Summary
이 프로토콜은 스냅 냉동 조직의 염색질 준비에 중점을 두고 있으며 X-ChIP(Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation)에 이어 정량적 PCR 분석(X-ChIP-qPCR) 또는 차세대 시퀀싱 접근법(X-ChIP-seq)에 적합합니다.
Abstract
X-ChIP(Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation)는 숙주 및/또는 병원체 염색질에 대한 히스톤 표시 수준과 전사 인자의 점유를 평가하는 데 널리 사용되는 기술입니다. 조직에서 염색질 준비는 세포 배양에 사용되는 것과 유사한 재현 가능하고 신뢰할 수 있는 프로토콜을 얻기 위해 극복해야 하는 추가적인 문제를 야기합니다. 조직 파괴 및 고정은 염색질의 효율적인 전단을 달성하기 위한 중요한 단계입니다. 서로 다른 세포 유형과 클러스터가 공존하면 최적의 단편 크기에 도달하기 위해 서로 다른 전단 시간이 필요할 수 있으며 전단 재현성을 방해할 수 있습니다. 이 방법의 목적은 ChIP-qPCR 및 차세대 염기서열분석(NGS) 응용 분야 모두에 적합한 냉동 조직(간)에서 신뢰할 수 있고 재현 가능한 숙주 염색질 제제를 달성하는 것입니다. 우리는 액체 질소 조직 분쇄 후 균질화의 조합이 효율적으로 전단될 수 있는 해리된 단일 세포로 대부분 구성된 현탁액을 제공하기 때문에 균질화에만 비해 재현성을 증가시킨다는 것을 관찰했습니다. 또한, 고정 단계는 균일한 가교결합을 제공하기 위해 온화한 회전 하에서 수행되어야 합니다. 그런 다음 고정된 물질은 완충액 기반 핵 분리에 적합하여 세포질 단백질과 병원체 DNA 및 RNA(해당되는 경우)의 오염을 줄여 시간이 많이 소요되는 원심분리 구배를 방지합니다. 후속 초음파 처리는 핵 용해를 완료하고 염색질을 전단하여 선택한 전단 조건에 따라 특정 크기 범위를 생성합니다. 크기 범위는 NGS 애플리케이션의 경우 100 - 300 nt 사이여야 하며, ChIP-qPCR 분석의 경우 더 높을 수 있습니다(300-700 nt). 이러한 프로토콜 적응은 냉동 조직 표본의 염색질 분석을 크게 향상시킬 수 있습니다.
Introduction
포유류 세포에서의 후성유전학적 조절은 발견 이후 점점더 많은 인식을 얻고 있으며1, 이러한 메커니즘에 대한 이해는 세포 생물학뿐만 아니라 질병 및 종양 생물학에서도 중요한 통찰력을 제공할 수 있다는 점을 고려할 때 더욱 그렇습니다. 또한, 감염원은 숙주 후성유전학적 변화를 일으킬 수 있는 반면2 숙주 세포 기계는 지속성 DNA 바이러스와 같은 병원체의 염색질에도 영향을 미칠 수 있습니다 3,4. 이 숙주-병원체 상호 작용은 감염 지속성에 중요한 역할을 하는 것으로 보입니다. 2
DNA와의 가역적 결합을 통해 히스톤 단백질은 뉴클레오솜이라는 복합체를 형성합니다. 뉴클레오솜은 차례로 염색질로 알려진 더 높은 수준의 조직에 도달합니다. 염색질 리모델링은 유전자 발현을 엄격하게 조절하여 전사 인자(TF)에 대한 접근을 허용하거나 거부하는 것으로 알려져 있습니다5. 이러한 인자는 RNA 중합효소 II(PolII)를 유전자 프로모터로 모집하는 것을 유발하거나 차단하여 DNA 주형6에서 mRNA 합성에 영향을 미칠 수 있습니다. 히스톤 단백질은 히스톤 주름의 양쪽 끝에 꼬리7개를 포함하고 있으며, 이는 번역 후 변형(PTM)의 대상이 될 수 있어 구조적 염색질 변화에 의한 유전자 전사의 엄격한 조절을 허용합니다. 대부분의 히스톤 PTM은 꼬리 N-말단에 위치하며, 아세틸화와 메틸화가 가장 잘 연구된 PTM이지만, 인산화8, 유비퀴틴화9 및 리보실화10 도 보고되었다. 이러한 단백질을 특성화하고 연구하는 것은 유전자 조절에 대한 깊은 통찰력을 얻는 데 필수적입니다.
현재, DNA-단백질의 직접적인 상호작용을 연구하기 위해 사용할 수 있는 몇 가지 잘 확립된 방법과 도구가 있다: 전기영동 이동성 이동 분석법(Electrophoretic mobility shift assay, EMSA), 효모 단일 하이브리드 분석법(Yeast one-hybrid assay, Y1H), DNA 발자국 측정법(DNA footprinting)11. 그러나 이러한 방법은 그 자체로 단일 DNA-단백질 상호 작용에 초점을 맞추고 게놈 전체 연구에는 적용할 수 없습니다. 이러한 기술의 또 다른 한계는 조사된 DNA 세그먼트와의 히스톤 연관성이 부족하다는 것입니다. 따라서, 이러한 접근법은 생체 내 전사 기계의 복잡성을 반영하기 위한 것이 아니며, DNA에 대한 단백질 결합에 영향을 미칠 수 있는(촉진 또는 억제) 중요한 구조적 변화(12 ) 또는 다른 필수 효소/보조인자(13 )를 고려하지 않는다.
포름알데히드(FA)와 같은 물질로 세포를 고정하면 단백질-DNA 상호작용의 생체 내 스냅샷을 제공할 수 있다는 아이디어는 염색질 면역침전 분석(ChIP)14 개발의 기초를 만들었습니다. 이는 정량적 PCR(qPCR) 기술 및 고특이적 항체의 가용성과 함께 ChIP-qPCR 분석의 개발을 가능하게 했습니다. 그 후, 비용이 점점 더 저렴해지고 있는 차세대 염기서열 분석 기술(NGS)의 출현으로 ChIP 실험과 NGS 접근법(ChIP-seq)을 결합하여 연구자들에게 염색질 조절을 조사할 수 있는 새롭고 강력한 도구를 제공했습니다. 이러한 분석에서 분리 또는 배양된 세포는 디숙신이미딜 글루타레이트(DSG) 및/또는 FA로 고정되고, 핵은 분리되고, 염색질은 관심 항체에 의해 단편화되고 침전됩니다. 이후, DNA를 정제하여 PCR 또는 NGS 접근법으로 분석한다. EMSA, Y1H 및 DNA 풋프린트와 달리 ChIP 분석은 세포 내 단백질-DNA 상호 작용에 대한 글로벌 스냅샷을 제공할 수 있습니다. 이는 유연성을 제공하고 동일한 샘플 내에서 여러 유전자좌를 분석할 수 있습니다. 그러나 분석의 특성으로 인해 ChIP는 결국 직접적인 상호 작용뿐만 아니라 직접적인 상호 작용뿐만 아니라 직접적인 상호 작용도 감지할 수 있으며 직접적인 단백질-DNA 상호 작용에 관심이 있을 때 위에서 언급한 방법의 정밀도를 제공하지 않습니다.
세포 배양 물질의 염색질 전처리 프로토콜은 잘 확립되어 있으며15 재현성이 높기 때문에 사용자는 1-2일 이내에 qPCR 및 NGS 접근법 모두에 적합한 염색질을 얻을 수 있습니다. 그러나 전체 조직에서 고품질 염색질을 얻는 것은 염색질의 최적 고정 및 전단을 달성하면서 조직 내 세포를 해리해야 하기 때문에 여전히 어려운 일입니다. 또한, 뚜렷한 유형의 조직의 구성과 형태가 다양하므로 기존 프로토콜의 조정이 필요합니다16,17. 냉동보존된 조직의 사용은 신선한 샘플에 비해 추가적인 문제를 제공합니다. 이는 광범위한 물질 손실 없이 단일 세포 현탁액을 얻는 것이 어렵기 때문입니다. 이로 인해 부적절한 전단이 발생하여 다운스트림 적용이 방해를 받습니다. 그럼에도 불구하고 신선한 조직 표본이 아닌 냉동 조직 표본에 접근하는 것은 작업 유연성을 높일 뿐만 아니라 종단 또는 비교 연구에서 유래한 표본을 다루는 연구자에게 유일한 옵션이 될 수도 있습니다. 냉동 조직에 대한 소수의 염색질 준비 프로토콜이 발표되었습니다. 이는 대부분 시편 해동 후 다지기, 수동/기계 기반 해리 또는 액체 질소 분쇄 단계18,19,20을 기반으로 합니다.
여기에서는 바이러스 및 숙주 게놈 분석을 목표로 하는 X-ChIP 접근법에 적합한 재현 가능한 염색질 전단을 달성하기 위해 액체 질소의 조직 분쇄와 유봉 균질화를 결합한 냉동 고정되지 않은 간 표본에 대해 최적화된 염색질 준비 방법15 를 설명합니다.
Protocol
인간 간 키메라 마우스(21 )로부터의 조직 샘플링은 유럽 연합 지침 86/609/EEC에 따라 수행되었고, 헬싱키 선언의 원칙에 따라 함부르크 시 및 주의 윤리 위원회에 의해 승인되었다.
1. 시약 준비
- 탈이온수에 1.25M 글리신 용액을 준비합니다. 0.22μm 기공 크기 필터가 있는 제균 필터. 4 °C에서 보관하십시오.
- 5M 염화나트륨(NaCl) 용액을 준비합니다. 실온에서 보관하십시오.
- CaCl2 용액 준비 : 탈 이온수에서 300 mM CaCl2 및 10 mM Tris-HCl pH 8. 0.22μm 기공 크기의 필터가 있는 멸균 필터로 RT에 보관합니다.
- 탈이온수에 10% Triton X-100 희석액을 준비합니다. RT에 보관하십시오.
- Tris-EDTA 완충액을 준비하십시오 : 탈 이온수에서 1 mM EDTA 및 10 mM Tris pH 8. 4 °C에서 보관하십시오.
- 필요한 양에 따라 다음 버퍼를 준비합니다.
- 완충액 A를 준비하십시오 : 50 mM Hepes-KOH pH 7.5, 140 mM NaCl, 1 mM 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), 10 % 글리세롤, 0.5 % NP-40 및 0.25 % 트리톤 X-100 탈 이온수. 0.22μm 기공 크기 필터가 있는 제균 필터. 4 °C에서 보관하십시오.
- 완충액 B를 준비합니다: 10mM Tris-HCl pH 8, 200mM NaCl, 1mM EDTA, 0.5mM egtazic acid(EGTA). 0.22μm 기공 크기 필터가 있는 제균 필터. 4 °C에서 보관하십시오.
- 완충액 C를 준비한다: 탈이온수에서 1% SDS, 10 mM EDTA 및 50 mM Tris-HCl pH 8. 0.22μm 기공 크기 필터가 있는 제균 필터. RT에 보관하십시오.
- 염색질 희석 완충액을 준비합니다 : 0.01 % SDS, 1.1 % Triton X-100, 1.2 mM EDTA, 16.6 mM Tris-HCl pH 8 및 166 mM NaCl 탈 이온수. 0.22μm 기공 크기 필터가 있는 제균 필터. 4 °C에서 보관하십시오.
2. 재료 준비
- 드라이 아이스, 얼음 및 액체 질소를 수집하십시오.
주의 : 드라이아이스와 액체 질소는 화상을 입지 않도록 주의하여 다루십시오. - 원심분리기를 4°C에서 사전 냉각합니다.
참고: 이 단계는 염색질의 품질을 저하시키므로 세척 단계 동안 단백질 분해 및 가교 해제를 방지하는 데 중요합니다. - 드라이 아이스에 멸균 접시를 넣고 식히십시오.
알림: 플레이트가 절단 과정을 용이하게 할 수 있을 만큼 충분히 큰지 확인하십시오. 100mm 페트리 플레이트/세포 배양 접시를 사용하는 것이 좋습니다. - 글리신 1.25M의 필요한 부분 표본을 꺼내 RT에 도달하게하십시오.
- 완충액 A, B 및 PBS의 필요한 분취량을 꺼냅니다. 프로테아제 및/또는 탈아세틸화효소 및 포스파타제 억제제를 첨가하여 1배 농도에 도달하고 얼음 위에 둡니다.
- 버퍼 C의 필요한 부분 표본을 꺼내 RT에 남겨 둡니다. 지정될 때까지 프로테아제 및/또는 탈아세틸화효소 및 포스파타제 억제제를 추가하지 마십시오.
- RT PBS의 필요한 부분 표본을 꺼냅니다.
주의: 버퍼 C에는 도데실황산나트륨(SDS)이 포함되어 있습니다. 버퍼를 준비할 때 적절한 안전 조치를 취하십시오.
참고: SDS는 얼음에 침전되며 프로테아제와 탈아세틸라제 억제제는 RT에서 안정적이지 않습니다. - 액체 질소를 챔버에 붓는 모르타르를 사전 냉각하고 공급 업체 지침을 엄격히 준수하십시오. 금속 유봉을 드라이아이스로 최소 5분 동안 식힙니다.
참고 : 제안 된 모르타르에 대한 대체 모르타르를 사용할 수 있습니다. 그러나,이 프로토콜에 사용 된 장치는 독특한 구조로 인해 분쇄 과정에서 상당한 손실없이 소량의 조직으로 작업 할 수 있습니다. - Dounce 균질화기를 관련 유봉 A와 함께 얼음 위에서 미리 식힙니다.
알림: Pestle A는 균질화기와 헐렁하게 맞습니다. 이를 통해 현저한 세포 용해 없이 단일 세포 현탁액을 얻을 수 있습니다.
3. 조직 가교
- 메스와 핀셋을 사용하여 드라이 아이스에 접시에 직접 약 50mg의 냉동 조직을 자릅니다.
알림: 메스를 RT에 두는 것이 절단 과정을 용이하게 하므로 권장됩니다. 메스에 너무 많은 압력을 가하면 조직 조각이 절단 영역 외부로 흩어질 위험이 증가하므로 피하십시오. 참고로 50mg의 조직(이 경우 간)은 약 500만 개의 세포를 생성해야 합니다. 따뜻한 칼날은 절삭날을 녹입니다. 그러나 조직 조각의 상대적으로 큰 크기를 고려할 때 이것은 제한된 효과를 가져야 합니다. 작은 조각을 자를 때 조직이 흩어지지 않도록 주의를 기울이면서 차가운 메스를 사용하는 것이 도움이 될 수 있습니다. - 잘라낸 티슈를 드라이아이스로 식힌 1.5mL 튜브에 넣습니다. 조직 해동을 피하십시오.
- 조직이 들어있는 튜브를 박격포로 옮기고 5 분 동안 그대로 두십시오.
알림: 샘플을 모르타르에 그대로 두면 온도가 낮아집니다(-80°C에서 -196°C로). 이것은 인성을 증가시키고 분쇄 단계를 더 쉽게 만듭니다. - 더 이상 단단한 부스러기가 보이지 않을 때까지 미리 식힌 유봉을 사용하여 샘플에 압력을 가하십시오.
알림: 과도한 회전력에 의한 유봉 가열은 샘플을 해동시키므로 피하는 것이 중요합니다. 모든 시료 분쇄 후 70% 에탄올(EtOH)로 유봉을 세척하고 드라이아이스에서 다시 식힙니다. - 모르타르에서 샘플이 들어있는 튜브를 제거하고 필요한 억제제와 함께 얼음처럼 차가운 PBS 950 μL를 추가합니다. 샘플이 완전히 재현탁될 때까지 부드럽게 위아래로 피펫을 만듭니다. 즉시 3.6단계로 진행합니다.
- 조직 현탁액을 균질화기로 옮기고 유봉 A로 20-30회 도포하여 더 미세한 현탁액을 얻습니다. 거품을 피하십시오.
참고: 스트로크 양은 조직 일관성에 따라 최적화되어야 합니다. 이 단계는 분쇄 후 얻어진 세포의 작은 클러스터를 추가로 해리시킨다. 부적절한 균질화는 전단 효율에 영향을 줄 수 있습니다. - 균질액을 이미 얼음 위에서 미리 냉각된 새 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
- 4°C에서 1,300 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 조심스럽게 제거한다.
- 부드러운 피펫팅으로 950μL의 RT PBS에 펠릿을 완전히 재현탁하고 16% MeOH가 없는 FA 63.6μL를 추가하여 1% 최종 농도를 갖습니다. 즉시 3.10단계로 진행합니다.
주의 : FA는 독성 화학 물질입니다. 적절한 안전 조치와 함께 흄 후드 아래에서 취급하십시오.
참고: 불완전한 재현탁은 고정 단계에서 세포 응집을 유발할 수 있습니다. 이것은 용해와 전단 과정을 방해합니다. - RT에서 10분 회전한 다음 즉시 3.11단계로 진행합니다.
참고: 응집체를 피하기 위해 회전이 필요합니다. 고정에 필요한 시간은 관심 대상과 샘플 유형에 따라 최적화되어야 합니다. 과도한 고정 시간은 적절한 전단을 방해할 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. - RT에서 1.25M 글리신 113μL를 추가하여 125mM 최종 농도를 얻고 5분 동안 회전합니다.
