Summary
Detta protokoll fokuserar på kromatinberedning från snäppfrysta vävnader och det är lämpligt för tvärbindning av kromatinimmunoprecipitation (X-ChIP) följt av antingen kvantitativ PCR-analys (X-ChIP-qPCR) eller nästa generations sekvenseringsmetoder (X-ChIP-seq).
Abstract
Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) är en allmänt använd teknik för att bedöma nivåer av histonmärken och beläggning av transkriptionsfaktorer på värd- och / eller patogenkromatin. Kromatinberedning från vävnader skapar ytterligare utmaningar som måste övervinnas för att erhålla reproducerbara och tillförlitliga protokoll jämförbara med dem som används för cellodling. Vävnadsstörning och fixering är kritiska steg för att uppnå effektiv skjuvning av kromatin. Samexistens mellan olika celltyper och kluster kan också kräva olika skjuvningstider för att uppnå optimal fragmentstorlek och hindrar skjuvningens reproducerbarhet. Syftet med denna metod är att uppnå tillförlitliga och reproducerbara värdkromatinpreparat från frusen vävnad (lever) lämpliga för både ChIP-qPCR och nästa generations sekvenseringsapplikationer (NGS). Vi observerade att kombinationen av flytande kvävevävnadspulverisering följt av homogenisering leder till ökad reproducerbarhet jämfört med enbart homogenisering, eftersom det ger en suspension som huvudsakligen består av dissocierade enskilda celler som effektivt kan skjuvas. Dessutom bör fixeringssteget utföras under mild rotation för att ge homogen tvärbindning. Det fasta materialet är sedan lämpligt för buffertbaserad kärnisolering, för att minska kontaminering av cytoplasmatiskt protein och patogen-DNA och RNA (i förekommande fall), vilket undviker tidskrävande centrifugeringsgradienter. Efterföljande ultraljudsbehandling kommer att slutföra nukleär lys och skjuva kromatinet, vilket ger ett specifikt storleksintervall enligt de valda skjuvningsförhållandena. Storleksintervallet bör falla mellan 100 och 300 nt för NGS-applikationer, medan det kan vara högre (300-700 nt) för ChIP-qPCR-analys. Sådana protokollanpassningar kan avsevärt förbättra kromatinanalyser från frysta vävnadsprover.
Introduction
Sedan dess upptäckt har epigenetisk reglering i däggdjursceller fått allt större erkännande1, med tanke på att förståelsen av sådana mekanismer skulle ge viktiga insikter inte bara inom cellbiologi utan också inom sjukdoms- och tumörbiologi. Dessutom kan smittämnen också orsaka värdepigenetiska förändringar2 medan värdcellmaskineriet också kan påverka kromatin hos patogener, såsom persisterande DNA-virus 3,4. Detta värd-patogen-samspel verkar spela en roll i infektionsbeständighet. 2
Genom en reversibel förening med DNA bildar histonproteiner ett komplex som kallas nukleosom. Nukleosomer når i sin tur en högre organisationsnivå som kallas kromatin. Kromatinremodellering är känd för att tätt reglera genuttryck, bevilja eller neka tillgång till transkriptionsfaktorer (TFs)5. Dessa faktorer kan antingen utlösa eller blockera rekryteringen av RNA-polymeras II (PolII) på genpromotorer, vilket påverkar mRNA-syntesen från DNA-mallen6. Histonproteiner innehåller svansar7, som flankerar båda ändarna av histonvecket, vilket kan utsättas för posttranslationella modifieringar (PTM), vilket möjliggör en tät reglering av gentranskriptionen genom strukturella kromatinförändringar. De flesta histon-PTM är belägna vid svansens N-terminal, med acetylering och metylering som de bäst studerade PTM, även om fosforylering8, ubiquitinering9 och ribosylering10 också har rapporterats. Att karakterisera och studera sådana proteiner är då viktigt för att få en djup inblick i genreglering.
För närvarande finns det en handfull väletablerade metoder och verktyg tillgängliga för att studera direkta DNA-proteininteraktioner: Electrophoretic mobility shift assay (EMSA), Yeast one-hybrid assay (Y1H) och DNA footprinting11. Dessa metoder fokuserar dock i sig på enskilda DNA-proteininteraktioner och är inte tillämpliga för genomomfattande studier. En annan begränsning av dessa tekniker är bristen på histonförening med de undersökta DNA-segmenten. Sådana tillvägagångssätt är således inte avsedda att återspegla komplexiteten hos transkriptionsmaskineriet in vivo och de tar inte hänsyn till viktiga strukturella förändringar12 eller andra nödvändiga enzymer/kofaktorer13 som kan påverka (antingen främja eller hämma) proteinbindning till DNA.
Tanken att fixering av celler med medel som formaldehyd (FA) skulle kunna ge en in vivo-ögonblicksbild av protein-DNA-interaktioner, skapade grunden för utvecklingen av kromatinimmunoprecipitationsanalyser (ChIP)14. Detta, tillsammans med tillgången till kvantitativ PCR-teknik (qPCR) och mycket specifika antikroppar, möjliggjorde utvecklingen av ChIP-qPCR-analyser. Därefter tillkomsten av nästa generations sekvenseringstekniker (NGS), vars kostnader blir billigare, medgav att koppla ChIP-experiment med NGS-tillvägagångssätt (ChIP-seq), vilket ger forskare nya kraftfulla verktyg som möjliggör undersökning av kromatinreglering. I dessa analyser fixeras isolerade eller odlade celler med disuccinimidylglutarat (DSG) och / eller FA, kärnor isoleras, kromatin fragmenteras sedan och fälls ut av antikroppen av intresse. Därefter renas och analyseras DNA med PCR- eller NGS-metoder. I motsats till EMSA, Y1H och DNA-fotavtryck har ChIP-analyser förmågan att ge en global ögonblicksbild av protein-DNA-interaktion i cellen. Detta ger flexibilitet och möjliggör analys av flera loci inom samma prov. På grund av analysens karaktär kan ChIP så småningom upptäcka inte bara direkta interaktioner, utan även indirekta, som inte erbjuder precisionen hos ovan nämnda metoder, när de är intresserade av direkta protein-DNA-interaktioner.
Kromatinberedningsprotokoll från cellodlingsmaterial är väletablerade15 och mycket reproducerbara, vilket gör det möjligt för användaren att erhålla kromatin som är lämpligt både för qPCR- och NGS-metoder på 1-2 arbetsdagar. Att erhålla högkvalitativt kromatin från hela vävnader utgör emellertid fortfarande en utmaning på grund av behovet av att dissociera cellerna i vävnaden samtidigt som optimal fixering och skjuvning av kromatinet uppnås. Dessutom varierar sammansättningen och morfologin hos olika typer av vävnader, vilket kräver justering av befintliga protokoll16,17. Användningen av kryokonserverad vävnad erbjuder ytterligare utmaningar jämfört med färska prover. Detta beror på svårigheten att erhålla en enda cellsuspension utan omfattande materialförlust. Detta leder till felaktig skjuvning, vilket hindrar nedströmsapplikationer. Att få tillgång till frysta vävnadsprover snarare än den färska motsvarigheten ökar inte bara arbetsflexibiliteten utan det kan också utgöra det enda alternativet för forskare som arbetar med prover som härrör från longitudinella eller jämförande studier. En handfull kromatinberedningsprotokoll för fryst vävnad har publicerats. Dessa är mestadels baserade på provupptining följt av malning, manuell / maskinbaserad dissociation eller flytande kvävepulverisering steg18,19,20.
Här beskriver vi en optimerad kromatinberedningsmetod15 för frysta ofixerade leverprover, som kombinerar vävnadspulverisering i flytande kväve med mortelhomogenisering, för att uppnå en reproducerbar kromatinskjuvning lämplig för X-ChIP-metoder som syftar till att analysera både virala och värdgenom.
Protocol
Vävnadsprovtagning från humana leverchimära möss21 utfördes i enlighet med EU-direktivet 86/609/EEG och godkändes av den etiska kommittén i staden och delstaten Hamburg i enlighet med principerna i Helsingforsdeklarationen.
1. Beredning av reagenser
- Förbered 1,25 M glycinlösning i avjoniserat vatten. Sterilfilter med filter i porstorlek 0,22 μm. Förvaras vid 4 °C.
- Förbered 5 M natriumkloridlösning (NaCl). Förvaras i rumstemperatur.
- Bered CaCl 2-lösning: 300 mM CaCl2 och 10 mM Tris-HCl pH 8 i avjoniserat vatten. Sterilfilter med filter i porstorlek 0,22 μm och förvaras vid rumstemperatur.
- Förbered en 10% Triton X-100 utspädning i avjoniserat vatten. Förvara på RT.
- Förbered Tris-EDTA-buffert: 1 mM EDTA och 10 mM Tris pH 8 i avjoniserat vatten. Förvaras vid 4 °C.
- Förbered följande buffertar enligt den mängd som krävs:
- Förbered buffert A: 50 mM Hepes-KOH pH 7,5, 140 mM NaCl, 1 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA), 10% glycerol, 0,5% NP-40 och 0,25% Triton X-100 i avjoniserat vatten. Sterilfilter med filter i porstorlek 0,22 μm. Förvaras vid 4 °C.
- Förbered buffert B: 10 mM Tris-HCl pH 8, 200 mM NaCl, 1mM EDTA, 0,5 mM egtazinsyra (EGTA). Sterilfilter med filter i porstorlek 0,22 μm. Förvaras vid 4 °C.
- Förbered buffert C: 1% SDS, 10 mM EDTA och 50 mM Tris-HCl pH 8 i avjoniserat vatten. Sterilfilter med filter i porstorlek 0,22 μm. Förvara på RT.
- Förbered kromatinutspädningsbuffert: 0,01% SDS, 1,1% Triton X-100, 1,2 mM EDTA, 16,6 mM Tris-HCl pH 8 och 166 mM NaCl i avjoniserat vatten. Sterilfilter med filter i porstorlek 0,22 μm. Förvaras vid 4 °C.
2. Förberedelse av material
- Samla torris, is och flytande kväve.
VARNING: Hantera torris och flytande kväve med nödvändig försiktighet för att undvika brännskador. - Förkyl centrifugen vid 4 °C.
OBS: Detta steg är viktigt för att undvika proteinnedbrytning och avtvärbindning under tvättstegen eftersom detta kommer att minska kromatinets kvalitet. - Lägg en steril tallrik på torris och låt den svalna.
OBS: Se till att plattan är tillräckligt stor för att underlätta skärprocessen. En 100 mm petriskål rekommenderas. - Ta ut den nödvändiga alikvoten av glycin 1,25 M och låt den nå RT.
- Ta ut nödvändiga alikvoter av buffert A, B och PBS. Tillsätt proteas och / eller deacetylas och fosfatashämmare för att nå 1-faldig koncentration och lämna dem på is.
- Ta ut den nödvändiga alikvoten av buffert C och lämna den vid RT. Tillsätt inte proteas och/eller deacetylas och fosfatashämmare förrän annat anges.
- Ta ut den nödvändiga alikvoten av RT PBS.
VARNING: Buffert C innehåller natriumdodecylsulfat (SDS). Anta lämpliga säkerhetsåtgärder när bufferten förbereds.
OBS: SDS fälls ut på is, och proteas och deacetylashämmare är inte stabila vid RT. - Förkyl morteln som häller flytande kväve i sin kammare, följ strikt leverantörens instruktioner. Kyl ner metallstöten i torris i minst 5 min.
OBS: Det är möjligt att använda en alternativ murbruk till den föreslagna. Anordningen som används i detta protokoll, på grund av sin speciella konstruktion, tillåter emellertid att arbeta med liten mängd vävnad utan väsentlig förlust under pulveriseringsprocessen. - Förkyl homogenisatorn Dounce med tillhörande stöt A på is.
OBS: Stöt A har en lös passform med homogenisatorn. Detta gör det möjligt att erhålla en enda cellsuspension utan signifikant celllys.
3. Vävnadens tvärbindning
- Skär ca 50 mg frusen vävnad direkt på skålen på torris med hjälp av en skalpell och pincett.
OBS: Det rekommenderas att hålla skalpellen vid RT, eftersom detta kommer att underlätta skärprocessen. Undvik att applicera för mycket tryck på skalpellen, eftersom detta ökar risken för att sprida vävnadsbitar utanför skärområdet. Att notera, 50 mg vävnad (lever i detta fall) bör ge cirka 5 miljoner celler. Observera att det varma bladet tinar skäreggen. Med tanke på vävnadsstyckets relativt stora storlek bör detta dock ha en begränsad effekt. När mindre bitar skärs kan det vara fördelaktigt att använda en kall skalpell med uppmärksamhet för att undvika spridning av vävnaden. - Lägg den skurna vävnaden i ett 1,5 ml rör som redan kylts på torris. Undvik upptining av vävnader.
- Flytta röret som innehåller vävnaden till murbruket och låt det sitta där i 5 minuter.
OBS: Om provet får vila i murbruk sänks dess temperatur (från -80 °C till -196 °C). Detta ökar dess seghet och gör pulveriseringssteget enklare. - Tryck på provet med hjälp av den förkylda stöten tills inga mer fasta smulor är synliga.
OBS: Det är viktigt att undvika uppvärmning av stötar genom alltför stora rotationskrafter, eftersom detta kommer att tina provet. Efter varje provpulverisering, rengör stöten med 70% etanol (EtOH) och låt den kyla igen på torris. - Ta bort röret med provet från morteln och tillsätt 950 μl iskall PBS med erforderliga hämmare. Pipettera försiktigt upp och ner tills provet är helt suspenderat. Fortsätt omedelbart till steg 3.6.
- Överför vävnadssuspensionen till homogenisatorn och applicera 20-30 slag med stöt A för att få en finare suspension. Undvik skumning.
OBS: Strokemängden bör optimeras enligt vävnadskonsistensen. Detta steg dissocierar ytterligare de små kluster av celler som erhållits efter pulverisering. En felaktig homogenisering kan påverka skjuvningseffektiviteten. - Överför homogenatet till ett nytt 1,5 ml rör, redan förkylt på is.
- Centrifugera i 5 minuter vid 1 300 x g vid 4 °C och avlägsna försiktigt supernatanten.
- Återsuspendera pelleten helt i 950 μL RT PBS genom försiktig pipettering och tillsätt 63,6 μL 16% MeOH-fri FA för att få en slutlig koncentration på 1%. Fortsätt omedelbart till steg 3.10.
VARNING: FA är en giftig kemikalie. Hantera den under en dragskåp med lämpliga säkerhetsåtgärder.
OBS: Ofullständig resuspension kan provocera cellaggregering under fixeringssteget. Detta hindrar lysen och skjuvningsprocessen. - Rotera 10 min vid RT. Fortsätt sedan omedelbart till steg 3.11
OBS: Rotation är nödvändig för att undvika aggregat. Den tid som krävs för fixering bör optimeras, beroende på målet av intresse och provtypen. Det är viktigt att notera att överdrivna fixeringstider kan hindra korrekt klippning. - Tillsätt 113 μl 1,25 M glycin vid rumstemperatur för att erhålla en slutlig koncentration på 125 mM och rotera i 5 minuter.
OBS: Glycin släcker fixeringsreaktionen och undviker överbindning. - Centrifugera vid 1 300 x g i 3 min vid 4 °C.
- Kassera supernatanten och suspendera pelleten försiktigt genom att pipettera in 950 μL iskall PBS med erforderliga hämmare.
- Centrifugera vid 1 300 x g i 3 min vid 4 °C.
- Upprepa steg 3.13-3.14 och fortsätt omedelbart till kromatinisoleringsstegen.
4. Kromatinisolering
- Tillsätt 950 μl buffert A med erforderliga hämmare till pelleten. Blanda försiktigt genom pipettering tills pelleten är helt återsuspenderad och rotera 10 min vid 4 °C.
OBS: Detta steg lyserar den fasta encellssuspensionen, utan nukleilys. Detta gör det möjligt att befria provet av cytosoliska proteiner och RNA. Förlängning av lystiden kan vara till nytta för svåra att lysera celler, vilket ökar vävnadens hanteringstid. Vid denna tidpunkt är det möjligt att kontrollera preparatet under mikroskopet efter trypan blue / DAPI-färgning för att kontrollera storleken på klustren och närvaron av enskilda celler. De enda kärnorna kan emellertid inte vara lätta att uppskatta på grund av det fasta vävnadsmaterialet. - Centrifugera vid 2 000 x g i 5 minuter vid 4 °C och avlägsna försiktigt supernatanten.
- Tillsätt 950 μL buffert B med erforderliga hämmare till pelleten. Blanda försiktigt genom pipettering tills pelleten är helt återsuspenderad och rotera 10 min vid 4 °C.
OBS: Detta steg tvättar ut lysbufferten från kärnberedningen för att undvika ytterligare oönskad lys. - Centrifugera vid 2000 x g i 5 min vid 4 °C. Tillsätt under tiden de nödvändiga hämmarna (samma som steg 2.5) till buffert C.
- Ta försiktigt bort supernatanten.
- Tillsätt 300 μL RT-buffert C till pelleten och pipettera kraftigt.
- Virvla provet i 15-30 s och snurra röret kort för att samla dropparna på locket.
OBS: Detta steg är viktigt för att frigöra och lysera de fasta kärnorna. För att bevara provets integritet och samtidigt undvika SDS-nederbörd, håll provet före ultraljudsbehandling i ett plastställ som hålls på is för att upprätthålla en temperatur på 9-11 ° C.
5. Fragmentering av kromatin
- Överför provet till tre rena 0,65 ml ultraljudsbehandling-certifierade rör som säkerställer 100 μL lyserade kärnor suspension per rör.
OBS: Det är möjligt att använda 1,5 ml ultraljudsbehandling-certifierade rör med en maximal volym på 300 μL. En särskild hållare för dessa rör behövs. 0,65 ml bör erbjuda mer homogen skjuvning på grund av den mindre volymen av provet per rör. - Sonicate kromatin för 28 cykler vid hög intensitet med 30 s ON och 30 s OFF inställning. Se till att ultraljudsbadet är ordentligt kylt (is eller kylanordning).
OBS: Detta steg behöver optimeras i nästan alla fall. Användaren bör komma ihåg att ökad skjuvningstid kommer att ge mindre och mer homogena fragment; Detta kan dock öka chansen att sänka kromatinkvaliteten. Välj det lägsta antalet cykler som ger den fragmentstorlek som krävs. Under optimeringen av detta steg är det användbart att utföra kärnfärgning för att kontrollera om antalet cykler var tillräckligt för att lysera majoriteten av kärnorna. - Överför det ultraljudsbaserade kromatinet till ett nytt 1,5 ml rör som tidigare kylts på is.
- Tillsätt 30 μL Triton X-100 10% lösning och virvel i 5-10 s.
Triton X-100 binder SDS och förhindrar ytterligare utfällning vid 4 °C. Den slutliga mängden Triton X-100 bör alltid vara 1%. - Centrifugera vid 16 000 x g i 15 min vid 4 °C.
- Överför supernatanten till ett rent 1,5 ml rör förkylt på is.
- Anmärkning: Supernatanten innehåller det klippta kromatinet och ska vara klar. Pelleten innehåller "ej skjuvbara" vilor och den bör förbli ganska liten (mestadels brun vid levervävnad). Leta efter indikation på misslyckad klippning: kromatinlösning som inte blev tydligare och liknande pelletsdimensioner som de från steg 4.5.
6. DNA-rening
- Överför 10–25 μl skjuvat kromatin till ett nytt rör och tillsätt buffert C för att nå en slutlig volym på 200 μl. Förvara resten av kromatinet vid -80 °C tills den används vidare. Vid behov kan proceduren avbrytas i detta steg och provet förvaras vid -20 °C.
- Tillsätt 8 μl 5 M NaCl och inkubera minst 6 timmar vid 65 °C i ett värmeblock under skakning vid 1000 rpm.
OBS: Detta steg avlänkar kromatinet. Det är säkrare att förlänga tvärbindningen över natten när det är möjligt. Närvaron av NaCl gör processen effektivare. - Låt proverna svalna vid rumstemperatur i 5 minuter och tillsätt 2 μl RNas A.
- Inkubera i 1 timme vid 37 °C under skakning vid 1000 rpm.
- Ta bort proverna från värmeblocket och tillsätt 7 μl 300 mMCaCl2 och 2 μL proteinas K.
- Ställ in värmeblocket på 56 °C och inkubera i 30 min under skakning vid 1000 rpm. Bered under tiden ett fasseparationsrör för varje prov genom att centrifugera ner dem vid 16 000 x g i 1 min vid 4 °C.
OBS: Dessa speciella rör gör fasseparationen under nukleinsyrafenol-kloroformextraktion enklare. - Ta bort rören från värmeblocket och låt dem balansera vid rumstemperatur i 3 minuter.
- Överför 400 μl av provet till ett tidigare centrifugerat fasseparationsrör.
- Tillsätt 400 μL fenol-kloroform-isoamylalkohollösning (PCI) och virvel i 5 sekunder.
VARNING: PCI är en mycket flyktig och giftig förening. Hantera den med nödvändiga säkerhetsåtgärder under ett dragskåp. - Centrifugera vid 16 000 x g i 5 min vid 4 °C.
- Tillsätt 400 μL kloroform och virvel i 5 s.
VARNING: Kloroform är en mycket flyktig och giftig förening. Hantera den med nödvändiga säkerhetsåtgärder under ett dragskåp.
OBS: Detta steg tvättar bort eventuella rester av fenol, som kan störa nedströms PCR-applikationer. - Centrifugera vid 16 000 x g i 5 min vid 4 °C.
- Överför 400 μL av den övre fasen till ett nytt 1,5 ml rör där 24 μL 5 M NaCl och 0,75 μL glykogen tillsattes. Kort virvel.
- Tillsätt 1 055 μL 100 % EtOH och virvel noggrant. Se till att blandningen är korrekt.
- Inkubera vid -80 °C i 1 timme eller vid -20 °C över natten (ON).
OBS: Detta steg fäller ut det skjuvade DNA; För att maximera avkastningen föreslås att man väljer ON-inkubationen. - Centrifugera vid 16 000 x g i 30 min vid 4 °C.
- Ta försiktigt bort supernatanten och var uppmärksam på att inte förskjuta pelleten.
- Tillsätt 500 μL kall 70% EtOH. Luta röret försiktigt för att säkerställa att pelleten tvättas.
OBS: Detta steg är viktigt för att avlägsna saltrester som kan ha fällts ut tillsammans med nukleinsyrorna. Salter kan störa andra nedströms applikationer. - Centrifugera vid 16 000 x g i 15 min vid 4 °C.
- Ta försiktigt bort hela supernatanten och låt pelleten torka vid RT.
OBS: Inkubation av röret på ett värmeblock vid 37 °C minskar den tid som krävs för torkning. - Tillsätt 50 μL Tris-EDTA-lösning (TE-buffert) och sätt röret på värmeblocket vid 37 °C i 5-10 min under skakning vid 300 rpm.
