Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Fluorescensbaserade mätningar av fosfatidylserin/fosfatidylinositol 4-fosfatutbyte mellan membran

Published: March 14, 2021 doi: 10.3791/62177
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Université Côte d’Azur, Centre National de la Recherche Scientifique, Institut de Pharmacologie Moléculaire et Cellulaire
* These authors contributed equally

Summary

Här beskriver vi protokoll med fluorescerande lipidsensorer och liposomer för att avgöra om ett protein extraherar och transporterar fosfatidylserin eller fosfatidylinositol 4-fosfat in vitro.

Abstract

Flera medlemmar av den evolutionärt bevarade oxysterolbindande protein (OSBP)-relaterade proteiner (ORP)/OSBP homologs (Osh) familjen har nyligen visat sig representera en ny lipid överföring protein (LTP) grupp i jäst och mänskliga celler. De överför fosfatidylserin (PS) från endoplasma retikulum (ER) till plasmamembranet (PM) via PS/fosfatidylinositol 4-fosfat (PI(4)P) utbytescykler. Detta fynd möjliggör en bättre förståelse för hur PS, som är avgörande för signalprocesser, distribueras i hela cellen och undersökningen av sambandet mellan denna process och fosfoinositid (PIP) metabolism. Utvecklingen av nya fluorescensbaserade protokoll har varit avgörande för upptäckten och karakteriseringen av denna nya cellulära mekanism in vitro på molekylär nivå. Detta dokument beskriver produktion och användning av två fluorescerande märkta lipidsensorer, NBD-C2Lact och NBD-PHFAPP, för att mäta ett proteins förmåga att extrahera PS eller PI(4)P och överföra dessa lipider mellan konstgjorda membran. Först beskriver protokollet hur man producerar, märker och hämtar hög renhetsprover av dessa två konstruktioner. För det andra förklarar detta dokument hur man använder dessa sensorer med en fluorescens microplate läsare för att avgöra om ett protein kan extrahera PS eller PI(4)P från liposomer, med Osh6p som en fallstudie. Slutligen visar detta protokoll hur man exakt mäter kinetiken i PS/PI(4)P utbyte mellan liposomer av definierad lipidsammansättning och för att bestämma lipidöverföringshastigheter genom fluorescensresonansenergiöverföring (FRET) med hjälp av en standardfluorometer.

Introduction

Den exakta fördelningen av lipider mellan olika membran och i membranen i eukaryota celler1,2 har djupgående biologiska konsekvenser. Dekryptera hur LTPs fungerar är en viktig fråga icellbiologi 3,4,5,6, och in vitro-metoder är av stort värde för att ta itu med denna fråga7,8,9,10,11. Här presenteras en in vitro,fluorescensbaserad strategi som har bidragit till att fastställa att flera ORP/Osh-proteiner påverkar PS/PI(4)P utbyte mellan cellmembran12 och därmed utgör en ny klass av LTPs. PS är en anjonisk glycerophospholipid som representerar 2-10% av de totala membranlipiderna i eukaryotaceller 13,14,16. Det fördelas längs en gradient mellan akuten och statsministern, där den representerar 5-7% och upp till 30% av glycerophospholipids,respektive 17,18,19. Dessutom är PS i huvudsak koncentrerat till statsministerns cytosoliska broschyr. Denna uppbyggnad och den ojämna partitionen av PS i PM är avgörande för cellulära signalprocesser19. På grund av den negativa laddningen av PS-molekyler är statsministerns cytosoliska broschyr mycket mer anjonisk än den cytosolliska broschyren från andra organeller1,2,19,20. Detta möjliggör rekryteringen, via elektrostatiska krafter, av signalproteiner som myristoylated alanin-rika C-kinas substrat (MARCKS)21, sarkom (Src)22, Kirsten-rat sarkom viral oncogene (K-Ras)23, och Ras-relaterade C3 botulinum toxin substrat 1 (Rac1)24 som innehåller en sträcka av positivt laddade aminosyror och en lipid svans.

PS känns också igen av konventionella proteinkinas C på ett stereoselectivt sätt via en C2-domän25. PS syntetiseras dock i ER26, vilket indikerar att det måste exporteras till statsministern innan det kan spela sin roll. Det var inte känt hur detta uppnåddes19 förrän konstaterandet att i jäst, Osh6p och Osh7p överföra PS från AKUT till PM27. Dessa LTPs tillhör en evolutionärt bevarad familj i eukaryoter vars grundande medlem är OSBP och som innehåller proteiner (ORPs i mänskliga, Osh proteiner i jäst) integrera en OSBP-relaterad domän (ORD) med en ficka för att vara värd för en lipidmolekyl. Osh6p och Osh7p består endast av ett ORD vars strukturella egenskaper är anpassade för att specifikt binda PS och överföra den mellan membran. Hur dessa proteiner riktade ps från akuten till statsministern var dock oklart. Osh6p och Osh7p kan fånga PI(4)P som en alternativ lipid ligand12. I jäst syntetiseras PI(4)P från fosfatidylinositol (PI) i Golgi och PM med PI 4-kinaser, Pik1p respektive Stt4p. Däremot finns det ingen PI(4)P i ER-membranet, eftersom denna lipid hydrolyseras till PI av Sac1p fosfatas. Därför finns det en PI(4)P-lutning vid både ER/Golgi- och ER/PM-gränssnitten. Osh6p och Osh7p överför PS från akuten till pm via PS/PI(4)P utbytescykler med pi(4)P-lutningen som finns mellan dessa tvåmembran 12.

Inom en cykel extraherar Osh6p PS från akuten, byter PS mot PI(4)P vid pm och överför PI(4)P tillbaka till akuten för att extrahera en annan PS-molekyl. Osh6p/ Osh7p interagerar med Ist2p28, ett av de få proteiner som ansluter och föra ER-membranet och statsministern i närheten av varandra för att skapa ER-PM kontaktplatser i jäst29,30,31. Dessutom blir associeringen av Osh6p med negativt laddade membran svag så snart proteinet extraherar en av sina lipidligander på grund av en konformationsförändring som ändrar dess elektrostatiska egenskaper32. Detta hjälper Osh6p genom att förkorta dess membranboende tid och därigenom upprätthålla effektiviteten i dess lipidöverföringsaktivitet. I kombination med bindningen till Ist2p kan denna mekanism göra det möjligt för Osh6p/7p att både snabbt och korrekt utföra lipidutbyte vid ER/PM-gränssnittet. I mänskliga celler utför ORP5- och ORP8-proteiner PS/PI(4)P-utbyte på ER-PM-kontaktplatser via distinktamekanismer 33. De har ett centralt ORD, som liknar Osh6p, men är direkt förankrade på akuten via ett C-terminalt transmembransegment33 och dockar in i PM via en N-terminal Pleckstrin homology (PH) domän som känner igen PI(4)P och PI(4,5)P233,34,35. ORP5/8 använder PI(4)P för att överföra PS, och det har visat sig att ORP5/8 dessutom reglerar PM PI(4,5)P2-nivåer och förmodligen modulerar signalvägar. En minskning av PI(4)P och PI(4,5)P2-nivåerna sänker i sin tur ORP5/ORP8-aktiviteten eftersom dessa proteiner associeras med statsministern på ett PIP-beroende sätt. Onormalt hög PS syntes, som leder till Lenz-Majewski syndrom, påverkar PI(4)P nivåer genom ORP5/836. När aktiviteten hos båda proteinerna blockeras blir PS mindre riklig vid statsministern, vilket sänker den onkogena förmågan att signalera proteiner37.

Omvänt verkar ORP5 överuttryck främja cancercellsinvasion och metastaserande processer38. Således kan förändringar av ORP5/8 aktivitet allvarligt ändra cellulärt beteende genom förändringar i lipid homeostas. Vidare upptar ORP5 och ORP8 ER-mitokondrier kontaktplatser och bevarar vissa mitokondriella funktioner, eventuellt genom att leverera PS39. Dessutom lokaliserar ORP5 till ER-lipid droppe kontaktplatser för att leverera PS till lipid droppar av PS / PI (4) P utbyte40. Den strategi som beskrivs häri för att mäta i) PS- och PI(4)P-extraktion från liposomer och ii) PS- och PI(4)P-transport mellan liposomer har utarbetats för att upprätta och analysera PS/PI(4)P-utbytesaktiviteten för Osh6p/Osh7p12,32 och används av andra grupper för att analysera verksamheten hos ORP5/ORP835 och andra LTP10, 41. I artikel 3.1 i eu Den är baserad på användningen av en fluorescensplatta läsare, en standard L-format spektrofluorometer, och två fluorescerande sensorer, NBD-C2Lact och NBD-PHFAPP, som kan upptäcka PS respektive PI(4)P.

NBD-C2Lact motsvarar C2-domänen för glykoprotein, laktadin, som återengineererades för att inkludera en unik lösningsmedelsexponerad cystein nära det förmodade PS-bindningsstället. En polaritetskänslig NBD-fluorofor (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol) är kovalst kopplad till dessa rester(figur 1A)12. För att vara mer exakt klonades C2-domänen av laktadin (Bos taurus, UniProt: Q95114, rester 270-427) till en pGEX-4T3 vektor som ska uttryckas i fusion med glutation S-transferase (GST) i Escherichia coli. C2-laktsekvensen muterades sedan för att ersätta två lösningsmedelsanpassade cysteinrester (C270, C427) med alaninrester och för att föra in en cysteinrester i en region nära det förmodade PS-bindande området (H352C-mutationen) som senare kan märkas med N,N'-dimetyl-N-(iodoacetyl)-N'-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl) etylendiamine (IANBD) 12. En klyvningsplats för trombin finns mellan GST-proteinet och N-ändstationen för C2-domänen. En stor fördel är att detta område selektivt erkänner PS på ett Ca2 +-oberoende sätt som strider mot andra kända C2-domäner eller Annexin A542. NBD-PHFAPP kommer från PH-domänen för det humana fyrafosfatadapterproteinet 1 (FAPP1), som återinträdes för att inkludera en enda lösningsmedelsexponerad cystein som kan märkas med en NBD-grupp nära PI(4)P-bindningsstället(figur 1A)43. Nukleotidsekvensen för PH-domänen för det mänskliga FAPP-proteinet (UniProt: Q9HB20, segment [1-100]) har klonats till en pGEX-4T3-vektor som ska uttryckas tillsammans med en GST-tagg. PHFAPP-sekvensen har modifierats för att sätta in en unik cysteinrester i proteinets membranbindningsgränssnitt43. Dessutom har en länk med nio rester införts mellan trombinklyvningsstället och PH-domänens N-ändstation för att säkerställa tillgängligheten till proteasen.

För att mäta PS-extraktion från liposomer, NBD-C2Lakt blandas med liposomer av fosfatidylkolin (PC) som innehåller spårmängder av PS. På grund av dess affinitet för PS binder denna konstruktion till liposomerna, och NBD-fluorforen upplever en förändring i polaritet när den kommer i kontakt med membranets hydrofobiska miljö, som framkallar ett blått skift och en ökning av fluorescensen. Om PS extraheras nästan helt med en stoichiometrisk mängd LTP associeras sonden inte med liposomer, och NBD-signalen är lägre (figur 1B)32. Denna skillnad i signal används för att avgöra om en LTP(t.ex. Osh6p) extraherar PS. En liknande strategi används med NBD-PHFAPP för att mäta PI(4)P-extraktion (figur 1B), som beskrivitstidigare 12,32. Två FRET-baserade analyser utformades för att i) mäta PS-transport från LA till L B-liposomer, som efterliknar ER-membranet respektive PM- och ii) PI(4)P-transporten i motsatt riktning. Dessa analyser utförs under samma förhållanden(dvs. samma buffert, temperatur och lipidkoncentration) för att mäta PS/PI(4)P-utbyte. För att mäta PS-transport blandas NBD-C2Lact med L A-liposomer bestående av PC och dopad med 5 mol% PS och 2 mol% av en fluorescerande rhodaminmärkt fosfatidyletanolamin (Rhod-PE)-och LB-liposomer som innehåller 5 mol% PI(4)P.

Vid noll tidpunkt, FRET med Rhod-PE quenches NBD fluorescens. Om PS transporteras från LA till L B-liposomer(t.ex. vid injektion av Osh6p) sker en snabb utsläckning på grund av flyttningen av NBD-C2Laktmolekyler från LA till LB-liposomer (figur 1C). Med tanke på mängden tillgänglig PS förblir NBD-C2Lact i huvudsak i ett membranbundet tillstånd under experimentetsgång 12. Således korrelerar NBD-signalens intensitet direkt med fördelningen av NBD-C2-laktmellan LA- och LB-liposomer och kan enkelt normaliseras för att avgöra hur mycket PS som överförs. För att mäta överföringen av PI(4)P i motsatt riktning blandas NBD-PHFAPP med LA- och L B-liposomer. Med tanke på att det endast binder till L B-liposomer som innehåller PI(4)P, men inte Rhod-PE, är dess fluorescens hög. Om PI(4)P överförs till L A-liposomer, flyttar den till dessa liposomer och signalen minskar på grund av FRET med Rhod-PE (Figur 1C). Signalen normaliseras för att avgöra hur mycket PI(4)P överförs43.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Rening av NBD-C2Lakt

OBS: Även om detta protokoll beskriver användningen av en cellstörare för att bryta bakterier, kan det ändras för att använda andra lysstrategier(t.ex. en fransk press). I början av reningen är det obligatoriskt att använda buffert som är nyavgasad, filtrerad och kompletterad med 2 mM dithiothreitol (DTT) för att förhindra oxidation av cystein. För proteinmärkningssteget är det dock viktigt att helt ta bort DTT. Många steg måste utföras på is eller i ett kallt rum för att undvika proteinnedbrytning. Prover med en volym på 30 μL skall samlas in i olika steg i protokollet för att utföra en analys med natriumdcylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) med en 15% akrylamidgel för att kontrollera reningens förlopp. Blanda tillräckligt med denaturering Laemmli provbuffert med varje alikvot och värm blandningen vid 95 °C. Frys och förvara rören vid -20 °C tills analysen.

  1. Uttryck för GST-C2Lakt i Escherichia coli
    1. Blanda 20 μL BL21 Guld kompetenta celler med 18 μL steriliserat vatten. Blanda sedan 2 μL pGEX-C2Laktplasmid (vid ~ 65 ng / μL) med bakterierna och omvandla dem genom elektroporering. Återanvänd bakterierna med 150 μL autoklaverat Lennox Lysogeny-Broth (LB) medium (10 g/L tryptone, 5 g/L jästextrakt, 5 g/L NaCl i avjoniserat vatten, glukosfritt). Låt bakterierna växa vid 37 °C i 1 timme i ett 2 ml snap-cap mikrocentrifugrör.
    2. Inokulera 25 ml LB-medium, kompletterat med 50 μg/ml ampicillin, med 150 μL bakteriell suspension i en 125 ml steril Erlenmeyerkolv. Placera kolven i en orbital shaker vid 37 °C och låt bakterierna växa över natten med omrörning vid 185 varv/min.
    3. Fyll två sterila 2 L Erlenmeyer-flaskor med 500 ml LB-medium kompletterat med 50 μg/ml ampicillin och tillsätt 5 ml förkulturupphängning. Låt bakterierna växa vid 37 °C med agitation vid 220 varv/min.
    4. Mät regelbundet suspensionens optiska densitet (OD) vid en våglängd (λ) på 600 nm. När OD når ett värde av ~0,6-0,7, tillsätt 500 μL av en stamlösning på 1 M isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) till varje kolv för att initiera uttrycket av GST-C2Lact. Skaka flaskorna vid 185 varv/min i 4 timmar vid 37 °C.
    5. Överför innehållet i varje kolv till en polypropylencentrifugflaska. Centrifugera de två flaskorna i 30 min vid 4600 × g vid 4 °C för att pelleta bakterierna. Kassera supernatanten och återanvänd varje pellet i 50 ml kall fosfatbuffrad saltlösning.
    6. Överför bakteriesuspensionen i varje flaska till ett koniskt centrifugeringsrör på 50 ml. Centrifugera de två rören i 30 min vid 2300 × g vid 4 °C. Ta bort supernaten och förvara rören, som var och en innehåller en bakteriepellet, vid -20 °C.
  2. Rening av C2Lakt
    1. På is fyller du två 50 ml koniska centrifugalrör med 50 ml buffert som innehåller 50 mM Tris-HCl, pH 7,4 och 150 mM NaCl (nedan kallad TN-buffert), tidigare filtrerade och avgasade genom membranvakuumfiltrering.
    2. För att förbereda lysbufferten i varje rör, lös upp en tablett etylendiamintetraacetikasyrafri proteashämmarcocktail i TN-bufferten genom mild ultraljudsbehandling eller virvel. Tillsätt andra antiproteaser (10 μM bestatin, 1 μg/mL pepstatin A och 10 μM fosforamidon). Viktigt, komplettera bufferten med 2 mM DTT.
    3. Fyll de två rören som innehåller de bakteriepellets som framställs i steg 1.1.6, med lysbuffert för att erhålla en slutlig volym på 30 ml i varje rör, och tina långsamt upp pelletsen på is i 10 minuter. Krossa varje pellets med en spatel i rostfritt stål och sätt tillbaka dem genom att virka rören och/eller genom att pipettera fjädringen fram och tillbaka med en pipettstyrenhet och en 25 ml pipett tills en homogen fjädring erhålls.
    4. Utför lys med hjälp av en förkyld cellstörare (se materialförteckningen)genom att ladda 30 ml av provet inuti behållaren och köra en brytcykel i kontinuerligt läge med ett tryck på 1,6 bar. Samla lysatet i samma rör, håll röret på is och tillsätt omedelbart 250 μL från en stamlösning på 200 mM fenylmetylmetylmetylfluorid (PMSF) framställd i isopropanol.
    5. Lysa det andra provet enligt samma procedur. Använd resten av lysbufferten för att tvätta cellstöraren och samla upp tvätten för att justera volymen för varje lysat (~ 30 ml) till en slutlig volym på 50 ml.
    6. Komplettera varje lysat med 5 mM MgCl2, och tillsätt 20 μg/ ml DNAse I för att fragmentera DNA och därmed minska provets viskositet. Inkubera på is i 30 minuter. Samla ett prov för gelanalys.
    7. Överför varje 50 ml lysat till ett förfört polykarbonat ultracentrifugerör (två totalt, se materialförteckningen). Centrifugera vid 186 000 × g vid 4 °C i minst 1 timme med hjälp av en ultracentrifug.
    8. Parallellt med centrifugeringssteget dosera 1,4 ml av ett slam som innehåller glutation i kombination med 4% agarose pärlor i två 50 ml koniska centrifugalrör, tillsätt 20 ml TN-buffert kompletterad med 1 mM DTT (TND-buffert) till varje rör, centrifugera vid 1200 × g i 5 min och kassera supernatanten. Upprepa detta tvättsteg två gånger.
    9. Efter centrifugering av bakterielyaten, ta bort ett 30 μL-prov från supernatanten och överför supernatanten från varje ultracentrifugerör till ett motsvarande 50 ml koniskt centrifugeringsrör som innehåller rena pärlor. För gelanalys, återanvänd skräppellet i ett av ultracentrifugerören med 50 ml TND-buffert och samla in ett 30 μL-prov.
    10. Placera rören på en rotator i 3-4 timmar vid 4 °C för att få en homogen pärlfjädring. Slå samman pärlupphängningen i en tom kromatografikolonn på 25 ml. Låt pärlorna dekantera och ta bort bufferten och obundna proteiner genom gravitationsflöde. Ta ett prov från eluatet för analys.
    11. Återanvänd pärlorna med 20 ml TND-buffert och samla upp eluaten genom gravitationsflödet. Upprepa detta steg två gånger för att helt tvätta pärlorna. Slå samman de insamlade eluaterna och behåll ett 30 μL-prov för vidare analys.
      OBS: Efter en kort dekantering, en volym på ~ 2 ml pärl suspension, till vilken GST-C2Lakt är fäst, sediment längst ner i kolonnen.
    12. Tillsätt 1 ml pärlsuspension till två 2 ml snaplock microcentrifuge-rör. Fyll varje rör med TND-buffert till en slutlig volym på 1,970 ml. Ta ett prov på 30 μL från ett rör för vidare analys (B1-prov). Tillsätt 10 μL cacl2-lösning på 10 mM och 25 μL från en stamlösning av mänsklig trombinproteaslösning vid 0,02 U/μL.
    13. Placera de två rören på en rotator vid 4 °C över natten så att trombin kan klyva av GST-taggen från C2Lact-domänen. Nästa dag, i varje rör, blanda 10 μL 200 mM PMSF-lösning med pärlsuspensionen för att hämma trombinåtgärden.
    14. Centrifugera rören vid 700 × g i 5 min och samla upp supernatanten, som innehåller löslig C2Laktdomän, från varje rör, utan att ta pärlorna. Slå ihop supernatanterna i ett 2 ml snap-cap microcentrifuge-rör (E1 eluat) som hålls på is.
    15. Tillsätt 1 ml TND-buffert till varje rör för att återanvända pärlorna och tvätta dem; upprepa steg 1.2.14. Utför detta steg tre gånger mer för att återställa en maximal mängd protein. Varje gång samlas de insamlade supernatanterna i ett nytt 2 ml-rör (E2, E3, E4 och E5) och ta en alikvot för vidare analys. I slutet av tvättstegen, ta en alikvot från pärlupphängningen (alikvot B2).
    16. Analysera de 30 μL-proverna som samlades in i de olika stegen i reningsprotokollet genom SDS-PAGE-separation på en 15% akrylamidgel.
    17. Ta bort potentiella förorenande pärlor genom att slå samman alla supernatanter(dvs.~ 10 ml) som samlats in under steg 1.2.14 och 1.2.15 i en 10 mL kromatografikolonn. Samla eluaten genom gravitationsflödet och behåll pärlorna längst ner i kolonnen.
    18. KoncentreraC2-laktprovet med en centrifugalfilterenhet med en molekylviktsskärning (MWCO) på 3 kDa och en centrifugeringshastighet på 2300 × g. Stoppa koncentrationsproceduren när proteinprovet är ~1 ml.
  3. Beredning och rening av NBD-C2Lakt
    1. Jämvikta en avsaltningskolonn (se materialförteckningen) medTN-buffert. Ladda kolonnen med 1 ml koncentreratC2-laktprov. Låt provet komma in i gelbädden helt, tillsätt 1,5 ml nyavgasad DTT-fri TN-buffert till kolonnen och samla eluat genom gravitationsflöde i ett 2 mL snaplock mikrocentrifugrör.
    2. Späd 50 μL eluat i en slutlig volym på 300 μL TN-buffert och registrera ett absorbansspektrum från 230 till 450 nm med ren TN-buffert som ett blindprov. BestämC2-laktkoncentrationen baserat på absorbansen uppmätt vid 280 nm, med tanke på en utdöendekoefficient ε lika med 44 920 M-1,cm-1.
    3. För att märkaC2-laktkonstruktionen med en NBD-fluorfor, blanda proteinet med ett tiofaldigt molärt överskott av N,N'-dimetyl-N-(jodataketyl)-N'-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)etylendiamin (IANBD amide).
      1. Lös upp 1 mg IANBD i vattenfri dimetylformamid (DMF), med tanke på att den slutliga volymen DMF som används för märkning avC2-laktkonstruktionen inte får överstiga 5 % (v/v) av proteinprovvolymen.
      2. För att bestämma volymen DMF (VDMF) föratt lösa upp IANBD, beräkna först den erforderliga mängden IANBD (m, uttryckt i mg) för att märka proteinet med hjälp av formel 1.
        m = 10 000 × C × V × MWIANBD (1)
        Där C är koncentrationen avC2-lakt mätt i steg 1.3.2, V är volymen av C2-laktprovet, och MW IANBD är fluorforens molekylvikt (420 g/mol).
      3. Beräkna VDMF med hjälp av formler 2 (med m0=1) och 3.
        VDMF= (m0/m) × VIANBD (2)
        VIANBD=0,05 × V (3)
        Där m0 är mängden IANBD-pulver i mg och VIANBD är den volym IANBD-lösning som ska tillsättas C2-laktprovet.
      4. Tillsätt volym VIANBD av den nyberedda IANBD-lösningen till C2-laktprovet och skakareaktionsblandningen vid 800-900 varv/min i 30 min vid 25 °C med hjälp av en termomixer skyddad mot ljus. Låt reaktionen fortsätta i 90 minuter på is. Rengör under tiden en centrifugalfilterenhet (MWCO= 3 kDa) med 10 ml TN-buffert.
    4. Tillsätt L-cystein (i 10-faldigt molaröverskott till IANBD) till reaktionsblandningen för att inaktivera fri IANBD.
    5. Tillsätt 15 ml TN-buffert till NBD-C2Lact-lösningen och överför NBD-C2Lact-lösningen till centrifugalfilterenheten. Koncentrera provet till 2 ml för att separera det mesta av den fria NBD från proteinet genom centrifugering vid 2300 × g. Upprepa detta tvättsteg två gånger. Centrifugera provet i ett 2 ml snaplockscentrifugrör i 10 min vid 19 000 × g vid 4 °C till pelletspotentialaggregat och samla upp supernatanten.
    6. Späd 50 μL eluat i en slutlig volym på 300 μL TN-buffert. Registrera absorbansspektrumet från 230 till 650 nm med hjälp av eluatet som samlats in under koncentrationsförfarandet som ett blankprov. Bestäm NBD-C2Laktkoncentrationen med maximal absorbans vid λ=280 och 495 nm och utrotningskoefficienterna ε= 44 920 M-1,cm-1 (protein) och 25 000 M-1,cm-1 (NBD-fluorfor).
      OBS: Om de två koncentrationsvärdena är lika, indikerar detta attC2-laktkonstruktionen är märkt med ett 1:1-förhållande med NBD-gruppen.
    7. Om NBD-C2-laktkoncentrationen som uppskattas vidmätningen av NBD-absorbans överstiger den koncentration som uppskattas från absorbansen av tryptofanrester (Trp), upprepa steg 1.3.5 för att ytterligare avlägsna gratis NBD.
    8. Tillsätt glycerol till provet för att få en slutlig koncentration på 10% (v/v) för att kryoskydda NBD-C2Laktkonstruktionen under blixtfrysning. Mät den slutliga proteinkoncentrationen.
    9. Förbered 50 μL alikvoter protein i 0,5 ml snaplock microcentrifuge-rör. Blixtfrys rören i flytande kväve och förvara dem vid -80 °C.