참고: 글리신은 과도한 가교를 피하면서 고정 반응을 완화합니다. - 4 °C에서 3분 동안 1,300 x g 로 원심분리합니다.
- 상층액을 버리고 필요한 억제제와 함께 얼음처럼 차가운 PBS 950μL에 피펫팅하여 펠릿을 조심스럽게 재현탁합니다.
- 4 °C에서 3분 동안 1,300 x g 로 원심분리합니다.
- 3.13-3.14 단계를 반복하고 즉시 염색질 분리 단계로 진행합니다.
4. 염색질 분리
- 필요한 억제제와 함께 버퍼 A 950μL를 펠릿에 추가합니다. 펠릿이 완전히 재현탁될 때까지 피펫팅으로 부드럽게 혼합하고 4°C에서 10분 동안 회전합니다.
참고: 이 단계는 핵 용해 없이 고정된 단일 세포 현탁액을 용해합니다. 이를 통해 세포질 단백질과 RNA 샘플을 제거 할 수 있습니다. 용해 시간을 연장하면 용해하기 어려운 세포에 도움이 될 수 있지만 조직의 처리 시간이 늘어납니다. 이 시점에서 트리판 블루/DAPI 염색 후 현미경으로 제제를 확인하여 클러스터의 크기와 단일 세포의 존재를 확인할 수 있습니다. 그러나 단일 핵은 고정된 조직 물질로 인해 인식하기가 쉽지 않을 수 있습니다. - 4°C에서 5분 동안 2,000 x g 로 원심분리하고 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
- 필요한 억제제와 함께 950 μL의 완충액 B를 펠릿에 첨가합니다. 펠릿이 완전히 재현탁될 때까지 피펫팅으로 부드럽게 혼합하고 4°C에서 10분 동안 회전합니다.
참고: 이 단계는 더 이상의 바람직하지 않은 용해를 피하기 위해 핵 준비에서 용해 완충액을 씻어냅니다. - 4 °C에서 5분 동안 2000 x g 에서 원심분리합니다. 한편, 완충액 C에 필요한 억제제(단계 2.5와 동일)를 추가합니다.
- 상층액을 조심스럽게 제거하십시오.
- 300 μL의 RT 버퍼 C를 펠릿에 넣고 세게 피펫팅합니다.
- 샘플을 15-30초 동안 소용돌이치고 튜브를 짧게 돌려 뚜껑에 방울을 모읍니다.
알림: 이 단계는 고정된 핵을 유리하고 용해하는 데 중요합니다. 샘플 무결성을 보존하고 동시에 SDS 침전을 피하기 위해, 초음파 처리 전에 샘플을 9-11°C의 온도를 유지하기 위해 얼음 위에 보관된 플라스틱 랙에 보관한다.
5. 염색질 단편화
- 샘플을 3 개의 깨끗한 0.65 mL 초음파 인증 튜브로 옮겨 튜브 당 100 μL의 용해 된 핵 현탁액을 보장합니다.
참고: 최대 부피가 300μL인 1.5mL 초음파 인증 튜브를 사용할 수 있습니다. 해당 튜브를 위한 특정 홀더가 필요합니다. 0.65mL는 튜브당 시료의 부피가 더 작기 때문에 더 균일한 전단을 제공해야 합니다. - 30초 ON 및 30초 OFF 설정으로 고강도로 28주기 동안 염색질을 초음파 처리합니다. 초음파 처리기 수조가 제대로 냉각되었는지 확인하십시오 (얼음 또는 냉각 장치).
참고: 이 단계는 거의 모든 경우에 최적화가 필요합니다. 사용자는 전단 시간을 늘리면 더 작고 균일한 조각이 제공된다는 점을 명심해야 합니다. 그러나 이것은 염색질 품질을 낮출 가능성을 증가시킬 수 있습니다. 필요한 조각 크기를 제공하는 가장 낮은 주기 수를 선택합니다. 이 단계를 최적화하는 동안 사이클 수가 대부분의 핵을 용해하기에 충분한지 확인하기 위해 핵 염색을 수행하는 것이 유용합니다. - 초음파 처리 된 염색질을 이전에 얼음 위에서 식힌 새로운 1.5 mL 튜브로 옮깁니다.
- 30 μL의 Triton X-100 10 % 용액을 넣고 5-10 초 동안 와동합니다.
참고: Triton X-100은 SDS에 결합하여 4°C에서 추가 침전을 방지합니다. Triton X-100의 최종 양은 항상 1 % 여야합니다. - 4°C에서 15분 동안 16,000 x g 로 원심분리합니다.
- 상층액을 얼음 위에서 미리 식힌 깨끗한 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
- 알림: 상층액에는 전단된 염색질이 포함되어 있으며 투명하게 보여야 합니다. 펠릿에는 "전단할 수 없는" 받침대가 포함되어 있으며 매우 작게 유지되어야 합니다(간 조직의 경우 대부분 갈색). 전단 실패의 징후를 찾으십시오: 더 명확해지지 않은 염색질 용액과 4.5단계의 펠릿 치수와 유사합니다.
6. DNA 정제
- 전단된 염색질 10-25μL를 새 튜브로 옮기고 완충액 C를 추가하여 최종 부피 200μL에 도달합니다. 나머지 염색질은 나중에 사용할 때까지 -80°C에서 보관합니다. 필요한 경우 이 단계에서 절차를 중단하고 샘플을 -20°C에서 보관할 수 있습니다.
- 8 μL의 5 M NaCl을 첨가하고, 1000 rpm에서 진탕 하에 가열 블록에서 65 °C에서 적어도 6 시간 동안 인큐베이션한다.
알림: 이 단계는 염색질을 가교 해제합니다. 가능하면 하룻밤 동안 가교 해제를 연장하는 것이 더 안전합니다. NaCl의 존재는 공정을 보다 효율적으로 만듭니다. - 샘플을 RT에서 5분 동안 식히고 2μL의 RNase A를 추가합니다.
- 1000 rpm에서 진탕 하에 37°C에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
- 가열 블록에서 샘플을 제거하고 7μL의 300mMCaCl2 와 2μL의 Proteinase K를 추가합니다.
- 가열 블록을 56°C로 설정하고 1000rpm에서 진탕하면서 30분 동안 배양합니다. 한편, 4°C에서 1분 동안 16,000 x g 에서 원심분리하여 모든 샘플에 대해 하나의 상분리 튜브를 준비합니다.
참고: 이 특수 튜브는 핵산 페놀-클로로포름 추출 중 상 분리를 더 쉽게 만듭니다. - 가열 블록에서 튜브를 제거하고 RT에서 3분 동안 평형을 이루도록 합니다.
- 400 μL의 시료를 이전에 원심분리된 상분리 튜브로 옮깁니다.
- 400μL의 페놀-클로로포름-이소아밀 알코올 용액(PCI)을 넣고 5초 동안 소용돌이칩니다.
주의: PCI는 휘발성 및 독성이 강한 화합물입니다. 흄 후드 아래에서 필요한 안전 조치와 함께 취급하십시오. - 4°C에서 5분 동안 16,000 x g 로 원심분리합니다.
- 400 μL의 클로로포름을 넣고 5 초 동안 와류합니다.
주의 : 클로로포름은 휘발성이 높고 독성이 강한 화합물입니다. 흄 후드 아래에서 필요한 안전 조치와 함께 취급하십시오.
참고: 이 단계는 다운스트림 PCR 응용 프로그램을 방해할 수 있는 페놀 잔류물을 씻어냅니다. - 4°C에서 5분 동안 16,000 x g 로 원심분리합니다.
- 상부 상 400μL를 새로운 1.5mL 튜브로 옮기고 24μL의 5M NaCl과 0.75μL 글리코겐을 첨가했습니다. 잠깐 소용돌이.
- 1,055 μL의 100% EtOH를 첨가하고 완전히 소용돌이칩니다. 적절한 혼합을 확인하십시오.
- -80°C에서 1시간 동안 또는 -20°C에서 하룻밤 동안 배양합니다(ON).
참고: 이 단계는 전단된 DNA를 침전시킵니다. 수율을 최대화하려면 ON 배양을 선택하는 것이 좋습니다. - 4°C에서 30분 동안 16,000 x g 로 원심분리합니다.
- 펠릿이 탈구되지 않도록 주의하면서 상등액을 조심스럽게 제거합니다.
- 차가운 70% EtOH 500μL를 추가합니다. 펠릿이 씻겨지도록 튜브를 부드럽게 기울입니다.
참고: 이 단계는 핵산과 함께 침전되었을 수 있는 염 잔류물을 제거하는 데 필수적입니다. 염은 다른 다운스트림 응용 프로그램을 방해할 수 있습니다. - 4°C에서 15분 동안 16,000 x g 로 원심분리합니다.
- 전체 상층액을 조심스럽게 제거하고 펠릿을 RT에서 건조시킵니다.
알림: 37°C의 가열 블록에서 튜브를 배양하면 건조에 필요한 시간이 단축됩니다. - 50 μL의 Tris-EDTA 용액(TE-Buffer)을 첨가하고, 300 rpm에서 진탕 하에 5-10분 동안 37°C에서 가열 블록에 튜브를 넣었다.
알림: 이 단계는 펠릿 용해를 보장합니다. 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있으며 샘플을 4°C에서 최대 1주일 동안 보관하거나 -20°C에서 장기간 보관할 수 있습니다. - 1 % 아가로스 겔에서 DNA 분석을 수행하십시오.
7. DNA 크기 분석
- 실행 완충액 (즉, 트리스-아세테이트-EDTA (TAE) 또는 트리스-보레이트-EDTA (TBE)) 당 1 g의 아가로스를 혼합하여 1% 아가로스 겔을 제조한다. 아가로스가 완전히 용해 될 때까지 현탁액을 가열하십시오. 겔 용액을 붓기 전에 아가로스 용액 100mL마다 EtBr 10μL을 추가합니다.
주의: EtBr은 발암성으로 알려진 DNA 삽입제입니다. 흄 후드 아래에서 필요한 안전 조치와 함께 취급하십시오.
참고: EtBr 염색(젤에 직접 또는 실행 후)을 강력히 권장합니다. 다른 DNA 삽입 염료는 DNA 도말 작업을 할 때 우리 손에서 잘 작동하지 않았습니다. 좁은 로딩 웰은 넓은 로딩 웰과 비교할 때 더 나은 해상도를 제공합니다. - 10 μL의 시료를 2 μL의 6x 로딩 염료와 혼합합니다. 다음으로, 겔에 10 μL의 샘플을 로드하고 로딩 염료의 마지막 밴드가 겔의 2/3에 대해 실행될 때까지 실행합니다. DNA 사다리를 추가해야 합니다.
- 젤을 이미지화하고 스미어 크기가 원하는 적용 범위에 속하는지 확인합니다.
염색질이 품질 관리를 통과하면 다운스트림 응용 분야에 사용할 수 있습니다.
Representative Results
염색질 준비는 성공적인 ChIP를 달성하기 위한 중요한 단계입니다. 냉동 표본에서 양질의 염색질을 준비하려면 효율적인 전단을 방해할 수 있는 조직 덩어리의 존재를 피하기 위해 고정 전에 효율적인 조직 파괴를 보장해야 합니다. 그림 1은 프로토콜의 요약된 파이프라인을 보여줍니다. 분쇄만으로는 다양한 크기와 소수의 단일 세포가 생성되는 세포 클러스터를 생성하기 때문에 조직을 완전히 해리하기에 충분하지 않습니다(그림 1a). 첫 번째 분쇄 단계를 Dounce 균질화와 연관시키면 조직 덩어리의 양이 크게 감소하고 나머지 덩어리는 더 작아집니다(그림 1b). 고정 및 용해 단계 후에 보이는 단일 핵의 수(그림 1c)가 증가하는 반면 일반적인 구형 모양은 손실됩니다. 28 사이클 동안 초음파 처리 후, 핵 염색 (Hoechst 33258 / DAPI)은 대부분 더 이상 보이지 않습니다. 이것은 실제로 성공적인 전단의 신호입니다(그림 1d). 염색질 분취량의 탈가교 및 아가로스 겔 상의 DNA의 시각화 후, 성공적인 전단은 100-300 bp 범위의 단편의 존재에 의해 인식될 수 있다(도 2a) DNA의 양은 제조된 조직 조각의 조성에 따라 달라질 수 있다. 이러한 염색질은 ChIP-qPCR에 성공적으로 사용될 수 있습니다. 그림 2b에서 볼 수 있듯이 염색질은 H3K4me3, H3K27ac(활성 유전자 관련 변형) 및 H3K27me3(침묵 유전자 관련 변형) 항체로 성공적으로 침전될 수 있습니다. 염색체 1 개방 판독 프레임 43(C1orf43), 프로테아좀 20S 서브유닛 베타 2(PSMB2) 및 글리세르알데히드 3-인산 탈수소효소(mGapdh) 프로모터 영역은 호메오박스 C13(HOXC13), 호메오박스 C12(HOXC12) 및 마우스 미엘린 전사 인자 1(mMyt1) 프로모터 영역과 비교하여 H3K4me3 및 H3K27ac가 풍부해졌습니다(표 1). 이는 C1orf43, PSMB2 및 mGapdh가 간에서 구성적으로 전사되는 반면 HOXC13, HOXC12 및 mMyt1은 침묵하기 때문입니다. H3K27me3은 ChIP 분석의 성공을 확인하는 반대 거동을 보여줍니다. 이 생쥐의 간이 키메라라는 사실은 우리가 쥐와 인간 염색질을 모두 분석 할 수있게 해주었습니다. 또한 동일한 염색질이 ChIP-seq 실험에 성공적으로 사용될 수 있습니다. 시퀀싱 단계 후, 판독은 정렬되지 않은 단편의 양을 줄이기 위해 쥐 게놈과 인간 게놈으로 구성된 인덱스에 정렬되었습니다. 그 후, 종에 따라 분리된 위치를 판독하고 EaSeq22로 추가로 분석했습니다. 그런 다음 모든 유전자의 전사 시작 부위(TSS)에서 신호 강도를 측정하고 결과를 H3K4me3 신호 강도에 대해 분류했습니다. 그림 3a 및 그림 3c는 마우스 및 인간 염색질 내 유전자의 상당 부분에 대해 TSS에서 H3K4me3 및 H3K27ac의 현저한 존재를 보여줍니다. 그 외에도 H3K27me3는 H3K4me3/H3K27ac와 역상관관계가 있습니다. H3K27me3은 이러한 PTM에서 예상된 바와 같이 TSS뿐만 아니라 유전자의 전체 길이에 존재합니다. 그림 3b 및 그림 3d는 H3K27me3에 대해 풍부하게 알려져 있고 마우스 및 인간 간 모두에서 전사적으로 비활성인 것으로 알려진 HOXC/HoxC 클러스터를 보여줍니다. H3K4me3 및 H3K27ac의 프로파일링은 이 두 PTM에 대한 피크를 보여주는 반면, H3K27me3의 신호 강도는 더 낮고 더 분산되는 경향이 있습니다.
염색질 준비의 복잡성으로 인해 과고정이 발생할 수 있으며, 용해 또는 초음파 처리 시간이 최적이 아닐 수 있으며, 큰 세포 덩어리가 지속될 수 있으며, 샘플의 부적절한 취급이 부적절 할 수 있습니다. 이것들은 준비의 질에 영향을 미치는 모든 사건입니다. 어떤 경우에는 올바른 크기 내에서 염색질 조각의 농축이 여전히 존재하거나 더 높은 크기로 이동합니다. 다른 경우에는 조기 용해 또는 전단 실패로 인해 재료가 손실 될 수 있습니다. 그림 4 는 이러한 부정적이고 차선의 결과의 몇 가지 예를 보여줍니다. 레인 3 및 4는 200 bp 내지 800 bp 사이의 단편 크기의 농축을 나타낸다. 그러나 단편 크기는 100bp에서 >10,000bp에 이릅니다. 레인 5 및 6에서는 100-250 bp 범위의 농축이 준비 중에 물질의 명확한 손실과 함께 존재합니다. 이것은 초음파 처리가 더 작은 조각을 생성하는 이유를 설명 할 수 있습니다. 레인 7은 절편 범위가 증가한 약간 차선의 준비를 나타내는 반면, 레인 8은 거의 완전한 재료 손실을 보여줍니다. 이는 조기 핵 용해 또는 불충분한 조직 해리로 인해 발생할 수 있으며 결과적으로 5.5단계 이후의 손실이 발생할 수 있습니다.
그림 1: 염색질 준비 프로토콜 개요. 사진은 조직 분쇄 후(a), 추가 수동 균질화(b), 핵 용해 후(c) 및 초음파 처리 후(원심분리 전)(d)를 촬영했습니다. 핵 염색은 Hoechst 33258/DAPI로 수행하였다. 스케일 바 = 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 대표적인 염색질 전단 및 ChIP-qPCR로 평가한 품질 . 다양한 염색질 제제의 프로토콜에 따라 단편화된 염색질 샘플이 포함된 1% 아가로스 겔. 전단되지 않은 염색질의 대조군이 추가되어 염색질/DNA 분해가 사전에 발생하지 않도록 합니다 (a). 전단된 염색질은 ChIP-qPCR 분석을 수행하여 품질에 대해 테스트되었습니다. H3K4me3, H3K27ac 및 H3K27me3 항체를 사용하여 새로 제조된 염색질을 침전시켰습니다. (b ) qPCR 분석은 인간 (C1orf43 및 PSMB2), 뮤린 (Gapdh) 활성 프로모터 및 인간 (HOXC13, HOXC12), 뮤린 (Myt1) 비활성 프로모터에 대해 수행하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 대표적인 ChIP-seq 분석. 판독은 인간 및 마우스 게놈(hg19 및 mm10)으로 생성된 인덱스에 맞춰졌습니다. 정렬 후 인간 및 쥐 판독을 분리하고 추가로 분석했습니다. 신호가 TSS에서 정량화되고 H3K4me3 강도(a)에 대한 내림차순으로 표시된 인간 유전자의 히트맵. 활성 유전자(b)에 의해 둘러싸인 억제된 유전자의 인간 유전자 클러스터(HOX cluster)의 예이다. 신호가 TSS에서 정량화되고 H3K4me3 강도(c)에 대한 내림차순으로 표시된 쥐 유전자의 히트맵. 활성 유전자(d)로 둘러싸인 억제된 유전자의 뮤린 유전자 클러스터(Hox cluster)의 예이다. 표시된 모든 데이터는 백만 읽기 당 EaSeq에 의해 정규화되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 최적이 아니고 실패한 염색질 준비. 프로토콜에 따라 단편화된 염색질 샘플이 있는 1% 아가로스 겔. 이 그림에는 대조군으로 사용되는 전단되지 않은 염색질(레인 2), 최적 전단이 아닌 전단(레인 3-4), 명확한 재료 손실이 있는 최적 전단(레인 5-6), 최적이 아닌 전단(레인 7) 및 광범위한 재료 손실(레인 8)이 포함되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 프라이머 이름 | 순서 | |
| C1orf43 프로모터 | 전달 | AGTGGGTGGAGAATGCAGAC |
| 후진 | 가가타캉캉캉챠캇 | |
| PSMB2 프로모터 | 전달 | CTTATTCAACCCCCCGACAAA |
| 후진 | 갓가가(GATGAAGGACGGTGAGGAGA) | |
| HOXC13 원위 프로모터 | 전달 | GAGCCCGAGATTCACTCAAC |
| 후진 | TTATGCCCAGTTTTGGGGTA | |
| HOXC12 원위 프로모터 | 전달 | AAAGCTTCCCACTGCAAAGA |
| 후진 | AAATCTGGGGGCGAACTACT | |
| mGAPDH 프로모터 | 전달 | GGTCCAAAGAGAGGAGGAGGAG |
| 후진 | GCCCTGCTTATCCAGTCCTA | |
| mMYT 프로모터 | 전달 | CAGCCCAATTCTAGCCACAT |
| 후진 | CCAAAGCAGGGGGAGTAGGAG |
표 1: ChIP-qPCR 분석에 사용되는 활성 및 비활성 유전자에 대한 qPCR 프라이머 목록.
Discussion
스냅 냉동 조직의 염색질 준비는 재현 가능하고 신뢰할 수 있는 결과를 얻기 위해 최적화해야 하는 단계가 많기 때문에 여전히 어려운 과제입니다. 이미 발표된 프로토콜(16,23)의 대부분은 수동 해리(douncing) 전에 조직 다듬기를 필요로 한다. 우리는 가능한 한 샘플을 고정하기 전에 단백질 분해를 유발할 수 있는 단계를 피하려고 노력했습니다. 분쇄 단계는 냉동 간 제제(24)에서 이미 사용되고 있으며, 수동 해리를 용이하고 재현가능하게 한다(도 2a 참조). 1.5mL 튜브용으로 특별히 설계된 모르타르(프로토콜 참조)를 사용하면 분쇄 공정 중 검체 손실이 줄어들어 간 생검 검체와 같은 소량의 조직을 처리할 수 있습니다. 원칙적으로 분쇄 단계 없이 직접 조직 균질화를 사용할 수 있습니다. 그러나 이전 분쇄가 없는 조직 균질화는 우리의 경험에서 재현성이 더 나쁘고 다운스트림 적용에 대한 문제의 출현이 더 높았습니다(데이터는 표시되지 않음).
조직에서 염색질을 준비할 때 발생하는 대부분의 문제는 이러한 샘플의 특성과 세포 클러스터가 품질을 잃지 않고 고정할 수 있을 만큼 충분히 작은지 여부를 적절하게 확인할 수 없기 때문에 발생합니다. 또한 각 단계에서 각 분취량을 확인하는 것은 시간이 많이 걸리므로 단백질 분해 가능성이 높아집니다.
고정 (3.9 단계)은 염색질 준비의 기본적이고 중요한 부분입니다. 조직의 특성으로 인해, 고정 단계는 조직이 균질화될 때까지 지연되었다. 이러한 연기된 고정 단계는 보다 균질한 세포 현탁액을 제조할 수 있는 장점이 있다. 그러나 특히 조작에 민감한 표적의 경우 3.6 단계 직전에 고정을 수행해야 할 수도 있음을 알고 있습니다. 이것은 매우 민감한 단백질 또는 PTM을 보호하는 데 도움이 될 수 있지만 세포 클러스터의 크기를 증가시킬 수 있지만 고정되면 비균질 전단이 발생할 수 있습니다. 프로토콜에 사용된 FA 용액의 농도는 표준이지만, 전체 고정을 개선하기 위해 수정될 수 있다. 여기에서 선택한 고정 시간은 현장에서 일반적으로 사용되는 표준 조건도 반영합니다. 고착액의 농도가 높을 경우 고정 시간이 단축될 수 있고, 사용량이 적은 경우에는 고착 시간을 늘려야 합니다. 작업자는 고정 시간의 변경이 샘플의 과도한 고정으로 이어지거나 단백질 분해의 여지를 줄 수 있다는 점을 고려해야 합니다. 큰 복합체 (또는 그 일부)와 TF를 침전시키는 것을 목표로하는 경우, DSG 용액과 FA 용액25,26을 사용하여 이중 단계 고정을 수행하는 것이 유리할 것입니다. 이 경우 DSG는 단백질-단백질 상호작용을 안정화시키는 반면, 포름알데히드는 주로 직접적인 DNA-단백질 상호작용에 작용합니다27.
작업자는 더 빠르고 독성 화합물을 사용하지 않는 6.7단계부터 시작하는 DNA 정제를 위한 컬럼 기반 키트를 구현할 가능성을 고려해야 합니다. 그러나 손실되는 결합되지 않은 DNA는 항상 일정량 있습니다. 이러한 이유로 고전적인 페놀-클로로포름 추출과 EtOH 침전을 사용하는 것이 좋습니다. 또한, 아가로스 겔을 실행하기 전에(단계 7.2) DNA 농도를 측정하고 모든 웰에 대해 동일한 양을 로드하여 보다 명확한 그림을 얻는 것이 도움이 될 수 있습니다.
이 프로토콜의 한계는 인간-간 키메라 마우스에서 추출한 간 표본만을 사용하여 이 프로토콜을 탐색하고 활용했다는 사실에서 비롯됩니다28. 간은 그 자체로 상피 조직과 결합 조직으로 이루어져 있다29. 질병의 경우, 섬유성 조직과 지방 조직이 존재할 수 있다30,31 조직 파괴 동안 추가적인 문제를 일으킨다. 그러나 우리는 우리의 프로토콜이 해리 및 초음파 처리 단계의 최적화 없이 뼈, 근육 및 지방 조직에 사용되지 않을 수 있음을 알고 있습니다. 주목해야 할 점은 모든 조직은 세포 배양 샘플과 같이 모든 조직에 적합한 프로토콜이 없기 때문에 일종의 최적화가 필요하다는 것입니다(15). 그러나 최적화가 거의 또는 전혀 없이 이 프로토콜이 폐, 장, 위, 췌장 또는 신장 조직과 같이 구성에서 간과 유사성을 공유하는 다른 조직에 성공적으로 적용될 수 있다고 믿습니다.
우리의 프로토콜은 또한 HBV 공유 폐쇄 DNA 에피솜(cccDNA)32에서 TF 및 히스톤 변형을 분석하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 이것은 인간 거대세포바이러스33(hCMV) 및 인간 아데노바이러스34(HAdV)와 같이 간에 영향을 미치는 다른 바이러스 게놈에 이러한 접근 방식을 적용할 수 있는 기회를 제공합니다. 카포시 육종 헤르페스 바이러스35 (KHSV), 단순 포진 바이러스 36 (HSV1 / 2) 폴리 오마 바이러스, 엡스타인-바 바이러스37 (EBV)과 같은 다른 조직에서 지속적인 감염을 일으키는 다른 DNA 바이러스를 분석하는 것이 가능하다는 것은 배제되지 않습니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 Maura Dandri(SFB 841 A5)에 대한 보조금으로 독일 연구 재단(DFG)의 지원을 받았고 연구 프로그램(LFF-FV44: EPILOG)을 통해 함부르크 주에서 지원했습니다.
기술적인 도움과 원고를 비판적으로 읽어주신 Dr. Tassilo Volz, Yvonne Ladiges 및 Annika Volmari에게 감사드립니다. Dr. Thomas Günther와 Adam Grundhoff 교수는 ChIP-qPCR 분석을 위한 매우 유용한 제안과 프라이머 세트를 제공했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22µm sterile syringe filter | Labsolute | 7699822 | |
| 1.5 mL Safeseal tubes | Sarstedt | 7,27,06,400 | |
| 6x orange loading dye | Thermofisher | R0631 | |
| Benchtop refrigerated centrifuge | |||
| Bioruptor NGS | Diagenode | ||
| Blade or Scalpel | |||
| Calcium chloride dihydrate | Carl Roth | HN04 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich (Merck) | C2432 | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | |
| Deacetylase Inhibitor | Active Motif | 37494 | |
| Dounce tissue grinder set | Sigma Aldrich (Merck) | DWK885300-0001-1EA | |
| EDTA 500 mM solution | PanReac AppliChem | A4892 | |
| EGTA | Sigma Aldrich (Merck) | E4378 | |
| EtBr | Carl Roth | 2218 | Concentration 10mg/mL |
| Ethanol absolute | CHEMSOLUTE | 2273 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich (Merck) | G9012 | |
| Glycin | Carl Roth | 0079 | |
| Glycogen | Roche | 10901393001 | Concentration: 20mg/mL |
| Heating block | |||
| HEPES | Sigma Aldrich (Merck) | H4034 | |
| LE Agarose | Biozym | 840000 | |
| Liquid nitrogen cooled mini mortar | Bel-Art | H37260-0100 | |
| MeOH free Formaldehyde 16% | Thermofisher | 28908 | |
| NP-40 | Roche | 11332473001 | |
| PBS 1x | Thermofisher | 10010015 | |
| Pefabloc SC-Protease-Inhibitor | Sigma Aldrich (Merck) | 11429868001 | |
| Phase Lock Gel - Heavy | QuantaBio | 2302830 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol 25:24:1 | Sigma Aldrich (Merck) | P3803 | |
| Potassium chloride | Carl Roth | 6781 | |
| Potassium hydroxyde | Merck | 105033 | |
| Proteinase K | Lucigen | MPRK092 | Concentration: 50 µg/µL |
| RNAse A | Lucigen | MRNA092 | Concentration: 5 mg/mL |
| SDS 10% solution | PanReac AppliChem | A3950 | |
| Sodium carbonate anhydrous | Carl Roth | A135 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich (Merck) | S7653 | |
| Sterile Petri dishes | Sarstedt | 83,39,02,500 | |
| Tris-HCl solution | Sigma Aldrich (Merck) | T2694 | |
| Triton-X100 | Sigma Aldrich (Merck) | X100 |
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