Summary
Denne protokol fokuserer på kromatinpræparation fra snapfrosne væv, og den er velegnet til tværbindingskromatinimmunudfældning (X-ChIP) efterfulgt af enten kvantitativ PCR-analyse (X-ChIP-qPCR) eller næste generations sekventeringsmetoder (X-ChIP-seq).
Abstract
Tværbinding af kromatinimmunudfældning (X-ChIP) er en meget anvendt teknik til vurdering af niveauer af histonmærker og belægning af transkriptionsfaktorer på værts- og / eller patogenkromatin. Kromatinpræparat fra væv skaber yderligere udfordringer, der skal overvindes for at opnå reproducerbare og pålidelige protokoller, der kan sammenlignes med dem, der anvendes til cellekultur. Vævsforstyrrelse og fiksering er kritiske trin for at opnå effektiv klipning af kromatin. Sameksistens af forskellige celletyper og klynger kan også kræve forskellige klippetider for at nå optimal fragmentstørrelse og hindrer forskydningsreproducerbarhed. Formålet med denne metode er at opnå pålidelige og reproducerbare værtskromatinpræparater fra frosset væv (lever), der er egnet til både ChIP-qPCR og næste generations sekventering (NGS) applikationer. Vi observerede, at kombinationen af pulverisering af flydende nitrogenvæv efterfulgt af homogenisering fører til øget reproducerbarhed sammenlignet med homogenisering alene, da det giver en suspension, der hovedsagelig består af dissocierede enkeltceller, der effektivt kan klippes. Desuden bør fikseringstrinnet udføres under mild rotation for at tilvejebringe homogen tværbinding. Det faste materiale er derefter egnet til bufferbaseret kerneisolering for at reducere kontaminering af cytoplasmatisk protein og patogen-DNA'er og RNA'er (når det er relevant) og undgå tidskrævende centrifugeringsgradienter. Efterfølgende sonikering vil fuldføre nuklear lyse og forskydning af kromatinet, hvilket producerer et specifikt størrelsesområde i henhold til de valgte skærebetingelser. Størrelsesområdet skal falde mellem 100 og 300 nt for NGS-applikationer, mens det kan være højere (300-700 nt) for ChIP-qPCR-analyse. Sådanne protokoltilpasninger kan i høj grad forbedre kromatinanalyser fra frosne vævsprøver.
Introduction
Siden opdagelsen har epigenetisk regulering i pattedyrceller vundet stigende anerkendelse1, i betragtning af at forståelsen af sådanne mekanismer ville give nøgleindsigt ikke kun i cellebiologi, men også i sygdoms- og tumorbiologi. Desuden kan infektiøse agenser også forårsage epigenetiske ændringer på værten2, mens værtscellemaskineriet også kan påvirke patogeners kromatin, såsom persisterende DNA-vira 3,4. Dette samspil mellem vært og patogen ser ud til at spille en rolle i infektionens vedholdenhed. 2
Gennem en reversibel tilknytning til DNA danner histonproteiner et kompleks kaldet nukleosom. Nukleosomer når igen et højere organisationsniveau kendt som kromatin. Kromatin remodellering er kendt for tæt at regulere genekspression, give eller nægte adgang til transkriptionsfaktorer (TF'er)5. Disse faktorer kan enten udløse eller blokere rekrutteringen af RNA-polymerase II (PolII) på genpromotorer, hvilket påvirker mRNA-syntese fra DNA-skabelonen6. Histonproteiner indeholder haler7, der flankerer begge ender af histonfolden, som kan udsættes for posttranslationelle modifikationer (PTM'er), hvilket muliggør en tæt regulering af gentranskriptionen ved strukturelle kromatinændringer. De fleste histon-PTM'er er placeret ved halen N-terminalen, hvor acetylering og methylering er de bedst undersøgte PTM'er, selvom phosphorylering8, ubiquitination9 og ribosylering10 også er blevet rapporteret. Karakterisering og undersøgelse af sådanne proteiner er derefter afgørende for at få en dyb indsigt i genregulering.
I øjeblikket er der en håndfuld veletablerede metoder og værktøjer til rådighed til at studere direkte DNA-proteininteraktioner: Elektroforetisk mobilitetsskiftassay (EMSA), gær-en-hybrid-assay (Y1H) og DNA-fodaftryk11. Disse metoder fokuserer imidlertid i sig selv på enkelte DNA-proteininteraktioner og er ikke anvendelige til genomdækkende undersøgelser. En anden begrænsning af disse teknikker er manglen på histonforbindelse med de undersøgte DNA-segmenter. Sådanne tilgange er således ikke beregnet til at afspejle kompleksiteten af transkriptionsmaskineriet in vivo , og de tager ikke højde for vigtige strukturelle ændringer12 eller andre krævede enzymer/cofaktorer13 , der kan påvirke (enten fremme eller hæmme) proteinbinding til DNA'et.
Ideen om, at fiksering af celler med midler som formaldehyd (FA) kunne give et in vivo-øjebliksbillede af protein-DNA-interaktioner, skabte grundlaget for udviklingen af kromatinimmunudfældningsassays (ChIP)14. Dette sammen med tilgængeligheden af den kvantitative PCR-teknologi (qPCR) og af meget specifikke antistoffer muliggjorde udviklingen af ChIP-qPCR-assays. Efterfølgende indrømmede fremkomsten af næste generations sekventeringsteknikker (NGS), hvis omkostninger bliver mere overkommelige, at parre ChIP-eksperimenter med NGS-tilgange (ChIP-seq), hvilket giver forskere nye kraftfulde værktøjer, der muliggør undersøgelse af kromatinregulering. I disse assays fikseres isolerede eller dyrkede celler med disuccinimidylglutarat (DSG) og / eller FA, kerner isoleres, kromatin fragmenteres derefter og udfældes af antistoffet af interesse. Herefter renses DNA og analyseres ved PCR- eller NGS-tilgange. I modsætning til EMSA, Y1H og DNA-fodaftryk har ChIP-assays evnen til at give et globalt øjebliksbillede af protein-DNA-interaktion i cellen. Dette giver fleksibilitet og gør det muligt at analysere flere loci inden for samme prøve. På grund af analysens art kan ChIP imidlertid i sidste ende detektere ikke kun direkte interaktioner, men også indirekte, hvilket ikke giver præcisionen af de ovennævnte metoder, når de er interesseret i direkte protein-DNA-interaktioner.
