (5), 00431 (2019).
  38. Du, X., Turner, N., Yang, H. The role of oxysterol-binding protein and its related proteins in cancer. Seminars in Cell & Developmental Biology. 81, 149-153 (2018).
  39. Galmes, R., et al. ORP5/ORP8 localize to endoplasmic reticulum-mitochondria contacts and are involved in mitochondrial function. EMBO reports. 17 (6), 800-810 (2016).
  40. Du, X., et al. ORP5 localizes to ER-lipid droplet contacts and regulates the level of PI(4)P on lipid droplets. The Journal of Cell Biology. 219 (1), 201905162 (2020).
  41. Wang, H., et al. ORP2 delivers cholesterol to the plasma membrane in exchange for phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PI(4,5)P2). Molecular Cell. 73 (3), 458-473 (2019).
  42. Kay, J. G., Grinstein, S. Sensing phosphatidylserine in cellular membranes. Sensors (Basel). 11 (2), 1744-1755 (2011).
  43. Moser von Filseck, J., Vanni, S., Mesmin, B., Antonny, B., Drin, G. A phosphatidylinositol-4-phosphate powered exchange mechanism to create a lipid gradient between membranes. Nature Communications. 6, 6671 (2015).
  44. Wills, R. C., Goulden, B. D., Hammond, G. R. V. Genetically encoded lipid biosensors. Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1526-1532 (2018).
  45. Raychaudhuri, S., Im, Y. J., Hurley, J. H., Prinz, W. A. Nonvesicular sterol movement from plasma membrane to ER requires oxysterol-binding protein-related proteins and phosphoinositides. The Journal of Cell Biology. 173 (1), 107-119 (2006).
  46. Lenoir, M., et al. Structural basis of wedging the Golgi membrane by FAPP pleckstrin homology domains. EMBO reports. 11 (4), 279-284 (2010).
  47. Liu, Y., Kahn, R. A., Prestegard, J. H. Interaction of Fapp1 with Arf1 and PI4P at a membrane surface: an example of coincidence detection. Structure. 22 (3), 421-430 (2014).
  48. Shao, C., Novakovic, V. A., Head, J. F., Seaton, B. A., Gilbert, G. E. Crystal structure of lactadherin C2 domain at 1.7A resolution with mutational and computational analyses of its membrane-binding motif. The Journal of Biological Chemistry. 283 (11), 7230-7241 (2008).
  49. Lipp, N. F., Ikhlef, S., Milanini, J., Drin, G. Lipid exchangers: cellular functions and mechanistic links with phosphoinositide metabolism. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 663 (2020).
  50. Venditti, R., et al. Molecular determinants of ER-Golgi contacts identified through a new FRET-FLIM system. The Journal of Cell Biology. 218 (3), 1055-1065 (2019).
  51. Pemberton, J. G., et al. Defining the subcellular distribution and metabolic channeling of phosphatidylinositol. The Journal of Cell Biology. 219 (3), (2020).
  52. Nakanishi, H., de los Santos, P., Neiman, A. M. Positive and negative regulation of a SNARE protein by control of intracellular localization. Molecular Biology of the Cell. 15 (4), 1802-1815 (2004).
  53. Maekawa, M., Yang, Y., Fairn, G. D. Perfringolysin O theta toxin as a tool to monitor the distribution and inhomogeneity of cholesterol in cellular membranes. Toxins. 8 (3), 67 (2016).

Tags

Biochemie Nummer 169 lipide transfer eiwit OSBP-gerelateerd eiwit fosfatidylserine fosfatidylinositol 4-fosfaat fluorescentie recombinant eiwit liposoom
Fluorescentie-gebaseerde metingen van fosfatidylserine / fosfatidylinositol 4-fosfaatuitwisseling tussen membranen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ikhlef, S., Lipp, N. F., Magdeleine, … More

Ikhlef, S., Lipp, N. F., Magdeleine, M., Drin, G. Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes. J. Vis. Exp. (169), e62177, doi:10.3791/62177 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter