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Biochemistry

Mesures basées sur la fluorescence de l’échange phosphatidylsérine/phosphatidylinositol 4-phosphate entre les membranes

Published: March 14, 2021 doi: 10.3791/62177
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Université Côte d’Azur, Centre National de la Recherche Scientifique, Institut de Pharmacologie Moléculaire et Cellulaire
* These authors contributed equally

Summary

Ici, nous décrivons des protocoles utilisant des capteurs lipidiques fluorescents et des liposomes pour déterminer si une protéine extrait et transporte de la phosphatidylsérine ou du phosphatidylinositol 4-phosphate in vitro.

Abstract

Plusieurs membres de la famille des protéines liées à la protéine de liaison à l’oxystérol (OSBP) conservées de manière évolutionnaire (ORP) / homologues OSBP (Osh) ont récemment été trouvés pour représenter un nouveau groupe de protéines de transfert lipidique (LTP) dans les levures et les cellules humaines. Ils transfèrent la phosphatidylsérine (PS) du réticulum endoplasmique (RE) à la membrane plasmique (PM) via les cycles d’échange PS/phosphatidylinositol 4-phosphate (PI(4)P). Cette découverte permet de mieux comprendre comment la PS, qui est essentielle pour les processus de signalisation, est distribuée dans toute la cellule et d’enquêter sur le lien entre ce processus et le métabolisme du phosphoinositide (PIP). Le développement de nouveaux protocoles basés sur la fluorescence a joué un rôle déterminant dans la découverte et la caractérisation de ce nouveau mécanisme cellulaire in vitro au niveau moléculaire. Cet article décrit la production et l’utilisation de deux capteurs lipidiques marqués par fluorescence, NBD-C2Lact et NBD-PHFAPP,pour mesurer la capacité d’une protéine à extraire PS ou PI(4)P et à transférer ces lipides entre membranes artificielles. Tout d’abord, le protocole décrit comment produire, étiqueter et obtenir des échantillons de haute pureté de ces deux constructions. Deuxièmement, cet article explique comment utiliser ces capteurs avec un lecteur de microplaques de fluorescence pour déterminer si une protéine peut extraire PS ou PI(4)P des liposomes, en utilisant Osh6p comme étude de cas. Enfin, ce protocole montre comment mesurer avec précision la cinétique de l’échange PS/PI(4)P entre liposomes de composition lipidique définie et déterminer les taux de transfert lipidique par transfert d’énergie par résonance de fluorescence (FRET) à l’aide d’un fluoromètre standard.

Introduction

La distribution précise des lipides entre différentes membranes et à l’intérieur des membranes des cellules eucaryotes1,2 a de profondes implications biologiques. Décrypter le fonctionnement des LTP est une question importante en biologie cellulaire3,4,5,6, et les approches in vitro sont d’une grande valeur pour aborder cette question7,8,9,10,11. Ici, une stratégie in vitrobasée sur la fluorescence est présentée qui a joué un rôle déterminant dans l’établissement que plusieurs protéines ORP/Osh affectent l’échange PS/PI(4)P entre les membranes cellulaires12 et constituent ainsi une nouvelle classe de LTP. PS est un glycérophospholipide anionique qui représente 2 à 10% des lipides membranaires totaux dans les cellules eucaryotes13,14,16. Il est distribué le long d’un gradient entre l’ER et le PM, où il représente 5-7% et jusqu’à 30% des glycérophospholipides, respectivement17,18,19. De plus, la PS est essentiellement concentrée dans la foliole cytosolique du PM. Cette accumulation et la partition inégale de PS dans le PM sont essentielles pour les processus de signalisation cellulaire19. En raison de la charge négative des molécules PS, la foliole cytosolique du PM est beaucoup plus anionique que la foliole cytosolique des autres organites1,2,19,20. Cela permet le recrutement, via des forces électrostatiques, de protéines de signalisation telles que le substrat C-kinase riche en alanine myristylée (MARCKS)21,le sarcome (Src)22,l’oncogène viral du sarcome Kirsten-rat (K-Ras)23et le substrat de toxine botulique C3 lié à Ras 1 (Rac1)24 qui contiennent un tronçon d’acides aminés chargés positivement et une queue lipidique.

La PS est également reconnue par la protéine kinase C conventionnelle de manière stéréosélective via un domaine C225. Cependant, le PS est synthétisé dansl’ER 26, indiquant qu’il doit être exporté vers le PM avant de pouvoir jouer son rôle. On ne savait pas comment cela avait été accompli19 jusqu’à ce que l’on constate que, dans la levure, Osh6p et Osh7p transfèrent le PS de l’ER au PM27. Ces LTP appartiennent à une famille conservée de manière évolutionnaire chez les eucaryotes dont le membre fondateur est OSBP et qui contient des protéines (ORP chez l’homme, protéines Osh chez la levure) intégrant un domaine lié à l’OSBP (ORD) avec une poche pour héberger une molécule lipidique. Osh6p et Osh7p sont uniquement constitués d’un ORD dont les caractéristiques structurelles sont adaptées pour lier spécifiquement le PS et le transférer entre les membranes. Néanmoins, la façon dont ces protéines ont transféré le PS de l’ER au PM n’était pas claire. Osh6p et Osh7p peuvent piéger PI(4)P comme ligand lipidiquealternatif 12. Dans la levure, PI(4)P est synthétisé à partir du phosphatidylinositol (PI) dans le Golgi et le PM par les PI 4-kinases, Pik1p et Stt4p, respectivement. En revanche, il n’y a pas de PI(4)P dans la membrane ER, car ce lipide est hydrolysé en PI par la phosphatase Sac1p. Par conséquent, un gradient PI(4)P existe à la fois aux interfaces ER/Golgi et ER/PM. Osh6p et Osh7p transfèrent le PS de l’ER au PM via des cycles d’échange PS/PI(4)P en utilisant le gradient PI(4)P qui existe entre ces deux membranes12.

Au cours d’un cycle, Osh6p extrait le PS de l’ER, échange le PS contre le PI(4)P au PM et transfère le PI(4)P à l’ER pour extraire une autre molécule de PS. Osh6p / Osh7p interagissent avec Ist2p28, l’une des rares protéines qui se connectent et rapprochent la membrane ER et le PM pour créer des sites de contact ER-PM dans la levure29,30,31. De plus, l’association d’Osh6p avec des membranes chargées négativement devient faible dès que la protéine extrait l’un de ses ligands lipidiques en raison d’un changement conformationnel qui modifie ses caractéristiques électrostatiques32. Cela aide Osh6p en raccourcissant son temps de séjour membranaire, maintenant ainsi l’efficacité de son activité de transfert lipidique. Combiné à la liaison à Ist2p, ce mécanisme pourrait permettre à Osh6p/7p d’exécuter rapidement et avec précision l’échange de lipides à l’interface ER/PM. Dans les cellules humaines, les protéines ORP5 et ORP8 exécutent l’échange PS/PI(4)P sur les sites de contact ER-PM via des mécanismes distincts33. Ils ont une ORD centrale, semblable à Osh6p, mais sont directement ancrés à l’ER via un segment transmembranaire C-terminal33 et s’amarrent au PM via un domaine d’homologie de Pleckstrin (PH) N-terminal qui reconnaît PI(4)P et PI(4,5)P233,34,35. ORP5/8 utilise PI(4)P pour transférer PS, et il a été démontré que ORP5/8 régule en outre les niveaux de PM PI(4,5)P2 et module probablement les voies de signalisation. À son tour, une diminution des niveaux de PI(4)P et PI(4,5)P2 diminue l’activité ORP5/ORP8 car ces protéines s’associent au PM d’une manière dépendante du PIP. La synthèse anormalement élevée de PS, qui conduit au syndrome de Lenz-Majewski, a un impact sur les niveaux de PI(4)P par ORP5/836. Lorsque l’activité des deux protéines est bloquée, le PS devient moins abondant au PM, ce qui réduit la capacité oncogène des protéines de signalisation37.

Inversement, la surexpression d’ORP5 semble favoriser l’invasion des cellules cancéreuses et les processus métastatiques38. Ainsi, les altérations de l’activité ORP5/8 peuvent modifier gravement le comportement cellulaire par des changements dans l’homéostasie lipidique. De plus, ORP5 et ORP8 occupent les sites de contact ER-mitochondries et préservent certaines fonctions mitochondriales, éventuellement en fournissant PS39. De plus, ORP5 se localise sur les sites de contact des gouttelettes ER-lipidiques pour délivrer du PS aux gouttelettes lipidiques par échange PS/PI(4)P40. La stratégie décrite ici pour mesurer (i) l’extraction de PS et DEP(4)P à partir de liposomes et (ii) le transport de PS et de PI(4)P entre liposomes a été conçue pour établir et analyser l’activité d’échange de PS/PI(4)P d’Osh6p/Osh7p12,32 et utilisée par d’autres groupes pour analyser l’activité d’ORP5/ORP835 et d’autres LTP10, 41. Il est basé sur l’utilisation d’un lecteur de plaque de fluorescence, d’un spectrofluoromètre standard au format L et de deux capteurs fluorescents, NBD-C2Lact et NBD-PHFAPP,qui peuvent détecter PS et PI(4)P, respectivement.

NBD-C2Lact correspond au domaine C2 de la glycoprotéine, la lactadhérine, qui a été remanié pour inclure une cystéine unique exposée au solvant près du site de liaison présumé du PS; un fluorophore NBD (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol) sensible à la polarité est lié de manière covalente à ce résidu(Figure 1A)12. Pour être plus précis, le domaine C2 de la lactadhérine (Bos taurus, UniProt: Q95114, résidus 270-427) a été cloné dans un vecteur pGEX-4T3 à exprimer en fusion avec la glutathion S-transférase (GST) chez Escherichia coli. La séquence C2Lact a ensuite été mutée pour remplacer deux résidus de cystéine accessibles aux solvants (C270, C427) par des résidus d’alanine et pour introduire un résidu de cystéine dans une région proche du site putatif de liaison PS (mutation H352C) qui peut ensuite être marqué avec N,N'-diméthyl-N-(iodoacétyl)-N'-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)éthylène diamine (IANBD)12 . Un site de clivage de la thrombine est présent entre la protéine GST et le N-terminus du domaine C2. Un avantage majeur est que ce domaine reconnaît sélectivement PS d’une manière indépendante de Ca2+contrairement à d’autres domaines C2 connus ou Annexin A542. NBD-PHFAPP est dérivé du domaine PH de la protéine 1 humaine adapteur de quatre phosphates (FAPP1), qui a été remaniée pour inclure une seule cystéine exposée au solvant qui peut être étiquetée avec un groupe NBD près du site de liaison PI(4)P (Figure 1A)43. La séquence nucléotidique du domaine PH de la protéine FAPP humaine (UniProt: Q9HB20, segment [1-100]) a été clonée en un vecteur pGEX-4T3 pour être exprimé en tandem avec une étiquette GST. La séquence PHFAPP a été modifiée pour insérer un résidu de cystéine unique dans l’interface de liaison membranaire de la protéine43. De plus, un agent de liaison à neuf résidus a été introduit entre le site de clivage de la thrombine et la terminaison N du domaine PH pour assurer l’accessibilité à la protéase.

Pour mesurer l’extraction de PS à partir de liposomes, NBD-C2Lact est mélangé à des liposomes en phosphatidylcholine (PC) contenant des traces de PS. En raison de son affinité pour le PS, cette construction se lie aux liposomes, et le fluorophore NBD subit un changement de polarité lorsqu’il entre en contact avec l’environnement hydrophobe de la membrane, ce qui provoque un décalage bleu et une augmentation de la fluorescence. Si le PS est extrait presque complètement par une quantité stœchiométrique de LTP, la sonde ne s’associe pas aux liposomes, et le signal NBD est plus faible(Figure 1B)32. Cette différence de signal est utilisée pour déterminer si un LTP(par exemple, Osh6p) extrait PS. Une stratégie similaire est utilisée avec NBD-PHFAPP pour mesurer l’extraction PI(4)P(Figure 1B), comme décrit précédemment12,32. Deux tests basés sur FRET ont été conçus pour (i) mesurer le transport PS des liposomes LA à LB, qui imitent respectivement la membrane ER et le PM, et (ii) le transport PI(4)P dans le sens inverse. Ces essais sont effectués dans les mêmes conditions(c.-à-d. même tampon, température et concentration lipidique) pour mesurer l’échange PS/PI(4)P. Pour mesurer le transport de la PS, NBD-C2Lact est mélangé à des liposomes LA composés de PC et dopés avec 5 mol% de PS et 2 mol% d’une phosphatidyléthanolamine fluorescente marquée à la rhodamine (Rhod-PE) - et des liposomes LB incorporant 5 mol% PI(4)P.

Au temps zéro, FRET avec Rhod-PE éteint la fluorescence NBD. Si le PS est transporté des liposomes LA vers LB (par exemple, lors de l’injection d’Osh6p), une décrochage rapide se produit en raison de la translocation des molécules NBD-C2Lact des liposomes LA à LB (Figure 1C). Compte tenu de la quantité de PS accessible, NBD-C2Lact reste essentiellement dans un état lié à la membrane au cours de l’expérience12. Ainsi, l’intensité du signal NBD est directement corrélée avec la distribution de NBD-C2Lact entre les liposomes LA et LB et peut être facilement normalisée pour déterminer la quantité de PS transférée. Pour mesurer le transfert de PI(4)P dans la direction opposée, NBD-PHFAPP est mélangé avec des liposomes LA et LB; étant donné qu’il ne se lie qu’aux liposomes LB qui contiennent pi(4)P, mais pas Rhod-PE, sa fluorescence est élevée. Si PI(4)P est transféré aux liposomes LA, il se transfère à ces liposomes, et le signal diminue en raison de FRET avec Rhod-PE (Figure 1C). Le signal est normalisé pour déterminer la quantité de PI(4)P transférée43.

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Protocol

1. Purification de NBD-C2Lact

REMARQUE: Bien que ce protocole détaille l’utilisation d’un perturbateur cellulaire pour briser les bactéries, il peut être modifié pour utiliser d’autres stratégies de lyse(par exemple, une presse Français). Au début de la purification, il est obligatoire d’utiliser un tampon fraîchement dégazé, filtré et complété par 2 mM de dithiothréitol (DTT) pour éviter l’oxydation de la cystéine. Cependant, pour l’étape de marquage des protéines, il est crucial de supprimer complètement la TNT. De nombreuses étapes doivent être effectuées sur la glace ou dans une chambre froide pour éviter toute dégradation des protéines. Des échantillons d’un volume de 30 μL doivent être prélevés à différentes étapes du protocole pour effectuer une analyse par électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide (SDS-PAGE) à l’aide d’un gel d’acrylamide à 15 % afin de vérifier l’avancement de la purification. Mélanger suffisamment de tampon d’échantillon Laemmli dénaturant avec chaque aliquote et chauffer le mélange à 95 °C. Congeler et conserver les tubes à -20 °C jusqu’à analyse.

  1. Expression de GST-C2Lact chez Escherichia coli
    1. Mélanger 20 μL de cellules bl21 Gold compétentes avec 18 μL d’eau stérilisée. Ensuite, mélangez 2 μL de plasmide pGEX-C2Lact (à ~65 ng/μL) avec les bactéries, et transformez-les par électroporation. Resuspendez les bactéries avec 150 μL de bouillon de lysogénie (LB) Lennox autoclavé (10 g/L de tryptone, 5 g/L d’extrait de levure, 5 g/L de NaCl dans de l’eau désionisée, sans glucose). Laissez les bactéries se développer à 37 °C pendant 1 h dans un tube de microcentrifugation à capuchon de 2 mL.
    2. Inoculer 25 mL de milieu LB, complété par 50 μg/mL d’ampicilline, avec 150 μL de suspension bactérienne dans une fiole stérile d’Erlenmeyer de 125 mL. Placez la fiole dans un agitateur orbital à 37 °C et laissez les bactéries se développer pendant la nuit avec agitation à 185 tr/min.
    3. Remplir deux flacons stériles d’Erlenmeyer de 2 L avec 500 mL de milieu LB complété par 50 μg/mL d’ampicilline, et ajouter 5 mL de suspension de préculture. Laissez les bactéries se développer à 37 °C avec agitation à 220 tr/min.
    4. Mesurer périodiquement la densité optique (OD) de la suspension à une longueur d’onde (λ) de 600 nm. Lorsque la DO atteint une valeur d’environ 0,6-0,7, ajouter 500 μL d’une solution mère de 1 M d’isopropyle β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) à chaque fiole pour initier l’expression de GST-C2Lact. Agiter les flacons à 185 tr/min pendant 4 h à 37 °C.
    5. Transférer le contenu de chaque flacon dans une bouteille de centrifugeuse en polypropylène. Centrifuger les deux bouteilles pendant 30 min à 4600 × g à 4 °C pour granuler les bactéries. Jeter le surnageant et resussaisir chaque pastille dans 50 mL de solution saline tamponnée au phosphate froid.
    6. Transférer la suspension bactérienne contenue dans chaque bouteille dans un tube de centrifugeuse conique de 50 mL. Centrifuger les deux tubes pendant 30 min à 2300 × g à 4°C. Retirez le surnageant et conservez les tubes, chacun contenant une pastille bactérienne, à -20 °C.
  2. Purification du C2Lact
    1. Sur glace, remplir deux tubes centrifuges coniques de 50 mL avec 50 mL de tampon contenant 50 mM de Tris-HCl, pH 7,4 et 150 mM de NaCl (ci-après appelé tampon TN), préalablement filtrés et dégazés par filtration sous vide membranaire.
    2. Pour préparer le tampon de lyse dans chaque tube, dissoudre un comprimé de cocktail d’inhibiteurs de protéase sans acide tétraacétique d’éthylènediamine dans le tampon TN par sonication légère ou vortex. Ajouter d’autres antiprotéases (10 μM de bestatine, 1 μg/mL de pepstatine A et 10 μM de phosphoramidon). Il est important de compléter le tampon avec 2 mM de TNT.
    3. Remplissez les deux tubes qui contiennent les pastilles bactériennes préparées à l’étape 1.1.6, avec un tampon de lyse pour obtenir un volume final de 30 mL dans chaque tube, et décongelez lentement les pastilles sur la glace pendant 10 min. Écraser chaque pastille avec une spatule en acier inoxydable et les remettre en suspension en tourbillonnant les tubes et/ou en pipetant la suspension d’avant en arrière avec un contrôleur de pipette et une pipette de 25 mL jusqu’à l’obtention d’une suspension homogène.
    4. Effectuer la lyse à l’aide d’un perturbateur de cellule prérefroidi (voir le tableau des matériaux)en chargeant 30 mL de l’échantillon à l’intérieur du réservoir et en exécutant un cycle de rupture en mode continu avec une pression de 1,6 bar. Recueillir le lysate dans le même tube, maintenir le tube sur de la glace et ajouter immédiatement 250 μL à partir d’une solution mère de 200 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) préparée dans de l’isopropanol.
    5. Lysez l’autre échantillon en suivant la même procédure. Utilisez le reste du tampon de lyse pour laver le perturbateur cellulaire et collectez le lavage pour ajuster le volume de chaque lysate (~ 30 mL) à un volume final de 50 mL.
    6. Complétez chaque lysate avec 5 mMMgCl2,et ajoutez 20 μg/mL de DNAse I pour fragmenter l’ADN et ainsi réduire la viscosité de l’échantillon. Incuber sur de la glace pendant 30 min. Prélever un échantillon pour l’analyse du gel.
    7. Transférer chaque lysate de 50 mL dans un tube ultracentrifuge en polycarbonate précédité (deux au total, voir le Tableau des matériaux). Centrifuger à 186 000 × g à 4 °C pendant au moins 1 h à l’aide d’une ultracentrifugeuse.
    8. Parallèlement à l’étape de centrifugation, distribuer 1,4 mL d’une boue contenant du glutathion couplée à 4 % de billes d’agarose dans deux tubes centrifuges coniques de 50 mL, ajouter 20 mL de tampon TN complété par 1 mM de TNT (tampon TND) à chaque tube, centrifuger à 1200 × g pendant 5 min et éliminer le surnageant. Répétez cette étape de lavage deux fois.
    9. Après la centrifugation du lysate bactérien, retirer un échantillon de 30 μL du surnageant et transférer le surnageant de chaque tube d’ultracentrifugeuse dans un tube de centrifugeuse conique correspondant de 50 mL contenant des billes propres. Pour l’analyse du gel, resuspendez la pastille de débris dans l’un des tubes d’ultracentrifugation avec 50 mL de tampon TND et prélez un échantillon de 30 μL.
    10. Placer les tubes sur un rotateur pendant 3-4 h à 4 °C pour obtenir une suspension homogène de billes. Regrouper les suspensions de billes dans une colonne de chromatographie vide de 25 mL. Laissez les perles décanter et retirez le tampon et les protéines non liées par écoulement par gravité. Prenez un échantillon de l’éluat pour analyse.
    11. Resuspendez les billes avec 20 mL de tampon TND et collectez l’éluat par écoulement gravitaire. Répétez cette étape deux fois pour laver complètement les perles. Mettre en commun les éluats collectés et conserver un échantillon de 30 μL pour une analyse plus approfondie.
      REMARQUE: Après une courte décantation, un volume d’environ 2 mL de suspension de billes, auquel est attaché GST-C2Lact, sédiments au fond de la colonne.
    12. Ajouter 1 mL de suspension de billes à deux tubes de microcentrifugation à capuchon de 2 mL. Remplissez chaque tube avec un tampon TND jusqu’à un volume final de 1,970 mL. Prenez un échantillon de 30 μL dans un tube pour une analyse plus approfondie (échantillon B1). Ajouter 10 μL de solution de CaCl2 de 10 mM et 25 μL à partir d’une solution mère de solution de protéase de thrombine humaine à 0,02 U/μL.
    13. Placez les deux tubes sur un rotateur à 4 °C pendant la nuit pour permettre à la thrombine de se détacher de l’étiquette GST du domaine C2Lact. Le lendemain, dans chaque tube, mélanger 10 μL de solution de PMSF de 200 mM avec la suspension de billes pour inhiber l’action de la thrombine.
    14. Centrifugez les tubes à 700 × g pendant 5 min, et collectez le surnageant, qui contient le domaine soluble C2Lact, de chaque tube, sans prendre les billes. Regrouper les surnageants dans un tube de microcentrifugation à capuchon de 2 mL (éluat E1) qui est maintenu sur la glace.
    15. Ajouter 1 mL de tampon TND à chaque tube pour ressuspender les perles et les laver; répétez l’étape 1.2.14. Effectuez cette étape trois fois de plus pour récupérer un maximum de protéines. Chaque fois, mettez en commun les surnageants collectés dans un nouveau tube de 2 mL (éluats E2, E3, E4 et E5) et prenez une aliquote pour une analyse plus approfondie. À la fin des étapes de lavage, prenez une aliquote de la suspension de perles (aliquote B2).
    16. Analyser les échantillons de 30 μL qui ont été prélevés aux différentes étapes du protocole de purification par séparation SDS-PAGE sur un gel d’acrylamide à 15%.
    17. Éliminer les billes potentiellement contaminantes en remettant en commun tous les surnageants(c.-à-d., ~ 10 mL) collectés au cours des étapes 1.2.14 et 1.2.15 dans une colonne de chromatographie de 10 mL. Recueillez l’éluat par écoulement gravitaire et retenez les perles au bas de la colonne.
    18. Concentrer l’échantillon de C2Lact à l’aide d’une unité de filtration centrifuge avec un seuil de poids moléculaire (MWCO) de 3 kDa et une vitesse de centrifugation de 2300 × g. Arrêtez la procédure de concentration lorsque le volume de l’échantillon de protéines est d’environ 1 mL.
  3. Préparation et purification du NBD-C2Lact
    1. Équilibrez une colonne de dessalement (voir la table des matériaux)avec un tampon TN. Chargez la colonne avec 1 mL d’échantillon concentré de C2Lact. Laissez l’échantillon pénétrer complètement dans le lit de gel, ajoutez 1,5 mL de tampon TN sans TNT fraîchement dégazé à la colonne et collectez l’éluat par écoulement gravitaire dans un tube de microcentrifuge à capuchon encliquetable de 2 mL.
    2. Diluer 50 μL d’éluat dans un volume final de tampon TN de 300 μL et enregistrer un spectre d’absorbance de 230 à 450 nm en utilisant un tampon TN pur comme blanc. Déterminer la concentration en C2Lact en fonction de l’absorbance mesurée à 280 nm, en considérant un coefficient d’extinction ε égal à 44 920 M-1,cm-1.
    3. Pour étiqueter la construction C2Lact avec un fluorophore NBD, mélanger la protéine avec un excès molaire dix fois supérieur de N,N'-diméthyl-N-(iodoacétyl)-N'(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)éthylènediamine (amide IANBD).
      1. Dissoudre 1 mg d’IANBD dans du diméthylformamide anhydre (DMF), en gardant à l’esprit que le volume final de DMF utilisé pour le labelage de la construction C2Lact ne doit pas dépasser 5 % (v/v) du volume de l’échantillon de protéines.
      2. Pour déterminer le volume de DMF (VDMF)pour dissoudre l’IANBD, calculez d’abord la quantité requise d’IANBD (m, exprimée en mg) pour étiqueter la protéine en utilisant la formule 1.
        m = 10 000 × C × V × MWIANBD (1)
        où C est la concentration de C2Lact mesurée à l’étape 1.3.2, V est le volume de l’échantillon de C2Lact, et MWIANBD est le poids moléculaire du fluorophore (420 g/mol).
      3. Calculer VDMF en utilisant les formules 2 (avec m0= 1) et 3.
        VDMF= (m0/m) × VIANBD (2)
        VIANBD= 0,05 × V (3)
        Où m0 est la quantité de poudre d’IANBD en mg, et VIANBD est le volume de solution d’IANBD à ajouter à l’échantillon de C2Lact.
      4. Ajouter le volume VIANBD de la solution IANBD fraîchement préparée à l’échantillon C2Lact et agiter le mélange réactionnel à 800-900 tr/min pendant 30 min à 25 °C à l’aide d’un thermomélangeur à l’abri de la lumière. Laissez la réaction se poursuivre pendant 90 min sur la glace. En attendant, nettoyez une unité de filtration centrifuge (MWCO = 3 kDa) avec 10 mL de tampon TN.
    4. Ajouter la L-cystéine (dans un excès molaire de 10 fois à l’IANBD) au mélange réactionnel pour inactiver l’IANBD libre.
    5. Ajouter 15 mL de tampon TN à la solution NBD-C2Lact et transférer la solution NBD-C2Lact à l’unité de filtration centrifuge. Concentrer l’échantillon à 2 mL pour séparer la majeure partie de la NBD libre de la protéine par centrifugation à 2300 × g. Répétez cette étape de lavage deux fois. Centrifuger l’échantillon dans un tube de centrifugeuse à capuchon encliquetable de 2 mL pendant 10 min à 19 000 × g à 4 °C pour granuler les agrégats potentiels, et prélever le surnageant.
    6. Diluer 50 μL d’éluat dans un volume final de 300 μL de tampon TN. Enregistrer le spectre d’absorbance de 230 à 650 nm en utilisant l’éluat recueilli pendant la procédure de concentration sous forme de blanc. Déterminer la concentration de NBD-C2Lact en utilisant l’absorbance maximale à λ=280 et 495 nm et les coefficients d’extinction ε= 44 920 M-10,cm -1 (protéine) et 25 000 M-1,cm-1 (fluorophore NBD).
      REMARQUE: Si les deux valeurs de concentration sont identiques, cela indique que la construction C2Lact est étiquetée à un rapport de 1: 1 avec le groupe NBD.
    7. Si la concentration de NBD-C2Lact estimée à partir de la mesure de l’absorbance nbD dépasse la concentration estimée à partir de l’absorbance des résidus de tryptophane (Trp), répétez l’étape 1.3.5 pour éliminer davantage les NBD libres.
    8. Ajouter le glycérol à l’échantillon pour obtenir une concentration finale de 10% (v/v) pour cryo-protéger la construction NBD-C2Lact pendant la congélation éclair. Mesurer la concentration finale en protéines.
    9. Préparer des aliquotes de protéines de 50 μL dans des tubes de microcentrifugation à capuchon de 0,5 mL. Congeler les tubes dans de l’azote liquide et les stocker à -80 °C.

2. Purification du NBD-PHFAPP

REMARQUE: La procédure de production et d’étiquetage du PHFAPP est identique à celle du NBD-C2Lact jusqu’au transfert de la solution nbD-C2Lact à une unité de filtration centrifuge à l’étape 1.3.4. À partir de cette étape, suivez le protocole décrit ci-dessous.

  1. Après l’étape de concentration, conserver 2 mL de NBD-PHFAPP à 4 °C dans l’obscurité pendant 1 jour au plus avant d’effectuer la chromatographie d’exclusion de taille. Avant la chromatographie d’exclusion de taille, vérifier qu’il n’y a pas de dépôt orange (agrégation pendant la concentration) au fond du tube. Si tel est le cas, centrifuger l’échantillon à 540 000 × g pendant 10 min à 4 °C et purifier le surnageant par chromatographie d’exclusion de taille.
    REMARQUE: La chromatographie d’exclusion de taille est réalisée sur une colonne remplie de copolymère dextran-acrylamide réticulé (voir la table des matériaux),préalablement équilibrée avec un tampon TND, à l’aide d’un système de chromatographie liquide à protéines rapides (voir la table des matériaux). La colonne doit être protégée de la lumière. Un débit de 1 mL/min a été utilisé, et l’élution de la construction NBD-PHFAPP a été suivie par l’enregistrement de l’absorbance à λ=280 (protéine) et 480 nm (NBD) à la sortie de la colonne.
    1. Injecter l’échantillon NBD-PHFAPP chargé dans une boucle d’injection de 2 mL sur la colonne et prélever immédiatement 2,5 mL de fractions d’éluat.
  2. Analyser toutes les fractions qui correspondent au pic principal détecté à 280 et 480 nm sur un gel SDS-PAGE à 15%. Mélanger un échantillon de 25 μL de chaque fraction avec 15 μL de tampon d’échantillon Laemmli avant de chauffer et de charger sur le gel.
    REMARQUE: Un pic principal, qui est détecté simultanément à λ = 280 et 480 nm, apparaît une fois qu’un volume de tampon d’environ 150 mL est passé à travers la colonne.
  3. Regrouper les fractions qui contiennent exclusivement la protéine NBD-PHFAPP (~12,2 kDa) et ajouter du glycérol à une concentration finale de 10% (v / v). Concentrer l’échantillon à l’aide d’une unité de filtration centrifuge avec un MWCO de 3 kDa à un volume final de 1 mL en utilisant une vitesse de centrifugation de 2300 × g.
  4. Préparez des aliquotes et enregistrez un spectre d’absorbance tel que décrit pour NBD-C2Lact. Utilisez un coefficient d’extinction ε= 29 450 M-1,cm -1 pour déterminer la concentration de la protéine en fonction de l’absorbance mesurée à λ=280 nm.

3. Préparation de liposomes pour l’extraction ou le transfert de PS et de PI(4)P

REMARQUE: Effectuez toutes les étapes à température ambiante, sauf indication contraire. Manipulez les solvants organiques, le rotavapor et l’azote liquide avec prudence.

  1. Préparer frais, filtré et dégazé 50 mM 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique (HEPES)-hydroxyde de potassium (KOH), pH 7,4, tampon d’acétate de potassium (HK) de 120 mM.
  2. Pour chaque type de liposome, prendre des quantités précises de différents lipides à partir de solutions d’origine et les mélanger dans une fiole en verre en forme de poire de 25 mL (Tableau 1). Ajouter le chloroforme pur pour ajuster le volume de chaque mélange à 1 mL. Étiquetez chaque flacon avec le nom du liposome. Envelopper les flacons contenant un mélange lipidique dopé au Rhod-PE avec du papier d’aluminium.
  3. Placez la fiole sur un évaporateur rotatif. Sécher les lipides sous vide et à 25 °C pendant au moins 30 min à une vitesse de rotation de 500 tr/min. Pour les films lipidiques contenant du PI(4)P, pré-prévenir le ballon à 32-34 °C pendant 5 min, sous une rotation douce, pour bien mélanger le PI(4)P avec les autres lipides avant de créer du vide dans le flacon pour éliminer le solvant, ce qui laissera derrière lui un film de lipides secs sur la paroi du flacon.
  4. Débranchez la fiole de l’évaporateur et placez-la dans une chambre à vide pendant 45 minutes pour éliminer les traces restantes de solvant. Remplissez la fiole avec 2 mL de tampon HK et ajoutez quelques billes de verre de 4 mm de diamètre à la solution. Tourbillonnez doucement la fiole pendant 2 min pour ressuspend les lipides et préparer des vésicules lipidiques multilamellaires (MLE) avec une concentration lipidique de 4 mM. Préparer des aliquotes de 0,5 mL de MLV dans des tubes de microcentrifugation à bouchon à vis de 1,5 mL.
  5. Congeler-décongeler les tubes 5x (en utilisant de l’azote liquide et un bain-marie à 37 °C, respectivement). Extrudez les liposomes ou stockez-les à -20 °C.
  6. Utilisez une mini-extrudeuse pour préparer les liposomes(c’est-à-dire les grandes vésicules unilamellaires) des MLV conformément aux directives du fabricant. Utilisez un filtre en polycarbonate avec des pores cylindriques uniformes de 200 nm de diamètre.
  7. Pour préparer chaque type de liposome, extruder au moins 250 μL de la suspension correspondante de MLV. Conserver les liposomes extrudés à 4 °C et dans l’obscurité s’ils contiennent du Rhod-PE. Utilisez les liposomes dans les 2 jours.
Composition lipidique (mol/mol) Lipide
Nom du liposome DoPC
(25 mg/mL)		 PAPA
(10 mg/mL)		 16:0 Liss Rhod-PE
(1 mg/mL)		 C16:0/C16:0-PI(4)P
(1 mg/mL)
Essais d’extraction Liposome 2 mol% PS PC/PS 98/2 247 μL 12,5 μL
Liposome 2 mol% PI(4)P PC/PI(4)P 98/2 247 μL 153 μL
Liposome PC PC 100 252 μL
Essais de transport LA  PC/PS/Rhod-PE 93/5/2 234 μL 31,4 μL 200 μL
LA sans PS PC/Rhod-PE 98/2 247 μL 200 μL
LB  PC/PI(4)P 95/5 237 μL 383 μL
LB sans PI(4)P PC 100 252 μL
LA-Eq PC/PS/PI(4)P/Rhod-PE 93/2.5/2.5/2 234 μL 15,7 μL 200 μL 191 μL
LB-Eq PC/PS/PI(4)P 95/2.5/2.5 239 μL 15,7 μL 191 μL

Tableau 1 : Volumes de solutions lipidiques à mélanger pour la préparation des liposomes. Abréviations: PS= phosphatidylsérine; PC = phosphatidylcholine; PI(4)P = phosphatidylinositol 4-phosphate; Rhod-PE = phosphatidyléthanolamine marquée à la rhodamine; DOPC = dioléoylphosphatidylcholine; POPS= 1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycero-3-phospho-L-sérine; 16:0 Liss Rhod-PE = 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoéthanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl).

4. Mesure de l’extraction PS ou PI(4)P

REMARQUE: Les mesures doivent être effectuées à l’aide d’une plaque noire de 96 puits et d’un lecteur de plaque de fluorescence équipé de monochromateurs: un pour l’excitation de fluorescence et un pour l’émission, avec une bande passante variable.

  1. Préparer un tampon HK frais, filtré et dégazé complété par 1 mM de MgCl2 (tampon HKM). Préparer des liposomes PC purs et des liposomes PC dopés avec 2 mol% PS ou 2 mol% PI(4)P (concentration lipidique finale de 4 mM, voir tableau 1).
    REMARQUE: Gardez les tubes remplis de la suspension de liposomes extrudés à température ambiante tout au long de l’expérience et gardez les protéines sur la glace. De plus, protégez les capteurs lipidiques de la lumière.
  2. Pour le dosage d’extraction PS, dans un puits, mélanger des liposomes contenant 2 mol% de PS (concentration lipidique finale de 80 μM, concentration de PS accessible de 0,8 μM) avec duLAct NBD-C2 (concentration finale de 250 nM) dans un volume final de 100 μL. Remplissez un deuxième puits avec la même quantité de liposome (80 μM, 2 mol% PS) et de NBD-C2Lact (250 nM) mélangé à 3 μM LTP (Osh6p comme témoin positif ou protéine d’intérêt).
    REMARQUE: Un temps d’incubation de 5 min est suffisant pour qu’Osh6p obtienne une extraction des lipides.
  3. Remplissez un troisième puits avec NBD-C2Lact (250 nM) mélangé à des liposomes PC purs (80 μM). Remplissez un quatrième puits uniquement avec des liposomes PC purs (80 μM). Répétez les étapes 4.2 à 4.3 pour préparer trois séries supplémentaires de quatre puits.
  4. Pour chaque puits, enregistrez un spectre NBD de 505 à 650 nm (bande passante 5 nm) lors de l’excitation à 490 nm (bande passante 5 nm) à 25 °C. Pour chaque série, soustrayez le spectre enregistré avec seulement des liposomes des autres spectres.
    NOTE: F et Fmax correspondent à l’intensité à 536 nm mesurée avec des liposomes contenant du PS en présence ou en l’absence de LTP, respectivement, tandis que F0 est l’intensité à la même longueur d’onde avec les liposomes PC purs. Pour chaque série, le pourcentage de PS accessible qui est extrait par la protéine est donné en utilisant la formule suivante.
    100 × (1-((F-F0)/(Fmax-F0))) (4)
  5. Pour le test d’extraction PI(4)P, préparer des liposomes dopés à 2 mol% PI(4)P, et effectuer des mesures avec la sonde NBD-PHFAPP. Effectuez des expériences de contrôle et déterminez le pourcentage d’extraction de la même manière que celle décrite ci-dessus.
    REMARQUE: La concentration en liposomes et en protéines est identique à celle utilisée dans le test d’extraction PS.