Kromatinpræparationsprotokoller fra cellekulturmateriale er veletablerede15 og meget reproducerbare, hvilket gør det muligt for brugeren at opnå kromatin, der er egnet til både qPCR- og NGS-tilgange på 1-2 arbejdsdage. Imidlertid udgør opnåelse af kromatin af høj kvalitet fra hele væv stadig en udfordring på grund af behovet for at adskille cellerne i vævet, samtidig med at der opnås optimal fiksering og klipning af kromatinet. Derudover varierer sammensætningen og morfologien af forskellige vævstyper, hvilket kræver justering af eksisterende protokoller16,17. Brugen af kryopræserveret væv giver yderligere udfordringer sammenlignet med friske prøver. Dette skyldes vanskeligheden ved at opnå en enkelt cellesuspension uden omfattende materialetab. Dette fører til forkert klipning, hvilket forhindrer downstream-applikationer. Ikke desto mindre øger adgang til frosne vævsprøver snarere end den friske modstykke ikke kun arbejdsfleksibiliteten, men det kan også repræsentere den eneste mulighed for forskere, der arbejder med prøver, der stammer fra langsgående eller sammenlignende undersøgelser. En håndfuld kromatinpræparationsprotokoller for frosset væv er blevet offentliggjort. Disse er for det meste baseret på prøveoptøning efterfulgt af hakning, manuel / maskinbaseret dissociation eller flydende nitrogenpulveriseringstrin18,19,20.
Her beskriver vi en optimeret kromatinpræparationsmetode15 til frosne ikke-fikserede leverprøver, der kombinerer vævspulverisering i flydende nitrogen med støderhomogenisering for at opnå en reproducerbar kromatinskæring, der er egnet til X-ChIP-tilgange, der sigter mod at analysere både virale og værtsgenomer.
Protocol
Vævsprøvetagning fra humane leverkimære mus21 blev udført i overensstemmelse med EU-direktivet 86/609/EØF og godkendt af det etiske udvalg i byen og delstaten Hamburg i overensstemmelse med principperne i Helsingfors-erklæringen.
1. Forberedelse af reagenser
- Forbered 1,25 M glycinopløsning i deioniseret vand. Sterilt filter med 0,22 μm porestort filter. Opbevares ved 4 °C.
- Forbered 5 M natriumchlorid (NaCl) opløsning. Opbevares ved stuetemperatur.
- Forbered CaCl2-opløsning : 300 mMCaCl2 og 10 mM Tris-HCl pH 8 i deioniseret vand. Sterilt filter med 0,22 μm porestort filter og opbevares ved RT.
- Forbered en 10% Triton X-100 fortynding i deioniseret vand. Opbevares hos RT.
- Forbered Tris-EDTA-buffer: 1 mM EDTA og 10 mM Tris pH 8 i deioniseret vand. Opbevares ved 4 °C.
- Forbered følgende buffere i henhold til det krævede beløb:
- Forbered buffer A: 50 mM Hepes-KOH pH 7,5, 140 mM NaCl, 1 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), 10% glycerol, 0,5% NP-40 og 0,25% Triton X-100 i deioniseret vand. Sterilt filter med 0,22 μm porestort filter. Opbevares ved 4 °C.
- Forbered buffer B: 10 mM Tris-HCl pH 8, 200 mM NaCl, 1mM EDTA, 0,5 mM egtazinsyre (EGTA). Sterilt filter med 0,22 μm porestort filter. Opbevares ved 4 °C.
- Forbered buffer C: 1% SDS, 10 mM EDTA og 50 mM Tris-HCl pH 8 i deioniseret vand. Sterilt filter med 0,22 μm porestort filter. Opbevares hos RT.
- Forbered kromatinfortyndingsbuffer: 0,01% SDS, 1,1% Triton X-100, 1,2 mM EDTA, 16,6 mM Tris-HCl pH 8 og 166 mM NaCl i deioniseret vand. Sterilt filter med 0,22 μm porestort filter. Opbevares ved 4 °C.
2. Materiale forberedelse
- Opsaml tøris, is og flydende nitrogen.
FORSIGTIG: Håndter tøris og flydende nitrogen med den nødvendige omhu for at undgå forbrændinger. - Centrifugen forafkøles ved 4 °C.
BEMÆRK: Dette trin er vigtigt for at undgå proteinnedbrydning og tværbinding under vasketrinnene, da dette vil reducere kromatinets kvalitet. - Sæt en steril plade på tøris og lad den køle af.
BEMÆRK: Sørg for, at pladen er stor nok til at lette skæreprocessen. En 100 mm petriplade/cellekulturskål anbefales. - Tag den nødvendige alikvote glycin 1,25 M ud og lad den nå RT.
- De nødvendige delprøver af buffer A, B og PBS udtages. Tilsæt protease- og/eller deacetylase- og fosfatasehæmmere for at nå 1 gange koncentration og lad dem ligge på is.
- Tag den nødvendige delprøve af buffer C ud, og lad den være ved RT. Tilsæt ikke protease- og/eller deacetylase- og fosfatasehæmmere, før det er angivet.
- Tag den nødvendige alikvote af RT PBS ud.
FORSIGTIG: Buffer C indeholder natriumdodecylsulfat (SDS). Anvend passende sikkerhedsforanstaltninger, når bufferen udarbejdes.
BEMÆRK: SDS udfældes på is, og protease- og deacetylasehæmmere er ikke stabile ved RT. - Forafkøl mørtel, der hælder flydende nitrogen i kammeret, nøje efter leverandørens anvisninger. Køl metalstøderen ned i tøris i mindst 5 min.
BEMÆRK: Det er muligt at bruge en alternativ mørtel til den foreslåede. Imidlertid tillader enheden, der anvendes i denne protokol, på grund af sin ejendommelige konstruktion at arbejde med lille mængde væv uden væsentligt tab under pulveriseringsprocessen. - Forafkøl Dounce-homogenisatoren med den tilhørende støder A på is.
BEMÆRK: Pestle A har en løs pasform med homogenisatoren. Dette gør det muligt at opnå en enkelt cellesuspension uden signifikant cellelyse.
3. Vævstværbinding
- Skær ca. 50 mg frosset væv direkte på fadet på tøris ved hjælp af en skalpel og pincet.
BEMÆRK: Det anbefales at holde skalpellen på RT, da dette vil lette skæreprocessen. Undgå at lægge for meget pres på skalpellen, da dette vil øge risikoen for at sprede vævsstykker uden for skæreområdet. For at bemærke skal 50 mg væv (lever i dette tilfælde) give omkring 5 millioner celler. Bemærk, at det varme blad vil tø skærkanten op. I betragtning af vævsstykkets relativt store størrelse bør dette dog have en begrænset effekt. Når mindre stykker skæres, kan det være en fordel at bruge en kold skalpel opmærksom for at undgå spredning af vævet. - Kom det afskårne væv i et 1,5 ml rør, der allerede er kølet på tøris. Undgå optøning af væv.
- Flyt røret, der indeholder vævet, til mørtel, og lad det sidde der i 5 minutter.
BEMÆRK: Hvis prøven hviler i mørtlen, sænkes temperaturen (fra -80 °C til -196 °C). Dette øger dets sejhed og gør pulveriseringstrinnet lettere. - Påfør tryk på prøven ved hjælp af den forkølede støder, indtil der ikke er flere faste smuldrer synlige.
BEMÆRK: Det er vigtigt at undgå støderopvarmning ved for store rotationskræfter, da dette vil tø prøven op. Efter hver prøvepulverisering rengøres støderen med 70% ethanol (EtOH) og lad den køle af igen på tøris. - Røret med prøven fjernes fra mørtel, og der tilsættes 950 μL iskold PBS med de nødvendige inhibitorer. Pipetten pipetteres forsigtigt op og ned, indtil prøven er helt opslæmmet. Fortsæt straks til trin 3.6.
- Overfør vævssuspensionen til homogenisatoren og påfør 20-30 slag med støder A for at opnå en finere suspension. Undgå skumdannelse.
BEMÆRK: Slagmængden skal optimeres i henhold til vævskonsistensen. Dette trin adskiller yderligere de små klynger af celler opnået efter pulverisering. En forkert homogenisering kan påvirke skæreeffektiviteten. - Overfør homogenatet til et nyt 1,5 ml rør, der allerede er forkølet på is.
- Der centrifugeres i 5 minutter ved 1.300 x g ved 4 °C, og supernatanten fjernes forsigtigt.
- Resuspender pellet fuldstændigt i 950 μL RT PBS ved forsigtig pipettering og tilsæt 63,6 μL 16% MeOH-fri FA for at få en slutkoncentration på 1%. Fortsæt straks til trin 3.10.
FORSIGTIG: FA er et giftigt kemikalie. Håndter det under en stinkhætte med passende sikkerhedsforanstaltninger.
BEMÆRK: Ufuldstændig resuspension kan fremkalde celleaggregering under fikseringstrinnet. Dette hindrer lysis og forskydningsprocessen. - Drej 10 min ved RT. Fortsæt derefter straks til trin 3.11
BEMÆRK: Rotation er nødvendig for at undgå aggregater. Den tid, der kræves til fiksering, skal optimeres i henhold til målet af interesse og prøvetypen. Det er vigtigt at bemærke, at overdrevne fikseringstider kan hindre korrekt klipning. - Tilsæt 113 μL 1,25 M glycin ved RT for at opnå en slutkoncentration på 125 mM og roter i 5 minutter.
BEMÆRK: Glycin slukker den fiksative reaktion og undgår over-tværbinding. - Der centrifugeres ved 1.300 x g i 3 minutter ved 4 °C.
- Supernatanten kasseres, og pelletpen resuspenderes omhyggeligt ved pipettering i 950 μl iskold PBS med de nødvendige inhibitorer.
- Der centrifugeres ved 1.300 x g i 3 minutter ved 4 °C.
- Gentag trin 3.13-3.14, og fortsæt straks til kromatinisoleringstrinnene.
4. Kromatinisolering
- Der tilsættes 950 μL buffer A med de nødvendige inhibitorer til pelleten. Bland forsigtigt ved pipettering, indtil pillen er helt opslæmmet, og drej 10 min ved 4 °C.
BEMÆRK: Dette trin lyserer den faste enkeltcellesuspension uden kernelyse. Dette giver mulighed for at befri prøven af cytosoliske proteiner og RNA'er. Forlængelse af lysistiden kan være gavnligt for celler, der er svære at lyse, hvilket dog øger vævets håndteringstid. På dette tidspunkt er det muligt at kontrollere præparatet under mikroskopet efter trypanblå/DAPI-farvning for at kontrollere størrelsen af klyngerne og tilstedeværelsen af enkeltceller. Imidlertid er de enkelte kerner muligvis ikke lette at værdsætte på grund af det faste vævsmateriale. - Der centrifugeres ved 2.000 x g i 5 minutter ved 4 °C, og supernatanten fjernes forsigtigt.
- Tilsæt 950 μL buffer B med de nødvendige hæmmere til pelleten. Bland forsigtigt ved pipettering, indtil pillen er helt opslæmmet, og drej 10 min ved 4 °C.
BEMÆRK: Dette trin vasker lysisbufferen ud af kernepræparatet for at undgå yderligere uønsket lysis. - Der centrifugeres ved 2000 x g i 5 minutter ved 4 °C. I mellemtiden tilsættes de nødvendige hæmmere (samme som trin 2.5) til buffer C.
- Supernatanten fjernes forsigtigt.
- Der tilsættes 300 μL RT-buffer C til pelleten, og pipetten pipetteres kraftigt.
- Vortex prøven i 15-30 s og drej røret kort for at samle dråberne på låget.
BEMÆRK: Dette trin er vigtigt for at frigøre og lyse de faste kerner. For at bevare prøveintegriteten og samtidig undgå SDS-nedbør skal prøven opbevares før sonikering i et plaststativ, der holdes på is for at opretholde en temperatur på 9-11 ° C.
5. Kromatinfragmentering
- Overfør prøven til tre rene 0,65 ml sonikeringscertificerede rør, der sikrer 100 μL lyseret kernesuspension pr. Rør.
BEMÆRK: Det er muligt at bruge 1,5 ml sonikeringscertificerede rør med et maksimalt volumen på 300 μL. Der er behov for en særlig holder til disse rør. 0,65 ml bør give en mere homogen klipning på grund af prøvens mindre volumen pr. rør. - Sonikere kromatin i 28 cyklusser ved høj intensitet med 30 s ON og 30 s OFF indstilling. Sørg for, at sonikatorbadet er korrekt afkølet (is eller køleanordning).
BEMÆRK: Dette trin skal optimeres i næsten alle tilfælde. Brugeren skal huske på, at øget skæretid vil give mindre og mere homogene fragmenter; Dette kan dog øge chancen for at sænke kromatinkvaliteten. Vælg det laveste antal cyklusser, der giver den krævede fragmentstørrelse. Under optimeringen af dette trin er det nyttigt at udføre nuklear farvning for at kontrollere, om antallet af cyklusser var tilstrækkeligt til at lyse størstedelen af kernerne. - Overfør det sonikerede kromatin til et nyt 1,5 ml rør, der tidligere er kølet på is.
- Tilsæt 30 μL Triton X-100 10% opløsning og hvirvel i 5-10 s.
BEMÆRK: Triton X-100 binder sikkerhedsdatabladet og forhindrer yderligere nedbør ved 4 °C. Det endelige beløb på Triton X-100 skal altid være 1%. - Der centrifugeres ved 16.000 x g i 15 minutter ved 4 °C.
- Supernatanten overføres til et rent 1,5 ml rør, der er forkølet på is.
- BEMÆRK: Supernatanten indeholder det klippede kromatin og skal fremstå klart. Pelleten indeholder "ikke klippelige" hviler, og den skal forblive ret lille (for det meste brun i tilfælde af levervæv). Se efter indikation af mislykket klipning: kromatinopløsning, der ikke blev klarere, og lignende pelletdimensioner som dem fra trin 4.5.
6. DNA-oprensning
- Der overføres 10-25 μL klippet kromatin til et nyt glas, og buffer C tilsættes for at nå et slutvolumen på 200 μL. Resten af kromatinet opbevares ved -80 °C indtil yderligere brug. Hvis det er nødvendigt, kan proceduren afbrydes på dette trin, og prøven opbevares ved -20 °C.
- Der tilsættes 8 μL 5 M NaCl, og der inkuberes mindst 6 timer ved 65 °C i en varmeblok under omrystning ved 1000 o/min.
BEMÆRK: Dette trin de-tværbinder kromatinet. Det er sikrere at forlænge de-tværbindingen natten over, når det er muligt. Tilstedeværelsen af NaCl gør processen mere effektiv. - Lad prøverne køle af ved RT i 5 minutter, og tilsæt 2 μL RNase A.
- Der inkuberes i 1 time ved 37 °C under omrystning ved 1000 o/min.
- Prøverne fjernes fra varmeblokken, og der tilsættes 7 μL 300 mMCaCl2 og 2 μL proteinase K.
- Sæt varmeblokken til 56 °C og inkuber i 30 minutter under omrystning ved 1000 omdr./min. I mellemtiden fremstilles et faseseparationsrør til hver prøve ved at centrifugere dem ned ved 16.000 x g i 1 min ved 4 °C.
BEMÆRK: Disse specielle rør gør faseadskillelsen under nukleinsyrephenol-chloroformekstraktion lettere. - Fjern rørene fra varmeblokken, og lad dem ekvilibrere ved RT i 3 min.
- 400 μL af prøven overføres til et tidligere centrifugeret faseseparationsrør.
- Tilsæt 400 μL phenol-chloroform-isoamylalkoholopløsning (PCI) og hvirvel i 5 s.
FORSIGTIG: PCI er en meget flygtig og giftig forbindelse. Håndter det med de nødvendige sikkerhedsforanstaltninger under en stinkhætte. - Der centrifugeres ved 16.000 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Der tilsættes 400 μL chloroform og hvirvel i 5 s.
FORSIGTIG: Chloroform er en meget flygtig og giftig forbindelse. Håndter det med de nødvendige sikkerhedsforanstaltninger under en stinkhætte.
BEMÆRK: Dette trin vasker mulige rester af phenol ud, der kan forstyrre downstream PCR-applikationer. - Der centrifugeres ved 16.000 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- 400 μL af den øvre fase overføres til et nyt 1,5 ml rør, hvor 24 μL 5 M NaCl og 0,75 μL glykogen blev tilsat. Kort hvirvel.
- Der tilsættes 1.055 μL 100% EtOH og hvirvel grundigt. Sørg for korrekt blanding.
- Der inkuberes ved -80 °C i 1 time eller ved -20 °C natten over (ON).
BEMÆRK: Dette trin udfælder det klippede DNA; For at maksimere udbyttet foreslås det at vælge ON-inkubationen. - Der centrifugeres ved 16.000 x g i 30 minutter ved 4 °C.
- Fjern forsigtigt supernatanten, og vær opmærksom på ikke at flytte pelleten.
- Tilsæt 500 μL kold 70% EtOH. Vip røret forsigtigt for at sikre, at pelleten vaskes.
BEMÆRK: Dette trin er vigtigt for at fjerne saltrester, der kunne have udfældet sammen med nukleinsyrerne. Salte kan forstyrre andre downstream-applikationer. - Der centrifugeres ved 16.000 x g i 15 minutter ved 4 °C.
- Hele supernatanten fjernes forsigtigt, og pellets tørres ved RT.
BEMÆRK: Inkubation af røret på en varmeblok ved 37 °C reducerer den tid, der kræves til tørring. - Der tilsættes 50 μL Tris-EDTA-opløsning (TE-buffer), og røret anbringes på varmeblokken ved 37 °C i 5-10 minutter under omrystning ved 300 omdr./min.
BEMÆRK: Dette trin sikrer pelletopløsningen. Protokollen kan sættes på pause her, og prøven kan opbevares ved 4 °C i op til 1 uge eller ved -20 °C ved længere opbevaring. - Udfør DNA-analyse på 1% agarosegel.
7. Analyse af DNA-størrelse
- Forbered en 1% agarosegel ved at blande 1 g agarose pr. 100 ml løbende buffer (dvs. Tris-acetat-EDTA (TAE) eller Tris-borat-EDTA (TBE)). Opvarm suspensionen, indtil agarosen er helt opløst. Der tilsættes 10 μL EtBr for hver 100 ml agaroseopløsning, før gelopløsningen hældes.
FORSIGTIG: EtBr er et DNA-interkaleringsmiddel, der vides at være kræftfremkaldende. Håndter det med de nødvendige sikkerhedsforanstaltninger under en stinkhætte.
BEMÆRK: EtBr-farvning (direkte i gel eller efter løb) anbefales kraftigt. Andre DNA-interkalerende farvestoffer fungerede ikke godt i vores hænder, når vi arbejdede med DNA-udstrygninger. Smalle belastningsbrønde giver en bedre opløsning sammenlignet med bredere. - Bland 10 μL af prøven med 2 μL 6x ilægningsfarvestof. Læg derefter 10 μL af prøven i gelen og kør den, indtil det sidste bånd af påfyldningsfarvestoffet løb for 2/3 af gelen. Sørg for at tilføje en DNA-stige.
- Tag billedet af gelen, og kontroller, om udtværingsstørrelsen falder inden for området for den ønskede anvendelse.
Hvis kromatinet består kvalitetskontrollen, kan det bruges til downstream-applikationer.
Representative Results
Forberedelse af kromatin er et afgørende skridt i at opnå en vellykket ChIP. For at forberede kromatin af god kvalitet fra frosne prøver bør vi sikre effektiv vævsforstyrrelse før fiksering for at undgå tilstedeværelsen af vævsklumper, der kan hindre effektiv klipning. Figur 1 viser en opsummeret pipeline af protokollen. Pulverisering alene er ikke tilstrækkelig til fuldstændigt at adskille vævet, da det producerer celleklynger af variabel størrelse og få enkeltceller (figur 1a). Ved at forbinde det første pulveriseringstrin med Dounce-homogenisering reduceres mængden af vævsklumper kraftigt, og de resterende er mindre (figur 1b). Efter fikserings- og lyseringstrinnene øges antallet af synlige enkeltkerner (figur 1c), mens det typiske sfæriske udseende går tabt. Efter sonikering i 28 cyklusser er den nukleare farvning (Hoechst 33258 / DAPI) for det meste ikke synlig længere. Dette er faktisk et tegn på vellykket klipning (figur 1d). Efter de-tværbinding af en kromatin alikvote og visualisering af DNA'et på agarosegel kan vellykket klipning genkendes ved tilstedeværelsen af fragmenter i området 100-300 bp. (Figur 2a) Mængden af DNA kan variere afhængigt af sammensætningen af det fremstillede vævsstykke. Sådan kromatin kan med succes anvendes til ChIP-qPCR. Som vist i figur 2b kunne kromatinet med succes udfældes med H3K4me3, H3K27ac (aktive genrelaterede modifikationer) og H3K27me3 (tavse genrelaterede modifikation) antistoffer. Promotorregionerne kromosom 1 åben læseramme 43 (C1orf43), proteasom 20S-underenhed Beta 2 (PSMB2) og glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (mGapdh) resulterede i promotorregioner beriget med H3K4me3 og H3K27ac sammenlignet med Homeobox C13 (HOXC13), Homeobox C12 (HOXC12) og promotorregionerne Myelin Transcription Factor 1 (mMyt1) (tabel 1). Dette skyldes, at C1orf43, PSMB2 og mGapdh konstitutivt transskriberes i leveren, mens HOXC13, HOXC12 og mMyt1 er tavse. H3K27me3 viser den modsatte adfærd, der bekræfter succesen med ChIP-analysen. Det faktum, at leveren af disse mus er en kimær, tillod os at analysere både murin og humant kromatin. Derudover kunne det samme kromatin med succes anvendes til ChIP-seq-eksperimenter. Efter sekventeringstrinnet blev aflæsningerne justeret til et indeks sammensat af både murin og humane genomer for at reducere mængden af ujusterede fragmenter. Derefter blev læsningerne adskilt efter art og yderligere analyseret med EaSeq22 . Signalintensiteten blev derefter målt på transkriptionsstartstedet (TSS) for hvert gen, og resultatet blev sorteret for H3K4me3-signalintensitet. Figur 3a og figur 3c viser både en markant tilstedeværelse af H3K4me3 og H3K27ac ved TSS for en betydelig del af generne i både muse- og humant kromatin. Derudover antikorrelerer H3K27me3 med H3K4me3 / H3K27ac. H3K27me3 er til stede på hele længden af genet og ikke kun ved TSS, som forventet fra denne PTM. Figur 3b og figur3d viser HOXC/HoxC-klyngen, der er kendt for at være beriget for H3K27me3 og transkriptionelt inaktiv i både muse- og menneskelever. Profileringen af H3K4me3 og H3K27ac viser toppe for disse to PTM'er, mens signalintensiteten af H3K27me3 har tendens til at være lavere og mere fordelt.
På grund af kompleksiteten af kromatinpræparatet kan overfiksering ske, lysis eller sonikeringstid kan være suboptimal, store celleklumper kan fortsætte, eller utilstrækkelig håndtering af prøven kan være utilstrækkelig. Disse er alle begivenheder, der påvirker præparatets kvalitet. I nogle tilfælde vil berigelsen af kromatinfragmenter inden for den korrekte størrelse stadig være til stede eller vil blive flyttet til en højere størrelse. I andre tilfælde kan der være tab af materiale på grund af for tidlig lysis eller mislykket klipning. Figur 4 viser nogle eksempler på sådanne negative og suboptimale resultater. Bane 3 og 4 viser en berigelse af fragmentstørrelsen mellem 200 bp og 800 bp. Det er imidlertid klart, at fragmentstørrelsen spænder fra 100 bp til >10.000 bp. I bane 5 og 6 er der en berigelse i området 100-250 bp til stede med et klart tab af materiale under forberedelsen. Dette kunne forklare, hvorfor sonikeringen producerede mindre fragmenter. Bane 7 viser en lidt suboptimal forberedelse med fragmentområdet øget, mens bane 8 viser et næsten fuldstændigt tab af materiale. Dette kan skyldes for tidlig nuklear lyse eller utilstrækkelig vævsdissociation med deraf følgende tab efter trin 5.5.
Figur 1: Oversigt over kromatinforberedelsesprotokol. Billeder blev taget efter vævspulverisering (a), yderligere manuel homogenisering (b), efter nuklear lyse (c) og efter sonikering (før centrifugering) (d). Der blev udført kernefarvning med Hoechst 33258/DAPI. Skalabjælke = 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentativ kromatinklipning og dens kvalitet vurderet ved ChIP-qPCR . 1% agarosegel med fragmenterede kromatinprøver ifølge protokoller fra forskellige kromatinpræparater. Der tilsættes en kontrol af uklippet kromatin for at sikre, at der ikke forinden ( a) sker nogen kromatin/DNA-nedbrydning. Klippet kromatin er blevet testet for kvalitet, der udfører et ChIP-qPCR-assay. H3K4me3, H3K27ac og H3K27me3 antistoffer blev anvendt til at udfælde det frisklavede kromatin. b ) qPCR-analyse blev udført på humane (C1orf43 og PSMB2), murine (Gapdh) aktive promotorer og humane (HOXC13, HOXC12), murine (Myt1) inaktive promotorer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentativ ChIP-seq-analyse. Læsninger er blevet justeret til et indeks oprettet med både menneskelige og musegenomer (hg19 og mm10). Efter justering blev humane og murinlæsninger adskilt og yderligere analyseret. Varmekort over humane gener, hvor signalet blev kvantificeret ved TSS og vist i faldende rækkefølge for H3K4me3-intensitet (a). Eksempel på human genklynge af undertrykte gener (HOX-klynge) omgivet af aktive gener (b). Varmekort over muringener, hvor signalet blev kvantificeret ved TSS og vist i faldende rækkefølge for H3K4me3-intensitet (c). Eksempel på en murin genklynge af undertrykte gener (Hox cluster) omgivet af aktive gener (d). Alle de viste data er blevet normaliseret af EaSeq pr. million læsninger. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Suboptimale og mislykkede kromatinpræparater. 1% agarosegel med fragmenterede kromatinprøver i henhold til protokollen. Figuren indeholder uklippet kromatin anvendt som kontrol (bane 2), ikke optimal klipning (bane 3-4), optimal klipning med klart materialetab (bane 5-6), suboptimal klipning (bane 7) og omfattende materialetab (bane 8). Klik her for at se en større version af denne figur.
| Primer navn | Sekvens | |
| C1orf43 promotor | Fremad | AGTGGGTGGAGAATGCAGAC |
| Omvendt | GAGATTACCCCACCCCATTC | |
| PSMB2-promotor | Fremad | CTTATTCAACCCCCGACAAA |
| Omvendt | GATGAAGGACGGTGAGAGGA | |
| HOXC13 distal promotor | Fremad | GAGCCCGAGATTCACTCAAC |
| Omvendt | TTATGCCCAGTTTTTGGGGTA | |
| HOXC12 distal promotor | Fremad | AAAGCTTCCCACTGCAAAGA |
| Omvendt | AAATCTGGGGGCGAACTACT | |
| mGAPDH promotor | Fremad | GGTCCAAAGAGAGGGAGGAG |
| Omvendt | GCCCTGCTTATCCAGTCCTA | |
| mMYT promotor | Fremad | CAGCCCAATTCTAGCCACAT |
| Omvendt | CCAAAGCAGGGGAGTAGGAG |
Tabel 1: qPCR-primerliste for aktive og inaktive gener, der anvendes til ChIP-qPCR-assays.
Discussion
Kromatinpræparat fra snapfrosset væv forbliver en udfordring på grund af antallet af trin, der skal optimeres for at opnå reproducerbare og pålidelige resultater. De fleste af de allerede offentliggjorte protokoller16,23 kræver vævshakning før manuel dissociation (fordobling). Vi forsøgte at undgå trin, der kunne provokere proteinnedbrydning før fikseringen af prøven så meget som muligt. Pulveriseringstrinnet anvendes allerede i frosne leverpræparater24 og gør den manuelle dissociation lettere og reproducerbar (se figur 2a). Ved brug af en mørtel, der er specielt designet til 1,5 ml rør (se protokoller), reduceres prøvetabet under pulveriseringsprocessen, hvilket gør det muligt at behandle små mængder væv, såsom leverbiopsiprøver. I princippet er det muligt at anvende direkte vævshomogenisering uden slibetrin; Imidlertid har vævshomogenisering uden tidligere pulverisering en dårligere reproducerbarhed efter vores erfaring, og forekomsten af problemer for downstream-applikationer var højere (data ikke vist).
De fleste af de problemer, der opstår ved fremstilling af kromatin fra væv, stammer fra arten af disse prøver og manglende evne til korrekt at kontrollere, om celleklyngerne er små nok til fiksering uden at miste kvalitet. Desuden ville det være tidskrævende at kontrollere hver prøve på hvert trin, hvilket øger chancen for proteinnedbrydning.
Fastgørelse (trin 3.9) er en grundlæggende og afgørende del af kromatinpræparatet. På grund af vævets natur er fikseringstrinnet blevet forsinket, indtil vævet blev homogeniseret. Et sådant udskudt fikseringstrin har den fordel, at der fremkommer en mere homogen cellesuspension. Vi anerkender dog, at i tilfælde af særligt manipulationsfølsomme mål, kan det være nødvendigt at udføre fikseringen lige før trin 3.6. Dette ville hjælpe med at beskytte ekstremt følsomme proteiner eller PTM'er, selvom det kan øge størrelsen af celleklyngerne, der, når de er faste, kan resultere i ikke-homogen klipning. Koncentrationen af FA-opløsningen, der anvendes i protokollen, er standard, men den kan ændres for at forsøge at forbedre den samlede fiksering. Den fikseringstid, der er valgt her, afspejler også standardbetingelser, der almindeligvis anvendes i marken. I tilfælde af højere koncentration af fikseringsopløsningen kan fikseringstiden reduceres, mens den i tilfælde af en lavere mængde skal øges. Den erhvervsdrivende bør overveje, at en ændring af bindingstiden enten kan føre til overfiksering af prøven eller give plads til proteinnedbrydning. I tilfælde af at sigte mod udfældning af store komplekser (eller en del af det) og TF'er, ville det være fordelagtigt at udføre en dobbelttrinsfiksering ved hjælp af en DSG-løsning efterfulgt af en FAen 25,26. DSG ville i dette tilfælde stabilisere protein-protein-interaktioner, mens formaldehyd hovedsagelig virker på direkte DNA-proteininteraktioner27.
Operatøren bør tage højde for muligheden for at implementere et kolonnebaseret kit til DNA-oprensning startende ved trin 6.7, som er hurtigere og ikke bruger giftige forbindelser. Der vil dog altid være en vis mængde ubundet DNA, der vil gå tabt. Af denne grund foreslår vi at bruge den klassiske phenol-chloroformekstraktion efterfulgt af EtOH-udfældning. Desuden kan det være en fordel at måle DNA-koncentrationen og indlæse den samme mængde for hver brønd for at få et klarere billede, før agarosegelen køres (trin 7.2).
En begrænsning af denne protokol stammer fra det faktum, at vi kun udforskede og brugte denne protokol ved hjælp af leverprøver afledt af kimære mus28 fra menneskelever. I sig selv består leveren af epitel og bindevæv29. I tilfælde af sygdom kan fibrotisk væv og fedtvæv være til stede30,31, hvilket skaber yderligere udfordringer under vævsforstyrrelser. Vi erkender dog, at vores protokol ikke må bruges på knogler, muskler og fedtvæv uden optimering af dissociations- og sonikeringstrinnene. At bemærke er, at hvert væv kræver en form for optimering på grund af fraværet af en protokol, der passer til dem alle, som for cellekulturprøver15. Vi mener dog, at med ringe eller ingen optimering overhovedet, kunne denne protokol med succes anvendes på andre væv, der deler ligheder med leveren i sammensætning, som lunge, tarm, mave, bugspytkirtel eller nyrevæv.
Vores protokol er også blevet brugt med succes til at analysere TF'er og histonmodifikationer på HBV-kovalent lukket DNA-episom (cccDNA)32. Dette åbner chancen for at anvende en sådan tilgang til andre virale genomer, der påvirker leveren, såsom humant cytomegalovirus33 (hCMV) og humant adenovirus34 (HAdV). Det er ikke udelukket, at det ville være muligt at analysere andre DNA-vira, der etablerer en vedvarende infektion i andre væv som Kaposi Sarcoma Herpes Virus35 (KHSV), Herpes Simplex Virus 36 (HSV1/2) Polyoma virus, Epstein-Barr Virus37 (EBV).
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Undersøgelsen blev støttet af den tyske forskningsfond (DFG) med et tilskud til Maura Dandri (SFB 841 A5) og af staten Hamburg med forskningsprogrammet (LFF-FV44: EPILOG).
Vi vil gerne takke Dr. Tassilo Volz, Yvonne Ladiges og Annika Volmari for den tekniske hjælp og for kritisk læsning af manuskriptet. Dr. Thomas Günther og Prof. Adam Grundhoff for at give meget nyttige forslag og primersættene til ChIP-qPCR-analysen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22µm sterile syringe filter | Labsolute | 7699822 | |
| 1.5 mL Safeseal tubes | Sarstedt | 7,27,06,400 | |
| 6x orange loading dye | Thermofisher | R0631 | |
| Benchtop refrigerated centrifuge | |||
| Bioruptor NGS | Diagenode | ||
| Blade or Scalpel | |||
| Calcium chloride dihydrate | Carl Roth | HN04 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich (Merck) | C2432 | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | |
| Deacetylase Inhibitor | Active Motif | 37494 | |
| Dounce tissue grinder set | Sigma Aldrich (Merck) | DWK885300-0001-1EA | |
| EDTA 500 mM solution | PanReac AppliChem | A4892 | |
| EGTA | Sigma Aldrich (Merck) | E4378 | |
| EtBr | Carl Roth | 2218 | Concentration 10mg/mL |
| Ethanol absolute | CHEMSOLUTE | 2273 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich (Merck) | G9012 | |
| Glycin | Carl Roth | 0079 | |
| Glycogen | Roche | 10901393001 | Concentration: 20mg/mL |
| Heating block | |||
| HEPES | Sigma Aldrich (Merck) | H4034 | |
| LE Agarose | Biozym | 840000 | |
| Liquid nitrogen cooled mini mortar | Bel-Art | H37260-0100 | |
| MeOH free Formaldehyde 16% | Thermofisher | 28908 | |
| NP-40 | Roche | 11332473001 | |
| PBS 1x | Thermofisher | 10010015 | |
| Pefabloc SC-Protease-Inhibitor | Sigma Aldrich (Merck) | 11429868001 | |
| Phase Lock Gel - Heavy | QuantaBio | 2302830 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol 25:24:1 | Sigma Aldrich (Merck) | P3803 | |
| Potassium chloride | Carl Roth | 6781 | |
| Potassium hydroxyde | Merck | 105033 | |
| Proteinase K | Lucigen | MPRK092 | Concentration: 50 µg/µL |
| RNAse A | Lucigen | MRNA092 | Concentration: 5 mg/mL |
| SDS 10% solution | PanReac AppliChem | A3950 | |
| Sodium carbonate anhydrous | Carl Roth | A135 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich (Merck) | S7653 | |
| Sterile Petri dishes | Sarstedt | 83,39,02,500 | |
| Tris-HCl solution | Sigma Aldrich (Merck) | T2694 | |
| Triton-X100 | Sigma Aldrich (Merck) | X100 |
References
- Waddington, C. H., Pantelouris, E. M. Transplantation of nuclei in newt's eggs. Nature. 172 (4388), 1050-1051 (1953).
- Silmon de Monerri, N. C., Kim, K. Pathogens hijack the epigenome: A new twist on host-pathogen interactions. American Journal of Pathology. 184 (4), 897-911 (2014).
- Knipe, D. M., et al. Snapshots: chromatin control of viral infection. Virology. 435 (1), 141-156 (2013).
- Tropberger, P., et al. Mapping of histone modifications in episomal HBV cccDNA uncovers an unusual chromatin organization amenable to epigenetic manipulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (42), 5715-5724 (2015).
- Sproul, D., Gilbert, N., Bickmore, W. A. The role of chromatin structure in regulating the expression of clustered genes. Nature Reviews Genetics. 6 (10), 775-781 (2005).
- Fischle, W., Wang, Y., Allis, C. D. Histone and chromatin cross-talk. Current Opinion in Cell Biology. 15 (2), 172-183 (2003).
- Ling, X., Harkness, T. A., Schultz, M. C., Fisher-Adams, G., Grunstein, M. Yeast histone H3 and H4 amino termini are important for nucleosome assembly in vivo and in vitro: redundant and position-independent functions in assembly but not in gene regulation. Genes & Development. 10 (6), 686-699 (1996).
- Zhang, L., Eugeni, E. E., Parthun, M. R., Freitas, M. A. Identification of novel histone post-translational modifications by peptide mass fingerprinting. Chromosoma. 112 (2), 77-86 (2003).
- Wang, H., et al. Role of histone H2A ubiquitination in Polycomb silencing. Nature. 431 (7010), 873-878 (2004).
- Hassa, P. O., Haenni, S. S., Elser, M., Hottiger, M. O. Nuclear ADP-ribosylation reactions in mammalian cells: where are we today and where are we going. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 70 (3), 789-829 (2006).
- Dey, B., et al. DNA-protein interactions: methods for detection and analysis. Molecular and Cellular Biochemistry. 365 (1-2), 279-299 (2012).
- Hager, G. L., McNally, J. G., Misteli, T. Transcription dynamics. Molecular Cell. 35 (6), 741-753 (2009).
- Nagy, Z., Tora, L. Distinct GCN5/PCAF-containing complexes function as co-activators and are involved in transcription factor and global histone acetylation. Oncogene. 26 (37), 5341-5357 (2007).
- Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
- Gunther, T., Theiss, J. M., Fischer, N., Grundhoff, A. Investigation of viral and host chromatin by ChIP-PCR or ChIP-Seq analysis. Current Protocols in Microbiology. 40, 11-21 (2016).
- Cotney, J. L., Noonan, J. P. Chromatin immunoprecipitation with fixed animal tissues and preparation for high-throughput sequencing. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (4), 419 (2015).
- Haim, Y., Tarnovscki, T., Bashari, D., Rudich, A. A chromatin immunoprecipitation (ChIP) protocol for use in whole human adipose tissue. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 305 (9), 1172-1177 (2013).
- Castellano-Castillo, D., et al. Chromatin immunoprecipitation improvements for the processing of small frozen pieces of adipose tissue. PLoS One. 13 (2), 0192314 (2018).
- Savic, D., Gertz, J., Jain, P., Cooper, G. M., Myers, R. M. Mapping genome-wide transcription factor binding sites in frozen tissues. Epigenetics Chromatin. 6 (1), 30 (2013).
- Perna, A., Alberi, L. A. TF-ChIP method for tissue-specific gene targets. Frontiers Cell Neuroscience. 13, 95 (2019).
- Allweiss, L., et al. Proliferation of primary human hepatocytes and prevention of hepatitis B virus reinfection efficiently deplete nuclear cccDNA in vivo. Gut. 67 (3), 542-552 (2018).
- Lerdrup, M., Johansen, J. V., Agrawal-Singh, S., Hansen, K. An interactive environment for agile analysis and visualization of ChIP-sequencing data. Nature Structural & Molecular Biology. 23 (4), 349-357 (2016).
- Perna, A., Alberi, L. A. TF-ChIP Method for Tissue-Specific Gene Targets. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 95 (2019).
- Liang, N., Fan, R., Goni, S., Treuter, E. Preparation of Frozen Liver Tissues for Integrated Omics Analysis. Methods in Molecular Biology. 1951, 167-178 (2019).
- Liu, Z., et al. Proteomic and network analysis of human serum albuminome by integrated use of quick crosslinking and two-step precipitation. Scientific Reports. 7 (1), 9856 (2017).
- Singh, A. A., et al. Optimized ChIP-seq method facilitates transcription factor profiling in human tumors. Life Science Alliance. 2 (1), 201800115 (2019).
- Aoki, T., et al. Bi-functional cross-linking reagents efficiently capture protein-DNA complexes in Drosophila embryos. Fly. 8 (1), 43-51 (2014).
- Allweiss, L., Dandri, M. Experimental in vitro and in vivo models for the study of human hepatitis B virus infection. Journal of Hepatology. 64, 1 Suppl 17-31 (2016).
- Krishna, M. Microscopic anatomy of the liver. Clinics in Liver Disease. 2, Suppl 1 4-7 (2013).
- Tannapfel, A., et al. Histopathological diagnosis of non-alcoholic and alcoholic fatty liver disease. Virchows Archiv. 458 (5), 511-523 (2011).
- Schuppan, D., Afdhal, N. H. Liver cirrhosis. Lancet. 371 (9615), 838-851 (2008).
- Allweiss, L., et al. Therapeutic shutdown of HBV transcripts promotes reappearance of the SMC5/6 complex and silencing of the viral genome in vivo. Gut. , 322571 (2021).
- Gerna, G., Kabanova, A., Lilleri, D. Human cytomegalovirus cell tropism and host cell receptors. Vaccines. 7 (3), (2019).
- Echavarria, M. Adenoviruses in immunocompromised hosts. Clinical Microbiology Reviews. 21 (4), 704-715 (2008).
- Frohlich, J., Grundhoff, A. Epigenetic control in Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection and associated disease. Seminars in Immunopathology. 42 (2), 143-157 (2020).
- Nicoll, M. P., Proenca, J. T., Efstathiou, S. The molecular basis of herpes simplex virus latency. FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 684-705 (2012).
- Thorley-Lawson, D. A., Hawkins, J. B., Tracy, S. I., Shapiro, M. The pathogenesis of Epstein-Barr virus persistent infection. Current Opinion in Virology. 3 (3), 227-232 (2013).