OBS: Detta steg säkerställer pelletsupplösningen. Protokollet kan pausas här, och provet kan förvaras vid 4 °C i upp till 1 vecka eller vid -20 °C för längre lagring. - Utför DNA-analys på 1% agarosgel.
7. Analys av DNA-storlek
- Bered en 1% agarosgel genom att blanda 1 g agaros per 100 ml löpande buffert (dvs. Tris-acetat-EDTA (TAE) eller Tris-borat-EDTA (TBE)). Värm suspensionen tills agarosen är helt upplöst. Tillsätt 10 μl EtBr för varje 100 ml agaroslösning innan gellösningen hälls.
VARNING: EtBr är ett DNA-interkalerande medel som är känt för att vara cancerframkallande. Hantera den med nödvändiga säkerhetsåtgärder under ett dragskåp.
OBS: EtBr-färgning (direkt i gel eller efter körning) rekommenderas starkt. Andra DNA-interkalerande färgämnen fungerade inte bra i våra händer när vi arbetade med DNA-utstryk. Smala lastbrunnar ger en bättre upplösning jämfört med bredare. - Blanda 10 μl av provet med 2 μl 6x laddningsfärgämne. Därefter laddar du 10 μL av provet i gelén och kör det tills det sista bandet av laddningsfärgen sprang för 2/3 av gelén. Se till att lägga till en DNA-stege.
- Avfyra gelén och kontrollera om utstryksstorleken faller inom intervallet för önskad applikation.
Om kromatinet klarar kvalitetskontrollen kan det användas för nedströmsapplikationer.
Representative Results
Beredning av kromatin är ett avgörande steg för att uppnå en framgångsrik ChIP. För att förbereda kromatin av god kvalitet från frysta prover bör vi säkerställa effektiv vävnadsstörning före fixering för att undvika förekomst av vävnadsklumpar som kan hindra effektiv skjuvning. Bild 1 visar en sammanfattad pipeline för protokollet. Pulverisering ensam är inte tillräcklig för att helt dissociera vävnaden eftersom den producerar cellkluster av varierande storlek och få enskilda celler (figur 1a). Genom att associera det första pulveriseringssteget med Dounce-homogenisering reduceras mängden vävnadsklumpar kraftigt och de återstående är mindre (figur 1b). Efter fixerings- och lysstegen ökar antalet synliga enskilda kärnor (figur 1c), medan det typiska sfäriska utseendet går förlorat. Efter ultraljudsbehandling för 28 cykler, nukleär färgning (Hoechst 33258/DAPI) är oftast inte synlig längre. Detta är verkligen ett tecken på framgångsrik klippning (figur 1d). Efter avbindning av en kromatinalikvot och visualisering av DNA på agarosgel kan framgångsrik skjuvning erkännas genom närvaron av fragment i intervallet 100-300 bp. (Figur 2a) Mängden DNA kan variera beroende på sammansättningen av det beredda vävnadsstycket. Sådant kromatin kan framgångsrikt användas för ChIP-qPCR. Som visas i figur 2b kunde kromatinet framgångsrikt fällas ut med H3K4me3, H3K27ac (aktiva genrelaterade modifieringar) och H3K27me3 (tystade gener relaterade till modifiering) antikroppar. Kromosom 1 öppen läsram 43 (C1orf43), proteasom 20S subenhet Beta 2 (PSMB2) och glyceraldehyd 3-fosfatdehydrogenas (mGapdh) promotorregioner resulterade anrikade i H3K4me3 och H3K27ac i jämförelse med Homeobox C13 (HOXC13), Homeobox C12 (HOXC12) och musmyelintranskriptionsfaktor 1 (mMyt1) promotorregioner (tabell 1). Detta beror på att C1orf43, PSMB2 och mGapdh transkriberas konstitutivt i levern, medan HOXC13, HOXC12 och mMyt1 tystas. H3K27me3 visar motsatt beteende som bekräftar framgången för ChIP-analysen. Det faktum att levern hos dessa möss är en chimär, gjorde det möjligt för oss att analysera både murin och humant kromatin. Dessutom kan samma kromatin framgångsrikt användas för ChIP-seq-experiment. Efter sekvenseringssteget justerades läsningarna till ett index bestående av både murina och humana genomer för att minska mängden ojusterade fragment. Därefter separerades läsningarna enligt art och analyserades vidare med EaSeq22 . Signalintensiteten mättes sedan vid transkriptionsstartplatsen (TSS) för varje gen och resultatet sorterades för H3K4me3-signalintensitet. Figur 3a och figur 3c visar både en markant förekomst av H3K4me3 och H3K27ac vid TSS för en betydande del av generna i både muskromatin och humant kromatin. Dessutom antikorrelerar H3K27me3 med H3K4me3/H3K27ac. H3K27me3 finns på hela genens längd och inte bara på TSS, som förväntat från denna PTM. Figur 3b och figur3d visar HOXC/HoxC-klustret som är känt för att vara anrikat för H3K27me3 och transkriptionellt inaktivt i både mus och människa. Profileringen av H3K4me3 och H3K27ac visar toppar för dessa två PTM medan signalintensiteten för H3K27me3 tenderar att vara lägre och mer distribuerad.
På grund av komplexiteten i kromatinberedningen kan överfixering hända, lys eller ultraljudsbehandling kan vara suboptimal, stora cellklumpar kan kvarstå, eller otillräcklig hantering av provet kan vara otillräcklig. Dessa är alla händelser som påverkar kvaliteten på beredningen. I vissa fall kommer anrikningen av kromatinfragment inom rätt storlek fortfarande att vara närvarande eller flyttas till en högre storlek. I andra fall kan det finnas förlust av material på grund av för tidig lys eller misslyckad skjuvning. Figur 4 visar några exempel på sådana negativa och suboptimala resultat. Lane 3 och 4 visar en anrikning av fragmentstorleken mellan 200 bp och 800 bp. Det är dock tydligt att fragmentstorleken sträcker sig från 100 bp till > 10 000 bp. I bana 5 och 6 finns en anrikning i intervallet 100-250 bp med en tydlig materialförlust under beredningen. Detta kan förklara varför ultraljudsbehandling producerade mindre fragment. Bana 7 visar en något suboptimal förberedelse med ökat fragmentområde, medan körfält 8 visar en nästan fullständig förlust av material. Detta kan orsakas av för tidig nukleär lys eller otillräcklig vävnadsdissociation med åtföljande förlust efter steg 5.5.
Figur 1: Översikt över protokoll för kromatinberedning. Bilder togs efter vävnadspulverisering (a), ytterligare manuell homogenisering (b), efter nukleär lys (c) och efter ultraljudsbehandling (före centrifugering) (d). Nukleär färgning utfördes med Hoechst 33258/DAPI. Skalstapel = 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Representativ kromatinskjuvning och dess kvalitet bedömd med ChIP-qPCR . 1% agarosgel med fragmenterade kromatinprover enligt protokoll från olika kromatinpreparat. En kontroll av oklippt kromatin tillsätts för att säkerställa att kromatin/DNA-nedbrytning inte bryts i förväg (a). Skjuvat kromatin har testats för kvalitet genom att utföra en ChIP-qPCR-analys. H3K4me3, H3K27ac och H3K27me3 antikroppar användes för att fälla ut det nyberedda kromatinet. (b ) qPCR-analys utfördes på humana (C1orf43 och PSMB2), murina (Gapdh) aktiva promotorer och humana (HOXC13, HOXC12), murina (Myt1) inaktiva promotorer. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Representativ ChIP-seq-analys. Läsningar har anpassats till ett index skapat med både human- och musgenom (hg19 och mm10). Efter anpassning separerades mänskliga och murina läsningar och analyserades ytterligare. Värmekarta över mänskliga gener där signalen kvantifierades vid TSS och visades i fallande ordning för H3K4me3 intensitet (a). Exempel på humant genkluster av undertryckta gener (HOX-kluster) omgivet av aktiva gener (b). Värmekarta över murina gener där signalen kvantifierades vid TSS och visades i fallande ordning för H3K4me3 intensitet (c). Exempel på ett murint genkluster av undertryckta gener (Hox-kluster) omgivet av aktiva gener (d). All data som visas har normaliserats av EaSeq per miljon läsningar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Suboptimala och misslyckade kromatinpreparat. 1% agarosgel med fragmenterade kromatinprover enligt protokollet. Figuren innehåller oskjuvad kromatin som används som kontroll (Lane 2), inte optimal skjuvning (Lane 3-4), optimal skjuvning med tydlig materialförlust (Lane 5-6), suboptimal skjuvning (Lane 7) och omfattande materialförlust (Lane 8). Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Primer namn | Sekvens | |
| C1orf43 promotor | Framåt | AGTGGGTGGAGAATGCAGAC |
| Omvända | GAGATTACCACCACCCCATTC | |
| PSMB2 promotor | Framåt | CTTATTCAACCCCCGACAAA |
| Omvända | GATGAAGGACGGTGAGAGGA | |
| HOXC13 distal promotor | Framåt | GAGCCCGAGATTCACTCAAC |
| Omvända | TTATGCCCAGTTTTTGGGGTA | |
| HOXC12 distal promotor | Framåt | AAAGCTTCCCACTGCAAAGA |
| Omvända | AAATCTGGGGGCGAACTACT | |
| mGAPDH promotor | Framåt | GGTCCAAAGAGAGGGAGGAG |
| Omvända | GCCCTGCTTATCCAGTCCTA | |
| mMYT-promotor | Framåt | CAGCCCAATTCTAGCCACAT |
| Omvända | CCAAAGCAGGGGAGTAGGAG |
Tabell 1: qPCR-primerlista för aktiva och inaktiva gener som används för ChIP-qPCR-analyser.
Discussion
Kromatinberedning från snapfryst vävnad är fortfarande en utmaning på grund av antalet steg som måste optimeras för att uppnå reproducerbara och tillförlitliga resultat. De flesta av de redan publicerade protokollen16,23 kräver vävnadshackning före manuell dissociation (douncing). Vi försökte undvika steg som kunde provocera proteinnedbrytning före fixeringen av provet så mycket som möjligt. Pulveriseringssteget används redan i frysta leverpreparat24 och gör den manuella dissociationen enklare och reproducerbar (se figur 2a). Med användning av en murbruk speciellt utformad för 1,5 ml rör (se protokoll) reduceras provförlusten under pulveriseringsprocessen, vilket gör det möjligt att bearbeta små mängder vävnad såsom leverbiopsiprover. I princip är det möjligt att använda direkt vävnadshomogenisering utan några slipsteg; Vävnadshomogenisering utan tidigare pulverisering har dock en sämre reproducerbarhet enligt vår erfarenhet och uppkomsten av problem för nedströmsapplikationer var högre (data visas inte).
De flesta av de problem som uppstår vid framställning av kromatin från vävnader härrör från dessa provers natur och oförmågan att kontrollera ordentligt om cellklusterna är tillräckligt små för fixering utan att förlora kvalitet. Dessutom skulle det vara tidskrävande att kontrollera varje alikvot vid varje steg, vilket ökar risken för proteinnedbrytning.
Fixering (steg 3.9) är en grundläggande och avgörande del av kromatinberedningen. På grund av vävnadens natur har fixeringssteget fördröjts tills vävnaden homogeniserades. Ett sådant uppskjutet fixeringssteg har fördelen att producera en mer homogen cellsuspension. Vi inser dock att vid särskilt manipulationskänsliga mål kan det vara nödvändigt att utföra fixeringen strax före steg 3.6. Detta skulle bidra till att skydda extremt känsliga proteiner eller PTM, även om det kan öka storleken på cellkluster, som när de fixeras kan resultera i icke-homogen skjuvning. Koncentrationen av FA-lösningen som används i protokollet är standard, men den kan modifieras för att försöka förbättra den totala fixeringen. Den fixeringstid som valts här återspeglar också standardförhållanden som vanligtvis används i fältet. Vid högre koncentration av fixeringslösningen kan fixeringstiden minskas, medan den vid en lägre mängd bör ökas. Verksamhetsutövaren bör beakta att en ändring av bindningstiden antingen kan leda till överfixering av provet eller ge utrymme för proteinnedbrytning. Om man syftar till att fälla ut stora komplex (eller en del av det) och TF, skulle det vara fördelaktigt att utföra en dubbelstegsfixering med en DSG-lösning följt av en FAen 25,26. DSG skulle i detta fall stabilisera protein-proteininteraktioner, medan formaldehyd verkar mestadels på direkta DNA-proteininteraktioner27.
Verksamhetsutövaren bör ta hänsyn till möjligheten att implementera ett kolonnbaserat kit för DNA-rening från och med steg 6.7 som är snabbare och inte använder giftiga föreningar. Det kommer dock alltid att finnas en viss mängd obundet DNA som kommer att gå förlorat. Av denna anledning föreslår vi att man använder den klassiska fenol-kloroformextraktionen följt av EtOH-utfällning. Dessutom, innan du kör agarosgelen (steg 7.2) kan det vara fördelaktigt att mäta DNA-koncentrationen och ladda samma mängd för varje brunn för att få en tydligare bild.
En begränsning av detta protokoll härrör från det faktum att vi utforskade och använde detta protokoll endast med leverprover härrörande från human-lever chimära möss28. I sig består levern av epitel och bindväv29. Vid sjukdom kan fibrotisk vävnad och fettvävnad vara närvarande30,31 vilket skapar ytterligare utmaningar vid vävnadsavbrott. Vi inser dock att vårt protokoll inte får användas på ben, muskler och fettvävnad utan optimering av dissociation och ultraljudsbehandling steg. Att notera är att varje vävnad kräver någon form av optimering på grund av avsaknaden av ett protokoll som är lämpligt för dem alla, som för cellodlingsprover15. Vi tror dock att med liten eller ingen optimering alls kan detta protokoll framgångsrikt tillämpas på andra vävnader som delar likheter med levern i sammansättning, som lung-, tarm-, mag-, bukspottkörtel- eller njurvävnader.
Vårt protokoll har också framgångsrikt använts för att analysera TF och histonmodifieringar på HBV-kovalent sluten DNA-episom (cccDNA)32. Detta öppnar chansen att tillämpa ett sådant tillvägagångssätt för andra virala genom som påverkar levern, såsom humant cytomegalovirus33 (hCMV) och humant adenovirus34 (HAdV). Det är inte uteslutet att det skulle vara möjligt att analysera andra DNA-virus som etablerar en ihållande infektion i andra vävnader som Kaposis sarkom, herpesvirus35 (KHSV), herpes simplexvirus36 (HSV1/2), polyomavirus, Epstein-Barr-virus37 (EBV).
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Studien stöddes av den tyska forskningsstiftelsen (DFG) av ett bidrag till Maura Dandri (SFB 841 A5) och av delstaten Hamburg med forskningsprogrammet (LFF-FV44: EPILOG).
Vi vill tacka Dr. Tassilo Volz, Yvonne Ladiges och Annika Volmari för den tekniska hjälpen och för kritisk läsning av manuskriptet. Dr. Thomas Günther och Prof. Adam Grundhoff för att ha gett mycket användbara förslag och primeruppsättningarna för ChIP-qPCR-analysen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22µm sterile syringe filter | Labsolute | 7699822 | |
| 1.5 mL Safeseal tubes | Sarstedt | 7,27,06,400 | |
| 6x orange loading dye | Thermofisher | R0631 | |
| Benchtop refrigerated centrifuge | |||
| Bioruptor NGS | Diagenode | ||
| Blade or Scalpel | |||
| Calcium chloride dihydrate | Carl Roth | HN04 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich (Merck) | C2432 | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | |
| Deacetylase Inhibitor | Active Motif | 37494 | |
| Dounce tissue grinder set | Sigma Aldrich (Merck) | DWK885300-0001-1EA | |
| EDTA 500 mM solution | PanReac AppliChem | A4892 | |
| EGTA | Sigma Aldrich (Merck) | E4378 | |
| EtBr | Carl Roth | 2218 | Concentration 10mg/mL |
| Ethanol absolute | CHEMSOLUTE | 2273 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich (Merck) | G9012 | |
| Glycin | Carl Roth | 0079 | |
| Glycogen | Roche | 10901393001 | Concentration: 20mg/mL |
| Heating block | |||
| HEPES | Sigma Aldrich (Merck) | H4034 | |
| LE Agarose | Biozym | 840000 | |
| Liquid nitrogen cooled mini mortar | Bel-Art | H37260-0100 | |
| MeOH free Formaldehyde 16% | Thermofisher | 28908 | |
| NP-40 | Roche | 11332473001 | |
| PBS 1x | Thermofisher | 10010015 | |
| Pefabloc SC-Protease-Inhibitor | Sigma Aldrich (Merck) | 11429868001 | |
| Phase Lock Gel - Heavy | QuantaBio | 2302830 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol 25:24:1 | Sigma Aldrich (Merck) | P3803 | |
| Potassium chloride | Carl Roth | 6781 | |
| Potassium hydroxyde | Merck | 105033 | |
| Proteinase K | Lucigen | MPRK092 | Concentration: 50 µg/µL |
| RNAse A | Lucigen | MRNA092 | Concentration: 5 mg/mL |
| SDS 10% solution | PanReac AppliChem | A3950 | |
| Sodium carbonate anhydrous | Carl Roth | A135 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich (Merck) | S7653 | |
| Sterile Petri dishes | Sarstedt | 83,39,02,500 | |
| Tris-HCl solution | Sigma Aldrich (Merck) | T2694 | |
| Triton-X100 | Sigma Aldrich (Merck) | X100 |
References
- Waddington, C. H., Pantelouris, E. M.
- Silmon de Monerri, N. C., Kim, K. Pathogens hijack the epigenome: A new twist on host-pathogen interactions. American Journal of Pathology. 184 (4), 897-911 (2014).
- Knipe, D. M., et al.
- Tropberger, P., et al. Mapping of histone modifications in episomal HBV cccDNA uncovers an unusual chromatin organization amenable to epigenetic manipulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (42), 5715-5724 (2015).
- Sproul, D., Gilbert, N., Bickmore, W. A. The role of chromatin structure in regulating the expression of clustered genes. Nature Reviews Genetics. 6 (10), 775-781 (2005).
- Fischle, W., Wang, Y., Allis, C. D.
- Ling, X., Harkness, T. A., Schultz, M. C., Fisher-Adams, G., Grunstein, M. Yeast histone H3 and H4 amino termini are important for nucleosome assembly in vivo and in vitro: redundant and position-independent functions in assembly but not in gene regulation. Genes & Development. 10 (6), 686-699 (1996).
- Zhang, L., Eugeni, E. E., Parthun, M. R., Freitas, M. A. Identification of novel histone post-translational modifications by peptide mass fingerprinting. Chromosoma. 112 (2), 77-86 (2003).
- Wang, H., et al. Role of histone H2A ubiquitination in Polycomb silencing. Nature. 431 (7010), 873-878 (2004).
- Hassa, P. O., Haenni, S. S., Elser, M., Hottiger, M. O. Nuclear ADP-ribosylation reactions in mammalian cells: where are we today and where are we going. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 70 (3), 789-829 (2006).
- Dey, B., et al. DNA-protein interactions: methods for detection and analysis. Molecular and Cellular Biochemistry. 365 (1-2), 279-299 (2012).
- Hager, G. L., McNally, J. G., Misteli, T.
- Nagy, Z., Tora, L. Distinct GCN5/PCAF-containing complexes function as co-activators and are involved in transcription factor and global histone acetylation. Oncogene. 26 (37), 5341-5357 (2007).
- Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
- Gunther, T., Theiss, J. M., Fischer, N., Grundhoff, A. Investigation of viral and host chromatin by ChIP-PCR or ChIP-Seq analysis. Current Protocols in Microbiology. 40, 11-21 (2016).
- Cotney, J. L., Noonan, J. P. Chromatin immunoprecipitation with fixed animal tissues and preparation for high-throughput sequencing. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (4), 419 (2015).
- Haim, Y., Tarnovscki, T., Bashari, D., Rudich, A. A chromatin immunoprecipitation (ChIP) protocol for use in whole human adipose tissue. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 305 (9), 1172-1177 (2013).
- Castellano-Castillo, D., et al. Chromatin immunoprecipitation improvements for the processing of small frozen pieces of adipose tissue. PLoS One. 13 (2), 0192314 (2018).
- Savic, D., Gertz, J., Jain, P., Cooper, G. M., Myers, R. M. Mapping genome-wide transcription factor binding sites in frozen tissues. Epigenetics Chromatin. 6 (1), 30 (2013).
- Perna, A., Alberi, L. A. TF-ChIP method for tissue-specific gene targets. Frontiers Cell Neuroscience. 13, 95 (2019).
- Allweiss, L., et al. Proliferation of primary human hepatocytes and prevention of hepatitis B virus reinfection efficiently deplete nuclear cccDNA in vivo. Gut. 67 (3), 542-552 (2018).
- Lerdrup, M., Johansen, J. V., Agrawal-Singh, S., Hansen, K. An interactive environment for agile analysis and visualization of ChIP-sequencing data. Nature Structural & Molecular Biology. 23 (4), 349-357 (2016).
- Perna, A., Alberi, L. A. TF-ChIP Method for Tissue-Specific Gene Targets. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 95 (2019).
- Liang, N., Fan, R., Goni, S., Treuter, E. Preparation of Frozen Liver Tissues for Integrated Omics Analysis. Methods in Molecular Biology. 1951, 167-178 (2019).
- Liu, Z., et al. Proteomic and network analysis of human serum albuminome by integrated use of quick crosslinking and two-step precipitation. Scientific Reports. 7 (1), 9856 (2017).
- Singh, A. A., et al. Optimized ChIP-seq method facilitates transcription factor profiling in human tumors. Life Science Alliance. 2 (1), 201800115 (2019).
- Aoki, T., et al. Bi-functional cross-linking reagents efficiently capture protein-DNA complexes in Drosophila embryos. Fly. 8 (1), 43-51 (2014).
- Allweiss, L., Dandri, M. Experimental in vitro and in vivo models for the study of human hepatitis B virus infection. Journal of Hepatology. 64, 1 Suppl 17-31 (2016).
- Krishna, M.
- Tannapfel, A., et al. Histopathological diagnosis of non-alcoholic and alcoholic fatty liver disease. Virchows Archiv. 458 (5), 511-523 (2011).
- Schuppan, D., Afdhal, N. H.
- Allweiss, L., et al. Therapeutic shutdown of HBV transcripts promotes reappearance of the SMC5/6 complex and silencing of the viral genome in vivo. Gut. , 322571 (2021).
- Gerna, G., Kabanova, A., Lilleri, D. Human cytomegalovirus cell tropism and host cell receptors. Vaccines. 7 (3), (2019).
- Echavarria, M.
- Frohlich, J., Grundhoff, A. Epigenetic control in Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection and associated disease. Seminars in Immunopathology. 42 (2), 143-157 (2020).
- Nicoll, M. P., Proenca, J. T., Efstathiou, S. The molecular basis of herpes simplex virus latency. FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 684-705 (2012).
- Thorley-Lawson, D. A., Hawkins, J. B., Tracy, S. I., Shapiro, M. The pathogenesis of Epstein-Barr virus persistent infection. Current Opinion in Virology. 3 (3), 227-232 (2013).