5. Mesure en temps réel du transport PS

REMARQUE: Un fluorimètre standard (format 90 °) équipé d’un support de cellule à température contrôlée et d’un agitateur magnétique est utilisé pour enregistrer la cinétique de transfert lipidique. Pour acquérir des données avec précision, il est essentiel de maintenir en permanence l’échantillon à la même température (réglée entre 25 et 37 °C selon l’origine de la protéine(par exemple,levure ou humain)) et de le remuer constamment. Le protocole décrit ci-dessous est destiné à la mesure du transport des lipides dans un échantillon de 600 μL contenu dans une cellule de quartz cylindrique.

  1. Préparer un tampon HKM fraîchement dégazé et filtré. Conservez les tubes contenant des liposomes extrudés à température ambiante. Enveloppez les tubes contenant des liposomes avec du Rhod-PE dans du papier d’aluminium et/ou conservez-les dans une boîte opaque pour éviter tout photobleachage.
  2. Ajustez les monochromateurs d’excitation et d’émission à λ = 460 nm (avec une bande passante courte (1-3 nm)) et à λ = 530 nm (avec une large bande passante (≥ 10 nm)), respectivement. Réglez le temps d’acquisition à 25 min avec une résolution temporelle ≤ 1 s.
  3. Dans la cuvette de quartz, diluer 30 μL de la suspension de liposomes LA et un volume de solution mère NBD-C2Lact dans un tampon HKM pré-averti pour préparer un échantillon de 570 μL contenant 200 μM de lipides totaux et 250 nM de NBD-C2Lact. Ajoutez une petite barre d’agitation magnétique et placez la cuvette dans le support du fluoromètre.
  4. Une fois que l’échantillon est équilibré thermiquement (après 3-5 min), déclenchez la mesure. Après 1 min, ajouter 30 μL de suspension de liposomes LB (concentration finale de 200 μM de lipides totaux) à l’échantillon. Après 3 min, injecter du LTP dans l’échantillon de sorte que la concentration finale du LTP soit de 200 nM, et acquérir le signal pour les 21 min restantes.
  5. Effectuer une expérience parallèle pour normaliser le signal NBD. Mélanger 30 μL de suspension de liposomes LA-Eq avec 250 nM NBD-C2Lact dans un tampon HKM (volume final de 570 μL). Après 1 min, injecter 30 μL de suspension de liposome LB-Eq.
    REMARQUE: La composition lipidique des liposomes LA-Eq et LB-Eq est similaire à celle des liposomes LA et LB utilisés dans le test de transfert, sauf que chacun d’eux contient 2,5 mol% PS et 2,5 mol% PI(4)P. En conséquence, le signal NBD mesuré, appelé FEq, correspond au signal qui doit être mesuré si PS a été complètement équilibré entre les liposomes LA et LB par un processus de transfert.
  6. Convertir les courbes cinétiques mesurées avec un LTP d’intérêt pour déterminer la quantité de PS (en μM) transférée des liposomes LA en LB au fil du temps. Normalisez chaque point de données (F) de la courbe à l’aide de la formule suivante.
    Norme F = (F-F0)/(FEq-F0) (5)
    dans lequel F0 correspond au signal NBD juste avant l’ajout d’un LTP, et FEq est le signal mesuré à l’étape 5.5.
    NOTE: La quantité de PS (en μM) transférée des liposomes LA à LB correspond à 2,5 ×normeF , étant donné que l’équilibre correspond à une situation où la moitié des molécules PS accessibles, contenues dans la feuillet externe des liposomes LA, (c’est-à-dire, correspondant à 5 mol% de 0,5 × 200 μM de lipides totaux) a été transférée dans les liposomes LB.

6. Mesure en temps réel du transport PI(4)P

  1. Réglez le fluorimètre (longueur d’onde d’excitation et d’émission, bande passante, temps d’acquisition, résolution temporelle) comme fait pour le test de transfert PS. De même, utilisez le même tampon, la même cuvette et les mêmes liposomes pour effectuer les expériences sous agitation constante à la même température.
  2. Dans la cuvette, mélanger 30 μL de suspension de liposomes LB et de NBD-PHFAPP avec un tampon HKM pré-averti pour obtenir un volume final de 570 μL (200 μM de lipides totaux, 250 nM NBD-PHFAPP). Une fois l’équilibre thermique de l’échantillon atteint, commencez la mesure et, après 1 min, injectez 30 μL de suspension de liposome LA. Après 3 min, injecter le LTP d’intérêt (concentration finale de 200 nM), et enregistrer le signal.
  3. Effectuez une deuxième expérience pour normaliser le signal NBD. Mélanger 30 μL de suspension de liposomeS LB-Eq avec 250 nM NBD-PHFAPP dans 570 μL de tampon HKM. Après 1 min, injecter 30 μL de suspension de liposome LA-Eq.
    NOTE: Ici, le signal NBD, appelé FEq, correspond à celui qui doit être mesuré si PI(4)P était entièrement équilibré entre les liposomes LA et LB.
  4. Convertir les courbes cinétiques pour déterminer la quantité de PI(4)P (en μM) transférée des liposomes LB en LA au fil du temps. Chaque point de données (F) est normalisé en utilisant la formule 5 dans laquelle F0 correspond au signal NBD avant l’ajout d’un LTP, et FEq est le signal mesuré à l’étape 6.3.
    NOTE: La quantité de PI(4)P (en μM) transférée des liposomes LB à LA correspond à 2,5 ×normeF , étant donné que l’équilibre correspond à une situation où la moitié du PI(4)P contenu dans la feuillet externe des liposomes LB (c’est-à-dire 0,5 × 5 μM) a été transférée dans les liposomes LA.

7. Analyse des courbes cinétiques

  1. Quantifier la mesure dans laquelle un LTP est efficace en déterminant la vitesse à laquelle ce LTP transfère les lipides d’une population de liposomes à l’autre dans les premières secondes suivant son injection dans la cuvette.
    1. Effectuer une régression linéaire des premiers points de données de la cinétique de transfert pour obtenir une pente. Divisez la valeur de pente par la concentration de LTP dans le mélange réactionnel pour déterminer le nombre de molécules lipidiques transférées par protéine par unité de temps (min ou s).

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Representative Results

Figure 1
Figure 1: Description des capteurs lipidiques fluorescents et des essais in vitro. (A) Modèles tridimensionnels de NBD-C2Lact et NBD-PHFAPP basés sur la structure cristalline du domaine C2 de la lactadhérine bovine (ID PDB: 3BN648) et la structure RMN du domaine PH de la protéine FAPP1 humaine (ID PDB: 2KCJ46). Une fraction N,N'-diméthyl-N-(thioacétyl)-N'-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)éthylènediamine, construite manuellement et énergétiquement minimisée, a été greffée sur la fonction thiol des résidus C352 (NBD-C2Lact)et C13 (NBD-PH FAPP)(représentés sous forme de sphères, avec du carbone en vert, de l’azote en bleu, de l’oxygène en rouge, du soufre en jaune et de l’hydrogène en blanc). La surface du site de liaison aux lipides de chaque sonde était colorée en bleu. (B) Essais d’extraction. Dans le test d’extraction PS, des liposomes PC/PS (98/2 mol/mol) ont été incubés avec 250 nM NBD-C2Lact. En l’absence d’extraction, la sonde est fortement liée aux liposomes, ce qui entraîne un décalage bleu de la fluorescence NBD et une augmentation de son intensité d’émission. Si l’extraction de PS s’est produite en présence d’un LTP(par exemple, Osh6p), la sonde s’est dissociée des liposomes et sa fluorescence était plus faible. Dans le test d’extraction PI(4)P, les liposomes ont été dopés avec 2 mol% PI(4)P, et 250 nM NBD-PHFAPP ont été utilisés. (C) Essais de transport lipidique à base de FRET. Dans le test de transport PS, des liposomes PC/PS/Rhod-PE (93/5/2 mol/mol, LA)ont été incubés avec 250 nM NBD-C2Lact. Les liposomes PC (LB),dopés ou non avec 5 mol% PI(4)P, et Osh6p ont été ajoutés séquentiellement à t = 1 min et t = 4 min, respectivement. Si le transport PS se produit, cela provoque une déchantisation du signal NBD correspondant à la translocation de NBD-C2Lact des liposomes LA à LB. Dans le test de transport PI(4)P, des liposomes LB dopés à 5 mol% PI(4)P ont été incubés avec 250 nM NBD-PHFAPP. Des liposomes PC (LA)dopés ou non avec 5 mol% de PS ont été ajoutés. Si le transport PI(4)P se produit, cela provoque une trempe du signal NBD due à la translocation de NBD-PHFAPP des liposomes LB à LA. Abréviations : NBD = 7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol fluorophore; RMN = résonance magnétique nucléaire; FAPP1 = protéine 1 à quatre adaptateurs de phosphate; PDB = Banque de données sur les protéines; PS= phosphatidylsérine; PC = phosphatidylcholine; LTP = protéine de transfert lipidique; Osh6p = protéine homologue 6 de la protéine de liaison à l’oxystérol (OSBP); PI(4)P = phosphatidylinositol 4-phosphate; FRET = transfert d’énergie de résonance de fluorescence; Rhod-PE = phosphatidyléthanolamine marquée à la rhodamine; LA liposomes = liposomes composés de PC, dopés à 2 mol% de Rhod-PE, et contenant ou non 5 mol% de PS; Liposomes LB = liposomes incorporant 5 mol% PI(4)P. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

La figure 2A montre une analyse SDS-PAGE des produits de différentes étapes menant à la purification de C2Lact. La voie 1 montre le profil protéique des bactéries lysées exprimant GST-C2Lact (~44,8 kDa), tandis que les voies 2 et 3 montrent respectivement les profils protéiques des débris surnageants et bactériens après ultracentrifugation. La comparaison de ces voies montre que lelact GST-C2 a été récupéré dans le surnageant et peut donc être isolé à l’aide de billes d’agarose liées au glutathion. Les voies 4 et 5 montrent les profils protéiques du surnageant après incubation avec des perles et des lavages récupérés par écoulement par gravité, tandis que la voie 6 montre le profil des protéines qui ont été retenues sur les perles. Une analyse de ces voies indique que presque toutes les voies GST-C2Lact ont été récupérées sur les perles.

Les voies 8-12 montrent la présence d’une bande majeure correspondant à C2Lact (~17,9 kDa) chez les surnageants récupérés par lavages successifs des billes après traitement à la thrombine. La voie 13 indique que la GST-C2Lactnon clivée, ainsi que la TPS (~26,9 kDa), sont restées liées à des perles après ce traitement. La comparaison de ces voies indique que la procédure de clivage, bien qu’elle ne soit pas efficace à 100%, a donné du C2Lact qui a ensuite été marqué par fluorescence. La figure 2B montre un spectre d’absorbance ultraviolette (UV) visible de C2Lact marqué avec NBD. Comme la construction est pure à 100%, ces résultats confirment que toutes les molécules de C2Lact ont été marquées avec un groupe NBD basé sur la densité optique mesurée à 280 nm (Trp) et 495 nm (NBD). La pureté duLAct NBD-C2 et sa fluorescence ont été déterminées par analyse SDS-PAGE (Figure 2C).

Figure 2
Figure 2: Purification de lalacte NBD-C2. ( A )L’analyseSDS-PAGE a été utilisée pour vérifier la présence de la protéine à différentes étapes de la procédure de purification avant l’étiquetage. Les pointes de flèche indiquent la position du domaineC2 Lact (pointe de flèche rouge), de la TPS seule (pointe de flèche grise) et de la constructionde la CCT GST-C2 (pointe de flèche noire). (B) Spectre d’absorbance UV-visible de NBD-C2Lact. (C) Analyse SDS-PAGE duLActNBD-C2 purifié. La première image a été acquise sous éclairage UV sans coloration et révèle la présence de la construction NBD-C2Lact car elle émet de la fluorescence. La deuxième image montre le même gel après une procédure de coloration protéique (voir le Tableau des matériaux). Abréviations : NBD = 7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol fluorophore; NBD-C2Lact = N,N'-diméthyl-N-(thioacétyl)-N'-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)fraction éthylènediamine liée à la fonction thiol du résidu C352 d’une version remaniée du domaine C2 de la lactadhérine bovine (ID PDB: 3BN648); PDB = Banque de données sur les protéines; SDS-PAGE = électrophorèse sur gel de polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium; TPS = glutathion S-transférase; MW = marqueur de taille de poids moléculaire; UV = ultraviolet. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La figure 3 montre les résultats des essais d’extraction PS et PI(4)P à l’aide d’Osh6p. Lorsqu’il n’était incubé qu’avec des liposomes contenant 2 mol% de PS, la fluorescence de NBD-C2Lact était maximale car le fluorophore NBD était inséré dans la membrane(c’est-à-dire un contexte hydrophobe), indiquant que le capteur était lié à la membrane. En présence d’Osh6p, la fluorescence était plus faible et comparable à celle mesurée avec des liposomes PC purs (Figure 3A). La normalisation des valeurs d’intensité à 536 nm a indiqué qu’environ 75 % du PS accessible a été extrait. Dans le deuxième essai, NBD-PHFAPP a été mélangé avec des liposomes contenant 2 mol% PI(4)P. Le signal NBD était élevé sans Osh6p, mais faible lorsque Osh6p était présent et était similaire à celui mesuré avec des liposomes sans PI(4)P(Figure 3B). Une analyse de l’intensité a révélé qu’environ 100 % du PI(4)P accessible a été extrait par le LTP.

Figure 3
Figure 3: Essais d’extraction. (A) Spectres de fluorescence de NBD-C2Lact (250 nM) mesurés lors de l’excitation à 460 nm en présence de liposomes (80 μM, 2 mol% PS) en l’absence ou en présence de 3 μM Osh6p. Les spectres de référence ont été enregistrés avec des liposomes PC purs incubés ou non avec NBD-C2Lact (panneau de gauche). Plusieurs spectres ont été enregistrés à partir de différentes séries de puits, corrigés en soustrayant le signal de diffusion de fond des liposomes DOPC seuls et moyennés (n = 4, ± SEM). Le pourcentage de PS accessible qui a été extrait est indiqué (panneau de droite). (B) Spectres de fluorescence de NBD-PHFAPP (250 nM) mélangés à des liposomes (80 μM, 2 mol% PI(4)P) en l’absence ou en présence de 3 μM Osh6p. Les spectres de référence enregistrés avec les liposomes PC en présence et en l’absence du capteur sont affichés (panneau de gauche). Plusieurs spectres ont été enregistrés à partir de différentes séries de puits, corrigés en soustrayant le signal de diffusion de fond des liposomes DOPC seuls et moyennés (n = 4, ± SEM). Le pourcentage de PI(4)P accessible qui a été extrait est indiqué (panneau de droite). Abréviations : NBD = 7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol fluorophore; NBD-C2Lact = N,N'-diméthyl-N-(thioacétyl)-N'-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)fraction éthylènediamine liée à la fonction thiol du résidu C352 d’une version remaniée du domaine C2 de la lactadhérine bovine (ID PDB: 3BN648); PDB = Banque de données sur les protéines; PS= phosphatidylsérine; PC = phosphatidylcholine; DOPC = dioléoylphosphatidylcholine; Osh6p = protéine homologue 6 de la protéine de liaison à l’oxystérol (OSBP); PI(4)P = phosphatidylinositol 4-phosphate; SEM = erreur-type de la moyenne; a.u. = unités arbitraires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La figure 4A montre les résultats typiques d’un test de transfert PS utilisant Osh6p comme LTP. Au moment zéro, NBD-C2Lact a été mélangé avec des liposomes LA contenant 5 mol% 16:0/18:1-PS (POPS) et 2 mol% Rhod-PE dans un volume de 570 μL de tampon HKM à 30 °C. Comme la sonde était liée aux liposomes LA, son signal a été éteint en raison de FRET avec Rhod-PE présent dans ces liposomes. Après une minute, des liposomes LB sans Rhod-PE (30 μL) ont été ajoutés; on s’attendait à ce que cela ne provoque qu’un léger changement dans le signal en raison de la diffusion de la lumière par cette deuxième population de liposomes et/ou d’un effet de dilution. L’intensité du signal après addition des liposomes LB correspond à F0. L’injection de quelques μL d’une solution mère d’Osh6p (typiquement 40 μM) pour diluer 200 nM de la protéine dans le mélange réactionnel a provoqué une lente augmentation du signal NBD due à la décrochage du fluorophore lorsque le PS a été transporté des liposomes LA vers LB, favorisant ainsi la translocation du NBD-C2Lact.

Lorsque les liposomes LB contenaient 5 mol% PI(4)P, la déchantie était beaucoup plus rapide, car PS était transféré plus rapidement par les liposomes Osh6p à LB en raison du contre-échange de PS avec PI(4)P par la LTP (deuxième courbe). La troisième courbe correspond à une expérience dans laquelle NBD-C2Lact a été mélangé avec des quantités égales de liposomes LA-Eq et LB-Eq. Le signal était supérieur à F0 et correspondait à une situation où la sonde était uniformément liée aux liposomes LA et LB, reflétant ainsi une situation où PS était complètement équilibré entre les deux populations de liposomes. FEq a été calculé en faisant la moyenne de la valeur du signal mesurée dans les 5 dernières minutes de l’expérience.

Figure 4
Figure 4: Cinétique typique du transport PS mesurée avec Osh6p et courbe de référence. (A) Les liposomes LB dépourvus de LIPIDES TOUX PI(4)P (200 μM) et Osh6p (200 nM) ont été ajoutés séquentiellement à une cuvette contenant des liposomes NBD-C2Lact (250 nM) et LA (200 μM) dopés avec 5 mol% PS et 2 mol% Rhod-PE (courbe gauche). La même expérience a été réalisée avec des liposomes LB dopés à 5 mol% PI(4)P (courbe du milieu). Pour déterminer FEq,NBD-C2Lact (250 nM) a été prémélangé avec des liposomes LA-Eq; ensuite, des liposomes LB-Eq ont été ajoutés (courbe de droite). (B) Courbes de transport PS moyenées déterminées après la normalisation de plusieurs mesures effectuées à l’aide de liposomes LB avec ou sans PI(4)P (moyenne ± SEM, n = 3). (C) Taux de transfert PS initiaux (moyenne ± SEM, n =3). Abréviations : NBD = 7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol fluorophore; NBD-C2Lact = N,N'-diméthyl-N-(thioacétyl)-N'-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)fraction éthylènediamine liée à la fonction thiol du résidu C352 d’une version remaniée du domaine C2 de la lactadhérine bovine (ID PDB: 3BN648); PDB = Banque de données sur les protéines; PS= phosphatidylsérine; Osh6p = protéine homologue 6 de la protéine de liaison à l’oxystérol (OSBP); PI(4)P = phosphatidylinositol 4-phosphate; Rhod-PE = phosphatidyléthanolamine marquée à la rhodamine; LA liposomes = liposomes composés de phosphatidylcholine, dopés à 2 mol% de Rhod-PE, et contenant ou non 5 mol% de PS; Liposomes LB = liposomes incorporant 5 mol% PI(4)P; F = fluorescence; F0 = fluorescence correspondant à NBD avant addition d’Osh6p; FEq = signal de fluorescence si PS est entièrement équilibré entre les liposomes LA et LB par un processus de transfert; SEM = erreur-type de la moyenne. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La figure 4B montre les courbes cinétiques moyennes du transfert PS des liposomes LA aux liposomes LB, dopés ou non dopés avec PI(4)P après la normalisation des données F en utilisant F0 et FEq comme valeurs de référence. Le taux de transport initial pour chaque expérience a été calculé en ajustant les points de données initiaux mesurés après l’injection de la protéine avec une fonction linéaire. La figure 4C montre le taux de transport PS initial moyen déterminé à partir de trois expériences distinctes utilisant des liposomes LB avec ou sans PI(4)P. Lorsque les liposomes LB contenaient 0 et 5 mol% PI(4)P, les taux étaient respectivement égaux à 1,4 et 15,8 PS.min-1 par molécule Osh6p. La figure 5A montre les résultats typiques d’un test de transfert PI(4)P utilisant Osh6p comme LTP, qui a été effectué avec les mêmes matériaux et conditions que ceux utilisés pour le test de transport PS.