2. Rening av NBD-PHFAPP

OBS: Förfarandet för att producera och märka PHFAPP är identiskt med NBD-C2-lakttills överföringen av NBD-C2Laktlösning till en centrifugalfilterenhet i steg 1.3.4. Från och med det här steget följer du protokollet nedan.

  1. Efter koncentrationssteget, håll 2 ml NBD-PHFAPP vid 4 °C i mörker i högst 1 dag innan du utför storleksuteslutning kromatografi. Innan kromatografin är utesluten kontrollerar du att det inte finns någon orange deponi (aggregering under koncentrationen) längst ner på röret. Om så är fallet, centrifugera provet vid 540 000 × g i 10 min vid 4 °C och rena supernatanten genom storleksuteslutningskromatografi.
    OBS: Kromatografi med storleksuteslutning utförs på en kolumn packad med korslänkad dextran-akrylamidkopolymer (se materialförteckningen),som tidigare var jämvikt med TND-buffert, med hjälp av ett snabbt protein flytande kromatografisystem (se materialförteckningen). Kolonnen måste skyddas mot ljus. Ett flöde på 1 ml/min användes, och eluering av NBD-PHFAPP konstruktion följdes av registrering av absorbansen vid λ=280 (protein) och 480 nm (NBD) vid kolumnutgången.
    1. Injicera NBD-PHFAPP-provet laddat i en 2 ml injektionsslinga på kolonnen och samla omedelbart in 2,5 ml fraktioner eluat.
  2. Analysera alla fraktioner som motsvarar huvudtoppen som detekteras vid 280 och 480 nm på en 15% SDS-PAGE-gel. Blanda ett 25 μL prov av varje fraktion med 15 μL Laemmli provbuffert före uppvärmning och lastning på gelén.
    OBS: En huvudtopp, som samtidigt detekteras vid λ= 280 och 480 nm, visas när en volym på ~150 ml buffert har passerat genom kolumnen.
  3. Slå samman fraktionerna som uteslutande innehåller NBD-PHFAPP-protein (~ 12,2 kDa) och tillsätt glycerol vid en slutlig koncentration på 10% (v/v). Koncentrera provet med en centrifugalfilterenhet med en MWCO på 3 kDa till en slutlig volym på 1 ml med en centrifugeringshastighet på 2300 × g.
  4. Förbered alikvoter och registrera ett absorbansspektrum enligt beskrivningen för NBD-C2Lact. Använd en utdöendeskoefficient ε= 29 450 M-1,cm-1 för att bestämma proteinkoncentrationen baserat på absorbansen mätt vid λ=280 nm.

3. Beredning av liposomer för PS- och PI(4)P-extraktions- eller överföringsanalyser

OBS: Utför alla steg i rumstemperatur om inget annat anges. Hantera organiska lösningsmedel, rotavapor och flytande kväve med försiktighet.

  1. Förbered färsk, filtrerad och avgasad 50 mM 4-(2-hydroxyetyl)-1-piperazineethanesulfonsyra (HEPES)-kaliumhydroxid (KOH), pH 7,4, 120 mM kaliumacetatbuffert (HK).
  2. För varje typ av liposom, ta exakta mängder olika lipider från stamlösningar och blanda dem i en päronformad glaskolv på 25 ml(tabell 1). Tillsätt ren kloroform för att justera volymen för varje blandning till 1 ml. Märk varje kolv med liposomnamnet. Linda flaskorna som innehåller lipidblandningen dopad med Rhod-PE med aluminiumfolie.
  3. Placera kolven på en roterande förångare. Torka lipiderna under vakuum och vid 25 °C i minst 30 minuter med en rotationshastighet på 500 varv/min. För lipidfilmer som innehåller PI(4)P, förvärm kolven vid 32-34 °C i 5 min, under mild rotation, för att korrekt blanda PI(4)P med de andra lipiderna innan vakuum i kolven för att avlägsna lösningsmedlet, vilket kommer att lämna efter sig en film med torra lipider på kolvväggen.
  4. Koppla bort kolven från förångaren och placera den i en vakuumkammare i 45 minuter för att avlägsna eventuella återstående spår av lösningsmedel. Fyll kolven med 2 ml HK-buffert och tillsätt några glaspärlor med diametern 4 mm till lösningen. Virvel försiktigt kolven i 2 minuter för att återanvända lipiderna och förbereda multilamellar lipid vesicles (MLVs) med en lipidkoncentration på 4 mM. Förbered 0,5 ml alikvoter mlv i 1,5 ml skruvlocksmikrocentrifugrör.
  5. Frys upp rören 5x (med flytande kväve och ett vattenbad vid 37 °C). Extrudera liposomerna eller förvara dem vid -20 °C.
  6. Använd en mini extruder för att förbereda liposomerna(dvs. stora enlamellar vesiklar) från MLV: er enligt tillverkarens riktlinjer. Använd ett polykarbonatfilter med enhetliga cylindriska porer med en diameter på 200 nm.
  7. För att förbereda varje typ av liposom, extrudera minst 250 μL av motsvarande suspension av MLV. Förvara de extruderade liposomerna vid 4 °C och i mörker om de innehåller Rhod-PE. Använd liposomerna inom 2 dagar.
Lipidkomposition (mol/mol) Lipid
Liposomnamn DOPC (dopc)
(25 mg/ml)		 DYKER
(10 mg/ml)		 16:0 Liss Rhod-PE
(1 mg/ml)		 C16:0/C16:0-PI(4)P
(1 mg/ml)
Extraktionsanalyser Liposom 2 mol% PS PC/PS 98/2 247 μL 12,5 μL
Liposom 2 mol% PI(4)P PC/PI(4)P 98/2 247 μL 153 μL
PC-liposom PC 100 (på 100) 252 μL
Transportanalyser L A (påalla)  PC/PS/Rhod-PE 93/5/2 234 μL 31,4 μL 200 μL
LA utan PS PC/Rhod-PE 98/2 247 μL 200 μL
LB (på)  PC/PI(4)P 95/5 237 μL 383 μL
LB utan PI(4)P PC 100 (på 100) 252 μL
LA-Eq (på andra) PC/PS/PI(4)P/Rhod-PE 93/2.5/2.5/2 234 μL 15,7 μL 200 μL 191 μL
LB-Eq (på andra) PC/PS/PI(4)P 95/2.5/2.5 239 μL 15,7 μL 191 μL

Tabell 1: Volymer lipidbuljonglösningar som ska blandas för liposompreparat. Förkortningar: PS= fosfatidylserin; PC = fosfatidylkolin; PI(4)P = fosfatidylinositol 4-fosfat. Rhod-PE = rhodaminmärkt fosfatidyletanolamin. DOPC = dioleoylphosphatidylcholine; POPS= 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfo-L-serin; 16:0 Liss Rhod-PE = 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl).

4. Mätning av PS- eller PI(4)P-extraktion

OBS: Mätningarna måste utföras med en svart 96-brunnsplatta och en fluorescensplatta med monokromer: en för fluorescensupphetsning och en för utsläpp, med variabel bandbredd.

  1. Förbered färsk, filtrerad och avgasad HK-buffert kompletterad med 1 mM MgCl2 (HKM-buffert). Förbered rena PC-liposomer och PC-liposomer med 2 mol% PS eller 2 mol% PI(4)P (4 mM slutlig lipidkoncentration, se tabell 1).
    OBS: Håll rören fyllda med suspension av extruderade liposomer vid rumstemperatur under hela experimentet och håll proteinerna på is. Skydda dessutom lipidsensorerna från ljus.
  2. För PS-extraktionsanalysen, blanda liposomer som innehåller 2 mol% PS (80 μM slutlig lipidkoncentration, 0,8 μM tillgänglig PS-koncentration) med NBD-C2-lakt (250 nM slutlig koncentration) i en slutlig volym på 100 μL. Fyll en andra brunn med samma mängd liposom (80 μM, 2 mol% PS) och NBD-C2Lact (250 nM) blandat med 3 μM LTP (Osh6p som positiv kontroll eller ett protein av intresse).
    OBS: En inkubationstid på 5 min är tillräcklig för att Osh6p ska uppnå lipidextraktion.
  3. Fyll en tredje brunn med NBD-C2Lact (250 nM) blandat med rena PC-liposomer (80 μM). Fyll endast en fjärde brunn med rena PC-liposomer (80 μM). Upprepa steg 4.2-4.3 för att förbereda ytterligare tre serier med fyra brunnar.
  4. För varje brunn, registrera ett NBD-spektrum från 505 till 650 nm (bandbredd 5 nm) vid excitation vid 490 nm (bandbredd 5 nm) vid 25 °C. För varje serie subtrat spektrumet registreras med endast liposomer från det andra spektra.
    OBS: F och Fmax motsvarar intensiteten vid 536 nm mätt med PS-innehållande liposomer i närvaro eller frånvaro av LTP, medan F0 är intensiteten vid samma våglängd med rena PC-liposomer. För varje serie anges procentandelen tillgänglig PS som extraheras av proteinet med hjälp av följande formel.
    100 × (1-((F-F0)/(Fmax-F0)))(4)
  5. För PI(4)P extraktionsanalys, förbered liposomer med 2 mol% PI(4)P och utför mätningar med NBD-PH FAPP-sonden. Utför kontroll experiment och bestäm utextraktions procenten på samma sätt som beskrivs ovan.
    OBS: Liposom- och proteinkoncentrationen är identiska med dem som används i PS-extraktionstestet.

5. Realtidsmätning av PS-transport

OBS: En standardfluorimeter (90° format) utrustad med en temperaturstyrd cellhållare och en magnetisk omrörare används för att spela in lipidöverföringskinetik. För att korrekt inhämta data är det viktigt att permanent bibehålla provet vid samma temperatur (satt mellan 25 och 37 °C beroende på proteinets ursprung (t.ex.jäst eller människa)) och att ständigt röra om det. Det protokoll som beskrivs nedan är mätning av lipidtransport i ett 600 μL-prov som ingår i en cylindrisk kvartscell.

  1. Förbered nyavgasad och filtrerad HKM-buffert. Förvara rören som innehåller extruderade liposomer i rumstemperatur. Linda rör som innehåller liposomer med Rhod-PE i aluminiumfolie och/eller förvara dem i en ogenomskinlig låda för att förhindra fotografering.
  2. Justera excitations- och emissionsmonokromatorerna vid λ = 460 nm (med kort bandbredd (1-3 nm)) respektive vid λ = 530 nm (med stor bandbredd (≥ 10 nm)) respektive. Ställ in förvärvstiden till 25 min med en tidsupplösning ≤ 1 s.
  3. Späd 30 μL L A-liposomfjädring och en volym NBD-C2 Laktlagerlösning i förvärmd HKM-buffert för att förbereda ett 570 μL-prov som innehåller 200 μM totala lipider och 250 nM NBD-C2-lakt . Tillsätt en liten magnetisk omrörningsstång och placera cuvetten i fluorometerhållaren.
  4. När provet är termiskt jämviktat (efter 3-5 min) utlöser du mätningen. Efter 1 min tillsätt 30 μL LB liposomfjädring (slutlig koncentration på 200 μM totala lipider) i provet. Efter 3 min, injicera LTP i provet så att den slutliga koncentrationen av LTP är 200 nM och förvärva signalen under de återstående 21 min.
  5. Utför ett parallellt experiment för att normalisera NBD-signalen. Blanda 30 μL LA-Eq liposomfjädring med 250 nM NBD-C2-lakti HKM-buffert (slutlig volym på 570 μL). Efter 1 min, injicera 30 μL LB-Eq liposom suspension.
    OBS: Lipidsammansättningen av LA-Eq och LB-Eq liposomer liknar den för LA- och L B-liposomer som används i överföringsanalysen, förutom att var och en av dem innehåller 2,5 mol% PS och 2,5 mol% PI(4)P. Som ett resultat motsvarar NBD-signalen som mäts, kallad FEq, signalen som bör mätas om PS var helt jämvikt mellan LA- och LB-liposomer genom en överföringsprocess.
  6. Konvertera de kinetiska kurvor som mäts med en LTP av intresse för att bestämma mängden PS (i μM) som överförts från LA till L B-liposomer över tid. Normalisera varje datapunkt (F) i kurvan med hjälp av följande formel.
    FNorm = (F-F0)/(FEq-F0) (5)
    där F0 motsvarar NBD-signalen strax före tillsats av en LTP, och FEq är signalen mätt i steg 5.5.
    OBS: Mängden PS (i μM) som överförs från LA till L B-liposomer motsvarar 2,5 × FNorm, med tanke på att jämvikten motsvarar en situation där hälften av tillgängliga PS-molekyler, som finns i LA-liposomens yttre bipacksedel (dvs.motsvarande 5 mol% av 0,5 × 200 μM totala lipider) har överförts till LB-liposomer.

6. Realtidsmätning av PI(4)P-transport

  1. Ställ in fluorimetern (excitation och utsläppsvåglängd, bandbredd, anskaffningstid, tidsupplösning) som gjorts för PS-överföringsanalysen. På samma sätt, använd samma buffert, cuvette och liposomer för att utföra experimenten under konstant omrörning vid samma temperatur.
  2. Blanda 30 μL L B-liposomfjädring och NBD-PHFAPP med förvärmd HKM-buffert i cuvette för att erhålla en slutlig volym på 570 μL (200 μM totala lipider, 250 nM NBD- PHFAPP). När provet har uppnåtts börjar du mäta och injicera 30 μL LA liposomfjädring efter 1 min. Efter 3 min injicera LTP av intresse (slutlig koncentration på 200 nM) och spela in signalen.
  3. Utför ett andra experiment för att normalisera NBD-signalen. Blanda 30 μL LB-Eq liposomfjädring med 250 nM NBD-PHFAPP i 570 μL HKM-buffert. Efter 1 min, injicera 30 μL LA-Eq liposom suspension.
    OBS: Här motsvarar NBD-signalen, kallad FEq,den som bör mätas om PI(4)P var helt jämvikt mellan LA- och L B-liposomer.
  4. Konvertera de kinetiska kurvorna för att bestämma mängden PI(4)P (i μM) som överförts från LB till LA liposomer över tid. Varje datapunkt (F) normaliseras med hjälp av formel 5 där F0 motsvarar NBD-signalen före tillsats av en LTP, och FEq är signalen mätt i steg 6.3.
    OBS: Mängden PI(4)P (i μM) som överförs från LB till L A-liposomer motsvarar 2,5 × FNorm,med tanke på att jämvikten motsvarar en situationdär ena halvan av PI(4)P i L B-liposomens yttre broschyr ( dvs. 0,5 × 5 μM) har överförts i LA liposomer.

7. Analys av kinetiska kurvor

  1. Kvantifiera i vilken utsträckning en LTP är effektiv genom att bestämma hur snabbt denna LTP överför lipider från en liposompopulation till den andra under de första sekunderna efter injektionen till cuvette.
    1. Utför en linjär regression av de första datapunkterna i överföringskinetiken för att få en lutning. Dividera lutningsvärdet med LTP-koncentrationen i reaktionsblandningen för att bestämma antalet lipidmolekyler som överförs per protein per tidsenhet (min eller s).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figure 1
Figur 1: Beskrivning av fluorescerande lipidsensorer och in vitro-analyser. (A) Tredimensionella modeller av NBD-C2Lakt och NBD-PHFAPP baserat på kristallstrukturen i C2-domänen för bovint laktadin (PDB-ID: 3BN648)och NMR-strukturen i PH-domänen för det mänskliga FAPP1-proteinet (PDB ID: 2KCJ46). En N,N'-dimetyl-N-(tioacetyl)-N'-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)etylendiamin moiety, byggd manuellt och energiskt minimerad, ympades på tiolfunktionen hos C352 (NBD-C2 Lact ) och C13 (NBD-PHFAPP)rester (representerade som sfärer, med kol i grönt, kväve i blått, syre i rött, svavel igultoch väte i vitt). Ytan på lipidbindningsstället för varje sond var färgad i blått. B)Extraktionsanalyser. I PS extraktionsanalysen inkuberades PC/PS-liposomer (98/2 mol/mol) med 250 nM NBD-C2Lact. I avsaknad av extraktion, sonden starkt bunden till liposomerna, vilket resulterar i en blå förskjutning av NBD fluorescens och en ökning av dess utsläpp intensitet. Om PS-extraktion inträffade i närvaro av en LTP (t.ex. Osh6p), var sonden dissociated från liposomerna och dess fluorescens lägre. I PI(4)P extraktionsanalysen dopade liposomer med 2 mol% PI(4)P och 250 nM NBD-PHFAPP användes. C)FRET-baserade lipidtransportanalyser. I PS-transporttestet inkuberades PC/PS/Rhod-PE-liposomer (93/5/2 mol/mol, LA)med 250 nM NBD-C2Lact. PC liposomer (LB),dopade eller inte med 5 mol% PI(4)P, och Osh6p lades sekventiellt till vid t = 1 min respektive t = 4 min. Om PS-transport sker framkallar detta en utsläckning av NBD-signalen som motsvarar flyttning av NBD-C2-laktfrån LA till L B-liposomer. I PI(4)P transportanalysen var LB liposomer dopade med 5 mol% PI(4)P inkuberade med 250 nM NBD-PHFAPP. PC liposomer (LA)dopade eller inte med 5 mol% PS lades till. Om PI(4)P-transport sker orsakar detta en släckning av NBD-signalen på grund av flyttning av NBD-PHFAPP från LB till L A-liposomer. Förkortningar: NBD = 7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol fluorofor; NMR = kärnmagnetisk resonans; FAPP1 = fyrafosfatadapterprotein 1; PDB = Protein Data Bank; PS= fosfatidylserin; PC = fosfatidylkolin; LTP = lipidöverföringsprotein; Osh6p = oxysterolbindande protein (OSBP) homolog 6 protein; PI(4)P = fosfatidylinositol 4-fosfat. FRET = fluorescens resonans energiöverföring; Rhod-PE = rhodaminmärkt fosfatidyletanolamin. LEn liposom = liposomer bestående av PC, dopade med 2 mol% Rhod-PE och innehållande eller inte 5 mol% PS; LB liposomer = liposomer med 5 mol% PI(4)P. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2A visar en SDS-PAGE-analys av produkter från olika steg som leder till rening avC2-lakt. Lane 1 visar proteinprofilen hos de lysade bakterierna som uttrycker GST-C2Lact (~ 44,8 kDa), medan körfält 2 respektive 3 visar proteinprofilerna hos supernatant och bakterieskräp efter ultracentrifugation. Jämförelsen av dessa körfält visar att GST-C2Lact har återvunnits i supernatanten och därmed kan isoleras med glutation-länkade agarose pärlor. Körfälten 4 och 5 visar supernatantens proteinprofiler efter inkubation med pärlor och tvättar som återvinns av gravitationsflödet, medan körfält 6 visar profilen för proteiner som har behållits på pärlorna. En analys av dessa körfält visar att nästan alla GST-C2Lact har återfunnits från pärlor.

Lanes 8-12 visar närvaron av ett stort band som motsvarar C2Lact (~ 17,9 kDa) i supernatants återhämtade sig genom successiva tvättar av pärlor efter trombinbehandling. Lane 13 indikerar att icke-klyvd GST-C2Lact, tillsammans med GST (~ 26,9 kDa), förblev bunden till pärlor efter denna behandling. Jämförelsen av dessa körfält indikerar att klyvningsförfarandet, om än inte 100% effektivt, gav C2Lact som sedan fluorescerande märkts. Figur 2B visar ett ultraviolett (UV)synligt absorbansspektrum av C2-laktmärkt med NBD. Eftersom konstruktionen är 100% ren bekräftar dessa resultat att alla C2Laktmolekyler var märkta med en NBD-grupp baserad på den optiska densiteten mätt vid 280 nm (Trp) och 495 nm (NBD). Renheten hos NBD-C2Lact och dess fluorescens bestämdes av SDS-PAGE-analys(figur 2C).

Figure 2
Figur 2: NBD-C2Laktrening. (A) SDS-PAGE-analys användes för att kontrollera förekomsten av proteinet i olika steg i reningsproceduren före märkning. Pilspetsarna anger positionen för C2Lact-domänen (röd pilspets), enbart för GST (grå pilspets) och gst-C2-laktkonstruktionen (svart pilspets). B) UV-synligt absorbansspektrum avNBD-C2-lakt . C) SDS-PAGE-analys av den renade NBD-C2-lakten. Den första bilden förvärvades under UV-belysning utan färgning och avslöjar närvaron av NBD-C2Laktkonstruktionen eftersom den avger fluorescens. Den andra bilden visar samma gel efter en proteinfärgningsprocedur (se materialförteckningen). Förkortningar: NBD = 7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol fluorofor; NBD-C2Lakt = N,N'-dimetyl-N-(tiotaketyl)-N'-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-4-0 etylendiamin som är kopplad till tiolfunktionen hos C352-rester av en återengineererad version av C2-området för bovint laktadin (PDB-ID: 3BN648), PDB = Protein Data Bank; SDS-PAGE = natriumdcylsulfatpolyakrylamidgelelektrofores; GST = glutation S-transferase; MW = markör för molekylviktsstorlek; UV = ultraviolett. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figur 3 visar resultaten från PS- och PI(4)P-extraktionsanalyser med hjälp av Osh6p. När endast inkuberas med liposomer som innehåller 2 mol% PS, var fluorescensen av NBD-C2 Lact maximal eftersom NBD-fluorforen sattes in i membranet (dvs. ett hydrofobiskt sammanhang), vilket indikerar attsensorn var membranbunden. I närvaro av Osh6p var fluorescensen lägre och jämförbar med den som mättes med rena PC-liposomer (figur 3A). Normaliseringen av intensitetsvärden vid 536 nm indikerade att ~75% av tillgänglig PS extraherades. I den andra analysen blandades NBD-PHFAPP med liposomer som innehåller 2 mol% PI(4)P. NBD-signalen var hög utan Osh6p, men låg när Osh6p var närvarande och liknade den som uppmättes med PI(4)P-fria liposomer (figur 3B). En analys av intensiteten visade att ~100% av tillgängliga PI(4)P extraherades av LTP.

Figure 3
Figur 3:Extraktionsanalyser. (A) Fluorescensspektra av NBD-C2-lakt (250 nM) mätt vid excitation vid 460 nm i närvaro av liposomer (80 μM, 2 mol% PS) i frånvaro eller närvaro av 3 μM Osh6p. Referensspektra spelades in med rena PC-liposomer inkuberade eller inte med NBD-C2Lact (vänster panel). Flera spektra registrerades från olika serier av brunnar, korrigeras genom subtrat bakgrundsspridningssignalen från DOPC liposomer ensam och genomsnittliga (n = 4, ± SEM). Procentandelen tillgänglig PS som extraherades anges (höger panel). B) Fluorescensspektra av NBD-PHFAPP (250 nM) blandat med liposomer (80 μM, 2 mol% PI(4)P) i frånvaro eller närvaro av 3 μM Osh6p. Referensspektra inspelat med PC-liposomer i närvaro och frånvaro av sensorn visas (vänster panel). Flera spektra registrerades från olika serier av brunnar, korrigeras genom subtrat bakgrundsspridningssignalen från DOPC liposomer ensam och genomsnittliga (n = 4, ± SEM). Procentandelen tillgängliga PI(4)P som extraherades anges (höger panel). Förkortningar: NBD = 7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol fluorofor; NBD-C2Lakt = N,N'-dimetyl-N-(tiotaketyl)-N'-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-4-0 etylendiamin som är kopplad till tiolfunktionen hos C352-rester av en återengineererad version av C2-området för bovint laktadin (PDB-ID: 3BN648), PDB = Protein Data Bank; PS= fosfatidylserin; PC = fosfatidylkolin; DOPC = dioleoylphosphatidylcholine; Osh6p = oxysterolbindande protein (OSBP) homolog 6 protein; PI(4)P = fosfatidylinositol 4-fosfat. SEM = standardfel av medelvärdet; a.u. = godtyckliga enheter. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figur 4A visar typiska resultat från en PS-överföringsanalys med Osh6p som LTP. Vid nollpunkten blandades NBD-C2Lact med L A-liposomer som innehöll 5 mol% 16:0/18:1-PS (POPS) och 2 mol% Rhod-PE i en volym av 570 μL HKM-buffert vid 30 °C. Som sonden bunden till LA liposomer släcktes dess signal på grund av FRET med Rhod-PE närvarande i dessa liposomer. Efter en minut tillsattes Rhod-PE-fria L B-liposomer (30 μL). Detta förväntades endast framkalla en liten förändring i signalen på grund av ljusspridning av denna andra liposompopulation och/eller en utspädningseffekt. Signalintensiteten efter tillsats av L B-liposomerna motsvarar F0. Injektionen av några μL av en stamlösning av Osh6p (vanligtvis 40 μM) för att späda ut 200 nM av proteinet i reaktionsblandningen framkallade en långsam ökning av NBD-signalen på grund av att fluorforen tömdes eftersom PS transporterades från LA till L B-liposomer, vilket främjade flyttning av NBD-C2-lakt .

När LB liposomer innehöll 5 mol% PI(4)P, var avsläckningen mycket snabbare, eftersom PS överfördes snabbare av Osh6p till LB liposomer på grund av motutbytet av PS med PI(4)P av LTP (andra kurvan). Den tredje kurvan motsvarar ett experiment där NBD-C2Lact blandades med lika stora mängder LA-Eq och LB-Eq liposomer. Signalen var högre än F0 och motsvarade en situation där sonden var jämnt bunden till LA och LB liposomer, vilket återspeglar en situation där PS var helt jämvikt mellan de två populationerna av liposomer. FEq beräknades genom att beräkna värdet på signalen mätt under experimentets sista 5 minuter.

Figure 4
Figur 4:Typisk PS-transportkinetik mätt med Osh6p och referenskurva. ( A) LB liposomer utan PI(4)P (200 μM totala lipider) och Osh6p (200 nM) tillsattes sekventiellt till en cuvette innehåller NBD-C2Lakt (250 nM) och LA liposomer (200 μM) dopade med 5 mol% PS och 2 mol% Rhod-PE (vänster kurva). Samma experiment utfördes med LB liposomer dopade med 5 mol% PI(4)P (mitten kurva). För att bestämma FEq,NBD-C2Lact (250 nM) var förblandad med LA-Eq liposomer; sedan lades LB-Eq liposomer till (höger kurva). B) Genomsnittliga PS-transportkurvor som bestäms efter normaliseringen av flera mätningar som utförts med L B-liposomer med eller utan PI(4)P (medelvärde ± SEM, n=3). c) Initiala PS-överföringshastigheter (± SEM, n=3). Förkortningar: NBD = 7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol fluorofor; NBD-C2Lakt = N,N'-dimetyl-N-(tiotaketyl)-N'-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-4-0 etylendiamin som är kopplad till tiolfunktionen hos C352-rester av en återengineererad version av C2-området för bovint laktadin (PDB-ID: 3BN648), PDB = Protein Data Bank; PS= fosfatidylserin; Osh6p = oxysterolbindande protein (OSBP) homolog 6 protein; PI(4)P = fosfatidylinositol 4-fosfat. Rhod-PE = rhodaminmärkt fosfatidyletanolamin. LEn liposom = liposomer bestående av fosfatidylkolin, dopad med 2 mol% Rhod-PE och innehållande eller inte 5 mol% PS; LB liposomer = liposomer med 5 mol% PI(4)P; F = fluorescens; F0 = fluorescens motsvarande NBD före tillsats av Osh6p; FEq = fluorescenssignal om PS är helt jämvikt mellan LA- och LB-liposomer genom en överföringsprocess. SEM = standardfel av medelvärdet. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figur 4B visar genomsnittliga kinetiska kurvor för PS-överföring från L A-liposomer till LB-liposomer, dopade eller inte dopade med PI(4)P efter normaliseringen av F-data med F0 och FEq som referensvärden. Den ursprungliga transporthastigheten för varje experiment beräknades genom att de ursprungliga datapunkterna mättes efter injektionen av proteinet med en linjär funktion. Figur 4C visar den genomsnittliga initiala PS-transporthastigheten som bestäms av tre olika experiment med L B-liposomer med eller utan PI(4)P. När LB liposomer innehöll 0 och 5 mol% PI(4)P, var satserna lika med 1,4 och 15,8 PS.min-1 per Osh6p molekyl. Figur 5A visar typiska resultat från en PI(4)P-överföringsanalys med Osh6p som ltp, som utfördes med samma material och villkor som de som användes för PS-transportanalysen.

Figure 5
Figur 5:Typisk PI(4)P transportkinetik mätt med Osh6p och referenskurva. (A) PS-fria liposomer som innehåller 2 mol% Rhod-PE (LA,200 μM totala lipider) och Osh6p (200 nM) lades sekventiellt till en cuvette som innehåller NBD-PHFAPP (250 nM) och LB liposomer (200 μM) dopade med 5 mol% PI(4)P (vänster kurva). Samma experiment utfördes med LA liposomer dopade med 5 mol% PS (mittenkurva). För att fastställa FEq,NBD-PHFAPP (250 nM) var förblandad med LB-Eq liposomer; sedan lades LA-Eq liposomer till (höger kurva). (B) PI(4)P överföringskinetik bestämd efter normalisering av flera mätningar av L A-liposomer med eller utan PS (medelvärde ± SEM, n=3). C)Initiala PI(4)P överföringshastigheter (± SEM, n=3). Förkortningar: NBD = 7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol fluorofor; NBD-PHFAPP = NBD-märkt pleckstrinhomologidomän för humant fyrafosfatadapterprotein 1 (FAPP1, UniProt: Q9HB20, segment [1-100]); PS= fosfatidylserin; Osh6p = oxysterolbindande protein (OSBP) homolog 6 protein; PI(4)P = fosfatidylinositol 4-fosfat. Rhod-PE = rhodaminmärkt fosfatidyletanolamin. LEn liposom = liposomer bestående av fosfatidylkolin, dopad med 2 mol% Rhod-PE och innehållande eller inte 5 mol% PS; LB liposomer = liposomer med 5 mol% PI(4)P; F = fluorescens; F0 = fluorescens motsvarande NBD före tillsats av Osh6p; FEq = fluorescenssignal om PI(4)P är helt jämvikt mellan LA- och LB-liposomer genom en överföringsprocess. SEM = standardfel av medelvärdet. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Vid nollpunkten blandades NBD-PHFAPP med LB liposomer som innehåller 5 mol% PI(4)P i en volym av 570 μL HKM-buffert. Eftersom NBD-PHFAPP var bunden till LB liposomer, var dess signal hög. Efter en minuttillsattes L A-liposomer (30 μL), vilket förväntades endast framkalla en liten förändring i signalen. Intensiteten motsvarade sedan F0. Injicera Osh6p (200 nM slutlig koncentration) i reaktionsblandningen utlöste en släckning av NBD-signalen på grund av flyttning av NBD-PHFAPP-molekyler till LA-liposomer eftersom PI(4)P överfördes från LB-liposomer till LA-liposomer. När LA liposomer innehöll 5 mol% POPS, var avsläckningen mycket snabbare på grund av en snabbare PI(4)P överföring som härrör från PS / PI (4) P utbyte. Den tredje kurvan motsvarar ett experiment där NBD-PHFAPP blandades med lika stora mängder LA-Eq och LB-Eq liposomer.

Signalen var lägre än F0 eftersom den motsvarade en situation där sonden var jämnt bunden till LA- och L B-liposomer, vilket tyder på en fullständig jämvikt av PI(4)P mellan liposomerna. FEq beräknades genom att beräkna värdet på signalen mätt under experimentets sista 5 minuter. Figur 5B, C visar genomsnittliga kinetiska kurvor som erhållits efter signalnormalisering och genomsnittlig PI(4)P initial överföringshastigheter mätt med LA liposomer som dopades eller inte dopades med 5 mol% PS. Här är det värt att notera att båda lipidliganderna transporterades snabbare och med liknande hastigheter när varje lipid ursprungligen fanns i LA- respektive LB-membran, vilket indikerar att Osh6p är en PS / PI (4) P-växlare.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Resultaten av dessa analyser förlitar sig direkt på signalerna från fluorescerande lipidsensorer. Reningen av dessa sonder märkta med ett 1:1-förhållande med NBD och utan gratis NBD-fluorforförorening är därför ett kritiskt steg i detta protokoll. Det är också obligatoriskt att kontrollera om det ltp som är under granskning är korrekt vikt och inte aggregerat. Mängden LTP som testas i extraktionsanalyserna måste vara lika med eller högre än mängden tillgängliga PS- eller PI(4)P-molekyler för att korrekt mäta om denna LTP effektivt extraherar dessa lipider. NBD-C2 Lact och NBD-PHFAPP binder till PS respektive PI(4)P enligt en klassisk mättnadsbindningskurva. Med tanke på deras respektive affiniteter för PS och PI(4)P förblir dessa sonder till stor del bundna till liposomerna även om liposomerna innehåller kvarvarande spår av dessa ligander. Detta kan leda till den felaktiga slutsatsen att en LTP inte effektivt extraherar dessa lipider. Protokollet förlitar sig på standard- och kommersiellt tillgängliga PC-, PS- och PI(4)P-underarter som är 18:1/18:1-PC, 16:0/18:1-PS respektive 16:0/16:0-PI(4)P. Att utföra experiment med lipidarter med andra aylkedjor kan ge olika resultat, som tidigare rapporterats12,35.

Om bulklipidkompositionen (med inte med tanke på PS eller PI(4)P) av LA- och LB-liposomer måste modifieras i överföringsanalyserna, är det viktigt att även utföra kontrollexperimenten med liposomerna LA-Eq och LB-Eq med en bulksammansättning som liknar LA- och L B-liposomer. respektive. Samma princip gäller för extraktionsanalyserna. Genetiskt kodade fluorescerande lipidbindande domäner används i stort sett för att analysera lipidfördelning inuticellerna 44. Försiktighet rekommenderas vid analys av sådana experiment som associering av dessa lipidsonder med membranet, även om de främst drivs av närvaron av den riktade lipiden, kan påverkas av andra parametrar (densitet av anjoniska lipider, lipidpackning) som skiljer sig mellan cellfack. I dessa in vitro-analyser är sammansättningen av liposomer mycket enklare än för cellmembran: de är mestadels gjorda av PC, en zwitterionic lipid, och exponerar därmed en ganska inert yta som inte påverkar hur PS och PI(4)P känns igen av deras motsvarande sensor. PHFAPP kan användas i närvaro av anjoniska lipider, såsom PS, fosfatidsyra (PA) och PI32, och C2Lact känner inte igen PI(4)P12; Båda dessa observationer möjliggör opartiska mätningar av PS/PI(4)P utbyte. NBD-PHFAPP påverkas inte av sterol43.

Det är dock inte känt om dessa sonder, i synnerhet NBD-C2 Lact , kan användas med liposomer med extrema egenskaper(t.ex. mycket låg eller hög lipidpackning, mycket negativtladdadyta, närvaro av lipiddomäner). Trots denna potentiella begränsning när det gäller liposomsammansättning har dessa överföringsanalyser baserade på fluorescerande sensorer enorma fördelar jämfört med andra metoder. För det första förlitar de sig inte på fluorescerande märkta PS och PI(4)P som har en extra skrymmande grupp och sannolikt inte är ordentligt tillgodosedda av bindningsfickan på ltps. För det andra erbjuder dessa analyser mycket bättre tidsupplösning än metoder baserade på liposomseparation (radioaktivitetsbaserade analyser45 eller masspektrometri33), och det bör noteras att radiomärkt PI(4)P och PS inte är kommersiellt tillgängliga. Ett proteins förmåga att överföra PS eller PI(4)P påverkas inte av associationen av fluorescerande sensorer med liposomer. Om mängden NBD-C2-lakteller NBD-PHFAPP och PS och PI(4)P i den yttre broschyren med liposomer som är tillgänglig för LTP beaktas, är endast 5 % av PS eller PI(4)P associerade med sond under en kinetisk mätning.

Dessutom täcks endast 0,55-0,86% av membranytan av sonden, med tanke på liposomernas totala yta (LA+L B-liposomer; 5,1 ×10 16 nm 2 med en yta på 0,7 nm2 per lipid), den membranyta som en enskild C2- eller PH-molekyl kan uppta (≈3,1 respektive 4,8 nm2,beräknad frånreferenserna 46 , 47,48) och deras koncentration (250 nM). Således är principerna bakom dessa analyser anpassade för att korrekt analysera de kinetiska och mekanistiska aspekterna av LTPs. Som nämnts i introduktionen kan förändringar i aktiviteten hos ORP5/8 leda till cellulära dysfunktioner49. Till exempel verkar invasiviteten hos bukspottskörtelcancerceller förlita sig på nivån av ORP5-uttryck. Dessutom finns det ett orsakssambandet mellan höga nivåer av ORP5-uttryck och den dåliga prognosen för mänsklig bukspottskörtelcancer. En hög nivå av ORP5 uttryck upptäcks också i lung tumör vävnader, och särskilt, i ögonbevarande fall. Intressant nog kan ORP5: s förmåga att överföra lipider förklara varför det främjar cellproliferation och migrering.

ORP5 uppreglerar däggdjursmålet för rapamycinkomplexet 1 (mTORC1), som spelar en central roll i cellöverlevnad och spridning, förmodligen för att det förbättrar aktiviteten hos Akt, en uppströms aktivator av mTORC1, genom att förse statsministern med PS. Sammantaget tyder dessa observationer på att ORP5 kan vara ett intressant farmakologiskt mål, och att dessa in vitro-analyser kan tjäna till att screena molekyler som kan hämma dess aktivitet. Denna analys kan också bidra till att bättre definiera om andra medlemmar av ORP/Osh-familjen är PS/PI(4)P-växlare. Noterbart är att ORP10 befanns kapsla in PS in vitro och överföra PS på ER-Golgi-kontaktplatserna27,50, men det är fortfarande okänt om det fungerar som en PS / PI (4) P-växlare. Dessutom kan dessa protokoll tjäna till att utforska förmågan hos LTPs som tillhör andra familjer att transportera PI(4)P, vilket nyligen visades med steroidogena akuta regulatoriska överföringsliknandeproteiner 10, eller PS. Dessutom har NBD-PHFAPP använts för att följa LTP: s förmåga att transportera PI (4,5)P2 mellan liposomer, eftersom det erkänner denna PIP10, 35. I artikel 35 i eu 20 Slutligen skulle denna strategi kunna anpassas för att mäta andra extraktions- eller transportprocesser in vitro med hjälp av andra lipidbindande domäner(t.ex. en icke-katalytisk PI-PLC för att upptäcka PI51,sporuleringsspecifikt protein 20-fragment för att upptäcka PA52,domän 4 (D4) perfringolysin O för att upptäcka sterol53).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att det inte finns några intressekonflikter.

Acknowledgments

Vi är tacksamma mot dr A. Cuttriss för hennes noggranna korrekturläsning av manuskriptet. Detta arbete finansieras av det franska nationella forskningsorganet ExCHANGE (ANR-16-CE13-0006) och av CNRS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 L-cysteine ≥97 % (FG)  Sigma W326305-100G Prepare a 10 mM L-cysteine stock solution in water. Aliquots are stored at -20 °C
2 mL Amber Vial, PTFE/Rub Lnr, for lipids storage in CHCL3 Wheaton W224681
4 mm-diameter glass beads Sigma Z265934-1EA
50 mL conical centrifuge tube Falcon
ÄKTA purifier GE healthcare FPLC
Aluminium foil
Amicon Ultra-15 with a MWCO of 3 and 10 kDa Merck UFC900324, UFC901024
Amicon Ultra-4 with a MWCO of 3 and 10 kDa Merck UFC800324, UFC801024
Ampicillin Prepare a 50 mg/mL stock solution with filtered and sterilized water and store it at -20 °C.
Bestatin Sigma B8385-10mg
BL21 Gold Competent Cells Agilent
C16:0 Liss  (Rhod-PE) in CHCl3 (1 mg/mL) Avanti Polar Lipids 810158C-5MG
C16:0/C16:0-PI(4)P   Echelon Lipids P-4016-3 Dissolve 1 mg of C16:0/C16:0-PI(4)P powder in 250 µL of MeOH and 250 µL of CHCl3. Then complete with CHCl3 to 1 mL. The solution must become clear.
C16:0/C18:1-PS (POPS) in CHCl3 (10 mg/mL) Avanti Polar Lipids 840034C-25mg
C18:1/C18:1-PC (DOPC) in CHCl3 (25 mg/mL) Avanti Polar Lipids 850375C-500mg
CaCl2  Sigma Prepare 10 mM CaCl2 stock solution in water.
Cell Disruptor Constant Dynamics
Chloroform (CHCl3) RPE-ISO Carlo Erba 438601
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail Roche 5056489001
Deionized (Milli-Q) water
Dimethylformamide (DMF), anhydrous, >99% pure
DNAse I Recombinant, RNAse free, in powder Roche 10104159001
DTT Euromedex EU0006-B Prepare 1 M DTT stock solution in Milli-Q water.  Prepare 1 mL aliquots and store them at -20 °C. 
Econo-Pac chromatography columns (1.5 × 12 cm). Biorad 7321010
Electroporation cuvette 2 mm Ozyme EP102
Electroporator Eppendorf 2510 Eppendorf
Fixed-Angle Rotor Ti45 and Ti45 tubes Beckman Spinning the batcerial lysates
Glass-syringes (10, 25, and 50 µL) for fluorescence experiment Hamilton
Glass-syringes (25 , 100, 250, 500, and 1000 µL) to handle lipid stock solutions Hamilton 1702RNR, 1710RNR, 1725RNR, 1750RN type3, 1001RN
Glutathione Sepharose 4B beads GE Healthcare 17-0756-05
Glycerol (99% pure) Sigma G5516-500ML
Hemolysis tubes with a cap
HEPES , >99 % pure Sigma H3375-500G
Illustra NAP 10 desalting column GE healthcare GE17-0854-02
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)  Euromedex EU0008-B Prepare 1 M IPTG stock solution in Milli-Qwater. Prepare 1 mL aliquots and store them at -20 °C. 
K-Acetate Prolabo 26664.293
Lennox LB Broth medium without glucose Prepared with milli-Q water and autoclaved.
Liquid nitrogen Linde
Methanol (MeOH) ≥99.8% VWR 20847.24
MgCl2 Sigma Prepare a 2 M MgCl2 solution. Filter the solution using a 0.45 µm filter. 
Microplate 96 Well PS F-Botom Black Non-Binding Greiner Bio-one 655900
Mini-Extruder with two 1 mL gas-tight Hamilton syringes Avanti Polar Lipids 610023
Monochromator-based fluorescence plate reader TECAN M1000 Pro
N,N'-Dimethyl-N-(Iodoacetyl)-N'-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Ethylenediamine) (IANBD Amide) Molecular Probes Dissolve 25 mg of IANBD in 2.5 mL of dimethylsulfoxide (DMSO) and prepare 25 aliquot of 100 µL in 1.5 mL screw-cap tubes. Do not completely screw the cap. Then, remove DMSO in a freeze-dryer to obtain 1 mg of dry IANBD per tube. Tubes are closed and stored at -20 °C in the dark.  
NaCl Sigma S3014-1KG
PBS 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM NaH2PO4, 1.8 mM KH2PO4, autoclaved and stored at 4 °C.
Pear-shaped glass flasks (25 mL, 14/23, Duran glass) Duran Group
Pepstatin Sigma p5318-25mg
pGEX-C2LACT  plasmid Available on request from our lab
pGEX-PHFAPP plasmid Available on request from our lab
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) ≥98.5% (GC) Sigma P7626-25g Prepare a 200 mM PMSF stock solution in isopropanol
Phosphoramidon Sigma R7385-10mg
Polycarbonate filters (19 mm in diameter) with pore size of 0.2 µm Avanti Polar Lipids 610006
Poly-Prep chromatography column (with a 0-2 mL bed volume and a 10 mL reservoir) Biorad 7311550
Prefilters (10 mm in diameter). Avanti Polar Lipids 610014
PyMOL http://pymol.org/ Construction of the 3D models of the proteins (Figure 1A)
Quartz cuvette for UV/visible fluorescence (minimum volume of 600 µL) Hellma
Quartz cuvettes Hellma
Refrigerated centrifuge  Eppendorf 5427R Eppendorf
Rotary evaporator Buchi B-100
Screw-cap microcentriguge tubes (1.5 mL) Sarsted
Small magnetic PFTE stirring bar (5 × 2 mm)
Snap-cap microcentriguge tubes (0.5, 1, and 2 mL) Eppendorf
SYPRO orange fluorescent stain to detect protein in SDS-PAGE gel
Thermomixer Starlab
THROMBIN, FROM HUMAN PLASMA Sigma 10602400001 Dissolve 20 units in 1 mL of milli-Q water and prepare 25 µL aliquots in 0.5 mL Eppendorf tubes. Then freeze and store at -80 °C.
Tris, ultra pure MP 819623
Ultracentrifuge L90K Beckman
UV/Visible absorbance spectrophotometer SAFAS
UV/visible spectrofluorometer with a temperature-controlled cell holder and stirring device Jasco or Shimadzu Jasco FP-8300 or Shimadzu RF-5301PC
Vacuum chamber
Water bath Julabo
XK 16/70 column packed with Sephacryl S200HR GE healthcare

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Drin, G. Topological regulation of lipid balance in cells. Annual Review of Biochemistry. 83, 51-77 (2014).
  2. Bigay, J., Antonny, B. Curvature, lipid packing, and electrostatics of membrane organelles: defining cellular territories in determining specificity. Developmental Cell. 23 (5), 886-895 (2012).
  3. Prinz, W. A. Lipid trafficking sans vesicles: where, why, how. Cell. 143 (6), 870-874 (2010).
  4. Holthuis, J. C., Menon, A. K. Lipid landscapes and pipelines in membrane homeostasis. Nature. 510 (7503), 48-57 (2014).
  5. Wong, L. H., Copic, A., Levine, T. P. Advances on the transfer of lipids by lipid transfer proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 516-530 (2017).
  6. Wong, L. H., Gatta, A. T., Levine, T. P. Lipid transfer proteins: the lipid commute via shuttles, bridges and tubes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (2), 85-101 (2019).
  7. Iaea, D. B., Dikiy, I., Kiburu, I., Eliezer, D., Maxfield, F. R. STARD4 membrane interactions and sterol binding. Biochemistry. 54 (30), 4623-4636 (2015).
  8. Wilhelm, L. P., et al. STARD3 mediates endoplasmic reticulum-to-endosome cholesterol transport at membrane contact sites. The EMBO Journal. 36 (10), 1412-1433 (2017).
  9. Bian, X., Saheki, Y., De Camilli, P. Ca(2+) releases E-Syt1 autoinhibition to couple ER-plasma membrane tethering with lipid transport. The EMBO Journal. 37 (2), 219-234 (2018).
  10. Horenkamp, F. A., Valverde, D. P., Nunnari, J., Reinisch, K. M. Molecular basis for sterol transport by StART-like lipid transfer domains. The EMBO Journal. 37 (6), 98002 (2018).
  11. Jentsch, J. A., et al. Structural basis of sterol binding and transport by a yeast StARkin domain. The Journal of Biological Chemistry. 293 (15), 5522-5531 (2018).
  12. Moser von Filseck, J., et al. INTRACELLULAR TRANSPORT. Phosphatidylserine transport by ORP/Osh proteins is driven by phosphatidylinositol 4-phosphate. Science. 349 (6246), 432-436 (2015).
  13. Daum, G., et al. Systematic analysis of yeast strains with possible defects in lipid metabolism. Yeast. 15 (7), 601-614 (1999).
  14. Ejsing, C. S., et al. Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).
  15. Leidl, K., Liebisch, G., Richter, D., Schmitz, G. Mass spectrometric analysis of lipid species of human circulating blood cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1781 (10), 655-664 (2008).
  16. Sampaio, J. L., et al. Membrane lipidome of an epithelial cell line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (5), 1903-1907 (2011).
  17. Vance, J. E., Steenbergen, R. Metabolism and functions of phosphatidylserine. Progress in Lipid Research. 44 (4), 207-234 (2005).
  18. Zinser, E., et al. Phospholipid synthesis and lipid composition of subcellular membranes in the unicellular eukaryote Saccharomyces cerevisiae. Journal of Bacteriology. 173 (6), 2026-2034 (1991).
  19. Leventis, P. A., Grinstein, S. The distribution and function of phosphatidylserine in cellular membranes. Annual Review of Biophysics. 39, 407-427 (2010).
  20. Yeung, T., et al. Membrane phosphatidylserine regulates surface charge and protein localization. Science. 319 (5860), 210-213 (2008).
  21. Kim, J., Shishido, T., Jiang, X., Aderem, A., McLaughlin, S. Phosphorylation, high ionic strength, and calmodulin reverse the binding of MARCKS to phospholipid vesicles. Journal of Biological Chemistry. 269 (45), 28214-28219 (1994).
  22. Sigal, C. T., Zhou, W., Buser, C. A., McLaughlin, S., Resh, M. D. Amino-terminal basic residues of Src mediate membrane binding through electrostatic interaction with acidic phospholipids. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (25), 12253-12257 (1994).
  23. Gal Bivona, T., et al. PKC regulates a farnesyl-electrostatic switch on K-Ras that promotes its association with Bcl-XL on mitochondria and induces apoptosis. Molecular Cell. 21 (4), 481-493 (2006).
  24. Finkielstein, C. V., Overduin, M., Capelluto, D. G. Cell migration and signaling specificity is determined by the phosphatidylserine recognition motif of Rac1. The Journal of Biological Chemistry. 281 (37), 27317-27326 (2006).
  25. Bolsover, S. R., Gomez-Fernandez, J. C., Corbalan-Garcia, S. Role of the Ca2+/Phosphatidylserine Binding Region of the C2 Domain in the Translocation of Protein Kinase Cα to the Plasma Membrane. Journal of Biological Chemistry. 278 (12), 10282-10290 (2003).
  26. Vance, J. E., Tasseva, G. Formation and function of phosphatidylserine and phosphatidylethanolamine in mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1831 (3), 543-554 (2013).
  27. Maeda, K., et al. Interactome map uncovers phosphatidylserine transport by oxysterol-binding proteins. Nature. 501 (7466), 257-261 (2013).
  28. D'Ambrosio, J. M., et al. Osh6 requires Ist2 for localization to ER-PM contacts and efficient phosphatidylserine transport in budding yeast. Journal of Cell Science. 133 (11), 243733 (2020).
  29. Manford, A. G., Stefan, C. J., Yuan, H. L., Macgurn, J. A., Emr, S. D. ER-to-plasma membrane tethering proteins regulate cell signaling and ER morphology. Developmental Cell. 23 (6), 1129-1140 (2012).
  30. Collado, J., et al. Tricalbin-mediated contact sites control ER curvature to maintain plasma membrane integrity. Developmental Cell. 51 (4), 476-487 (2019).
  31. Hoffmann, P. C., et al. Tricalbins contribute to cellular lipid flux and form curved ER-PM contacts that are bridged by rod-shaped structures. Developmental Cell. 51 (4), 488-502 (2019).
  32. Lipp, N. F., et al. An electrostatic switching mechanism to control the lipid transfer activity of Osh6p. Nature Communications. 10 (1), 3926 (2019).
  33. Chung, J., et al. INTRACELLULAR TRANSPORT. PI4P/phosphatidylserine countertransport at ORP5- and ORP8-mediated ER-plasma membrane contacts. Science. 349 (6246), 428-432 (2015).
  34. Sohn, M., et al. PI(4,5)P2 controls plasma membrane PI4P and PS levels via ORP5/8 recruitment to ER-PM contact sites. The Journal of Cell Biology. 217 (5), 1797-1813 (2018).
  35. Ghai, R., et al. ORP5 and ORP8 bind phosphatidylinositol-4, 5-biphosphate (PtdIns(4,5)P 2) and regulate its level at the plasma membrane. Nature Communications. 8 (1), 757 (2017).
  36. Sohn, M., et al. Lenz-Majewski mutations in PTDSS1 affect phosphatidylinositol 4-phosphate metabolism at ER-PM and ER-Golgi junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4314-4319 (2016).
  37. Kattan, W. E., et al. Targeting plasma membrane phosphatidylserine content to inhibit oncogenic KRAS function. Life Science Alliance. 2 (5), 00431 (2019).
  38. Du, X., Turner, N., Yang, H. The role of oxysterol-binding protein and its related proteins in cancer. Seminars in Cell & Developmental Biology. 81, 149-153 (2018).
  39. Galmes, R., et al. ORP5/ORP8 localize to endoplasmic reticulum-mitochondria contacts and are involved in mitochondrial function. EMBO reports. 17 (6), 800-810 (2016).
  40. Du, X., et al. ORP5 localizes to ER-lipid droplet contacts and regulates the level of PI(4)P on lipid droplets. The Journal of Cell Biology. 219 (1), 201905162 (2020).
  41. Wang, H., et al. ORP2 delivers cholesterol to the plasma membrane in exchange for phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PI(4,5)P2). Molecular Cell. 73 (3), 458-473 (2019).
  42. Kay, J. G., Grinstein, S. Sensing phosphatidylserine in cellular membranes. Sensors (Basel). 11 (2), 1744-1755 (2011).
  43. Moser von Filseck, J., Vanni, S., Mesmin, B., Antonny, B., Drin, G. A phosphatidylinositol-4-phosphate powered exchange mechanism to create a lipid gradient between membranes. Nature Communications. 6, 6671 (2015).
  44. Wills, R. C., Goulden, B. D., Hammond, G. R. V. Genetically encoded lipid biosensors. Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1526-1532 (2018).
  45. Raychaudhuri, S., Im, Y. J., Hurley, J. H., Prinz, W. A. Nonvesicular sterol movement from plasma membrane to ER requires oxysterol-binding protein-related proteins and phosphoinositides. The Journal of Cell Biology. 173 (1), 107-119 (2006).
  46. Lenoir, M., et al. Structural basis of wedging the Golgi membrane by FAPP pleckstrin homology domains. EMBO reports. 11 (4), 279-284 (2010).
  47. Liu, Y., Kahn, R. A., Prestegard, J. H. Interaction of Fapp1 with Arf1 and PI4P at a membrane surface: an example of coincidence detection. Structure. 22 (3), 421-430 (2014).
  48. Shao, C., Novakovic, V. A., Head, J. F., Seaton, B. A., Gilbert, G. E. Crystal structure of lactadherin C2 domain at 1.7A resolution with mutational and computational analyses of its membrane-binding motif. The Journal of Biological Chemistry. 283 (11), 7230-7241 (2008).
  49. Lipp, N. F., Ikhlef, S., Milanini, J., Drin, G. Lipid exchangers: cellular functions and mechanistic links with phosphoinositide metabolism. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 663 (2020).
  50. Venditti, R., et al. Molecular determinants of ER-Golgi contacts identified through a new FRET-FLIM system. The Journal of Cell Biology. 218 (3), 1055-1065 (2019).
  51. Pemberton, J. G., et al. Defining the subcellular distribution and metabolic channeling of phosphatidylinositol. The Journal of Cell Biology. 219 (3), (2020).
  52. Nakanishi, H., de los Santos, P., Neiman, A. M. Positive and negative regulation of a SNARE protein by control of intracellular localization. Molecular Biology of the Cell. 15 (4), 1802-1815 (2004).
  53. Maekawa, M., Yang, Y., Fairn, G. D. Perfringolysin O theta toxin as a tool to monitor the distribution and inhomogeneity of cholesterol in cellular membranes. Toxins. 8 (3), 67 (2016).

Tags

Biokemi nummer 169 lipidöverföringsprotein OSSBP-relaterat protein fosfatidylserin fosfatidylinositol 4-fosfat flöjtscens rekombinant protein liposom
Fluorescensbaserade mätningar av fosfatidylserin/fosfatidylinositol 4-fosfatutbyte mellan membran
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ikhlef, S., Lipp, N. F., Magdeleine, … More

Ikhlef, S., Lipp, N. F., Magdeleine, M., Drin, G. Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes. J. Vis. Exp. (169), e62177, doi:10.3791/62177 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter