Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

מדידות מבוססות פלואורסצנטיות של פוספטידילסרין/פוספטידילינוזיטול 4-חילופי פוספט בין ממברנות

Published: March 14, 2021 doi: 10.3791/62177
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Université Côte d’Azur, Centre National de la Recherche Scientifique, Institut de Pharmacologie Moléculaire et Cellulaire
* These authors contributed equally

Summary

כאן, אנו מתארים פרוטוקולים באמצעות חיישני שומנים פלואורסצנטיים וליפוזומים כדי לקבוע אם חלבון מחלץ ומעביר פוספטידילסרין או פוספטידילינוזיטול 4-פוספט במבחנה.

Abstract

לאחרונה נמצאו מספר חברים במשפחת החלבון המחייב אוקסיסטרול (OSBP) (ORP)/OSBP(Osh) המייצגים קבוצת חלבון העברת שומנים חדשני (LTP) בשמרים ובתאים אנושיים. הם מעבירים פוספטידילסרין (PS) מן reticulum אנדופלסמי (ER) לקרום הפלזמה (PM) באמצעות PS / פוספטידילינוזיטול 4-פוספט (PI(4)P) מחזורי חילופי. ממצא זה מאפשר הבנה טובה יותר של האופן שבו נ.ב., שהוא קריטי לתהליכי איתות, מופץ ברחבי התא וחקירת הקשר בין תהליך זה לבין חילוף החומרים של פוספינוסיטיד (PIP). הפיתוח של פרוטוקולים חדשים המבוססים על פלואורסצנטיות סייע בגילוי ואפיון של מנגנון תאי חדש זה במבחנה ברמה המולקולרית. מאמר זה מתאר את הייצור והשימוש בשני חיישני שומנים מתויגים פלואורסצנטית, NBD-C2Lact ו- NBD-PHFAPP, כדי למדוד את היכולת של חלבון לחלץ PS או PI(4)P ולהעביר שומנים אלה בין ממברנות מלאכותיות. ראשית, הפרוטוקול מתאר כיצד לייצר, לתייג ולקבל דגימות טוהר גבוה של שני מבנים אלה. שנית, מאמר זה מסביר כיצד להשתמש בחיישנים אלה עם קורא מיקרו-לוח פלואורסצנטי כדי לקבוע אם חלבון יכול לחלץ PS או PI(4)P ליפוזומים, באמצעות Osh6p כמקרה מבחן. לבסוף, פרוטוקול זה מראה כיצד למדוד במדויק את הקינטיקה של PS / PI(4)P להחליף בין ליפוזומים של הרכב שומנים מוגדרים כדי לקבוע את שיעורי העברת השומנים על ידי העברת אנרגיה תהודה פלואורסצנטית (FRET) באמצעות פלואורומטר סטנדרטי.

Introduction

ההתפלגות המדויקת של שומנים בין ממברנות שונות ובתוך הממברנות של תאים אאוקריוטים1,2 יש השלכות ביולוגיות עמוקות. פענוח האופן שבו תפקוד LTPs הוא נושא חשוב בביולוגיה של התא3,4,5,6, וגישות במבחנה הן בעלות ערך רב בטיפול בבעיה זו7,8,9,10,11. כאן, אין ויטרו, אסטרטגיה מבוססת פלואורסצנטיות מוצגת כי כבר אינסטרומנטלי לקבוע כי כמה חלבוני ORP / Osh להשפיע PS / PI(4)P חילופי בין קרום התא12 ובכך מהווים סוג חדש של LTPs. PS הוא גליצריופוספוליפיד אניוני המייצג 2-10% מכלל שומנים ממברנה בתאים אוקריוטים13,14,16. הוא מופץ לאורך שיפוע בין חדר המיון לבין ראש הממשלה, שם הוא מייצג 5-7% ועד 30% של גליצריופוספוליפידים, בהתאמה17,18,19. יתר על כן, נ.ב. מרוכז בעצם בעלון הציטוטוסולי של ראש הממשלה. הצטברות זו והמחיצה הלא אחידה של PS בראש הממשלה הם קריטיים לתהליכי איתות סלולריים19. בשל המטען השלילי של מולקולות נ.ב. העלון הציטוסולי של ראש הממשלה הוא הרבה יותר אניוני מאשר העלון הציטוטוסולי של אברונים אחרים1,2,19,20. זה מאפשר גיוס, באמצעות כוחות אלקטרוסטטיים, של חלבוני איתות כגון מצע C-kinase עשיר מאלנין myristoylated (MARCKS)21, סרקומה (Src)22, קירסטן-חולדת סרקומה ויראלי אונקוגן (K-Ras)23, וראס הקשורים C3 botulinum רעלן מצע 1 (Rac1)24 המכילים רצועה של חומצות אמינו טעונות חיובית וזנב שומניד.

נ.ב. מוכר גם על ידי חלבון קונבנציונאלי קינאז C באופן סטריאו-סלקטיבי באמצעות תחום C225. עם זאת, נ.ב. מסונתז ב- ER26, המציין כי יש לייצא אותו לראש הממשלה לפני שיוכל למלא את תפקידו. לא היה ידוע כיצד זה הושג19 עד הממצא כי, בשמרים, Osh6p ו Osh7p להעביר PS מן המיון ל PM27. LTPs אלה שייכים למשפחה שמורה אבולוציונית באאוקריוטים שחבר המייסד שלהם הוא OSBP ומכיל חלבונים (ORPs בחלבוני אדם, Osh בשמרים) המשלבים תחום הקשור ל- OSBP (ORD) עם כיס לארח מולקולת שומנים. Osh6p ו Osh7p מורכבים רק מ- ORD שתכונותיו המבניות מותאמות לאגד במיוחד את נ.ב. ולהעביר אותו בין הממברנות. עם זאת, לא היה ברור כיצד חלבונים אלה העבירו את נ.ב. ממיון לראש הממשלה. Osh6p ו Osh7p יכול ללכוד PI(4)P כמו ליגנד שומניםחלופי 12. בשמרים, PI(4)P מסונתז מפוספטידילינוזיטול (PI) בגולגי ובראש הממשלה על ידי PI 4-kinases, Pik1p ו- Stt4p, בהתאמה. לעומת זאת, אין PI(4)P בקרום המיון, כמו שומנים זה הוא hydrolyzed PI על ידי פוספטאז Sac1p. לפיכך, מעבר צבע PI(4)P קיים הן בממשקי ER /Golgi והן בממשקי ER/PM. Osh6p ו- Osh7p מעבירים PS מחדר המיון לראש הממשלה באמצעות מחזורי חילופי PS/PI(4)P באמצעות מעבר צבע PI(4)P שקיים בין שתי הממברנות הללו12.

בתוך מחזור אחד, Osh6p מחלץ PS מחדר המיון, מחליף PS עבור PI(4)P בראש הממשלה ומעביר PI(4)P בחזרה לחדר המיון כדי לחלץ מולקולת PS אחרת. Osh6p/Osh7p מתקשרים עם Ist2p28, אחד החלבונים הבודדים שמחברים ומביאים את קרום המיון ואת ראש הממשלה לקרבה זה לזה כדי ליצור אתרי קשר ER-PM בשמרים29,30,31. בנוסף, הקשר של Osh6p עם ממברנות טעונות שליליות הופך חלש ברגע שהחלבון מחלץ את אחד מהליגנדים השומנים שלו עקב שינוי קונפורמציה שמשנה את התכונות האלקטרוסטטוריות שלו32. זה מסייע Osh6p על ידי קיצור זמן התעכבות הממברנה שלה, ובכך לשמור על היעילות של פעילות העברת השומנים שלה. בשילוב עם האיגוד ל- Ist2p, מנגנון זה יכול לאפשר Osh6p/7p לבצע במהירות ובדייקות חילופי שומנים בממשק ER / PM. בתאים אנושיים, חלבוני ORP5 ו- ORP8 מבצעים חילופי PS/ PI(4)P באתרי מגע ER-PM באמצעות מנגנונים ברורים33. יש להם ORD מרכזי, בדומה Osh6p, אבל הם מעוגנים ישירות לחדר המיון באמצעות קטע transmembrane מסוף C33 לעגון לתוך ראש הממשלה באמצעות N-מסוף פלקסטרין הומוולוגיה (PH) תחום המזהה PI(4)P ו PI(4,5)P233,34,35. ORP5/8 משתמש ב- PI(4)P כדי להעביר נ.ב., והוכח כי ORP5/8 מווסת בנוסף את רמות PM PI(4,5)P2 וככל הנראה מווסת נתיבי איתות. בתורו, ירידה ברמות PI(4)P ו- PI(4,5)P2 מורידה את פעילות ORP5/ORP8 מכיוון שחלבונים אלה מקשרים את ראש הממשלה בצורה תלוית PIP. סינתזת PS גבוהה באופן חריג, המובילה לתסמונת לנץ-מג'בסקי, משפיעה על רמות PI(4)P באמצעות ORP5/836. כאשר הפעילות של שני החלבונים נחסמת, נ.ב. הופך פחות שופע בראש הממשלה, מה שמוריד את היכולת האונקוגנית של חלבוני איתות37.

לעומת זאת, ביטוי יתר ORP5 נראה לקדם פלישה לתאים סרטניים ותהליכים גרורתיים38. לכן, שינויים בפעילות ORP5/8 יכולים לשנות באופן חמור את ההתנהגות התאית באמצעות שינויים בהומאוסטזיס השומנים. יתר על כן, ORP5 ו- ORP8 תופסים אתרי קשר עם ER-mitochondria ושומרים על כמה פונקציות מיטוכונדריאליות, אולי על ידי אספקת PS39. בנוסף, ORP5 לוקליזציה לאתרי קשר טיפת שומנים ER כדי לספק PS טיפות שומנים על ידי PS / PI(4)P exchange40. האסטרטגיה המתוארת בזאת למדידת (i) PS ו- PI(4)P מיצוי ליפוזומים ו- (ii) טרנספורט PS ו- PI(4)P בין ליפוזומים הומצאה כדי להקים ולנתח את פעילות החליפין PS/PI(4)P של Osh6p/Osh7p12,32 ומשמשת קבוצות אחרות לניתוח הפעילות של ORP5/ORP835 ו- LTPs אחרים10, 41. הוא מבוסס על השימוש בקורא לוחות פלואורסצנטי, ספקטרופלואורומטר סטנדרטי בפורמט L, ושני חיישנים פלואורסצנטיים, NBD-C2Lact ו- NBD-PHFAPP, שיכולים לזהות PS ו- PI(4)P, בהתאמה.

NBD-C2לקט מתאים לתחום C2 של הגליקופרוטאין, לקטדרין, שהופצה מחדש כדי לכלול ציסטאין ייחודי חשוף ממס ליד אתר כריכת נ.ב. המשוער; פלואורופור NBD רגיש לקטבים (7-ניטרבנז-2-אוקסה-1,3-דיאזול) מקושר באופן קוולנטי לשאריות אלה(איור 1A)12. ליתר דיוק, תחום C2 של לקטדהרין (Bos taurus, UniProt: Q95114, שאריות 270-427) שוכפל לווקטור pGEX-4T3 שבא לידי ביטוי בהיתוך עם גלוטתיון S-transferase (GST) ב Escherichia coli. רצףה-C2 לקט עבר מוטציה כדי להחליף שני שאריות ציסטאין נגישות לממס (C270, C427) בשאריות אלנין ולהכניס שאריות ציסטאין לאזור הסמוך לאתר כריכת PS הפואטי (מוטציה H352C) שניתן לתייג לאחר מכן עם N,N'-דימתיל-N-(iodoacetyl)-N'-(7-ניטרובנץ-2-אוקסה-1,3-דיאזול-4-yl) אתילן דיאמין (IANBD) 12. אתר מחשוף עבור תרומבין קיים בין חלבון GST ואת N-terminus של תחום C2. יתרון מרכזי הוא כי דומיין זה מזהה באופן סלקטיבי PS באופן Ca2 +- עצמאי בניגוד לתחומים ידועים אחרים C2 או Annexin A542. NBD-PHFAPP נגזר מתחום PH של חלבון 4-פוספט-מתאם אנושי 1 (FAPP1), אשר היה מהוהה מחדש כדי לכלול ציסטאין אחד חשוף ממס שניתן לתייג עם קבוצת NBD ליד PI(4)P איגוד אתר(איור 1A)43. רצף הנוקלאוטידים של תחום ה- PH של חלבון FAPP האנושי (UniProt: Q9HB20, פלח שוק [1-100]) שוכפל לווקטור pGEX-4T3 שבא לידי ביטוי בד בבד עם תג GST. רצףFAPP PH שונה כדי להכניס שאריות ציסטאין ייחודי בתוך ממשק מחייב הממברנה של חלבון43. יתר על כן, מקשר תשע שאריות הוכנס בין אתר מחשוף תרומבין לבין N-terminus של דומיין PH כדי להבטיח נגישות לפרוטאז.

כדי למדוד מיצוי PS מליפוזומים, NBD-C2לקט מעורבב עם ליפוזומים עשוי פוספטידילכולין (PC) המכיל כמויות זעירות של PS. בשל זיקתו ל- PS, מבנה זה נקשר לליפוזומים, והפלואורופור של NBD חווה שינוי בקוטביות כשהוא בא במגע עם הסביבה ההידרופובית של הממברנה, אשר מעוררת שינוי כחול ועלייה בפלואורסצנטיות. אם נ.ב. מופק כמעט לחלוטין על ידי כמות סטויצ'יומטרית של LTP, הבדיקה אינה מקשרת עם ליפוזומים, ואות NBD נמוך יותר (איור 1B)32. הבדל זה באות משמש כדי לקבוע אם LTP(למשל, Osh6p) מחלץ PS. אסטרטגיה דומה משמשת עם NBD-PHFAPP למדידת PI(4)P חילוץ (איור 1B), כפי שתואר בעבר12,32. שתי מבחניות מבוססות FRET תוכננו (i) למדוד הובלת PS מ- LA ל- LB ליפוזומים, המחקים את קרום המיון ואת ראש הממשלה, בהתאמה, ו- (ii) תחבורה PI(4)P בכיוון ההפוך. בדיקות אלה מבוצעות באותם תנאים (כלומר, אותו חיץ, טמפרטורה וריכוז שומנים) כדי למדוד חילופי PS / PI(4)P. כדי למדוד הובלת PS, NBD-C2לקט מעורבב עם ליפוזומים LA המורכבים ממחשב אישי ומסומם עם 5 מול% PS ו -2 מול% של פוספטידילטנולמין פלואורסצנטי (Rhod-PE) ו LB ליפוזומים המשלבים 5 מול% PI(4)P.

בזמן אפס, FRET עם רוד-PE מרווה את פלואורסצנטיות NBD. אםנ.ב מועבר מ- LA ל- LB ליפוזומים ( למשל, עם הזרקת Osh6p), מתרחשת דהייה מהירה עקב טרנסלוקציה של מולקולותLact NBD-C2 מ- LA ל- LB ליפוזומים (איור 1C). בהתחשב בכמות ה- PS הנגיש, NBD-C2Lact נשאר למעשה במצב של קרום קשור במהלך הניסוי12. לכן, עוצמת האות NBD בקורלציה ישירה עם ההתפלגות של NBD-C2Lact בין LA ו LB ליפוזומים וניתן לנרמל בקלות כדי לקבוע כמה נ.ב. מועבר. כדי למדוד את ההעברה של PI(4)P בכיוון ההפוך, NBD-PHFAPP מעורבב עם ליפוזומים LA ו- LB; בהתחשב בכך שהוא נקשר רק ליפוזומים LB המכילים PI(4)P, אבל לא Rhod-PE, הפלואורסצנטיות שלה גבוהה. אם PI(4)P מועבר לליפוזומים מסוג LA, הוא מעביר את ה- ליפוזומים אלה, והאות פוחת עקב FRET עם Rhod-PE (איור 1C). האות מנורמל כדי לקבוע כמה PI(4)P מועבר43.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. טיהורהלק NBD-C2

הערה: למרות פרוטוקול זה מפרט את השימוש של משבש תא לשבור חיידקים, זה יכול להיות שונה להשתמש באסטרטגיות תמזה אחרות (למשל, עיתונות צרפתית). בתחילת הטיהור, חובה להשתמש חוצץ כי הוא טרי degassed, מסונן, בתוספת 2 mM dithiothreitol (DTT) כדי למנוע חמצון של ציסטאין. עם זאת, עבור שלב תיוג החלבון, זה חיוני כדי להסיר לחלוטין DTT. צעדים רבים חייבים להתבצע על קרח או בחדר קר כדי למנוע כל השפלת חלבון. דגימות של נפח 30 μL יש לאסוף בשלבים שונים של הפרוטוקול כדי לבצע ניתוח על ידי נתרן dodecylsulfate-polyacrylamide ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE) באמצעות ג'ל אקרילאמיד 15% כדי לבדוק את התקדמות הטיהור. מערבבים מספיק חיץ מדגם לאמלי עם כל aliquot, ומחממים את התערובת ב 95 °C (70 °F). להקפיא ולאחסן את הצינורות ב -20 °C (50 °F) עד ניתוח.

  1. ביטוי שלLact GST-C2 ב Escherichia coli
    1. לערבב 20 μL של BL21 זהב תאים מוסמכים עם 18 μL של מים מעוקרים. לאחר מכן, לערבב 2 μL של pGEX-C2Lact plasmid (ב ~ 65 ng / μL) עם החיידקים, ולהפוך אותם על ידי אלקטרופורציה. Resuspend החיידקים עם 150 μL של לנוקס ליסוגניה-מרק אוטומטי (LB) בינוני (10 גרם / L טריפטון, 5 גרם / L תמצית שמרים, 5 גרם / L NaCl במים deionized, ללא גלוקוז). תן לחיידקים לגדול ב 37 °C (55 °F) במשך 1 שעות בצינור microcentrifuge 2 מ"ל.
    2. לחסן 25 מ"ל של בינוני LB, בתוספת 50 מיקרוגרם / מ"ל אמפיצ'ין, עם 150 μL של השעיה חיידקית בבקבוק ארלנמייר סטרילי 125 מ"ל. מניחים את הבקבוקון בשייקר מסלולית ב 37 °C (7 °F), ולתת לחיידקים לגדול בן לילה עם עצבנות ב 185 סל"ד.
    3. מלא שני צלוחיות סטריליות 2 L Erlenmeyer עם 500 מ"ל של בינוני LB בתוספת 50 מיקרוגרם / מ"ל אמפיסילין, ולהוסיף 5 מ"ל של השעיה preculture. תן לחיידקים לגדול ב 37 °C עם עצבנות ב 220 סל"ד.
    4. מדי פעם למדוד את הצפיפות האופטית (OD) של ההשעיה באורך גל (λ) של 600 ננומטר. כאשר OD מגיע לערך של ~ 0.6-0.7, הוסף 500 μL של פתרון מניות של 1 M איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) לכל בקבוקון כדי ליזום את הביטוי שלLactGST-C2 . לנער את הבקבוקונים ב 185 סל"ד במשך 4 שעות ב 37 °C (50 °F).
    5. מעבירים את תכולת כל בקבוקון לבקבוק צנטריפוגה פוליפרופילן. צנטריפוגה שני הבקבוקים במשך 30 דקות ב 4600 × גרם ב 4 °C (50 °F) כדי כדורי החיידקים. השליכו את הסופר-נט, ושיספו מחדש כל גלולה ב-50 מ"ל של תמיסת מלח קרה עם פוספט.
    6. העבר את ההשעיה החיידקית הכלולה בכל בקבוק לצינור צנטריפוגה חרוט 50 מ"ל. צנטריפוגה שני הצינורות במשך 30 דקות ב 2300 × גרם ב 4 °C (55°F). הסר את supernatant, ולאחסן את הצינורות, שכל אחד מהם מכיל גלולה חיידקית, ב -20 °C (70 °F).
  2. טיהור C2לקט
    1. על קרח, מלא שני צינורות צנטריפוגליים חרוטיים 50 מ"ל עם 50 מ"ל של חוצץ המכיל 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, ו 150 mM NaCl (להלן נקרא חיץ TN), בעבר מסונן ו degassed על ידי סינון ואקום ממברנה.
    2. כדי להכין את חיץ התמוגה בכל צינור, להמיס טבליה של אתילנדיאמין טטראצטית ללא חומצה מעכב פרוטאז קוקטייל במאגר TN על ידי sonication קל או מערבולת. הוסף אנטי-פרוטאזים אחרים (10 μM bestatin, 1 מיקרוגרם / מ"ל פפסטטין A, ו 10 μM phosphoramidon). חשוב לציין, להשלים את המאגר עם 2 mM DTT.
    3. מלא את שני הצינורות המכילים את כדורי החיידקים שהוכנו בשלב 1.1.6, עם חוצץ תמיס כדי להשיג נפח סופי של 30 מ"ל בכל צינור, לאט להפשיר את הכדורים על קרח במשך 10 דקות. לרסק כל גלולה עם מרית נירוסטה, ו resuspend אותם על ידי מערבולת הצינורות ו / או על ידי pipetting המתלה הלוך ושוב עם בקר פיפטה 25 מ"ל pipette עד השעיה הומוגני מתקבל.
    4. בצע תמוז באמצעות משבש תא מכובס מראש (ראה טבלת החומרים) על-ידי טעינת 30 מ"ל של המדגם בתוך המאגר והפעלת מחזור שבירה במצב רציף עם לחץ של 1.6 בר. לאסוף את lysate באותו צינור, לשמור את הצינור על קרח, ומיד להוסיף 250 μL מפתרון מלאי של 200 mM פנילמתילסולפוניל פלואוריד (PMSF) מוכן איזופרופנול.
    5. התבדח על המדגם האחר לאחר אותו הליך. השתמש בשאר מאגר תמיסת הלטף כדי לשטוף את משבש התא, ולאסוף את הכביסה כדי לכוונן את עוצמת הקול של כל ליסאט (~ 30 מ"ל) לנפח סופי של 50 מ"ל.
    6. להשלים כל ליסאט עם 5 מ"מ MgCl2,ולהוסיף 20 מיקרוגרם / מ"ל של DNAse I כדי לפצל את ה- DNA ובכך להפחית את הצמיגות של המדגם. דגירה על קרח במשך 30 דקות. לאסוף מדגם לניתוח ג'ל.
    7. מעבירים כל 50 מ"ל ליסייט לצינור אולטרה-צנטריפוגה פוליקרבונט (שניים בסך הכל, ראו את טבלת החומרים). צנטריפוגה ב 186,000 × g ב 4 °C (50 °F) לפחות 1 שעה באמצעות אולטרה צנטריפוגה.
    8. במקביל לשלב הצנטריפוגה, מחלקים 1.4 מ"ל של תרחיף המכיל גלוטתיון בשילוב עם 4% חרוזי אגרוז לשני צינורות צנטריפוגליים חרוטיים 50 מ"ל, הוסיפו 20 מ"ל של חוצץ TN בתוספת 1 mM DTT (חיץ TND) לכל צינור, צנטריפוגה ב 1200 × g למשך 5 דקות, והשליכו את supernatant. חזור על שלב הכביסה הזה פעמיים.
    9. לאחר הצנטריפוגה של ליסאט חיידקי, להסיר דגימה 30 μL מן supernatant, ולהעביר את supernatant מכל צינור ultracentrifuge צינור צנטריפוגה 50 מ"ל המתאים המכיל חרוזים נקיים. לניתוח ג'ל, resuspend גלולה פסולת באחד צינורות ultracentrifuge עם 50 מ"ל של חוצץ TND, ולאסוף מדגם 30 μL.
    10. מניחים את הצינורות על סיבוב במשך 3-4 שעות ב 4 °C (4 °F) כדי לקבל השעיית חרוז הומוגני. בריכה את מתלים החרוזים בעמודה כרומטוגרפית ריקה של 25 מ"ל. תן החרוזים decant, ולהסיר את החץ וחלבונים לא מאוגדים על ידי זרימת הכבידה. קח דגימה מהאלואט לניתוח.
    11. resuspend החרוזים עם 20 מ"ל של חוצץ TND, ולאסוף את eluate על ידי זרימת הכבידה. חזור על שלב זה פעמיים כדי לשטוף לחלוטין את החרוזים. מאגר eluates שנאספו, ולשמור על מדגם 30 μL לניתוח נוסף.
      הערה: לאחר decantation קצר, נפח של ~ 2 מ"ל של השעיית חרוזים, שאליו GST-C2Lact מצורף, משקעים בתחתית העמודה.
    12. הוסף 1 מ"ל של השעיית חרוזים לשני צינורות מיקרוצנטריפוגה 2 מ"ל. מלא כל צינור במאגר TND לנפח סופי של 1.970 מ"ל. קח דגימת 30 μL מצינור אחד לניתוח נוסף (דגימת B1). הוסף 10 μL של פתרון 10 mM CaCl2 ו 25 μL מפתרון מלאי של פתרון פרוטאז תרומבין אנושי ב 0.02 U / μL.
    13. מניחים את שני הצינורות על סיבוב ב 4 °C בלילה כדי לאפשר תרומבין להיצמד את תג GST מן התחוםLact C2. למחרת, בכל צינור, לערבב 10 μL של פתרון PMSF 200 mM עם השעיית חרוזים כדי לעכב את פעולת תרומבין.
    14. צנטריפוגות הצינורות ב 700 × g במשך 5 דקות, ולאסוף את supernatant, אשר מכיל מסיס C2Lact תחום, מכל צינור, מבלי לקחת את החרוזים. איחדו את מזונות העל לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 2 מ"ל (E1 eluate) שנשמר על קרח.
    15. הוסף 1 מ"ל של חוצץ TND לכל צינור כדי resuspend החרוזים, ולשטוף אותם; חזור על שלב 1.2.14. בצע שלב זה שלוש פעמים נוספות כדי לשחזר כמות מקסימלית של חלבון. בכל פעם, לאסוף את supernatants שנאסף לתוך צינור חדש 2 מ"ל (E2, E3, E4, ו E5 eluates), ולקחת aliquot לניתוח נוסף. בסוף שלבי הכביסה, יש לקחת אליקואט מהשעיית החרוזים (aliquot B2).
    16. לנתח את 30 דגימות μL שנאספו בשלבים השונים של פרוטוקול הטיהור על ידי הפרדת SDS-PAGE על ג'ל אקרילאמיד 15%.
    17. הסר חרוזים מזהמים פוטנציאליים על ידי איגום כל supernatants(כלומר,~ 10 מ"ל) שנאספו במהלך שלבים 1.2.14 ו 1.2.15 לתוך עמוד כרומטוגרפיה 10 מ"ל. לאסוף את eluate על ידי זרימת הכבידה, ולשמור על החרוזים בתחתית העמוד.
    18. מרכז את דגימתהלק C2 באמצעות יחידת סינון צנטריפוגלית עם חיתוך משקל מולקולרי (MWCO) של 3 kDa ומהירות צנטריפוגה של 2300 × גרם. עצור את הליך הריכוז כאשר נפח דגימת החלבון הוא ~ 1 מ"ל.
  3. הכנה וטיהור של NBD-C2לקט
    1. שידוי עמודת התפלה (ראה טבלת החומרים) באמצעות מאגר TN. טען את העמודה עם 1 מ"ל של דגימתLact C2 מרוכזת. אפשר לדגימה להיכנס למיטת הג'ל לחלוטין, הוסף 1.5 מ"ל של חיץ TN טרי ללא גיהוי DTT לעמוד, ולאסוף את eluate על ידי זרימת הכבידה לתוך צינור microcentrifuge 2 מ"ל snap-cap.
    2. לדלל 50 μL של eluate בנפח סופי של 300 μL TN חוצץ, ולרשום ספקטרום ספיגה מ 230 ל 450 ננומטר באמצעות מאגר TN טהור ריק. לקבוע את ריכוזהלק C2 בהתבסס על הספיגה נמדד ב 280 ננומטר, בהתחשב מקדם הכחדה ε שווה 44,920 M-1.cm-1.
    3. כדי לתייג את מבנהה-C2 Lact עם פלואורופור NBD, מערבבים את החלבון עם עודף טוחן פי עשרה של N,N'-דימתיל-N-(iodoacetyl)-N'-(7-ניטרובנץ-2-אוקסה-1,3-דיאזול-4-yl)אתילנדיאמין (IANBD amide).
      1. יש להמיס 1 מ"ג של IANBD בדימתילפורמיד נטול מים (DMF), תוך התחשבות כי הנפח הסופי של DMF המשמש לתיוג מבנהה-C2 Lact אינו יכול לחרוג מ-5% (v/v) של נפח דגימת החלבון.
      2. כדי לקבוע את הנפח של DMF (VDMF) כדי להמיס IANBD, תחילה לחשב את הכמות הנדרשת של IANBD (מ ', לידי ביטוי מ"ג) כדי לתייג את החלבון באמצעות פורמולה 1.
        m = 10,000 × C × V × MWIANBD (1)
        כאשר C הוא הריכוז שלLact C2 נמדד בשלב 1.3.2, V הוא הנפח של מדגםLact C2, ו MWIANBD הוא המשקל המולקולרי של פלואורופור (420 גרם / מול).
      3. חשב VDMF באמצעות formulae 2 (עם m0=1) ו- 3.
        VDMF= (m0/m) × VIANBD (2)
        VIANBD=0.05 × V (3)
        איפה m0 היא הכמות של אבקת IANBD מ"ג, VIANBD הוא הנפח של פתרון IANBD להתווסף מדגםLact C2.
      4. הוסף נפח VIANBD של פתרון IANBD מוכן טרי לדגימתLact C2, ולנער את תערובת התגובה ב 800-900 סל"ד במשך 30 דקות ב 25 °C באמצעות thermomixer מוגן מפני אור. תן לתגובה להמשיך במשך 90 דקות על קרח. בינתיים, לנקות יחידת מסנן צנטריפוגלי (MWCO = 3 kDa) עם 10 מ"ל של חוצץ TN.
    4. הוסף L-ציסטאין (בעודף טוחנת פי 10 ל- IANBD) לתערובת התגובה כדי לאיטח IANBD חינם.
    5. הוסף 15 מ"ל של מאגר TN לפתרוןהלק NBD-C2, והעבר את פתרוןההקט NBD-C2 ליחידת המסנן הצנטריפוגלית. מרכז את המדגם ל 2 מ"ל כדי להפריד את רוב NBD חינם מן החלבון על ידי צנטריפוגה ב 2300 × גרם. חזור על שלב הכביסה פעמיים. צנטריפוגה הדגימה בצינור צנטריפוגה snap-cap 2 מ"ל במשך 10 דקות ב 19,000 × גרם ב 4 °C (55 °F) כדי גלולה אגרגטים פוטנציאליים, ולאסוף את supernatant.
    6. לדלל 50 μL של eluate בנפח הסופי של 300 μL של חוצץ TN. תיעד את ספקטרום הספיגה מ-230 ל-650 ננומטר באמצעות האלאט שנאסף במהלך הליך הריכוז כריקים. קבעו את ריכוזהלק NBD-C2 באמצעות הספיגה המקסימלית ב- λ = 280 ו 495 ננומטר ומקדם הכחדה ε = 44,920 M-1.cm-1 (חלבון) ו 25,000 M-1.cm-1 (פלואורופור NBD).
      הערה: אם שני ערכי הריכוז זהים, הדבר מציין כי מבנההלק C2 מסומן ביחס של 1:1 עם קבוצת NBD.
    7. אם ריכוזהלק NBD-C2 המוערך ממדידת ספיגת NBD עולה על הריכוז המוערך מספיגת שאריות טריפטופן (Trp), חזור על שלב 1.3.5 כדי להסיר עוד יותר NBD חינם.
    8. הוסף גלילסול למדגם כדי לקבל ריכוז סופי של 10% (v/v) כדי להגן על מבנההלק NBD-C2 במהלך הקפאת הבזק. מדוד את ריכוז החלבון הסופי.
    9. הכן 50 עליקוטים μL של חלבון בצינורות microcentrifuge 0.5 מ"ל. להקפיא את הצינורות בחנקן נוזלי, ולאחסן אותם ב -80 מעלות צלזיוס.

2. טיהור NBD-PHFAPP

הערה: ההליך לייצר ולתייגPH FAPP זהה לזה של NBD-C2Lact עד להעברת פתרון NBD-C2Lact ליחידת מסנן צנטריפוגלית בשלב 1.3.4. מצעד זה ואילך, בצע את הפרוטוקול המתואר להלן.

  1. לאחר שלב הריכוז, לשמור על 2 מ"ל של NBD-PHFAPP ב 4 °C (5 °F) בחושך לא יותר מיום אחד לפני ביצוע כרומטוגרפיה גודל-הדרה. לפני כרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל, ודא כי אין הפקדה כתומה (צבירה במהלך הריכוז) בתחתית הצינור. אם זה המקרה, צנטריפוגה הדגימה ב 540,000 גרם × במשך 10 דקות ב 4 °C (5 °F), ולטהר את supernatant על ידי כרומטוגרפיה גודל-הדרה.
    הערה: כרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל מבוצעת על עמודה עמוסה בקופולימר דקסטרן-אקרילאמיד מוצלב (ראה טבלת החומרים),ששוקל בעבר עם חיץ TND, באמצעות מערכת כרומטוגרפיה נוזלית חלבון מהירה (ראה טבלת החומרים). יש להגן על העמודה מפני אור. נעשה שימוש בקצב זרימה של 1 מ"ל/דקה, וההתלבטות של מבנה ה-FAPP NBD-PH לוותה ברישום הספיגה ב- λ = 280 (חלבון) ו- 480 ננומטר (NBD) ביציאת העמודה.
    1. הזרק את דגימת ה-FAPP NBD-PH שנטענה בלולאת הזרקה של 2 מ"ל על העמודה, ומידאסוף שברי 2.5 מ"ל של אלאט.
  2. נתח את כל השברים המתאימים לשיא הראשי שזוהה ב- 280 ו- 480 ננומטר על ג'ל SDS-PAGE של 15%. מערבבים מדגם 25 μL של כל שבר עם 15 μL של חוצץ מדגם Laemmli לפני חימום וטעינה על הג'ל.
    הערה: שיא ראשי, אשר מזוהה בו זמנית ב λ = 280 ו 480 ננומטר, מופיע לאחר נפח של ~ 150 מ"ל מאגר מועבר דרך העמודה.
  3. מאגר השברים המכילים באופן בלעדי חלבון NBD-PHFAPP (~ 12.2 kDa), ולהוסיף גליצל בריכוז סופי של 10% (v/ v). מרכז את המדגם באמצעות יחידת סינון צנטריפוגלית עם MWCO של 3 kDa לנפח סופי של 1 מ"ל באמצעות מהירות צנטריפוגה של 2300 × גרם.
  4. הכן עליקוטים, ורשום ספקטרום ספיגה כמתואר עבורLactNBD-C2 . השתמש מקדם הכחדה ε = 29,450 M-1.cm-1 כדי לקבוע את ריכוז החלבון בהתבסס על הספיגה נמדד ב λ = 280 ננומטר.

3. הכנת ליפוזומים עבור נ.ב. ו PI(4)P מיצוי או העברות

הערה: בצעו את כל השלבים בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת. יש לטפל בממסים אורגניים, רוטוואפור וחנקן נוזלי בזהירות.

  1. הכן חומצה טרייה, מסוננת ומוגזלת 50 mM 4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפרזינתאנסולניק (HEPES)-אשלגן הידרוקסיד (KOH), pH 7.4, 120 mM אשלגן אצטט (HK) חוצץ.
  2. עבור כל סוג של ליפוזום, לקחת כמויות מדויקות של שומנים שונים מפתרונות מלאי, ולערבב אותם בקבוק זכוכית בצורת אגס 25 מ"ל(טבלה 1). הוסף כלורופורם טהור כדי להתאים את הנפח של כל תערובת ל 1 מ"ל. תייגו כל בקבוקון בשם הליפוזום. עוטפים את הבקבוקונים המכילים תערובת שומנים מסוממים עם Rhod-PE עם רדיד אלומיניום.
  3. מניחים את הבקבוקון על מאיד סיבובי. יבש את השומנים תחת ואקום וב 25 °C לפחות 30 דקות במהירות סיבוב של 500 סל"ד. עבור סרטי שומנים המכילים PI(4)P, יש לקדם את הבקבוקון ב-32-34 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, תחת סיבוב עדין, כדי לערבב כראוי PI(4)P עם שומנים אחרים לפני יצירת ואקום בבקבוק כדי להסיר את הממס, אשר ישאיר מאחוריו סרט של שומנים יבשים על קיר הבקבוק.
  4. נתק את הבקבוקון מן המאייד, ומניחים אותו בתא ואקום במשך 45 דקות כדי להסיר את כל עקבות הנותרים של ממס. מלא את הבקבוקון עם 2 מ"ל של חוצץ HK, ולהוסיף כמה חרוזי זכוכית בקוטר 4 מ"מ לפתרון. מערבולת בעדינות את הבקבוק במשך 2 דקות כדי resuspend השומנים ולהכין שלפוחיות שומנים multilamellar (MLVs) עם ריכוז שומנים של 4 מ"מ. הכן 0.5 מ"ל aliquots של MLVs ב 1.5 מ"ל בורג מכסה צינורות microcentrifuge.
  5. להפשיר להקפיא את הצינורות 5x (באמצעות חנקן נוזלי ואמבט מים ב 37 °C (37 °F), בהתאמה). לתבל את הליפוזומים או לאחסן אותם ב -20 מעלות צלזיוס.
  6. השתמש מפלט מיני כדי להכין את הליפוזומים(כלומר, שלל חד-צדדי גדול) מן MLVs על פי הנחיות היצרן. השתמש מסנן פוליקרבונט עם נקבוביות גליליות אחידות בקוטר 200 ננומטר.
  7. כדי להכין כל סוג של ליפוזום, לפרט לפחות 250 μL של ההשעיה המקבילה של MLVs. לאחסן את ליפוזומים extruded ב 4 °C (75 °F) בחושך אם הם מכילים Rhod-PE. השתמש ליפוזומים בתוך 2 ימים.
קומפוזיציה שומנים בדם (מול/מול) השומנים
שם ליפוזום DOPC
(25 מ"ג/מ"ל)		 אבא
(10 מ"ג/מ"ל)		 16:0 ליס רוד-PE
(1 מ"ג/מ"ל)		 C16:0/C16:0-PI(4)P
(1 מ"ג/מ"ל)
מיצוי תוחם ליפוזום 2 מול% נ.ב. מחשב/נ.ב. 98/2 247 μL 12.5 μL
ליפוזום 2 מול% PI(4)P PC/PI(4)P 98/2 247 μL 153 μL
ליפוזום מחשב אישי מחשב 100 252 μL
עבירות תחבורה LA  מחשב/נ.ב./רוד-PE 93/5/2 234 μL 31.4 μL 200 μL
LA ללא נ.ב. מחשב/רוד-PE 98/2 247 μL 200 μL
LB  PC/PI(4)P 95/5 237 μL 383 μL
LB ללא PI(4)P מחשב 100 252 μL
LA-Eq מחשב/נ.ב./PI(4)P/רוד-PE 93/2.5/2.5/2 234 μL 15.7 μL 200 μL 191 μL
LB-Eq מחשב/נ.ב./PI(4)P 95/2.5/2.5 239 μL 15.7 μL 191 μL

טבלה 1: כמויות של פתרונות מלאי שומנים להיות מעורב להכנת ליפוזום. קיצורים: נ.ב. = פוספטידילסרין; PC = פוספטידילכולין; PI(4)P = פוספטידילינוזיטול 4-פוספט; רוד-PE = רודמין-תווית פוספטידילטנולמין; DOPC = דיאולאוילפוספטידילכולין; POPS= 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-גליצרי-3-פוספו-L-סרין; 16:0 ליס רוד-PE = 1,2-דיפלמיטויל-סן-גליקרו-3-פוספוטנולמין-N-(ליסאמין רודמין B סולפוניל).

4. מדידת נ.ב. או PI(4)P מיצוי

הערה: יש לבצע מדידות באמצעות צלחת שחורה 96-באר וקורא לוחות פלואורסצנטי המצויד בשחור-כרומטורים: אחד לערעור פלואורסצנטי ואחד לפליטה, עם רוחב פס משתנה.

  1. הכן חוצץ HK טרי, מסונן ומנוטר בתוספת 1 מ"מ MgCl2 (חוצץ HKM). הכן ליפוזומים טהורים PC וליפוזומים PC מסוממים עם 2 מול% PS או 2 מול% PI(4)P (4 mM ריכוז השומנים הסופי, ראה טבלה 1).
    הערה: שמור את הצינורות מלאים בהשעיה של ליפוזומים בולטים בטמפרטורת החדר לאורך כל הניסוי, ולשמור את החלבונים על קרח. בנוסף, להגן על חיישני השומנים מפני אור.
  2. לבדיקת החילוץ של נ.ב. בבאר אחת, לערבב ליפוזומים המכילים 2 מול% PS (80 מיקרומטר ריכוז שומנים סופיים, 0.8 מיקרומטר נגיש PS ריכוז) עם NBD-C2לקט (250 nM ריכוז סופי) בנפח סופי של 100 μL. מלא באר שנייה עם אותה כמות של ליפוזום (80 μM, 2 מול% PS) ו NBD-C2Lact (250 ננומטר) מעורבב עם 3 μM LTP (Osh6p כמו שליטה חיובית או חלבון של עניין).
    הערה: זמן דגירה של 5 דקות מספיק עבור Osh6p כדי להשיג מיצוי שומנים בדם.
  3. מלא באר שלישית עם NBD-C2לקט (250 ננומטר) מעורבב עם ליפוזומים PC טהור (80 מיקרומטר). מלא באר רביעית רק עם ליפוזומים PC טהור (80 מיקרומטר). חזור על שלבים 4.2-4.3 כדי להכין שלוש סדרות נוספות של ארבע בארות.
  4. עבור כל באר, הקלט ספקטרום NBD מ 505 עד 650 ננומטר (רוחב פס 5 ננומטר) על עירור ב 490 ננומטר (רוחב פס 5 ננומטר) ב 25 °C (5 °F). עבור כל סדרה, הפחת את הספקטרום שנרשם רק עם ליפוזומים מהספקטרום האחר.
    הערה: F ו- Fmax תואמים את העוצמה ב 536 ננומטר נמדד עם ליפוזומים המכילים PS בנוכחות או היעדר LTP, בהתאמה, בעוד F0 הוא העוצמה באותו אורך גל עם ליפוזומים PC טהורים. עבור כל סדרה, אחוז ה-PS הנגיש המופק על ידי החלבון ניתן באמצעות הנוסחה הבאה.
    100 × (1-(F-F0)/(Fמקסימום-F0))) (4)
  5. לבדיקת החילוץ PI(4)P, הכינו ליפוזומים מסוממים עם 2 מול% PI(4)P, ובצעו מדידות עם בדיקתה-FAPP NBD-PH. בצע ניסויי בקרה וקבע את אחוז החילוץ באותו אופן שתואר לעיל.
    הערה: ריכוז ליפוזום וחלבון זהים לאלה המשמשים בבחאי החילוץ של PS.

5. מדידה בזמן אמת של הובלת נ.ב.

הערה: פלורומטר סטנדרטי (תבנית 90° ) המצויד במחזיק תא מבוקר טמפרטורה ומערבב מגנטי משמש להקלטת קינטיקה להעברת שומנים. כדי להשיג נתונים במדויק, זה המפתח לשמור על המדגם לצמיתות באותה טמפרטורה (להגדיר בין 25 ל 37 °C (37 °F) בהתאם למקור החלבון(למשל.,,שמרים או אדם)) ולערבב אותו כל הזמן. הפרוטוקול המתואר להלן הוא למדידה של הובלת שומנים בדם במדגם 600 μL הכלול בתא קוורץ גלילי.

  1. הכן מאגר HKM מסונן ומסונן. שמור את הצינורות המכילים ליפוזומים בולטים בטמפרטורת החדר. עטפו צינורות המכילים ליפוזומים עם Rhod-PE בנייר אלומיניום, ו/או אחסנו אותם בקופסה אטומה כדי למנוע הלבנה.
  2. התאם את מונוכרומאטורים עירור ופליטה ב λ = 460 ננומטר (עם רוחב פס קצר (1-3 ננומטר)) וב λ = 530 ננומטר (עם רוחב פס גדול (≥ 10 ננומטר)), בהתאמה. הגדר את זמן הרכישה ב 25 דקות עם רזולוציית זמן ≤ 1 s.
  3. בקובט קוורץ, לדלל 30 μL של השעיית LA ליפוזום ונפח של NBD-C2Lact פתרון מלאי במאגר HKM מחמם מראש כדי להכין מדגם 570 μL המכיל 200 μM סה"כ שומנים ו 250 nM NBD-C2Lact. מוסיפים מוט ערבוב מגנטי קטן, וממקמים את הקובט במחזיק הפלואורומטר.
  4. לאחר המדגם הוא שפל תרמית (לאחר 3-5 דקות), להפעיל את המדידה. לאחר 1 דקות, להוסיף 30 μL של השעיית ליפוזום LB (ריכוז סופי של 200 μM ליפידים הכולל) לדגימה. לאחר 3 דקות, להזריק LTP לתוך המדגם, כך הריכוז הסופי של LTP הוא 200 ננומטר, ולרכוש את האות עבור 21 דקות הנותרות.
  5. בצע ניסוי מקביל כדי לנרמל את אות NBD. לערבב 30 μL של LA-Eq ליפוזום מתלה עם 250 nM NBD-C2Lact במאגר HKM (נפח סופי של 570 μL). לאחר 1 דקות, להזריק 30 μL של השעיית ליפוזום LB-Eq.
    הערה: הרכב השומנים של ליפוזומים LA-Eq ו- LB-Eq דומים לזה של ליפוזומים LA ו- LB המשמשים בבדיקת ההעברה, אלא שכל אחד מהם מכיל 2.5 מול% PS ו- 2.5 מול% PI(4)P. כתוצאה מכך, אות NBD הנמדד, המכונה FEq, מתאים לאות שיש למדוד אם נ.ב. היה מכויל לחלוטין בין ליפוזומים LA ו- LB על ידי תהליך העברה.
  6. המר את העקומות הקינטיות הנמדדות עם LTP של עניין כדי לקבוע את כמות PS (ב- μM) שהועברה מ- LA ל- LB ליפוזומים לאורך זמן. נרמל כל נקודת נתונים (F) של העקומה באמצעות הנוסחה הבאה.
    Fנורמה = (F-F0)/(FEq-F0) (5)
    שבו F0 מתאים לאות NBD ממש לפני התוספת של LTP, ו- FEq הוא האות הנמדד בשלב 5.5.
    הערה: כמות PS (ב μM) מועבר LA כדי LB ליפוזומים מתאים 2.5 × Fנורם, בהתחשב בכך שיווי המשקל מתאים למצב שבו מחצית מולקולות נ.ב. נגיש, הכלול בעלון החיצוני של ליפוזומים LA, (כלומר,המקביל 5 מול% של 0.5 × 200 μM ליפידים הכולל) הועבר לתוך ליפוזומים LB.

6. מדידה בזמן אמת של תחבורה PI(4)P

  1. הגדר את הפלורימטר (עירור ואורך גל פליטה, רוחב פס, זמן רכישה, רזולוציית זמן) כפי שנעשה עבור תפילת העברת PS. כמו כן, השתמש באותו חוצץ, cuvette, ליפוזומים כדי לבצע את הניסויים תחת ערבוב מתמיד באותה טמפרטורה.
  2. ב cuvette, לערבב 30 μL של השעיית ליפוזום LB ו- NBD-PHFAPP עם חוצץ HKM מחמם מראש כדי להשיג נפח סופי של 570 μL (200 μM סה"כ שומנים, 250 nM NBD- PHFAPP). לאחר השתוות תרמית של המדגם הוא הגיע, להתחיל את המדידה, ולאחר 1 דקות, להזריק 30 μL של Lהשעיית ליפוזום. לאחר 3 דקות, להזריק את LTP של עניין (ריכוז סופי של 200 ננומטר), ולתעד את האות.
  3. בצע ניסוי שני כדי לנרמל את אות NBD. לערבב 30 μL של LB-Eq ליפוזום השעיה עם 250 nM NBD-PHFAPP ב 570 μL של חוצץ HKM. לאחר 1 דקות, להזריק 30 μL של LA-Eq השעיה ליפוזום.
    הערה: כאן, אות NBD, המכונה FEq, מתאים לזה שיש למדוד אם PI(4)P היה מכויל לחלוטין בין ליפוזומים LA ו- LB.
  4. המר את העקומות הקינטיות כדי לקבוע את כמות ה- PI(4)P (ב- μM) המועבר מ- LB ל- LA ליפוזומים לאורך זמן. כל נקודת נתונים (F) מנורמלת באמצעות נוסחה 5 שבה F0 מתאים לאות NBD לפני הוספת LTP, ו- FEq הוא האות הנמדד בשלב 6.3.
    הערה: כמות PI(4)P (ב- μM) המועברת מ- LB ל- Lליפוזומים תואמת ל- 2.5 × Fנורם, בהתחשב בכך שיווי המשקל מתאים למצב שבו מחצית מה- PI (4)P הכלול בעלון החיצוני של ליפוזומים LB (כלומר, 0.5 × 5 μM) הועברה בליפוזומים LA.