Figure 5
Figure 5: Cinétique typique du transport PI(4)P mesurée avec Osh6p et courbe de référence. ( A )Desliposomes sans PS contenant 2 mol% de Rhod-PE (LA,200 μM de lipides totaux) et Osh6p (200 nM) ont été ajoutés séquentiellement à une cuvette contenant desliposomes NBD-PH FAPP (250 nM) et LB (200 μM) dopés à 5 mol% PI(4)P (courbe de gauche). La même expérience a été réalisée avec des liposomes LA dopés avec 5 mol% PS (courbe du milieu). Pour déterminer FEq,NBD-PHFAPP (250 nM) a été prémélangé avec des liposomes LB-Eq; puis, des liposomes LA-Eq ont été ajoutés (courbe de droite). (B) PI(4)Cinétique de transfert P déterminée après normalisation de plusieurs mesures de liposomes LA avec ou sans PS (moyenne ± SEM, n = 3). (C) Taux de transfert initiaux PI(4)P (moyenne ± SEM, n=3). Abréviations : NBD = 7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol fluorophore; NBD-PHFAPP = domaine d’homologie pleckstrine marqué NBD de la protéine 1 humaine adaptatrice à quatre phosphates (FAPP1, UniProt: Q9HB20, segment [1-100]); PS= phosphatidylsérine; Osh6p = protéine homologue 6 de la protéine de liaison à l’oxystérol (OSBP); PI(4)P = phosphatidylinositol 4-phosphate; Rhod-PE = phosphatidyléthanolamine marquée à la rhodamine; LA liposomes = liposomes composés de phosphatidylcholine, dopés à 2 mol% de Rhod-PE, et contenant ou non 5 mol% de PS; Liposomes LB = liposomes incorporant 5 mol% PI(4)P; F = fluorescence; F0 = fluorescence correspondant à NBD avant addition d’Osh6p; FEq = signal de fluorescence si PI(4)P est complètement équilibré entre les liposomes LA et LB par un processus de transfert; SEM = erreur-type de la moyenne. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Au moment zéro, NBD-PHFAPP a été mélangé avec des liposomes LB contenant 5 mol% PI(4)P dans un volume de 570 μL de tampon HKM. Parce que NBD-PHFAPP était lié aux liposomes LB, son signal était élevé. Après une minute, des liposomes LA (30 μL) ont été ajoutés, ce qui ne devrait provoquer qu’un léger changement dans le signal. L’intensité correspondait alors à F0. L’injection d’Osh6p (concentration finale de 200 nM) dans le mélange réactionnel a déclenché une trempe du signal NBD en raison de la translocation des molécules NBD-PHFAPP en liposomes LA lorsque PI(4)P a été transféré des liposomes LB aux liposomes LA. Lorsque les liposomes LA contenaient 5 mol% de POPS, la décrnchation était beaucoup plus rapide en raison d’un transfert PI(4)P plus rapide résultant de l’échange PS/PI(4)P. La troisième courbe correspond à une expérience dans laquelle NBD-PHFAPP a été mélangé avec des quantités égales de liposomes LA-Eq et LB-Eq.

Le signal était inférieur à F0 car il correspondait à une situation où la sonde était uniformément liée aux liposomes LA et LB, ce qui indiquait un équilibre complet de PI(4)P entre les liposomes. FEq a été calculé en faisant la moyenne de la valeur du signal mesurée dans les 5 dernières minutes de l’expérience. La figure 5B,C montre les courbes cinétiques moyennes obtenues après normalisation du signal et les taux de transfert initiaux moyens PI(4)P mesurés avec des liposomes LA dopés ou non dopés avec 5 mol% PS. Ici, il convient de noter que les deux ligands lipidiques ont été transportés plus rapidement et avec des vitesses similaires lorsque chaque lipide était initialement présent dans les membranes LA et LB, respectivement, ce qui indique que Osh6p est un échangeur PS / PI (4) P.

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Discussion

Les résultats de ces tests reposent directement sur les signaux des capteurs lipidiques fluorescents. Ainsi, la purification de ces sondes marquées à un rapport de 1:1 avec NBD et sans contamination fluorophore NBD libre est une étape critique de ce protocole. Il est également obligatoire de vérifier si le LTP examiné est correctement plié et non agrégé. La quantité de LTP testée dans les essais d’extraction doit être égale ou supérieure à celle des molécules PS ou PI(4)P accessibles pour mesurer correctement si cette LTP extrait efficacement ces lipides. En effet, NBD-C2Lact et NBD-PHFAPP se lient respectivement à PS et PI(4)P, suivant une courbe de liaison de saturation classique. Compte tenu de leurs affinités respectives pour PS et PI(4)P, ces sondes restent largement liées aux liposomes même si les liposomes contiennent des traces résiduelles de ces ligands. Cela peut conduire à la conclusion erronée qu’un LTP n’extrait pas efficacement ces lipides. Le protocole repose sur des sous-espèces PC, PS et PI(4)P standard et disponibles dans le commerce, qui sont respectivement 18:1/18:1-PC, 16:0/18:1-PS et 16:0/16:0-PI(4)P. Effectuer des expériences utilisant des espèces lipidiques avec d’autres chaînes acyliques peut donner des résultats différents, comme indiqué précédemment12,35.

Dans les essais de transfert, si la composition lipidique en vrac (sans tenir compte de PS ou PI(4)P) des liposomes LA et LB doit être modifiée, il est essentiel d’effectuer également les expériences de contrôle en utilisant des liposomes LA-Eq et LB-Eq avec une composition en vrac similaire à celle des liposomes LA et LB, respectivement. Le même principe s’applique aux essais d’extraction. Les domaines de liaison aux lipides fluorescents génétiquement codés sont largement utilisés pour analyser la distribution des lipides à l’intérieur des cellules44. La prudence est recommandée lors de l’analyse d’expériences telles que l’association de ces sondes lipidiques avec la membrane, bien que principalement motivée par la présence du lipide ciblé, peut être influencée par d’autres paramètres (densité des lipides anioniques, emballage lipidique) qui diffèrent entre les compartiments cellulaires. Dans ces essais in vitro, la composition des liposomes est beaucoup plus simple que celle des membranes cellulaires : ils sont pour la plupart constitués de PC, un lipide zwitterionique, et exposent ainsi une surface plutôt inerte qui n’impacte pas la façon dont PS et PI(4)P sont reconnus par leur capteur correspondant. PHFAPP peut être utilisé en présence de lipides anioniques, tels que le PS, l’acide phosphatidique (PA), et le PI32,et C2Lact ne reconnaît pas le PI(4)P12; ces deux observations permettent des mesures non biaisées de l’échange PS/PI(4)P. NBD-PHFAPP n’est pas influencé par le stérol43.

Cependant, on ne sait pas si ces sondes, en particulier NBD-C2Lact, peuvent être utilisées avec des liposomes présentant des caractéristiques extrêmes(par exemple, emballage lipidique très faible ou élevé, surface chargée très négativement, présence de domaines lipidiques). Malgré cette limitation potentielle en ce qui concerne la composition des liposomes, ces tests de transfert basés sur des capteurs fluorescents présentent d’énormes avantages par rapport à d’autres méthodes. Premièrement, ils ne reposent pas sur des PS et des PI(4)P marqués par fluorescence qui portent un groupe plus volumineux et ne sont probablement pas correctement pris en compte par la poche de liaison des LTP. Deuxièmement, ces essais offrent une bien meilleure résolution temporelle que les méthodes basées sur la séparation des liposomes (tests basés sur la radioactivité45 ou spectrométrie de masse33),et il convient de noter que les PI(4)P et PS radiomarqués ne sont pas disponibles dans le commerce. La capacité d’une protéine à transférer PS ou PI(4)P n’est pas affectée par l’association des capteurs fluorescents avec les liposomes. En effet, si l’on considère la quantité de NBD-C2Lact ou NBD-PHFAPP et celle de PS et PI(4)P dans la notice externe des liposomes accessible au LTP, seuls 5% de PS ou PI(4)P sont associés à la sonde lors d’une mesure cinétique.

De plus, seulement 0,55-0,86% de la surface de la membrane est couverte par la sonde, compte tenu de la surface totale des liposomes (liposomes LA+ LB; 5,1 × 1016 nm2 avec une surface de 0,7 nm2 par lipide), la surface de la membrane qu’une molécule individuelle de C2 ou de PH peut occuper (≈3,1 et 4,8 nm2, respectivement, estimée à partir des références46, 47,48) et leur concentration (250 nM). Ainsi, les principes qui sous-tendent ces essais sont adaptés pour analyser correctement les aspects cinétiques et mécanistes des LTP. Comme mentionné dans l’introduction, les altérations de l’activité de l’ORP5/8 peuvent entraîner des dysfonctionnements cellulaires49. Par exemple, le caractère invasif des cellules cancéreuses du pancréas semble dépendre du niveau d’expression de l’ORP5. De plus, il existe une causalité entre les niveaux élevés d’expression de l’ORP5 et le mauvais pronostic du cancer du pancréas humain. Un niveau élevé d’expression d’ORP5 est également détecté dans les tissus tumoraux pulmonaires, et plus particulièrement dans les cas métastatiques. Fait intéressant, la capacité de l’ORP5 à transférer les lipides pourrait expliquer pourquoi il favorise la prolifération et la migration cellulaires.

ORP5 régule à la hausse la cible mammalienne du complexe de rapamycine 1 (mTORC1), qui joue un rôle central dans la survie et la prolifération cellulaires, probablement parce qu’il améliore l’activité d’Akt, un activateur en amont de mTORC1, en fournissant au PM du PS. Globalement, ces observations suggèrent que l’ORP5 pourrait être une cible pharmacologique intéressante, et que ces tests in vitro pourraient servir à dépister des molécules capables d’inhiber son activité. Ce test peut également aider à mieux définir si d’autres membres de la famille ORP/Osh sont des échangeurs PS/PI(4)P. Notamment, ORP10 s’est avéré encapsuler le PS in vitro et transférer le PS dans les sites de contact ER-Golgi27,50, mais on ne sait toujours pas s’il agit comme un échangeur PS / PI (4) P. En outre, ces protocoles peuvent servir à explorer la capacité des LTP appartenant à d’autres familles à transporter PI(4)P, comme cela a été récemment montré avec les protéines stéroïdogènes de type transfert régulateur aigu10, ou PS. De plus, NBD-PHFAPP a été utilisé pour suivre la capacité de LTP à transporter PI(4,5)P2 entre liposomes, car il reconnaît ce PIP10, 35. Enfin, cette stratégie pourrait être adaptée pour mesurer d’autres procédés d’extraction ou de transport in vitro en utilisant d’autres domaines de liaison aux lipides (parexemple, un PI-PLC non catalytique pour détecter PI51,un fragment de protéine 20 spécifique à la sporulation pour détecter PA52,le domaine 4 (D4) de la perfringolysine O pour détecter le stérol53).

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflits d’intérêts.

Acknowledgments

Nous sommes reconnaissants à la Dre A. Cuttriss pour sa relecture attentive du manuscrit. Ces travaux sont financés par la subvention ExCHANGE de l’Agence nationale de la recherche Français (ANR-16-CE13-0006) et par le CNRS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 L-cysteine ≥97 % (FG)  Sigma W326305-100G Prepare a 10 mM L-cysteine stock solution in water. Aliquots are stored at -20 °C
2 mL Amber Vial, PTFE/Rub Lnr, for lipids storage in CHCL3 Wheaton W224681
4 mm-diameter glass beads Sigma Z265934-1EA
50 mL conical centrifuge tube Falcon
ÄKTA purifier GE healthcare FPLC
Aluminium foil
Amicon Ultra-15 with a MWCO of 3 and 10 kDa Merck UFC900324, UFC901024
Amicon Ultra-4 with a MWCO of 3 and 10 kDa Merck UFC800324, UFC801024
Ampicillin Prepare a 50 mg/mL stock solution with filtered and sterilized water and store it at -20 °C.
Bestatin Sigma B8385-10mg
BL21 Gold Competent Cells Agilent
C16:0 Liss  (Rhod-PE) in CHCl3 (1 mg/mL) Avanti Polar Lipids 810158C-5MG
C16:0/C16:0-PI(4)P   Echelon Lipids P-4016-3 Dissolve 1 mg of C16:0/C16:0-PI(4)P powder in 250 µL of MeOH and 250 µL of CHCl3. Then complete with CHCl3 to 1 mL. The solution must become clear.
C16:0/C18:1-PS (POPS) in CHCl3 (10 mg/mL) Avanti Polar Lipids 840034C-25mg
C18:1/C18:1-PC (DOPC) in CHCl3 (25 mg/mL) Avanti Polar Lipids 850375C-500mg
CaCl2  Sigma Prepare 10 mM CaCl2 stock solution in water.
Cell Disruptor Constant Dynamics
Chloroform (CHCl3) RPE-ISO Carlo Erba 438601
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail Roche 5056489001
Deionized (Milli-Q) water
Dimethylformamide (DMF), anhydrous, >99% pure
DNAse I Recombinant, RNAse free, in powder Roche 10104159001
DTT Euromedex EU0006-B Prepare 1 M DTT stock solution in Milli-Q water.  Prepare 1 mL aliquots and store them at -20 °C. 
Econo-Pac chromatography columns (1.5 × 12 cm). Biorad 7321010
Electroporation cuvette 2 mm Ozyme EP102
Electroporator Eppendorf 2510 Eppendorf
Fixed-Angle Rotor Ti45 and Ti45 tubes Beckman Spinning the batcerial lysates
Glass-syringes (10, 25, and 50 µL) for fluorescence experiment Hamilton
Glass-syringes (25 , 100, 250, 500, and 1000 µL) to handle lipid stock solutions Hamilton 1702RNR, 1710RNR, 1725RNR, 1750RN type3, 1001RN
Glutathione Sepharose 4B beads GE Healthcare 17-0756-05
Glycerol (99% pure) Sigma G5516-500ML
Hemolysis tubes with a cap
HEPES , >99 % pure Sigma H3375-500G
Illustra NAP 10 desalting column GE healthcare GE17-0854-02
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)  Euromedex EU0008-B Prepare 1 M IPTG stock solution in Milli-Qwater. Prepare 1 mL aliquots and store them at -20 °C. 
K-Acetate Prolabo 26664.293
Lennox LB Broth medium without glucose Prepared with milli-Q water and autoclaved.
Liquid nitrogen Linde
Methanol (MeOH) ≥99.8% VWR 20847.24
MgCl2 Sigma Prepare a 2 M MgCl2 solution. Filter the solution using a 0.45 µm filter. 
Microplate 96 Well PS F-Botom Black Non-Binding Greiner Bio-one 655900
Mini-Extruder with two 1 mL gas-tight Hamilton syringes Avanti Polar Lipids 610023
Monochromator-based fluorescence plate reader TECAN M1000 Pro
N,N'-Dimethyl-N-(Iodoacetyl)-N'-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Ethylenediamine) (IANBD Amide) Molecular Probes Dissolve 25 mg of IANBD in 2.5 mL of dimethylsulfoxide (DMSO) and prepare 25 aliquot of 100 µL in 1.5 mL screw-cap tubes. Do not completely screw the cap. Then, remove DMSO in a freeze-dryer to obtain 1 mg of dry IANBD per tube. Tubes are closed and stored at -20 °C in the dark.  
NaCl Sigma S3014-1KG
PBS 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM NaH2PO4, 1.8 mM KH2PO4, autoclaved and stored at 4 °C.
Pear-shaped glass flasks (25 mL, 14/23, Duran glass) Duran Group
Pepstatin Sigma p5318-25mg
pGEX-C2LACT  plasmid Available on request from our lab
pGEX-PHFAPP plasmid Available on request from our lab
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) ≥98.5% (GC) Sigma P7626-25g Prepare a 200 mM PMSF stock solution in isopropanol
Phosphoramidon Sigma R7385-10mg
Polycarbonate filters (19 mm in diameter) with pore size of 0.2 µm Avanti Polar Lipids 610006
Poly-Prep chromatography column (with a 0-2 mL bed volume and a 10 mL reservoir) Biorad 7311550
Prefilters (10 mm in diameter). Avanti Polar Lipids 610014
PyMOL http://pymol.org/ Construction of the 3D models of the proteins (Figure 1A)
Quartz cuvette for UV/visible fluorescence (minimum volume of 600 µL) Hellma
Quartz cuvettes Hellma
Refrigerated centrifuge  Eppendorf 5427R Eppendorf
Rotary evaporator Buchi B-100
Screw-cap microcentriguge tubes (1.5 mL) Sarsted
Small magnetic PFTE stirring bar (5 × 2 mm)
Snap-cap microcentriguge tubes (0.5, 1, and 2 mL) Eppendorf
SYPRO orange fluorescent stain to detect protein in SDS-PAGE gel
Thermomixer Starlab
THROMBIN, FROM HUMAN PLASMA Sigma 10602400001 Dissolve 20 units in 1 mL of milli-Q water and prepare 25 µL aliquots in 0.5 mL Eppendorf tubes. Then freeze and store at -80 °C.
Tris, ultra pure MP 819623
Ultracentrifuge L90K Beckman
UV/Visible absorbance spectrophotometer SAFAS
UV/visible spectrofluorometer with a temperature-controlled cell holder and stirring device Jasco or Shimadzu Jasco FP-8300 or Shimadzu RF-5301PC
Vacuum chamber
Water bath Julabo
XK 16/70 column packed with Sephacryl S200HR GE healthcare

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Biochimie numéro 169 protéine de transfert lipidique protéine liée à l’OSBP phosphatidylsérine phosphatidylinositol 4-phosphate fluorescence protéine recombinante liposome
Mesures basées sur la fluorescence de l’échange phosphatidylsérine/phosphatidylinositol 4-phosphate entre les membranes
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Ikhlef, S., Lipp, N. F., Magdeleine, … More

Ikhlef, S., Lipp, N. F., Magdeleine, M., Drin, G. Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes. J. Vis. Exp. (169), e62177, doi:10.3791/62177 (2021).

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