7. ניתוח עקומות קינטיקה

  1. לכמת את המידה שבה LTP יעיל על ידי קביעת המהירות שבה LTP זה מעביר שומנים מאוכלוסיית ליפוזום אחת לאחרת בשניות הראשונות לאחר הזרקתו לקובט.
    1. בצע רגרסיה ליניארית של נקודות הנתונים הראשונות של קינטיקה ההעברה כדי להשיג שיפוע. חלק את ערך השיפוע בריכוז LTP בתערובת התגובה כדי לקבוע את מספר מולקולות השומנים המועברות לכל חלבון ליחידת זמן (דקות או ים).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figure 1
איור 1: תיאור חיישני השומנים הפלואורסצנטיים ובבדיקות במבחנה. (A)דגמים תלת-ממדיים של NBD-C2Lact ו- NBD-PHFAPP המבוססים על מבנה הגביש של תחום C2 של לקטדרין בקר (מזהה PDB: 3BN648)ומבנה NMR של תחום ה- PH של חלבון FAPP1 האנושי (מזהה PDB: 2KCJ46). N,N'-דימתיל-N-(thioacetyl)-N'-(7-ניטרבנץ-2-אוקסה-1,3-דיאזול-4-yl)אתילנדיאמין מויטי, שנבנה באופן ידני וממוזער אנרגטית, הושתל על פונקציית התיול של C352 (NBD-C2Lact)ו- C13 (NBD-PHFAPP) שאריות (המיוצגות כדורים, עם פחמן בירוק, חנקן בכחול, חמצן באדום, גופרית בצהוב ומימן בלבן). פני השטח של אתר כריכת השומנים של כל בדיקה נצבעו בכחול. (ב)תוחם חילוץ. ב- PS החילוץ assay, PC / PS ליפוזומים (98/2 מול / מול) היו דגירה עם 250 nM NBD-C2Lact. בהיעדר מיצוי, הגשושית קשורה מאוד לליפוזומים, וכתוצאה מכך שינוי כחול של פלואורסצנטיות NBD ועלייה בעוצמת הפליטה שלה. אם חילוץנ.ב. התרחש בנוכחות LTP ( למשל, Osh6p), הגשושית התנתקה מהליפוזומים, והפלואורסצנטיות שלה הייתה נמוכה יותר. ב PI(4)P חילוץ assay, ליפוזומים היו מסוממים עם 2 מול% PI(4)P, ו 250 nM NBD-PHFAPP שימש. (C)עבירות תחבורה שומנים מבוססות FRET. ב- PS הובלה assay, PC / PS / Rhod-PE ליפוזומים (93/5/2 מול / מול, LA) היו דגירה עם 250 nM NBD-C2Lact. ליפוזומים PC (LB), מסומם או לא עם 5 מול% PI(4)P, ו Osh6p נוספו ברצף ב t = 1 דקות ו t = 4 דקות, בהתאמה. אם תעבורת PS מתרחשת, זה מעורר dequenching של אות NBD המתאים טרנסלוקציה של LBD-C2Lact מ LA ל LB ליפוזומים. ב PI(4)P תחבורה assay, LB ליפוזומים מסוממים עם 5 מול% PI(4)P היו דגירה עם 250 nM NBD-PHFAPP. ליפוזומים PC (LA)מסומם או לא עם 5 מול% PS נוספו. אם מתרחשת תעבורת PI(4)P, הדבר גורם להרוות את אות NBD עקב טרנסלוקציה של NBD-PHFAPP מ- LB לליפוזומים של LA. קיצורים: NBD = 7-ניטרבנץ-2-oxa-1,3-דיאזול פלואורופור; NMR = תהודה מגנטית גרעינית; FAPP1 = חלבון ארבעה-מתאם פוספט 1; PDB = בנק נתוני חלבון; נ.ב. פוספטידילסרין; PC = פוספטידילכולין; LTP = חלבון העברת שומנים; Osh6p = חלבון מחייב אוקסיסטרול (OSBP) הומולוג 6 חלבון; PI(4)P = פוספטידילינוזיטול 4-פוספט; FRET = העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית; רוד-PE = רודמין-תווית פוספטידילטנולמין; Lליפוזומים = ליפוזומים המורכבים ממחשב אישי, מסוממים עם 2 מול% רוד-PE, ומכילים או לא 5 מול% PS; ליפוזומים LB = ליפוזומים המשלבים 5 מול% PI(4)P. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2A מציג ניתוח SDS-PAGE של המוצרים של שלבים שונים המובילים לטיהורשל LactC2 . Lane 1 מציג את פרופיל החלבון של החיידקים המהוללים המבטאים אתהלק GST-C2 (~ 44.8 kDa), בעוד נתיבים 2 ו -3 בהתאמה מראים את פרופילי החלבון של פסולת על-טבעית וחיידקית לאחר צנטריפוגה אולטרה-מרכזית. ההשוואה של נתיבים אלה מראה כי GST-C2לקט כבר התאושש supernatant ולכן ניתן לבודד באמצעות חרוזי אגרוז הקשורים גלוטתיון. נתיבים 4 ו-5 מציגים את פרופילי החלבון של הסופר-טבעי לאחר הדגירה עם חרוזים ושטיפה שנמצאו על ידי זרימת הכבידה, ואילו נתיב 6 מראה את הפרופיל של חלבונים שנשמרו על החרוזים. ניתוח של נתיבים אלה מצביע על כך שכמעט כלLact GST-C2 כבר התאושש מן החרוזים.

נתיבים 8-12 מראים את נוכחותה של להקה גדולה המתאימה ל- C2Lact (~ 17.9 kDa) בסופרנטים שהתאוששו באמצעות שטיפה רצופה של החרוזים לאחר טיפול תרומבין. נתיב 13 מציין כיLactGST-C2 לא מבקע , יחד עם GST (~ 26.9 kDa), נשאר חייב חרוזים לאחר טיפול זה. ההשוואה של נתיבים אלה מצביעה על כך שהליך המחשוף, אם כי לא יעיל ב-100%, הניבLact C2 שאז תויג באופן פלואורסצנטי. איור 2B מציג ספקטרום ספיגה אולטרה סגול (UV) שלLact C2 המסומן ב-NBD. כמו המבנה הוא 100% טהור, תוצאות אלה לאשר כי כל מולקולותLact C2 היו מסומנים עם קבוצת NBD בהתבסס על הצפיפות האופטית נמדד ב 280 ננומטר (Trp) ו 495 ננומטר (NBD). הטוהר של NBD-C2לקט והפלואורסצנטיות שלו נקבעו על ידי ניתוח SDS-PAGE(איור 2C).

Figure 2
איור 2: טיהורהלק NBD-C2. (A)ניתוח SDS-PAGE שימש לבדיקת נוכחות החלבון בשלבים שונים של הליך הטיהור לפני התיוג. ראשי החצים מציינים את המיקום של קבוצת המחשבים C2Lact (ראש חץ אדום), של GST לבד (ראש חץ אפור) ושל מבנההלק GST-C2 (ראש חץ שחור). (B) ספקטרום ספיגה הנראה UV שלLactNBD-C2 . (ג) ניתוח SDS-PAGE שלLactNBD-C2 מטוהר. התמונה הראשונה נרכשה תחת תאורת UV ללא כתמים וחושף את נוכחותו של מבנההלק NBD-C2 כפי שהוא פולט פלואורסצנטיות. התמונה השנייה מציגה את אותו ג'ל לאחר הליך הכתמת חלבונים (ראה טבלת החומרים). קיצורים: NBD = 7-ניטרבנץ-2-oxa-1,3-דיאזול פלואורופור; NBD-C2לקט = N,N'-דימתיל-N-(thioacetyl)-N'-(7-ניטרבנץ-2-אוקסה-1,3-דיאזול-4-yl)אתילנדיאמין מויטי המקושר לתפקוד תיול של C352 שאריות של גרסה מחודשת של תחום C2 של לקטדרין בקר (מזהה PDB: 3BN648); PDB = בנק נתוני חלבון; SDS-PAGE = נתרן דודצילסולפט אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילמיד; GST = גלוטתיון S-transferase; MW = סמן גודל משקל מולקולרי; UV = אולטרה סגול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3 מציג את התוצאות של PS ו- PI(4)P חילוץ התקפות באמצעות Osh6p. כאשר רק דגירה עם ליפוזומים המכילים 2 מול% PS, הפלואורסצנטיות של NBD-C2Lact הייתה מקסימלית כמו פלואורופור NBD הוכנס לממברנה (כלומר, הקשר הידרופובי), המציין כי החיישן היה קשור ממברנה. בנוכחות Osh6p, הפלואורסצנטיות הייתה נמוכה יותר ודומה לזו שנמדדה עם ליפוזומים טהורים של PC (איור 3A). הנורמליזציה של ערכי האינטנסיביות ב- 536 ננומטר הצביעה על כך ש- ~ 75% מ- PS הנגיש הופק. ב- assay השני, NBD-PHFAPP היה מעורבב עם ליפוזומים המכילים 2 מול% PI(4)P. אות NBD היה גבוה ללא Osh6p, אך נמוך כאשר Osh6p היה נוכח והיה דומה לזה שנמדד עם PI(4)ליפוזומים ללא P(איור 3B). ניתוח של העוצמה גילה כי ~ 100 % של PI נגיש(4)P חולץ על ידי LTP.

Figure 3
איור 3: בדיקת מיצוי. (A) ספקטרום פלואורסצנטיות של NBD-C2 לקט (250ננומטר) נמדד על עירור ב 460 ננומטר בנוכחות ליפוזומים (80 מיקרומטר, 2 מול% PS) בהיעדר או נוכחות של 3 μM Osh6p. ספקטרום התייחסות נרשמו עם ליפוזומים PC טהורים דגירה או לא עם NBD-C2Lact (פאנל שמאלי). מספר ספקטרום נרשמו מסדרות שונות של בארות, תוקנו על ידי חיסור אות פיזור הרקע מליפוזומים של DOPC בלבד ובממוצע (n = 4, ± SEM). אחוז ה- PS הנגיש שחולץ מצוין (החלונית הימנית). (B)ספקטרום פלואורסצנטיות של NBD-PHFAPP (250 נ"מ) מעורבב עם ליפוזומים (80 מיקרומטר, 2 מול% PI(4)P) בהיעדר או נוכחות של 3 μM Osh6p. ספקטרום התייחסות שנרשם עם ליפוזומים PC בנוכחות ובהיעדר החיישן מוצגים (פאנל שמאלי). מספר ספקטרום נרשמו מסדרות שונות של בארות, תוקנו על ידי חיסור אות פיזור הרקע מליפוזומים של DOPC בלבד ובממוצע (n = 4, ± SEM). אחוז ה- PI(4)P הנגיש שחולץ מצוין (החלונית הימנית). קיצורים: NBD = 7-ניטרבנץ-2-oxa-1,3-דיאזול פלואורופור; NBD-C2לקט = N,N'-דימתיל-N-(thioacetyl)-N'-(7-ניטרבנץ-2-אוקסה-1,3-דיאזול-4-yl)אתילנדיאמין מויטי המקושר לתפקוד תיול של C352 שאריות של גרסה מחודשת של תחום C2 של לקטדרין בקר (מזהה PDB: 3BN648); PDB = בנק נתוני חלבון; נ.ב. פוספטידילסרין; PC = פוספטידילכולין; DOPC = דיאולאוילפוספטידילכולין; Osh6p = חלבון מחייב אוקסיסטרול (OSBP) הומולוג 6 חלבון; PI(4)P = פוספטידילינוזיטול 4-פוספט; SEM = שגיאה סטנדרטית של הממוצע; a.u. = יחידות שרירותיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4A מציג תוצאות אופייניות מביקורת העברת PS באמצעות Osh6p כ-LTP. בזמן אפס, NBD-C2לקט היה מעורבב עם LA ליפוזומים המכילים 5 מול% 16:0/18:1-PS (POPS) ו 2 מול% רוד-PE בנפח של 570 μL של חוצץ HKM ב 30 °C (50 °F). כמו הגשושיתקשורה L ליפוזומים, האות שלה היה מרווה עקב FRET עם Rhod-PE נוכח ליפוזומים אלה. לאחר דקה אחת, נוספו ליפוזומים LB ללא ראוד-PE (30 μL); זה היה צפוי רק לעורר שינוי קל באות עקב דיפוזיה קלה על ידי אוכלוסיית ליפוזום שנייה זו ו / או אפקט דילול. עוצמת האות לאחר התוספת של ליפוזומים LB תואמת F0. הזרקה של כמה μL של פתרון מלאי של Osh6p (בדרך כלל 40 מיקרומטר) כדי לדלל 200 ננומטר של החלבון בתערובת התגובה עורר עלייה איטית באות NBD עקב dequenching של פלואורופור כמו PS הועבר מ LA ל LB ליפוזומים, ובכך קידום טרנסלוקציה של NBD-C2Lact.

כאשר ליפוזומים LB הכילו 5 מול% PI(4)P, dequenching היה הרבה יותר מהר, כמו נ.ב הועבר מהר יותר על ידי Osh6p ל LB ליפוזומים בשל שינוי הנגד של PS עם PI(4)P על ידי LTP (עקומה שנייה). העקומה השלישית תואמת לניסוי שבו NBD-C2לקט היה מעורבב עם כמויות שוות של LA-Eq ו LB-Eq ליפוזומים. האות היה גבוה יותר מ- F0 והתכתב למצב שבו הגשושית הייתה קשורה באופן שווה לליפוזומים של LA ו- LB, ובכך שיקפה מצב שבו נ.ב. היה משוויב לחלוטין בין שתי אוכלוסיות הליפוזומים. FEq חושב על ידי חישוב ממוצע של ערך האות שנמדד ב -5 הדקות האחרונות של הניסוי.

Figure 4
איור 4: קינטיקה אופיינית של הובלת PS שנמדדה עם עקומת Osh6p ועיקול התייחסות. (A)ליפוזומים מסוג LB נטולי PI(4)P (200 מיקרומטר סה"כ שומנים) ו- Osh6p (200 ננומטר) נוספו ברצף לקובט המכיל NBD-C2Lact (250 ננומטר) וליקומסומים של LA (200 מיקרומטר) עם 5 מול% PS ו-2 מול% Rhod-PE (עקומה שמאלית). אותו ניסוי בוצע עם ליפוזומים LB מסוממים עם 5 מול% PI(4)P (עקומת ביניים). כדי לקבוע FEq, NBD-C2לקט (250 ננומטר) היה מעורבב מראש עם ליפוזומים LA-Eq; לאחר מכן, ליפוזומים LB-Eq נוספו (עקומה ימנית). (B)עקומות תעבורה ממוצעות של PS נקבעות לאחר הנורמליזציה של מספר מדידות שבוצעו באמצעות ליפוזומים מסוג LB עם או בלי PI(4)P (ממוצע ± SEM, n = 3). (ג) שיעורי העברת PS ראשוניים (כלומר ± SEM, n = 3). קיצורים: NBD = 7-ניטרבנץ-2-oxa-1,3-דיאזול פלואורופור; NBD-C2לקט = N,N'-דימתיל-N-(thioacetyl)-N'-(7-ניטרבנץ-2-אוקסה-1,3-דיאזול-4-yl)אתילנדיאמין מויטי המקושר לתפקוד תיול של C352 שאריות של גרסה מחודשת של תחום C2 של לקטדרין בקר (מזהה PDB: 3BN648); PDB = בנק נתוני חלבון; נ.ב. פוספטידילסרין; Osh6p = חלבון מחייב אוקסיסטרול (OSBP) הומולוג 6 חלבון; PI(4)P = פוספטידילינוזיטול 4-פוספט; רוד-PE = רודמין-תווית פוספטידילטנולמין; Lליפוזומים = ליפוזומים המורכבים מפוספטידילכולין, מסוממים עם 2 מול% רוד-PE, ומכילים או לא 5 מול% PS; ליפוזומים LB = ליפוזומים המשלבים 5 מול% PI(4)P; F = פלואורסצנטיות; F0 = פלואורסצנטיות המתאימה ל- NBD לפני הוספת Osh6p; FEq = אות פלואורסצנטי אם נ.ב. הוא שפל לחלוטין בין LA ו LB ליפוזומים על ידי תהליך העברה; SEM = שגיאה סטנדרטית של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4B מציג עקומות קינטיות ממוצעות של העברת PS מ- LA ליפוזומים לליפוזומים מסוג LB, מסוממים או לא מסוממים עם PI(4)P לאחר הנורמליזציה של נתוני F באמצעות F0 ו- FEq כערכי ייחוס. קצב ההובלה הראשוני עבור כל ניסוי חושב על ידי התאמת נקודות הנתונים הראשוניות שנמדדו לאחר הזרקת החלבון עם פונקציה ליניארית. איור 4C מציג את קצב ההובלה ההתחלתי הממוצע של PS שנקבע משלושה ניסויים שונים באמצעות ליפוזומים של LB עם או בלי PI(4)P. כאשר ליפוזומים LB הכילו 0 ו 5 מול% PI(4)P, השיעורים היו שווים בהתאמה 1.4 ו 15.8 PS.min-1 לכל מולקולת Osh6p. איור 5A מציג תוצאות אופייניות מבחיקת העברה PI(4)P באמצעות Osh6p כ-LTP, אשר בוצעה עם אותם חומרים ותנאים כמו אלה המשמשים לבדיקת התחבורה של PS.

Figure 5
איור 5: קינטיקה אופיינית לתחבורה PI(4)P נמדדת עם Osh6p ועקומת התייחסות. (A)ליפוזומים נטולי PS המכילים 2 מול% רוד-PE (LA,200 מיקרומטר סה"כ שומנים) ו- Osh6p (200 ננומטר) נוספו ברצף לקובט המכיל NBD-PHFAPP (250 נ"מ) וליפוזומים LB (200 מיקרומטר) מסוממים עם 5 מול% PI(4)P (עקומה שמאלית). אותו ניסוי בוצע עם ליפוזומים LA מסוממים עם 5 מול% PS (עקומת ביניים). כדי לקבוע FEq, NBD-PHFAPP (250 ננומטר) היה מעורבב מראש עם ליפוזומים LB-Eq; לאחר מכן, ליפוזומים LA-Eq נוספו (עקומה ימנית). (B)PI(4)P העברת קינטיקה נקבע לאחר נורמליזציה של מספר מדידות של LA ליפוזומים עם או בלי PS (ממוצע ± SEM, n = 3). (C)שיעורי העברה ראשוניים של PI(4)P (כלומר ± SEM, n = 3). קיצורים: NBD = 7-ניטרבנץ-2-oxa-1,3-דיאזול פלואורופור; NBD-PHFAPP = NBD שכותרתו תחום ההומולוגיה Pleckstrin של חלבון אנושי ארבעה פוספט-מתאם 1 (FAPP1, UniProt: Q9HB20, קטע [1-100]); נ.ב. פוספטידילסרין; Osh6p = חלבון מחייב אוקסיסטרול (OSBP) הומולוג 6 חלבון; PI(4)P = פוספטידילינוזיטול 4-פוספט; רוד-PE = רודמין-תווית פוספטידילטנולמין; Lליפוזומים = ליפוזומים המורכבים מפוספטידילכולין, מסוממים עם 2 מול% רוד-PE, ומכילים או לא 5 מול% PS; ליפוזומים LB = ליפוזומים המשלבים 5 מול% PI(4)P; F = פלואורסצנטיות; F0 = פלואורסצנטיות המתאימה ל- NBD לפני הוספת Osh6p; FEq = אות פלואורסצנטי אם PI(4)P הוא שפל לחלוטין בין ליפוזומים LA ו- LB על ידי תהליך העברה; SEM = שגיאה סטנדרטית של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

בזמן אפס, NBD-PHFAPP היה מעורבב עם ליפוזומים LB המכיל 5 מול% PI(4)P בנפח של 570 μL של חוצץ HKM. מכיוון ש- NBD-PHFAPP היה קשור לליפוזומים של LB, האות שלו היה גבוה. לאחר דקה אחת, LA ליפוזומים (30 μL) נוספו, אשר היה צפוי רק לעורר שינוי קל באות. העוצמה אז התאימה F0. הזרקת Osh6p (ריכוז סופי של 200 ננומטר) לתערובת התגובה עוררה מרווה של אות NBD עקב טרנסלוקציה של מולקולותFAPP NBD-PH ל- LA ליפוזומים כמו PI(4)P הועבר מליפוזומים LB לליפוזומים LA. כאשר LA ליפוזומים הכילו 5 מול% POPS, dequenching היה הרבה יותר מהר בשל העברת PI(4)P מהירה יותר הנובעת חילופי PS / PI(4)P. העקומה השלישית תואמת לניסוי שבו NBD-PHFAPP היה מעורבב עם כמויות שוות של LA-Eq ו LB-Eq ליפוזומים.

האות היה נמוך יותר מ- F0 מכיוון שהוא התאים למצב שבו הגשושית הייתה קשורה באופן אחיד לליפוזומים LA ו- LB, ובכך מעידה על שיווי משקל מלא של PI(4)P בין הליפוזומים. FEq חושב על ידי חישוב ממוצע של ערך האות שנמדד ב -5 הדקות האחרונות של הניסוי. איור 5B,C מראה עקומות קינטיקה ממוצעות שהושגו לאחר נורמליזציה של אותות וממוצע PI(4)P שיעורי העברה ראשוניים נמדדו עם ליפוזומים LA שהיו מסוממים או לא מסוממים עם 5 מול% PS. כאן, ראוי לציין כי שני ליגנדים שומנים הועברו מהר יותר עם מהירויות דומות כאשר כל שומנים היה נוכח בתחילה ממברנות LA ו- LB, בהתאמה, מה שמצביע על כך Osh6p הוא מחליף PS / PI(4).P.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

התוצאות של בדיקות אלה מסתמכות ישירות על האותות של חיישני השומנים הפלואורסצנטיים. לכן, הטיהור של בדיקות אלה שכותרתו ביחס 1:1 עם NBD וללא זיהום פלואורופור NBD חינם הוא צעד קריטי בפרוטוקול זה. כמו כן, חובה לבדוק אם ה- LTP הנבדק מקופל כראוי ולא צבור. כמות ה- LTP שנבדקה בבדיקות החילוץ חייבת להיות שווה או גבוהה מזו של מולקולות PS או PI(4)P נגישות כדי למדוד כראוי אם LTP זה מחלץ ביעילות שומנים אלה. ואכן, NBD-C2לקט ו- NBD-PHFAPP נקשרים ל- PS ו- PI(4)P, בהתאמה, בעקבות עקומת כריכת רוויה קלאסית. בהתחשב זיקתם בהתאמה PS ו PI(4)P, בדיקות אלה נשארים קשורים במידה רבה ליפוזומים גם אם הליפוזומים מכילים עקבות שיורית של ליגנדים אלה. זה יכול להוביל למסקנה שגויה כי LTP אינו ביעילות לחלץ שומנים אלה. הפרוטוקול מסתמך על תת-מינים סטנדרטיים וזמינים מסחרית של מחשבים אישיים, PS ו- PI(4)P שהם 18:1/18:1-PC, 16:0/18:1-PS ו- 16:0/16:0-PI(4)P, בהתאמה. ביצוע ניסויים באמצעות מינים שומנים עם שרשראות אציל אחרות יכול לתת תוצאות שונות, כפי שדווח בעבר12,35.

בעבירות, אם הרכב השומנים בתפזורת (לא שוקל PS או PI(4)P) של ליפוזומים LA ו- LB יש לשנות, זה המפתח גם לבצע את ניסויי הבקרה באמצעות LA-Eq ו LB-Eq ליפוזומים עם הרכב בתפזורת דומה לזה של ליפוזומים LA ו- LB, בהתאמה. אותו עיקרון חל על עשיות החילוץ. תחומים מקודדים גנטית פלואורסצנטית מחייבי שומנים משמשים באופן נרחב כדי לנתח את התפלגות השומנים בתוך תאים44. זהירות מומלצת בעת ניתוח ניסויים כגון הקשר של בדיקות שומנים אלה עם הממברנה, אם כי מונע בעיקר על ידי נוכחות של השומנים הממוקדים, יכול להיות מושפע על ידי פרמטרים אחרים (צפיפות של שומנים אניוניים, אריזת שומנים) השונים בין תאי התא. במבחנות אלה במבחנה, הרכב הליפוזומים הוא הרבה יותר פשוט מזה של ממברנות הסלולר: הם עשויים בעיקר של PC, שומנים zwitterionic, ובכך לחשוף משטח אינרטי למדי שאינו משפיע על איך PS ו PI(4)P מזוהים על ידי החיישן המתאים שלהם. PHFAPP יכול לשמש בנוכחות שומנים אניוניים, כגון PS, חומצה פוספטידית (PA), ו PI32, ו- C2Lact אינו מזהה PI(4)P12; שתי תצפיות אלה מאפשרות מדידות משוחדות של חילופי PS/PI(4)P. NBD-PHFAPP אינו מושפע סטרול43.

עם זאת, לא ידוע אם בדיקות אלה, בפרט, NBD-C2Lact, ניתן להשתמש עם ליפוזומים עם תכונות קיצוניות (למשל, נמוך מאוד או גבוה שומנים אריזה, משטח טעון שלילית מאוד, נוכחות של תחומים שומנים). למרות מגבלה פוטנציאלית זו ביחס להרכב ליפוזום, בדיקות העברה אלה המבוססות על חיישני פלורסנט יש יתרונות עצומים בהשוואה לשיטות אחרות. ראשית, הם אינם מסתמכים על PS ו- PI(4)P שנושאים קבוצה מגושם במיוחד וסביר להניח שאינם מאוכלסים כראוי על ידי הכיס המחייב של LTPs. שנית, מקרים אלה מציעים רזולוציית זמן טובה בהרבה מאשר שיטות המבוססות על הפרדת ליפוזום (סמך רדיואקטיביות45 או ספקטרומטריית מסה33), ויש לציין כי PI(4)P ו- PS מבוססי רדיו אינם זמינים מסחרית. היכולת של חלבון להעביר PS או PI(4)P אינה מושפעת על ידי הקשר של חיישנים פלואורסצנטיים עם ליפוזומים. ואכן, אם כמות ה-NBD-C2Lact או NBD-PHFAPP ושל PS ו- PI(4)P בעלון החיצוני של ליפוזומים הנגישים ל- LTP נחשבת, רק 5% של PS או PI(4)P קשורים לבדיקה במהלך מדידת קינטיקה.

יתר על כן, רק 0.55-0.86% משטח הממברנה מכוסה על ידי הגשושית, בהתחשב במשטח הכולל של ליפוזומים (LA+ LB ליפוזומים; 5.1 × 1016 ננומטר2 עם שטח של 0.7 ננומטר2 לכל שומנים), משטח הממברנה כי מולקולת C2 או PH בודדים אחד יכול לכבוש (≈3.1 ו 4.8 ננומטר2, בהתאמה, מוערך מהתייחסויות46, 47,48) והריכוז שלהם (250 ננומטר). לפיכך, העקרונות העומדים בבסיס בחינה זו מותאמים לנתח כראוי את ההיבטים הקינטיים והמכניסטיים של LTPs. כפי שהוזכר במבוא, שינויים בפעילות של ORP5/8 יכול להוביל תפקוד לקוי הסלולר49. לדוגמה, הפולשניות של תאי סרטן הלבלב מסתמכת על רמת הביטוי ORP5. יתר על כן, סיבתיות קיימת בין רמות גבוהות של ביטוי ORP5 לבין הפרוגנוזה הירודה של סרטן הלבלב האנושי. רמה גבוהה של ביטוי ORP5 מזוהה גם ברקמות גידול ריאות, ובמיוחד, במקרים גרורתיים. מעניין, היכולת של ORP5 להעביר שומנים עשויה להסביר מדוע הוא מקדם התפשטות תאים והגירה.

ORP5 מעלה את היעד היונקים של קומפלקס rapamycin 1 (mTORC1), אשר ממלא תפקיד מרכזי בהישרדות תאים והתפשטות, כנראה בגלל זה משפר את הפעילות של Akt, מפעיל במעלה הזרם של mTORC1, על ידי אספקת ראש הממשלה עם PS. בסך הכל, תצפיות אלה מציעות כי ORP5 עשוי להיות יעד פרמקולוגי מעניין, וכי אלה במבחנה אסיסטים עשוי לשמש מולקולות מסך המסוגלים לעכב את פעילותה. הבדיקה הזו יכולה גם לעזור להגדיר טוב יותר אם חברים אחרים במשפחת ORP/Osh הם מחליפי PS/PI(4)P. יש לציין כי ORP10 נמצא כמי שמקמצן את נ.ב. במבחנה ומעביר נ.ב. באתרי קשר ER-Golgi27,50, אך עדיין לא ידוע אם הוא פועל כמחליפון PS/PI(4)P. יתר על כן, פרוטוקולים אלה יכולים לשמש כדי לחקור את היכולת של LTPs השייכים למשפחות אחרות להעביר PI(4)P, כפי שהוכח לאחרונה עם חלבונים רגולטוריים חריפים steroidogenic כמו העברת10, או PS. בנוסף, NBD-PHFAPP שימש לעקוב אחר היכולת של LTP להעביר PI(4,5)P2 בין ליפוזומים, כפי שהוא מזהה PIP10, 35. לבסוף, אסטרטגיה זו יכולה להיות מותאמת כדי למדוד תהליכי מיצוי או הובלה אחרים במבחנה באמצעות תחומים אחרים מחייבי שומנים(למשל, PI-PLC לא קטליטי כדי לזהות PI51, חלבון ספציפי לנבג 20 קטע כדי לזהות PA52, תחום 4 (D4) של perfringolysin O כדי לזהות סטרול53).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

Acknowledgments

אנו מודים לד"ר א. קאטריס על הגהתה הקפדנית של כתב היד. עבודה זו ממומנת על ידי מענק ExCHANGE של סוכנות המחקר הלאומית הצרפתית (ANR-16-CE13-0006) ועל ידי CNRS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 L-cysteine ≥97 % (FG)  Sigma W326305-100G Prepare a 10 mM L-cysteine stock solution in water. Aliquots are stored at -20 °C
2 mL Amber Vial, PTFE/Rub Lnr, for lipids storage in CHCL3 Wheaton W224681
4 mm-diameter glass beads Sigma Z265934-1EA
50 mL conical centrifuge tube Falcon
ÄKTA purifier GE healthcare FPLC
Aluminium foil
Amicon Ultra-15 with a MWCO of 3 and 10 kDa Merck UFC900324, UFC901024
Amicon Ultra-4 with a MWCO of 3 and 10 kDa Merck UFC800324, UFC801024
Ampicillin Prepare a 50 mg/mL stock solution with filtered and sterilized water and store it at -20 °C.
Bestatin Sigma B8385-10mg
BL21 Gold Competent Cells Agilent
C16:0 Liss  (Rhod-PE) in CHCl3 (1 mg/mL) Avanti Polar Lipids 810158C-5MG
C16:0/C16:0-PI(4)P   Echelon Lipids P-4016-3 Dissolve 1 mg of C16:0/C16:0-PI(4)P powder in 250 µL of MeOH and 250 µL of CHCl3. Then complete with CHCl3 to 1 mL. The solution must become clear.
C16:0/C18:1-PS (POPS) in CHCl3 (10 mg/mL) Avanti Polar Lipids 840034C-25mg
C18:1/C18:1-PC (DOPC) in CHCl3 (25 mg/mL) Avanti Polar Lipids 850375C-500mg
CaCl2  Sigma Prepare 10 mM CaCl2 stock solution in water.
Cell Disruptor Constant Dynamics
Chloroform (CHCl3) RPE-ISO Carlo Erba 438601
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail Roche 5056489001
Deionized (Milli-Q) water
Dimethylformamide (DMF), anhydrous, >99% pure
DNAse I Recombinant, RNAse free, in powder Roche 10104159001
DTT Euromedex EU0006-B Prepare 1 M DTT stock solution in Milli-Q water.  Prepare 1 mL aliquots and store them at -20 °C. 
Econo-Pac chromatography columns (1.5 × 12 cm). Biorad 7321010
Electroporation cuvette 2 mm Ozyme EP102
Electroporator Eppendorf 2510 Eppendorf
Fixed-Angle Rotor Ti45 and Ti45 tubes Beckman Spinning the batcerial lysates
Glass-syringes (10, 25, and 50 µL) for fluorescence experiment Hamilton
Glass-syringes (25 , 100, 250, 500, and 1000 µL) to handle lipid stock solutions Hamilton 1702RNR, 1710RNR, 1725RNR, 1750RN type3, 1001RN
Glutathione Sepharose 4B beads GE Healthcare 17-0756-05
Glycerol (99% pure) Sigma G5516-500ML
Hemolysis tubes with a cap
HEPES , >99 % pure Sigma H3375-500G
Illustra NAP 10 desalting column GE healthcare GE17-0854-02
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)  Euromedex EU0008-B Prepare 1 M IPTG stock solution in Milli-Qwater. Prepare 1 mL aliquots and store them at -20 °C. 
K-Acetate Prolabo 26664.293
Lennox LB Broth medium without glucose Prepared with milli-Q water and autoclaved.
Liquid nitrogen Linde
Methanol (MeOH) ≥99.8% VWR 20847.24
MgCl2 Sigma Prepare a 2 M MgCl2 solution. Filter the solution using a 0.45 µm filter. 
Microplate 96 Well PS F-Botom Black Non-Binding Greiner Bio-one 655900
Mini-Extruder with two 1 mL gas-tight Hamilton syringes Avanti Polar Lipids 610023
Monochromator-based fluorescence plate reader TECAN M1000 Pro
N,N'-Dimethyl-N-(Iodoacetyl)-N'-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Ethylenediamine) (IANBD Amide) Molecular Probes Dissolve 25 mg of IANBD in 2.5 mL of dimethylsulfoxide (DMSO) and prepare 25 aliquot of 100 µL in 1.5 mL screw-cap tubes. Do not completely screw the cap. Then, remove DMSO in a freeze-dryer to obtain 1 mg of dry IANBD per tube. Tubes are closed and stored at -20 °C in the dark.  
NaCl Sigma S3014-1KG
PBS 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM NaH2PO4, 1.8 mM KH2PO4, autoclaved and stored at 4 °C.
Pear-shaped glass flasks (25 mL, 14/23, Duran glass) Duran Group
Pepstatin Sigma p5318-25mg
pGEX-C2LACT  plasmid Available on request from our lab
pGEX-PHFAPP plasmid Available on request from our lab
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) ≥98.5% (GC) Sigma P7626-25g Prepare a 200 mM PMSF stock solution in isopropanol
Phosphoramidon Sigma R7385-10mg
Polycarbonate filters (19 mm in diameter) with pore size of 0.2 µm Avanti Polar Lipids 610006
Poly-Prep chromatography column (with a 0-2 mL bed volume and a 10 mL reservoir) Biorad 7311550
Prefilters (10 mm in diameter). Avanti Polar Lipids 610014
PyMOL http://pymol.org/ Construction of the 3D models of the proteins (Figure 1A)
Quartz cuvette for UV/visible fluorescence (minimum volume of 600 µL) Hellma
Quartz cuvettes Hellma
Refrigerated centrifuge  Eppendorf 5427R Eppendorf
Rotary evaporator Buchi B-100
Screw-cap microcentriguge tubes (1.5 mL) Sarsted
Small magnetic PFTE stirring bar (5 × 2 mm)
Snap-cap microcentriguge tubes (0.5, 1, and 2 mL) Eppendorf
SYPRO orange fluorescent stain to detect protein in SDS-PAGE gel
Thermomixer Starlab
THROMBIN, FROM HUMAN PLASMA Sigma 10602400001 Dissolve 20 units in 1 mL of milli-Q water and prepare 25 µL aliquots in 0.5 mL Eppendorf tubes. Then freeze and store at -80 °C.
Tris, ultra pure MP 819623
Ultracentrifuge L90K Beckman
UV/Visible absorbance spectrophotometer SAFAS
UV/visible spectrofluorometer with a temperature-controlled cell holder and stirring device Jasco or Shimadzu Jasco FP-8300 or Shimadzu RF-5301PC
Vacuum chamber
Water bath Julabo
XK 16/70 column packed with Sephacryl S200HR GE healthcare

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Drin, G. Topological regulation of lipid balance in cells. Annual Review of Biochemistry. 83, 51-77 (2014).
  2. Bigay, J., Antonny, B. Curvature, lipid packing, and electrostatics of membrane organelles: defining cellular territories in determining specificity. Developmental Cell. 23 (5), 886-895 (2012).
  3. Prinz, W. A. Lipid trafficking sans vesicles: where, why, how. Cell. 143 (6), 870-874 (2010).
  4. Holthuis, J. C., Menon, A. K. Lipid landscapes and pipelines in membrane homeostasis. Nature. 510 (7503), 48-57 (2014).
  5. Wong, L. H., Copic, A., Levine, T. P. Advances on the transfer of lipids by lipid transfer proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 516-530 (2017).
  6. Wong, L. H., Gatta, A. T., Levine, T. P. Lipid transfer proteins: the lipid commute via shuttles, bridges and tubes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (2), 85-101 (2019).
  7. Iaea, D. B., Dikiy, I., Kiburu, I., Eliezer, D., Maxfield, F. R. STARD4 membrane interactions and sterol binding. Biochemistry. 54 (30), 4623-4636 (2015).
  8. Wilhelm, L. P., et al. STARD3 mediates endoplasmic reticulum-to-endosome cholesterol transport at membrane contact sites. The EMBO Journal. 36 (10), 1412-1433 (2017).
  9. Bian, X., Saheki, Y., De Camilli, P. Ca(2+) releases E-Syt1 autoinhibition to couple ER-plasma membrane tethering with lipid transport. The EMBO Journal. 37 (2), 219-234 (2018).
  10. Horenkamp, F. A., Valverde, D. P., Nunnari, J., Reinisch, K. M. Molecular basis for sterol transport by StART-like lipid transfer domains. The EMBO Journal. 37 (6), 98002 (2018).
  11. Jentsch, J. A., et al. Structural basis of sterol binding and transport by a yeast StARkin domain. The Journal of Biological Chemistry. 293 (15), 5522-5531 (2018).
  12. Moser von Filseck, J., et al. INTRACELLULAR TRANSPORT. Phosphatidylserine transport by ORP/Osh proteins is driven by phosphatidylinositol 4-phosphate. Science. 349 (6246), 432-436 (2015).
  13. Daum, G., et al. Systematic analysis of yeast strains with possible defects in lipid metabolism. Yeast. 15 (7), 601-614 (1999).
  14. Ejsing, C. S., et al. Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).
  15. Leidl, K., Liebisch, G., Richter, D., Schmitz, G. Mass spectrometric analysis of lipid species of human circulating blood cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1781 (10), 655-664 (2008).
  16. Sampaio, J. L., et al. Membrane lipidome of an epithelial cell line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (5), 1903-1907 (2011).
  17. Vance, J. E., Steenbergen, R. Metabolism and functions of phosphatidylserine. Progress in Lipid Research. 44 (4), 207-234 (2005).
  18. Zinser, E., et al. Phospholipid synthesis and lipid composition of subcellular membranes in the unicellular eukaryote Saccharomyces cerevisiae. Journal of Bacteriology. 173 (6), 2026-2034 (1991).
  19. Leventis, P. A., Grinstein, S. The distribution and function of phosphatidylserine in cellular membranes. Annual Review of Biophysics. 39, 407-427 (2010).
  20. Yeung, T., et al. Membrane phosphatidylserine regulates surface charge and protein localization. Science. 319 (5860), 210-213 (2008).
  21. Kim, J., Shishido, T., Jiang, X., Aderem, A., McLaughlin, S. Phosphorylation, high ionic strength, and calmodulin reverse the binding of MARCKS to phospholipid vesicles. Journal of Biological Chemistry. 269 (45), 28214-28219 (1994).
  22. Sigal, C. T., Zhou, W., Buser, C. A., McLaughlin, S., Resh, M. D. Amino-terminal basic residues of Src mediate membrane binding through electrostatic interaction with acidic phospholipids. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (25), 12253-12257 (1994).
  23. Gal Bivona, T., et al. PKC regulates a farnesyl-electrostatic switch on K-Ras that promotes its association with Bcl-XL on mitochondria and induces apoptosis. Molecular Cell. 21 (4), 481-493 (2006).
  24. Finkielstein, C. V., Overduin, M., Capelluto, D. G. Cell migration and signaling specificity is determined by the phosphatidylserine recognition motif of Rac1. The Journal of Biological Chemistry. 281 (37), 27317-27326 (2006).
  25. Bolsover, S. R., Gomez-Fernandez, J. C., Corbalan-Garcia, S. Role of the Ca2+/Phosphatidylserine Binding Region of the C2 Domain in the Translocation of Protein Kinase Cα to the Plasma Membrane. Journal of Biological Chemistry. 278 (12), 10282-10290 (2003).
  26. Vance, J. E., Tasseva, G. Formation and function of phosphatidylserine and phosphatidylethanolamine in mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1831 (3), 543-554 (2013).
  27. Maeda, K., et al. Interactome map uncovers phosphatidylserine transport by oxysterol-binding proteins. Nature. 501 (7466), 257-261 (2013).
  28. D'Ambrosio, J. M., et al. Osh6 requires Ist2 for localization to ER-PM contacts and efficient phosphatidylserine transport in budding yeast. Journal of Cell Science. 133 (11), 243733 (2020).
  29. Manford, A. G., Stefan, C. J., Yuan, H. L., Macgurn, J. A., Emr, S. D. ER-to-plasma membrane tethering proteins regulate cell signaling and ER morphology. Developmental Cell. 23 (6), 1129-1140 (2012).
  30. Collado, J., et al. Tricalbin-mediated contact sites control ER curvature to maintain plasma membrane integrity. Developmental Cell. 51 (4), 476-487 (2019).
  31. Hoffmann, P. C., et al. Tricalbins contribute to cellular lipid flux and form curved ER-PM contacts that are bridged by rod-shaped structures. Developmental Cell. 51 (4), 488-502 (2019).
  32. Lipp, N. F., et al. An electrostatic switching mechanism to control the lipid transfer activity of Osh6p. Nature Communications. 10 (1), 3926 (2019).
  33. Chung, J., et al. INTRACELLULAR TRANSPORT. PI4P/phosphatidylserine countertransport at ORP5- and ORP8-mediated ER-plasma membrane contacts. Science. 349 (6246), 428-432 (2015).
  34. Sohn, M., et al. PI(4,5)P2 controls plasma membrane PI4P and PS levels via ORP5/8 recruitment to ER-PM contact sites. The Journal of Cell Biology. 217 (5), 1797-1813 (2018).
  35. Ghai, R., et al. ORP5 and ORP8 bind phosphatidylinositol-4, 5-biphosphate (PtdIns(4,5)P 2) and regulate its level at the plasma membrane. Nature Communications. 8 (1), 757 (2017).
  36. Sohn, M., et al. Lenz-Majewski mutations in PTDSS1 affect phosphatidylinositol 4-phosphate metabolism at ER-PM and ER-Golgi junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4314-4319 (2016).
  37. Kattan, W. E., et al. Targeting plasma membrane phosphatidylserine content to inhibit oncogenic KRAS function. Life Science Alliance. 2 (5), 00431 (2019).
  38. Du, X., Turner, N., Yang, H. The role of oxysterol-binding protein and its related proteins in cancer. Seminars in Cell & Developmental Biology. 81, 149-153 (2018).
  39. Galmes, R., et al. ORP5/ORP8 localize to endoplasmic reticulum-mitochondria contacts and are involved in mitochondrial function. EMBO reports. 17 (6), 800-810 (2016).
  40. Du, X., et al. ORP5 localizes to ER-lipid droplet contacts and regulates the level of PI(4)P on lipid droplets. The Journal of Cell Biology. 219 (1), 201905162 (2020).
  41. Wang, H., et al. ORP2 delivers cholesterol to the plasma membrane in exchange for phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PI(4,5)P2). Molecular Cell. 73 (3), 458-473 (2019).
  42. Kay, J. G., Grinstein, S. Sensing phosphatidylserine in cellular membranes. Sensors (Basel). 11 (2), 1744-1755 (2011).
  43. Moser von Filseck, J., Vanni, S., Mesmin, B., Antonny, B., Drin, G. A phosphatidylinositol-4-phosphate powered exchange mechanism to create a lipid gradient between membranes. Nature Communications. 6, 6671 (2015).
  44. Wills, R. C., Goulden, B. D., Hammond, G. R. V. Genetically encoded lipid biosensors. Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1526-1532 (2018).
  45. Raychaudhuri, S., Im, Y. J., Hurley, J. H., Prinz, W. A. Nonvesicular sterol movement from plasma membrane to ER requires oxysterol-binding protein-related proteins and phosphoinositides. The Journal of Cell Biology. 173 (1), 107-119 (2006).
  46. Lenoir, M., et al. Structural basis of wedging the Golgi membrane by FAPP pleckstrin homology domains. EMBO reports. 11 (4), 279-284 (2010).
  47. Liu, Y., Kahn, R. A., Prestegard, J. H. Interaction of Fapp1 with Arf1 and PI4P at a membrane surface: an example of coincidence detection. Structure. 22 (3), 421-430 (2014).
  48. Shao, C., Novakovic, V. A., Head, J. F., Seaton, B. A., Gilbert, G. E. Crystal structure of lactadherin C2 domain at 1.7A resolution with mutational and computational analyses of its membrane-binding motif. The Journal of Biological Chemistry. 283 (11), 7230-7241 (2008).
  49. Lipp, N. F., Ikhlef, S., Milanini, J., Drin, G. Lipid exchangers: cellular functions and mechanistic links with phosphoinositide metabolism. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 663 (2020).
  50. Venditti, R., et al. Molecular determinants of ER-Golgi contacts identified through a new FRET-FLIM system. The Journal of Cell Biology. 218 (3), 1055-1065 (2019).
  51. Pemberton, J. G., et al. Defining the subcellular distribution and metabolic channeling of phosphatidylinositol. The Journal of Cell Biology. 219 (3), (2020).
  52. Nakanishi, H., de los Santos, P., Neiman, A. M. Positive and negative regulation of a SNARE protein by control of intracellular localization. Molecular Biology of the Cell. 15 (4), 1802-1815 (2004).
  53. Maekawa, M., Yang, Y., Fairn, G. D. Perfringolysin O theta toxin as a tool to monitor the distribution and inhomogeneity of cholesterol in cellular membranes. Toxins. 8 (3), 67 (2016).

Tags

ביוכימיה גיליון 169 חלבון העברת שומנים בדם חלבון הקשור ל-OSBP פוספטידילסרין פוספטידילינוזיטול 4-פוספט פלואורסצנטיות חלבון רקומביננטי ליפוזום
מדידות מבוססות פלואורסצנטיות של פוספטידילסרין/פוספטידילינוזיטול 4-חילופי פוספט בין ממברנות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ikhlef, S., Lipp, N. F., Magdeleine, … More

Ikhlef, S., Lipp, N. F., Magdeleine, M., Drin, G. Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes. J. Vis. Exp. (169), e62177, doi:10.3791/62177 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter