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Biology

क्रोमैटिन इम्यूनोप्रेसिपेशन विश्लेषण के लिए जमे हुए चिमेरिक यकृत ऊतक से क्रोमैटिन निष्कर्षण

Published: March 23, 2021 doi: 10.3791/62179
Automatic Translation
1,3, 1, 1,2
1Department of Internal Medicine, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, 2German Center for Infection Research (DZIF), Hamburg-Lübeck-Borstel-Riems site, 3Research Department Virus Immunology, Leibniz Institute for Experimental Virology

Summary

यह प्रोटोकॉल स्नैप जमे हुए ऊतकों से क्रोमैटिन तैयारी पर केंद्रित है और यह क्रॉसलिंकिंग क्रोमैटिन इम्यूनोप्रेसिपेशन (एक्स-सीएचआईपी) के लिए उपयुक्त है, जिसके बाद मात्रात्मक पीसीआर विश्लेषण (एक्स-सीएचआईपी-क्यूपीसीआर) या अगली पीढ़ी के अनुक्रमण दृष्टिकोण (एक्स-सीएचआईपी-सेक) हैं।

Abstract

क्रॉसलिंकिंग क्रोमैटिन इम्यूनोप्रेसिपेशन (एक्स-सीएचआईपी) एक व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली तकनीक है जो मेजबान और / या रोगज़नक़ क्रोमैटिन पर हिस्टोन निशान और प्रतिलेखन कारकों के अधिभोग के स्तर का आकलन करती है। ऊतकों से क्रोमैटिन की तैयारी अतिरिक्त चुनौतियां पैदा करती है जिन्हें सेल संस्कृति के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और विश्वसनीय प्रोटोकॉल प्राप्त करने के लिए दूर करने की आवश्यकता होती है। क्रोमैटिन के कुशल कतरन को प्राप्त करने के लिए ऊतक विघटन और निर्धारण महत्वपूर्ण कदम हैं। विभिन्न सेल प्रकारों और समूहों के सह-अस्तित्व को इष्टतम टुकड़े के आकार तक पहुंचने के लिए अलग-अलग कतरनी समय की आवश्यकता हो सकती है और कतरनी प्रजनन क्षमता में बाधा उत्पन्न होती है। इस विधि का उद्देश्य सीएचआईपी-क्यूपीसीआर और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस) दोनों अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त जमे हुए ऊतक (यकृत) से विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मेजबान क्रोमैटिन तैयारी प्राप्त करना है। हमने देखा कि होमोजेनाइजेशन के बाद तरल नाइट्रोजन ऊतक पुल्वराइजेशन के संयोजन से केवल होमोजेनाइजेशन की तुलना में प्रजनन क्षमता में वृद्धि होती है, क्योंकि यह एक निलंबन प्रदान करता है जिसमें ज्यादातर विघटित एकल कोशिकाएं होती हैं जिन्हें कुशलतापूर्वक कतरनी किया जा सकता है। इसके अलावा, सजातीय क्रॉसलिंकिंग प्रदान करने के लिए निर्धारण चरण हल्के रोटेशन के तहत किया जाना चाहिए। निश्चित सामग्री तब बफर-आधारित नाभिक अलगाव के लिए उपयुक्त है, ताकि साइटोप्लाज्मिक प्रोटीन और रोगज़नक़ डीएनए और आरएनए (जब लागू हो) के संदूषण को कम किया जा सके, समय लेने वाले सेंट्रीफ्यूजेशन ग्रेडिएंट से बचा जा सके। बाद में सोनिकेशन परमाणु लाइसिस को पूरा करेगा और क्रोमैटिन को कतरनी देगा, जो चुने हुए कतरन स्थितियों के अनुसार एक विशिष्ट आकार सीमा का उत्पादन करेगा। एनजीएस अनुप्रयोगों के लिए आकार सीमा 100 और 300 एनटी के बीच होनी चाहिए, जबकि यह सीएचआईपी-क्यूपीसीआर विश्लेषण के लिए अधिक (300-700 एनटी) हो सकती है। इस तरह के प्रोटोकॉल अनुकूलन जमे हुए ऊतक नमूनों से क्रोमैटिन विश्लेषण में काफी सुधार कर सकते हैं।

Introduction

इसकी खोज के बाद से, स्तनधारी कोशिकाओं में एपिजेनेटिक विनियमन ने बढ़ती मान्यता प्राप्त कीहै 1, यह देखते हुए कि इस तरह के तंत्र की समझ न केवल कोशिका जीव विज्ञान में, बल्कि रोग और ट्यूमर जीव विज्ञान में भी महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करेगी। इसके अलावा, संक्रामक एजेंट मेजबान एपिजेनेटिकपरिवर्तन 2 का कारण भी बन सकते हैं जबकि मेजबान सेल मशीनरी रोगजनकों के क्रोमैटिन को भी प्रभावित कर सकती है, जैसे कि डीएनए वायरस 3,4। यह मेजबान-रोगज़नक़ परस्पर क्रिया संक्रमण दृढ़ता में एक भूमिका निभाती है। 2

डीएनए के साथ एक प्रतिवर्ती संबंध के माध्यम से, हिस्टोन प्रोटीन न्यूक्लियोसोम नामक एक परिसर बनाते हैं। न्यूक्लियोसोम बदले में क्रोमैटिन नामक संगठन के एक उच्च स्तर तक पहुंचते हैं। क्रोमैटिन रीमॉडेलिंग जीन अभिव्यक्ति को कसकर विनियमित करने, प्रतिलेखन कारकों (टीएफ) तक पहुंच प्रदान करने या अस्वीकार करने के लिए जाना जाता है। ये कारक या तो जीन प्रमोटरों पर आरएनए पोलीमरेज़ II (पीओएलआईआई) की भर्ती को ट्रिगर या अवरुद्ध कर सकते हैं, डीएनए टेम्पलेट6 से एमआरएनए संश्लेषण को प्रभावित कर सकते हैं। हिस्टोन प्रोटीन में पूंछ7 होते हैं, जो हिस्टोन फोल्ड के दोनों सिरों को फ्लैंक करते हैं, जो पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों (पीटीएम) के अधीन हो सकते हैं, जिससे संरचनात्मक क्रोमैटिन परिवर्तनों द्वारा जीन प्रतिलेखन के तंग विनियमन की अनुमति मिलती है। अधिकांश हिस्टोन पीटीएम पूंछ एन-टर्मिनस पर स्थित हैं, जिसमें एसिटिलीकरण और मिथाइलेशन सबसे अच्छा अध्ययन किए गए पीटीएम हैं, हालांकि फॉस्फोराइलेशन8, सर्वव्यापी9 और राइबोसिलेशन10 भी रिपोर्ट किए गए हैं। जीन विनियमन में गहरी अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए ऐसे प्रोटीन ों की विशेषता और अध्ययन करना आवश्यक है।

वर्तमान में, प्रत्यक्ष डीएनए-प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए कुछ अच्छी तरह से स्थापित तरीके और उपकरण उपलब्ध हैं: इलेक्ट्रोफोरेटिक मोबिलिटी शिफ्ट परख (ईएमएसए), खमीर एक-हाइब्रिड परख (वाई 1 एच) और डीएनए फुटप्रिंटिंग11। हालांकि, ये विधियां एकल डीएनए-प्रोटीन इंटरैक्शन पर ध्यान केंद्रित करती हैं और जीनोम-व्यापक अध्ययन के लिए लागू नहीं होती हैं। उन तकनीकों की एक और सीमा डीएनए खंडों की जांच के साथ हिस्टोन एसोसिएशन की कमी है। इस प्रकार, इस तरह के दृष्टिकोण विवो में ट्रांसक्रिप्शनल मशीनरी की जटिलता को प्रतिबिंबित करने के लिए नहीं हैं और वे महत्वपूर्ण संरचनात्मक परिवर्तनों12 या अन्य आवश्यक एंजाइमों / कोफ़ैक्टर्स13 को ध्यान में नहीं रखते हैं जो डीएनए को प्रोटीन बाइंडिंग को प्रभावित (या तो बढ़ावा दे सकते हैं या बाधित कर सकते हैं)।

यह विचार कि फॉर्मलाडेहाइड (एफए) जैसे एजेंटों के साथ कोशिकाओं को ठीक करना प्रोटीन-डीएनए इंटरैक्शन का एक इनविवो स्नैपशॉट प्रदान कर सकता है, ने क्रोमैटिन इम्यूनोप्रेसिटेशन एसेस (सीएचआईपी) 14 के विकास के लिए आधार बनाया। यह, मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर) तकनीक और अत्यधिक विशिष्ट एंटीबॉडी की उपलब्धता के साथ, सीएचआईपी-क्यूपीसीआर परख के विकास की अनुमति देता है। इसके बाद, अगली पीढ़ी की अनुक्रमण तकनीकों (एनजीएस) के आगमन, जिनकी लागत अधिक किफायती हो रही है, ने एनजीएस दृष्टिकोण (सीएचआईपी-सेक) के साथ कुछ सीएचआईपी प्रयोगों को स्वीकार किया, इस प्रकार शोधकर्ताओं को क्रोमैटिन विनियमन की जांच को सक्षम करने वाले नए शक्तिशाली उपकरण प्रदान किए। इन परखों में, पृथक या सुसंस्कृत कोशिकाओं को डिसुसिनिमिडिल ग्लूटारेट (डीएसजी) और / या एफए के साथ तय किया जाता है, नाभिक को अलग किया जाता है, क्रोमैटिन को तब खंडित किया जाता है और रुचि के एंटीबॉडी द्वारा अवक्षेपित किया जाता है। इसके बाद, पीसीआर या एनजीएस दृष्टिकोण द्वारा डीएनए को शुद्ध और विश्लेषण किया जाता है। ईएमएसए, वाई 1 एच और डीएनए पदचिह्न के विपरीत, सीएचआईपी परख में सेल के भीतर प्रोटीन-डीएनए इंटरैक्शन का वैश्विक स्नैपशॉट प्रदान करने की क्षमता है। यह लचीलापन प्रदान करता है और एक ही नमूने के भीतर कई लोकी के विश्लेषण की अनुमति देता है। हालांकि, परख की प्रकृति के कारण, सीएचआईपी, अंततः, न केवल प्रत्यक्ष इंटरैक्शन का पता लगा सकता है, बल्कि अप्रत्यक्ष भी हो सकता है, जब प्रत्यक्ष प्रोटीन-डीएनए इंटरैक्शन में रुचि रखते हैं, तो उपर्युक्त विधियों की सटीकता की पेशकश नहीं करते हैं।

सेल कल्चर सामग्री से क्रोमैटिन तैयारी प्रोटोकॉल अच्छी तरह से स्थापित15 और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं, जिससे उपयोगकर्ता को 1-2 कार्य दिवसों में क्यूपीसीआर और एनजीएस दोनों दृष्टिकोणों के लिए उपयुक्त क्रोमैटिन प्राप्त करने की अनुमति मिलती है। हालांकि, पूरे ऊतकों से उच्च गुणवत्ता वाले क्रोमैटिन प्राप्त करना अभी भी एक चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है क्योंकि क्रोमैटिन के इष्टतम निर्धारण और कतरनी को प्राप्त करते हुए ऊतक के भीतर कोशिकाओं को अलग करने की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, अलग-अलग प्रकार के ऊतकों की संरचना और आकृति विज्ञान भिन्न होते हैं, इस प्रकार मौजूदा प्रोटोकॉल16,17 के समायोजन की आवश्यकता होती है। क्रायोसंरक्षित ऊतक का उपयोग ताजा नमूनों की तुलना में अतिरिक्त चुनौतियां प्रदान करता है। यह व्यापक सामग्री हानि के बिना एकल सेल निलंबन प्राप्त करने की कठिनाई के कारण है। इससे अनुचित कतरनी होती है, डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों में बाधा आती है। बहरहाल, ताजा समकक्ष के बजाय जमे हुए ऊतक नमूनों तक पहुंचने से न केवल काम का लचीलापन बढ़ता है, बल्कि यह अनुदैर्ध्य या तुलनात्मक अध्ययन से उत्पन्न नमूनों के साथ काम करने वाले शोधकर्ताओं के लिए एकमात्र विकल्प का भी प्रतिनिधित्व कर सकता है। जमे हुए ऊतक के लिए मुट्ठी भर क्रोमैटिन तैयारी प्रोटोकॉल प्रकाशित किए गए हैं। ये ज्यादातर नमूना पिघलने पर आधारित होते हैं, जिसके बाद मिनिंग, मैनुअल / मशीन-आधारित पृथक्करण या तरल नाइट्रोजन पुल्वराइजेशन चरण18,19,20 होते हैं।

यहां हम जमे हुए अनिर्धारित यकृत नमूनों के लिए एक अनुकूलित क्रोमैटिन तैयारी विधि15 का वर्णन करते हैं, जो वायरल और मेजबान जीनोम दोनों का विश्लेषण करने के उद्देश्य से एक्स-सीएचआईपी दृष्टिकोण ों के लिए उपयुक्त प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य क्रोमैटिन कतरनी प्राप्त करने के लिए तरल नाइट्रोजन में ऊतक पुल्वराइजेशन को पेस्टल होमोजेनाइजेशन के साथ जोड़ता है।

Protocol

मानव यकृत चिमेरिक चूहों21 से ऊतक का नमूना यूरोपीय संघ के निर्देश 86/609 / ईईसी के अनुसार किया गया था और हेलसिंकी की घोषणा के सिद्धांतों के अनुसार शहर और हैम्बर्ग राज्य की नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. अभिकर्मकों की तैयारी

  1. विआयनीकृत पानी में 1.25 एम ग्लाइसिन घोल तैयार करें। 0.22 μm छिद्र आकार के फिल्टर के साथ बाँझ फ़िल्टर। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. 5 एम सोडियम क्लोराइड (NaCl) घोल तैयार करें। कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
  3. CaCl2 समाधान तैयार करें: विआयनीकृत पानी में 300 mM CaCl2 और 10 mM Tris-HCl pH 8। 0.22 μm छिद्र आकार के फ़िल्टर के साथ बाँझ फ़िल्टर और RT पर स्टोर करें।
  4. विआयनीकृत पानी में 10% ट्राइटन एक्स -100 तनुकरण तैयार करें। आरटी पर स्टोर करें।
  5. ट्रिस-ईडीटीए बफर तैयार करें: विआयनीकृत पानी में 1 एमएम ईडीटीए और 10 एमएम ट्रिस पीएच 8। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  6. आवश्यक राशि के अनुसार निम्नलिखित बफर तैयार करें:
    1. बफर ए तैयार करें: 50 एमएम हेप्स-कोह पीएच 7.5, 140 एमएम एनएसीएल, 1 एमएम एथिलीनडायमाइनटेट्राएसिटिक एसिड (ईडीटीए), 10% ग्लिसरॉल, 0.5% एनपी -40 और 0.25% ट्राइटन एक्स -100 विआयनीकृत पानी में। 0.22 μm छिद्र आकार के फिल्टर के साथ बाँझ फ़िल्टर। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. बफर बी तैयार करें: 10 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8, 200 एमएम एनएसीएल, 1 एमएम ईडीटीए, 0.5 एमएम एग्टाजिक एसिड (ईजीटीए)। 0.22 μm छिद्र आकार के फिल्टर के साथ बाँझ फ़िल्टर। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    3. बफर सी तैयार करें: विआयनीकृत पानी में 1% एसडीएस, 10 एमएम ईडीटीए और 50 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8। 0.22 μm छिद्र आकार के फिल्टर के साथ बाँझ फ़िल्टर। आरटी पर स्टोर करें।
    4. क्रोमैटिन तनुकरण बफर तैयार करें: विआयनीकृत पानी में 0.01% एसडीएस, 1.1% ट्राइटन एक्स -100, 1.2 एमएम ईडीटीए, 16.6 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8 और 166 एमएम एनएसीएल। 0.22 μm छिद्र आकार के फिल्टर के साथ बाँझ फ़िल्टर। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. सामग्री तैयार करना

  1. सूखी बर्फ, बर्फ, और तरल नाइट्रोजन इकट्ठा करें।
    सावधानी: जलने से बचने के लिए आवश्यक देखभाल के साथ सूखी बर्फ और तरल नाइट्रोजन को संभालें।
  2. सेंट्रीफ्यूज को 4 डिग्री सेल्सियस पर प्री-ठंडा करें।
    नोट: यह कदम धोने के चरणों के दौरान प्रोटीन क्षरण और डी-क्रॉसलिंकिंग से बचने के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि यह क्रोमैटिन की गुणवत्ता को कम कर देगा।
  3. सूखी बर्फ पर एक बाँझ प्लेट रखें और इसे ठंडा होने दें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि प्लेट काटने की प्रक्रिया को सुविधाजनक बनाने के लिए पर्याप्त बड़ी है। सेल कल्चर डिश की सिफारिश की जाती है।
  4. ग्लाइसिन 1.25 एम का आवश्यक एलिकोट निकालें और इसे आरटी तक पहुंचने दें।
  5. बफर ए, बी और पीबीएस के आवश्यक एलिकोट निकालें। 1 गुना एकाग्रता तक पहुंचने के लिए प्रोटीज और / या डेसेटाइलेज़ और फॉस्फेट इनहिबिटर जोड़ें और उन्हें बर्फ पर छोड़ दें।
  6. इसे आरटी पर छोड़कर बफर सी का आवश्यक एलिकोट निकालें। निर्दिष्ट होने तक प्रोटीज और / या डेसेटाइलेज़ और फॉस्फेट इनहिबिटर न जोड़ें।
  7. आरटी पीबीएस का आवश्यक एलिकोट निकालें।
    सावधानी: बफर सी में सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) होता है। बफर तैयार करते समय उचित सुरक्षा उपायों को अपनाएं।
    नोट: एसडीएस बर्फ पर अवक्षेपित होता है, और प्रोटीज और डेसेटाइलेज़ अवरोधक आरटी पर स्थिर नहीं होते हैं।
  8. आपूर्तिकर्ता निर्देशों का सख्ती से पालन करते हुए, अपने कक्ष में तरल नाइट्रोजन डालने वाले मोर्टार को प्री-ठंडा करें। धातु के मूसल को कम से कम 5 मिनट के लिए सूखी बर्फ में ठंडा करें।
    नोट: प्रस्तावित मोर्टार के लिए एक वैकल्पिक मोर्टार का उपयोग करना संभव है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाने वाला उपकरण, इसके अजीब निर्माण के कारण, फुफ्फुसप्रक्रिया के दौरान पर्याप्त नुकसान के बिना ऊतक की छोटी मात्रा के साथ काम करने की अनुमति देता है।
  9. बर्फ पर संबंधित मूसल ए के साथ डोंस होमोजिनाइज़र को प्री-चिल करें।
    नोट: पेस्टल ए में होमोजिनाइज़र के साथ एक ढीला फिट है। यह महत्वपूर्ण सेल लाइसिस के बिना एकल सेल निलंबन प्राप्त करने की अनुमति देता है।

3. ऊतक क्रॉसलिंकिंग

  1. स्केलपेल और चिमटी की मदद से सूखी बर्फ पर सीधे डिश पर लगभग 50 मिलीग्राम जमे हुए ऊतक को काटें।
    नोट: स्केलपेल को आरटी पर रखने का सुझाव दिया जाता है, क्योंकि इससे काटने की प्रक्रिया आसान हो जाएगी। स्केलपेल पर बहुत अधिक दबाव डालने से बचें, क्योंकि इससे काटने वाले क्षेत्र के बाहर ऊतक के टुकड़े बिखरने का खतरा बढ़ जाएगा। ध्यान दें, 50 मिलीग्राम ऊतक (इस मामले में यकृत) को लगभग 5 मिलियन कोशिकाओं का उत्पादन करना चाहिए। ध्यान दें कि गर्म ब्लेड काटने के किनारे को पिघला देगा। ऊतक के टुकड़े के अपेक्षाकृत बड़े आकार को ध्यान में रखते हुए, हालांकि, इसका सीमित प्रभाव होना चाहिए। जब छोटे टुकड़े काटे जाते हैं, तो ऊतक के बिखरने से बचने के लिए ध्यान देने वाले ठंडे स्केलपेल का उपयोग करना फायदेमंद हो सकता है।
  2. कटे हुए ऊतक को सूखी बर्फ पर पहले से ठंडा 1.5 एमएल ट्यूब में रखें। ऊतक पिघलने से बचें।
  3. ऊतक युक्त ट्यूब को मोर्टार में ले जाएं, इसे 5 मिनट के लिए वहां बैठने दें।
    नोट: मोर्टार में नमूना आराम करने से इसका तापमान कम हो जाता है (-80 डिग्री सेल्सियस से -196 डिग्री सेल्सियस तक)। यह इसकी कठोरता को बढ़ाता है और पुल्वराइजेशन चरण को आसान बनाता है।
  4. पूर्व-ठंडा मूसल की मदद से नमूने पर दबाव लागू करें जब तक कि कोई और ठोस उखड़ न दिखाई दे।
    नोट: अत्यधिक घूर्णी बलों द्वारा मूसल हीटिंग से बचना महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह नमूने को पिघला देगा। प्रत्येक नमूना पुल्वराइजेशन के बाद मूसल को 70% इथेनॉल (ईटीओएच) के साथ साफ करें और इसे सूखी बर्फ पर फिर से ठंडा होने दें।
  5. मोर्टार से नमूने वाली ट्यूब को हटा दें और आवश्यक अवरोधकों के साथ बर्फ-ठंडे पीबीएस के 950 μL जोड़ें। पिपेट धीरे से ऊपर और नीचे जब तक नमूना पूरी तरह से पुन: निलंबित न हो जाए। चरण 3.6 पर तुरंत आगे बढ़ें।
  6. ऊतक निलंबन को होमोजिनाइज़र में स्थानांतरित करें और एक बेहतर निलंबन प्राप्त करने के लिए मूसल ए के साथ 20-30 स्ट्रोक लागू करें। झाग से बचें।
    नोट: ऊतक संयोजन के अनुसार स्ट्रोक की मात्रा को अनुकूलित किया जाना चाहिए। यह चरण फुफ्फुसीकरण के बाद प्राप्त कोशिकाओं के छोटे समूहों को अलग करता है। एक अनुचित समरूपीकरण कतरनी दक्षता को प्रभावित कर सकता है।
  7. होमोजेनेट को एक नई 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें, जो पहले से ही बर्फ पर ठंडा है।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,300 x g पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरने वाले को सावधानीपूर्वक हटा दें।
  9. कोमल पाइपिंग द्वारा आरटी पीबीएस के 950 μL में गोली को पूरी तरह से निलंबित करें और 1% अंतिम एकाग्रता रखने के लिए 16% MeOH-मुक्त एफए के 63.6 μL जोड़ें। चरण 3.10 के लिए तुरंत आगे बढ़ें।
    सावधानी: एफए एक विषाक्त रसायन है। उचित सुरक्षा उपायों के साथ इसे फ्यूम हुड के तहत संभालें।
    नोट: अपूर्ण पुन: निलंबन निर्धारण चरण के दौरान सेल एकत्रीकरण को उत्तेजित कर सकता है। यह लाइसिस और कतरनी प्रक्रिया में बाधा डालता है।
  10. RT पर 10 मिनट घुमाएं। फिर तुरंत चरण 3.11 पर आगे बढ़ें।
    नोट: समुच्चय से बचने के लिए रोटेशन आवश्यक है। निर्धारण के लिए आवश्यक समय की मात्रा को ब्याज के लक्ष्य और नमूना प्रकार के अनुसार अनुकूलित किया जाना चाहिए। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि अत्यधिक निर्धारण समय उचित सुनवाई में बाधा डाल सकता है।
  11. 125 एमएम अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए आरटी में 1.25 एम ग्लाइसिन के 113 μL जोड़ें और 5 मिनट के लिए घुमाएं।
    नोट: ग्लाइसिन ओवर-क्रॉसलिंकिंग से बचने वाली फिक्सेटिव प्रतिक्रिया को बुझाता है।
  12. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 1,300 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
  13. सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें और आवश्यक अवरोधकों के साथ बर्फ-ठंडे पीबीएस के 950 μL में पाइपिंग करके गोली को सावधानीपूर्वक पुन: निलंबित करें।
  14. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 1,300 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
  15. चरण 3.13-3.14 दोहराएं और क्रोमैटिन अलगाव चरणों के लिए तुरंत आगे बढ़ें।

4. क्रोमैटिन अलगाव

  1. गोली में आवश्यक अवरोधकों के साथ बफर ए के 950 μL जोड़ें। गोली को पूरी तरह से निलंबित होने तक पाइप करके धीरे से मिलाएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट घुमाएं।
    नोट: यह चरण नाभिक लाइसिस के बिना निश्चित एकल कोशिका निलंबन को रोकता है। यह साइटोसोलिक प्रोटीन और आरएनए के नमूने से छुटकारा पाने की अनुमति देता है। लयसिस समय को लम्बा करना कठिन-से-लाइज़ कोशिकाओं के लिए फायदेमंद हो सकता है, हालांकि, ऊतक के हैंडलिंग समय में वृद्धि हो सकती है। इस बिंदु पर समूहों के आकार और एकल कोशिकाओं की उपस्थिति की जांच करने के लिए ट्राइपैन ब्लू / डीएपीआई धुंधला होने के बाद माइक्रोस्कोप के तहत तैयारी की जांच करना संभव है। हालांकि, निश्चित ऊतक सामग्री के कारण एकल नाभिक की सराहना करना आसान नहीं हो सकता है।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 2,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरने वाले को सावधानीपूर्वक हटा दें।
  3. गोली में आवश्यक अवरोधकों के साथ बफर बी के 950 μL जोड़ें। गोली को पूरी तरह से निलंबित होने तक पाइप करके धीरे से मिलाएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट घुमाएं।
    नोट: यह कदम आगे अवांछित लाइसिस से बचने के लिए नाभिक की तैयारी से लाइसिस बफर को धोता है।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 2000 x g पर सेंट्रीफ्यूज। इस बीच, बफर सी में आवश्यक अवरोधक (चरण 2.5 के समान) जोड़ें।
  5. सुपरनैटेंट को सावधानी से हटा दें।
  6. पेलेट और पिपेट में 300 μL RT बफर C जोड़ें।
  7. नमूने को 15-30 सेकंड के लिए भंवर करें और ढक्कन पर बूंदों को इकट्ठा करने के लिए ट्यूब को संक्षेप में घुमाएं।
    नोट: यह कदम निश्चित नाभिक को मुक्त करने और स्थिर करने के लिए महत्वपूर्ण है। नमूना अखंडता को संरक्षित करने के लिए और एक ही समय में एसडीएस वर्षा से बचने के लिए 9-11 डिग्री सेल्सियस के तापमान को बनाए रखने के लिए बर्फ पर रखे प्लास्टिक रैक में सोनिकेशन से पहले नमूना रखें।

5. क्रोमैटिन विखंडन

  1. नमूने को तीन साफ 0.65 एमएल सोनिकेशन-प्रमाणित ट्यूबों में स्थानांतरित करें, जो प्रति ट्यूब 100 μL लाइसेड नाभिक निलंबन सुनिश्चित करता है।
    नोट: 300 μL की अधिकतम मात्रा के साथ 1.5 mL सोनिकेशन-प्रमाणित ट्यूबों का उपयोग करना संभव है। उन ट्यूबों के लिए एक विशिष्ट धारक की आवश्यकता होती है। प्रति ट्यूब नमूने की छोटी मात्रा के कारण 0.65 एमएल को अधिक सजातीय कतरनी की पेशकश करनी चाहिए।
  2. 30 एस ऑन और 30 एस ऑफ सेटिंग के साथ उच्च तीव्रता पर 28 चक्रों के लिए क्रोमैटिन को सोनिकेट करें। सुनिश्चित करें कि सोनिकेटर स्नान ठीक से ठंडा है (बर्फ या शीतलन उपकरण)।
    नोट: इस चरण को लगभग हर मामले में अनुकूलन की आवश्यकता है। उपयोगकर्ता को यह ध्यान रखना चाहिए कि कतरनी समय बढ़ाने से छोटे और अधिक सजातीय टुकड़े मिलेंगे; हालांकि, इससे क्रोमैटिन की गुणवत्ता कम होने का मौका बढ़ सकता है। आवश्यक टुकड़ा आकार प्रदान करने वाले चक्रों की सबसे कम संख्या चुनें। इस चरण के अनुकूलन के दौरान, यह जांचने के लिए परमाणु धुंधला प्रदर्शन करना उपयोगी है कि चक्रों की संख्या नाभिक के बहुमत को स्थिर करने के लिए पर्याप्त थी या नहीं।
  3. सोनिकेटेड क्रोमैटिन को एक नए 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें जो पहले बर्फ पर ठंडा था।
  4. ट्राइटन एक्स -100 के 30 μL 10% समाधान और 5-10 s के लिए भंवर जोड़ें।
    नोट: ट्राइटन एक्स -100 एसडीएस को बांधता है जो 4 डिग्री सेल्सियस पर आगे वर्षा को रोकता है। ट्राइटन एक्स -100 की अंतिम राशि हमेशा 1% होनी चाहिए।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 16,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
  6. सतह पर तैरनेवाला को बर्फ पर पहले से ठंडा 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  7. नोट: सतह पर तैरने वाले में कतरनी क्रोमैटिन होता है और स्पष्ट दिखाई देना चाहिए। गोली में "कतरने योग्य नहीं" आराम होता है और इसे काफी छोटा रहना चाहिए (यकृत ऊतक के मामले में ज्यादातर भूरा)। असफल कतरनी के संकेत की तलाश करें: क्रोमैटिन समाधान जो स्पष्ट नहीं हुआ और चरण 4.5 से समान गोली आयाम।

6. डीएनए शुद्धिकरण

  1. कतरनी क्रोमैटिन के 10-25 μL को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें और 200 μL की अंतिम मात्रा तक पहुंचने के लिए बफर सी जोड़ें। आगे के उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर बाकी क्रोमैटिन स्टोर करें। यदि आवश्यक हो, तो प्रक्रिया को इस चरण में बाधित किया जा सकता है और नमूना -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. 5 M NaCl के 8 μL जोड़ें और 1000 RPM पर हिलाने के तहत हीटिंग ब्लॉक में 65 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 6 घंटे इनक्यूबेट करें।
    नोट: यह चरण क्रोमैटिन को डी-क्रॉसलिंक करता है। जब संभव हो तो रात भर डी-क्रॉसलिंकिंग का विस्तार करना सुरक्षित है। NaCl की उपस्थिति प्रक्रिया को और अधिक कुशल बनाती है।
  3. नमूने को 5 मिनट के लिए आरटी पर ठंडा होने दें और 2 μL RNase A जोड़ें।
  4. 1000 आरपीएम पर झटकों के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  5. हीटिंग ब्लॉक से नमूने निकालें और 300 mM CaCl 2 के 7 μL और Proteinase K के2 μL जोड़ें।
  6. हीटिंग ब्लॉक को 56 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें और 1000 आरपीएम पर झटकों के तहत 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। इस बीच प्रत्येक नमूने के लिए एक चरण-पृथक्करण ट्यूब तैयार करें, उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 16,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करके।
    नोट: ये विशेष ट्यूब न्यूक्लिक एसिड फिनोल-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण के दौरान चरण पृथक्करण को आसान बनाते हैं।
  7. ट्यूबों को हीटिंग ब्लॉक से निकालें और उन्हें 3 मिनट के लिए आरटी पर बराबर होने दें।
  8. नमूने के 400 μL को पहले से सेंट्रीफ्यूज चरण-पृथक्करण ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  9. फिनोल-क्लोरोफॉर्म-आइसोमाइल अल्कोहल समाधान (पीसीआई) के 400 μL जोड़ें और 5 सेकंड के लिए भंवर जोड़ें।
    सावधानी: पीसीआई एक अत्यधिक अस्थिर और विषाक्त यौगिक है। कृपया इसे फ्यूम हुड के तहत आवश्यक सुरक्षा उपायों के साथ संभालें।
  10. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 16,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
  11. 5 सेकंड के लिए क्लोरोफॉर्म और भंवर के 400 μL जोड़ें।
    चेतावनी: क्लोरोफॉर्म एक अत्यधिक अस्थिर और विषाक्त यौगिक है। कृपया इसे फ्यूम हुड के तहत आवश्यक सुरक्षा उपायों के साथ संभालें।
    नोट: यह कदम फिनोल के संभावित अवशेषों को धोता है, जो डाउनस्ट्रीम पीसीआर अनुप्रयोगों में हस्तक्षेप कर सकता है।
  12. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 16,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
  13. ऊपरी चरण के 400 μL को एक नई 1.5 mL ट्यूब में स्थानांतरित करें जहां 5 M NaCl के 24 μL और 0.75 μL ग्लाइकोजन जोड़े गए थे। संक्षेप में भंवर।
  14. 1,055 μL 100% EtOH और भंवर को अच्छी तरह से जोड़ें। उचित मिश्रण सुनिश्चित करें।
  15. 1 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर या रात भर -20 डिग्री सेल्सियस (ओएन) पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: यह कदम कतरनी डीएनए को अवक्षेपित करता है; उपज को अधिकतम करने के लिए ओएन इनक्यूबेशन चुनने का सुझाव दिया जाता है।
  16. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 16,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
  17. गोली को अव्यवस्थित न करने पर ध्यान देते हुए सतह पर तैरनेवाले को सावधानी पूर्वक हटा दें।
  18. ठंडा 70% ईटीओएच के 500 μL जोड़ें। गोली को धोने के लिए ट्यूब को धीरे से झुकाएं।
    नोट: यह कदम नमक अवशेषों को हटाने के लिए आवश्यक है जो न्यूक्लिक एसिड के साथ सह-अवक्षेपित हो सकते हैं। लवण अन्य डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों में हस्तक्षेप कर सकते हैं।
  19. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 16,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
  20. पूरे सुपरनैटेंट को सावधानी से हटा दें और आरटी पर गोली को सूखने दें।
    नोट: 37 डिग्री सेल्सियस पर हीटिंग ब्लॉक पर ट्यूब को इंजेक्ट करने से सुखाने के लिए आवश्यक समय कम हो जाएगा।
  21. ट्रिस-ईडीटीए समाधान (टीई-बफर) के 50 μL जोड़ें और ट्यूब को 300 आरपीएम पर हिलाने के तहत 5-10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर हीटिंग ब्लॉक पर रखें।
    नोट: यह चरण गोली विघटन सुनिश्चित करता है। प्रोटोकॉल को यहां रोका जा सकता है, और नमूना 1 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर या लंबे समय तक भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  22. 1% Agarose जेल पर डीएनए विश्लेषण करें।

7. डीएनए आकार विश्लेषण

  1. प्रति 100 एमएल रनिंग बफर (यानी, ट्रिस-एसीटेट-ईडीटीए (टीएई) या ट्रिस-बोरेट-ईडीटीए (टीबीई)) में 1 ग्राम एगारोस को मिलाकर 1% एगारोस जेल तैयार करें। सस्पेंशन को तब तक गर्म करें जब तक कि अगारोस पूरी तरह से घुल न जाए। जेल घोल डालने से पहले प्रत्येक 100 मिलीलीटर एगारोस समाधान के लिए 10 μL EtBr जोड़ें।
    चेतावनी: ईटीबीआर एक डीएनए इंटरकैलेटिंग एजेंट है जिसे कार्सिनोजेनिक माना जाता है। कृपया इसे फ्यूम हुड के तहत आवश्यक सुरक्षा उपायों के साथ संभालें।
    नोट: ईटीबीआर धुंधला (सीधे जेल में या रन के बाद) दृढ़ता से सुझाव दिया जाता है। डीएनए स्मीयर के साथ काम करते समय अन्य डीएनए-इंटरकैलेटिंग रंगों ने हमारे हाथों में अच्छा प्रदर्शन नहीं किया। व्यापक लोगों की तुलना में संकीर्ण लोडिंग कुएं बेहतर रिज़ॉल्यूशन प्रदान करते हैं।
  2. नमूने के 10 μL को 6x लोडिंग डाई के 2 μL के साथ मिलाएं। इसके बाद, जेल में नमूने के 10 μL लोड करें और इसे तब तक चलाएं जब तक कि लोडिंग डाई का अंतिम बैंड जेल के 2/3 भाग के लिए न चले। एक डीएनए सीढ़ी जोड़ना सुनिश्चित करें।
  3. जेल की छवि बनाएं और सत्यापित करें कि क्या स्मीयर का आकार वांछित आवेदन के लिए सीमा में आता है।
    यदि क्रोमैटिन गुणवत्ता नियंत्रण पास करता है, तो इसका उपयोग डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है।

Representative Results

क्रोमैटिन तैयार करना एक सफल CHIP प्राप्त करने में एक महत्वपूर्ण कदम है। जमे हुए नमूनों से अच्छी गुणवत्ता वाले क्रोमैटिन तैयार करने के लिए, हमें ऊतक झुरमुट की उपस्थिति से बचने के लिए निर्धारण से पहले कुशल ऊतक व्यवधान सुनिश्चित करना चाहिए जो कुशल कतरनी में बाधा डाल सकता है। चित्रा 1 प्रोटोकॉल की एक सारांशित पाइपलाइन दिखाता है। ऊतक को पूरी तरह से अलग करने के लिए अकेले फुफ्फुसीकरण पर्याप्त नहीं है क्योंकि यह चर आकार और कुछ एकल कोशिकाओं के सेल क्लस्टर का उत्पादन करता है (चित्रा 1 ए)। पहले फुफ्फुसीकरण चरण को डॉस होमोजेनाइजेशन के साथ जोड़ते हुए, ऊतक-झुरमुट की मात्रा दृढ़ता से कम हो जाती है और शेष छोटे होते हैं (चित्रा 1 बी)। निर्धारण और लाइसिस चरणों के बाद, दृश्यमान एकल नाभिक (चित्रा 1 सी) की संख्या बढ़ जाती है, जबकि विशिष्ट गोलाकार उपस्थिति खो जाती है। 28 चक्रों के लिए सोनिकेशन के बाद, परमाणु धुंधलापन (Hoechst 33258 / DAPI) ज्यादातर अब दिखाई नहीं देता है। यह वास्तव में सफल सुनवाई का संकेत है (चित्रा 1 डी)। क्रोमैटिन एलिकोट के डी-क्रॉसलिंकिंग और अगारोस जेल पर डीएनए के विज़ुअलाइज़ेशन के बाद, सफल कतरनी को 100-300 बीपी की सीमा में टुकड़ों की उपस्थिति से पहचाना जा सकता है। इस तरह के क्रोमैटिन को CHIP-qPCR के लिए सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया जा सकता है। जैसा कि चित्रा 2 बी में दिखाया गया है, क्रोमैटिन को एच 3 के 4 एम 3, एच 3 के 27 एसी (सक्रिय जीन से संबंधित संशोधन) और एच 3 के 27 एम 3 (मौन जीन से संबंधित संशोधन) एंटीबॉडी के साथ सफलतापूर्वक अवक्षेपित किया जा सकता है। क्रोमोसोम 1 ओपन रीडिंग फ्रेम 43 (सी1ओआरएफ43), प्रोटीसम 20एस सबयूनिट बीटा 2 (पीएसएमबी2) और ग्लिसराल्डिहाइड 3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज (एमगैपध) प्रमोटर क्षेत्रों के परिणामस्वरूप होमोबॉक्स सी13 (एचओएक्ससी13), होमोबॉक्स सी12 (एचओएक्ससी12) और माउस माइलिन ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर 1 (एमवाईटी1) प्रमोटर क्षेत्रों की तुलना में एच3के4एमई3 और एच3के27एसी में समृद्ध हुए। ऐसा इसलिए है क्योंकि C1orf43, PSMB2 और mGapdh को यकृत में संवैधानिक रूप से स्थानांतरित किया जाता है, जबकि HOXC13, HOXC12 और mMyt1 को चुप करा दिया जाता है। H3K27me3 CHIP परख की सफलता की पुष्टि करने वाले विपरीत व्यवहार को दर्शाता है। तथ्य यह है कि इन चूहों का यकृत एक चिमेरा है, जिससे हमें मुराइन और मानव क्रोमैटिन दोनों का विश्लेषण करने की अनुमति मिली। इसके अलावा, एक ही क्रोमैटिन को CHIP-seq प्रयोगों के लिए सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया जा सकता है। अनुक्रमण चरण के बाद, रीड को एक सूचकांक के साथ संरेखित किया गया था जो मुराइन और मानव जीनोम दोनों से बना था ताकि असंरेखित टुकड़ों की मात्रा को कम किया जा सके। इसके बाद, प्रजातियों के अनुसार अलग किया गया और ईसेक22 के साथ आगे विश्लेषण किया गया। सिग्नल की तीव्रता को तब प्रत्येक जीन के ट्रांसक्रिप्शन स्टार्ट साइट (टीएसएस) पर मापा गया था और परिणाम एच 3 के 4 एम 3 सिग्नल तीव्रता के लिए क्रमबद्ध किया गया था। चित्रा 3 ए और चित्रा 3 सी माउस और मानव क्रोमैटिन दोनों के भीतर जीन के काफी हिस्से के लिए टीएसएस में एच 3 के 4 एम 3 और एच 3 के 27 एसी की चिह्नित उपस्थिति दिखाते हैं। इसके अलावा, H3K27me3 H3K4me3/ H3K27ac के साथ एंटीकोरिलेशन करता है। H3K27me3 जीन की पूरी लंबाई पर मौजूद है और न केवल टीएसएस में, जैसा कि इस पीटीएम से अपेक्षित है। चित्र 3 बी और चित्रा 3 डी एचओएक्ससी / होक्ससी क्लस्टर को दिखाते हैं जो एच 3 के 27 एम 3 के लिए समृद्ध होने के लिए जाना जाता है और माउस और मानव यकृत दोनों में ट्रांसक्रिप्शनल रूप से निष्क्रिय है। H3K4me3 और H3K27ac की प्रोफाइलिंग इस दो PTM के लिए शिखर दिखाती है जबकि H3K27me3 की सिग्नल तीव्रता कम और अधिक वितरित होती है।

क्रोमैटिन तैयारी की जटिलता के कारण, अति-निर्धारण हो सकता है, लाइसिस या सोनिकेशन समय उप-इष्टतम हो सकता है, बड़े सेल क्लंप बने रह सकते हैं, या नमूने की अपर्याप्त हैंडलिंग अपर्याप्त हो सकती है। ये सभी तैयारी की गुणवत्ता को प्रभावित करने वाली घटनाएं हैं। कुछ मामलों में, सही आकार के भीतर क्रोमैटिन टुकड़ों का संवर्धन अभी भी मौजूद होगा या उच्च आकार में स्थानांतरित कर दिया जाएगा। अन्य मामलों में, समय से पहले लाइसिस या असफल कतरन के कारण सामग्री का नुकसान हो सकता है। चित्रा 4 इस तरह के नकारात्मक और उप-मानक परिणामों के कुछ उदाहरण दिखाता है। लेन 3 और 4 200 बीपी और 800 बीपी के बीच टुकड़े के आकार का संवर्धन दिखाते हैं। हालांकि, यह स्पष्ट है कि टुकड़े का आकार 100 बीपी से > 10,000 बीपी तक फैला है। लेन 5 और 6 में तैयारी के दौरान सामग्री के स्पष्ट नुकसान के साथ 100-250 बीपी रेंज में एक संवर्धन मौजूद है। यह समझा सकता है कि सोनिकेशन ने छोटे टुकड़े क्यों पैदा किए। लेन 7 टुकड़े की सीमा में वृद्धि के साथ थोड़ा उप-इष्टतम तैयारी दिखाता है, जबकि लेन 8 सामग्री का लगभग पूरा नुकसान दिखाता है। यह समय से पहले परमाणु लाइसिस या अपर्याप्त ऊतक पृथक्करण के कारण हो सकता है जिसके परिणामस्वरूप चरण 5.5 के बाद नुकसान होता है।

Figure 1
चित्रा 1: क्रोमैटिन तैयारी प्रोटोकॉल अवलोकन। चित्र ऊतक पुल्वराइजेशन (ए), अतिरिक्त मैनुअल होमोजेनाइजेशन (बी), परमाणु लाइसिस (सी) के बाद और सोनिकेशन के बाद (सेंट्रीफ्यूजेशन से पहले) (डी) के बाद लिए गए थे। परमाणु धुंधलापन Hoechst 33258 / DAPI के साथ किया गया था। स्केल बार = 200 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: प्रतिनिधि क्रोमैटिन कतरनी, और इसकी गुणवत्ता का मूल्यांकन CHIP-QPCR द्वारा किया जाता है। विभिन्न क्रोमैटिन तैयारी से प्रोटोकॉल के अनुसार खंडित क्रोमैटिन नमूनों के साथ 1% एगारोस जेल। पहले से कोई क्रोमैटिन / डीएनए गिरावट सुनिश्चित करने के लिए अनशीयर क्रोमैटिन का एक नियंत्रण जोड़ा जाता है (ए)। कतरनी क्रोमैटिन को सीएचआईपी-क्यूपीसीआर परख प्रदर्शन करने वाली गुणवत्ता के लिए परीक्षण किया गया है। H3K4me3, H3K27ac और H3K27me3 एंटीबॉडी का उपयोग ताजा तैयार क्रोमैटिन को अवक्षेपित करने के लिए किया गया था। (ख) क्यूपीसीआर विश्लेषण मानव (सी1ओआरएफ43 और पीएसएमबी2), मुराइन (गैपध) सक्रिय प्रमोटरों और मानव (एचओएक्ससी13, एचओएक्ससी12), मुराइन (माइट1) निष्क्रिय प्रमोटरों पर किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: प्रतिनिधि CHIP-seq विश्लेषण। रीड्स को मानव और माउस जीनोम (एचजी 19 और एमएम 10) दोनों के साथ बनाए गए सूचकांक के साथ संरेखित किया गया है। संरेखण के बाद मानव और मुराइन रीडिंग को अलग किया गया और आगे विश्लेषण किया गया। मानव जीन का हीटमैप जहां टीएसएस में सिग्नल की मात्रा निर्धारित की गई थी और एच 3 के 4 एम 3 तीव्रता (ए) के लिए अवरोही क्रम में दिखाया गया था। सक्रिय जीन (बी) से घिरे दबे हुए जीन (एचओएक्स क्लस्टर) के मानव जीन क्लस्टर का उदाहरण। म्यूरिन जीन का हीटमैप जहां टीएसएस में सिग्नल की मात्रा निर्धारित की गई थी और एच 3 के 4 एम 3 तीव्रता (सी) के लिए अवरोही क्रम में दिखाया गया था। सक्रिय जीन (डी) से घिरे दबे हुए जीन (होक्स क्लस्टर) के एक मुराइन जीन क्लस्टर का उदाहरण। दिखाए गए सभी डेटा को EaSeq प्रति मिलियन पढ़ने के द्वारा सामान्यीकृत किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: उप-मानक और असफल क्रोमैटिन तैयारी। प्रोटोकॉल के अनुसार खंडित क्रोमैटिन नमूनों के साथ 1% एगारोस जेल। आंकड़े में नियंत्रण (लेन 2) के रूप में उपयोग किए जाने वाले अनशीयर क्रोमैटिन शामिल हैं, इष्टतम कतरनी (लेन 3-4), स्पष्ट सामग्री हानि (लेन 5-6), उप-मानक कतरनी (लेन 7) और व्यापक सामग्री हानि (लेन 8) के साथ इष्टतम कतरनी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

प्राइमर का नाम अनुक्रम
C1orf43 प्रमोटर आगे AGTGGGTGGAGAATGCAGAC
उल्टा GAGATTACCCCCCCCCATTC
पीएसएमबी 2 प्रमोटर आगे CTTATTCAACCCCCGACAAA
उल्टा GATGAAGGGGGTGAGAGA
एचओएक्ससी 13 डिस्टल प्रमोटर आगे GAGCCGAGATTCACTCAAC
उल्टा TTATGCCCAGTTTTTGGGTA
एचओएक्ससी 12 डिस्टल प्रमोटर आगे AAAGCTTCCCACTGCAAGA
उल्टा AAATCTGGGGGCGAACTACT
mGAPDH प्रमोटर आगे GGTCCAAAGAGAGGAG
उल्टा GCCTGCTCTCTCCAGTCTCTC
एमएमवाईटी प्रमोटर आगे CAGCCCAATTCTAGCCAT
उल्टा CCAAAGCAGGGGGAGGAGGAG

तालिका 1: सीएचआईपी-क्यूपीसीआर परख के लिए उपयोग किए जाने वाले सक्रिय और निष्क्रिय जीन के लिए क्यूपीसीआर प्राइमर सूची।

Discussion

स्नैप जमे हुए ऊतक से क्रोमैटिन की तैयारी एक चुनौती बनी हुई है क्योंकि प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए कई चरणों को अनुकूलित करने की आवश्यकता होती है। पहले से ही प्रकाशित प्रोटोकॉल16,23 में से अधिकांश को मैनुअल पृथक्करण (डौंसिंग) से पहले ऊतक मिंकिंग की आवश्यकता होती है। हमने उन कदमों से बचने की कोशिश की जो जितना संभव हो सके नमूने के निर्धारण से पहले प्रोटीन क्षरण को भड़का सकते हैं। फुफ्फुसीकरण चरण पहले से ही जमे हुए यकृतकी तैयारी 24 में उपयोग किया जाता है और मैन्युअल पृथक्करण को आसान और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य बनाता है (चित्रा 2 ए देखें)। विशेष रूप से 1.5 एमएल ट्यूबों (प्रोटोकॉल देखें) के लिए डिज़ाइन किए गए मोर्टार के उपयोग के साथ, फुफ्फुसप्रक्रिया के दौरान नमूना हानि कम हो जाती है, जिससे यकृत बायोप्सी नमूने जैसे ऊतक की छोटी मात्रा को संसाधित करने की अनुमति मिलती है। सिद्धांत रूप में किसी भी पीसने के चरणों के बिना प्रत्यक्ष ऊतक समरूपीकरण का उपयोग करना संभव है; हालांकि, पिछले पुल्वराइजेशन के बिना ऊतक समरूपीकरण में हमारे अनुभव में एक खराब प्रजनन क्षमता है और डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए समस्याओं की उपस्थिति अधिक थी (डेटा नहीं दिखाया गया है)।

ऊतकों से क्रोमैटिन तैयार करने में आने वाली अधिकांश समस्याएं इन नमूनों की प्रकृति और ठीक से जांचने की अक्षमता से उत्पन्न होती हैं कि क्या सेल क्लस्टर गुणवत्ता खोए बिना निर्धारण के लिए पर्याप्त छोटे हैं। इसके अलावा, प्रत्येक चरण में प्रत्येक एलिकोट की जांच करने में समय लगेगा जिससे प्रोटीन क्षरण की संभावना बढ़ जाएगी।

निर्धारण (चरण 3.9) क्रोमैटिन तैयारी का एक मौलिक और महत्वपूर्ण हिस्सा है। ऊतक की प्रकृति के कारण, निर्धारण चरण में देरी हुई है जब तक कि ऊतक को समरूप नहीं किया गया था। इस तरह के स्थगित निर्धारण चरण में अधिक सजातीय सेल निलंबन का उत्पादन करने का लाभ है। हालांकि, हम मानते हैं, कि विशेष रूप से हेरफेर-संवेदनशील लक्ष्यों के मामले में, चरण 3.6 से ठीक पहले निर्धारण करना आवश्यक हो सकता है। यह बेहद संवेदनशील प्रोटीन या पीटीएम की रक्षा करने में मदद करेगा, हालांकि यह सेल क्लस्टर के आकार को बढ़ा सकता है, जो तय होने पर गैर-सजातीय कतरनी का परिणाम हो सकता है। प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले एफए समाधान की एकाग्रता मानक है, हालांकि, इसे समग्र निर्धारण में सुधार करने का प्रयास करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। यहां चुना गया निर्धारण समय आमतौर पर क्षेत्र में उपयोग की जाने वाली मानक स्थितियों को भी दर्शाता है। फिक्सिंग समाधान की उच्च सांद्रता के मामले में, निर्धारण समय कम हो सकता है, जबकि कम राशि के मामले में इसे बढ़ाया जाना चाहिए। ऑपरेटर को यह विचार करना चाहिए कि निर्धारण समय में बदलाव से या तो नमूने का अति-निर्धारण हो सकता है या प्रोटीन क्षरण के लिए जगह मिल सकती है। बड़े परिसरों (या इसके हिस्से) और टीएफ को अवक्षेपित करने के लक्ष्य के मामले में, डीएसजी समाधान का उपयोग करके डबल स्टेप निर्धारण करना फायदेमंद होगा, जिसके बाद एफए25,26 होगा। इस मामले में डीएसजी प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन को स्थिर करेगा, जबकि फॉर्मलाडेहाइड ज्यादातर प्रत्यक्ष डीएनए-प्रोटीन इंटरैक्शन27 पर कार्य करता है।

ऑपरेटर को चरण 6.7 से शुरू होने वाले डीएनए शुद्धिकरण के लिए एक कॉलम-आधारित किट को लागू करने की संभावना को ध्यान में रखना चाहिए जो तेज है और विषाक्त यौगिकों का उपयोग नहीं करता है। हालांकि, हमेशा अनबाउंड डीएनए की एक निश्चित मात्रा होगी जो खो जाएगी। इस कारण से, हम ईटीओएच वर्षा के बाद शास्त्रीय फिनोल-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण का उपयोग करने का सुझाव देते हैं। इसके अलावा, एगारोस जेल (चरण 7.2) चलाने से पहले डीएनए एकाग्रता को मापना और स्पष्ट तस्वीर रखने के लिए हर कुएं के लिए समान मात्रा में लोड करना फायदेमंद हो सकता है।

इस प्रोटोकॉल की एक सीमा इस तथ्य से उपजी है कि हमने इस प्रोटोकॉल का पता लगाया और उपयोग केवल मानव-यकृत चिमेरिक चूहोंसे प्राप्त यकृत नमूनों का उपयोग करके किया। प्रति यकृत में उपकला और संयोजी ऊतकहोते हैं। रोग के मामले में, फाइब्रोटिक ऊतक और वसा ऊतक30,31 मौजूद हो सकते हैं जो ऊतक व्यवधान के दौरान अतिरिक्त चुनौतियां पैदा करते हैं। हालांकि, हम मानते हैं कि हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग हड्डी, मांसपेशियों और वसा ऊतक पर पृथक्करण और सोनिकेशन चरणों के अनुकूलन के बिना नहीं किया जा सकता है। ध्यान देने योग्य बात यह है कि प्रत्येक ऊतक को सेल कल्चर नमूने15 की तरह उन सभी के लिए उपयुक्त प्रोटोकॉल की अनुपस्थिति के कारण किसी प्रकार के अनुकूलन की आवश्यकता होती है। हालांकि, हमारा मानना है कि बहुत कम या बिना किसी अनुकूलन के, इस प्रोटोकॉल को अन्य ऊतकों पर सफलतापूर्वक लागू किया जा सकता है जो संरचना में यकृत के साथ समानताएं साझा करते हैं, जैसे फेफड़े, आंत, पेट, अग्न्याशय या गुर्दे के ऊतक।

हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग एचबीवी सहसंयोजक बंद डीएनए एपिसोम (सीसीसीडीएनए) 32 पर टीएफ और हिस्टोन संशोधनों का विश्लेषण करने के लिए भी सफलतापूर्वक किया गया है। यह यकृत को प्रभावित करने वाले अन्य वायरल जीनोम जैसे मानव साइटोमेगालोवायरस33 (एचएमवी) और मानव एडेनोवायरस34 (एचएडीवी) के लिए इस तरह के दृष्टिकोण को लागू करने का मौका खोलता है। यह बाहर नहीं किया गया है कि अन्य डीएनए वायरस का विश्लेषण करना संभव होगा जो अन्य ऊतकों जैसे कपोसी सारकोमा हर्पीस वायरस35 (केएचएसवी), हर्पीस सिम्प्लेक्स वायरस 36 (एचएसवी 1/2) पॉलीओमा वायरस, एपस्टीन-बार वायरस37 (ईबीवी) में लगातार संक्रमण स्थापित करते हैं।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

अध्ययन को जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (डीएफजी) द्वारा मौरा डांड्री (एसएफबी 841 ए 5) और हैम्बर्ग राज्य द्वारा अनुसंधान कार्यक्रम (एलएफएफ-एफवी 44: ईपीआईएलओजी) के साथ अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

हम तकनीकी सहायता के लिए और पांडुलिपि को गंभीर रूप से पढ़ने के लिए डॉ टैसिलो वोल्ज़, यवोन लाडिग्स और अन्निका वोल्मारी को धन्यवाद देना चाहते हैं। थॉमस गुंथर और प्रोफेसर एडम ग्रुंडहॉफ ने सीएचआईपी-क्यूपीसीआर विश्लेषण के लिए बहुत उपयोगी सुझाव और प्राइमर सेट प्रदान किए।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22µm sterile syringe filter Labsolute 7699822
1.5 mL Safeseal tubes Sarstedt 7,27,06,400
6x orange loading dye Thermofisher R0631
Benchtop refrigerated centrifuge
Bioruptor NGS Diagenode
Blade or Scalpel
Calcium chloride dihydrate Carl Roth HN04
Chloroform Sigma Aldrich (Merck) C2432
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Roche 11697498001
Deacetylase Inhibitor Active Motif 37494
Dounce tissue grinder set Sigma Aldrich (Merck) DWK885300-0001-1EA
EDTA 500 mM solution PanReac AppliChem A4892
EGTA Sigma Aldrich (Merck) E4378
EtBr Carl Roth 2218 Concentration 10mg/mL
Ethanol absolute CHEMSOLUTE 2273
Glycerol Sigma Aldrich (Merck) G9012
Glycin Carl Roth 0079
Glycogen Roche 10901393001 Concentration: 20mg/mL
Heating block
HEPES Sigma Aldrich (Merck) H4034
LE Agarose Biozym 840000
Liquid nitrogen cooled mini mortar Bel-Art H37260-0100
MeOH free Formaldehyde 16% Thermofisher 28908
NP-40 Roche 11332473001
PBS 1x Thermofisher 10010015
Pefabloc SC-Protease-Inhibitor Sigma Aldrich (Merck) 11429868001
Phase Lock Gel - Heavy QuantaBio 2302830
Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol 25:24:1 Sigma Aldrich (Merck) P3803
Potassium chloride Carl Roth 6781
Potassium hydroxyde Merck 105033
Proteinase K Lucigen MPRK092 Concentration: 50 µg/µL
RNAse A Lucigen MRNA092 Concentration: 5 mg/mL
SDS 10% solution PanReac AppliChem A3950
Sodium carbonate anhydrous Carl Roth A135
Sodium chloride Sigma Aldrich (Merck) S7653
Sterile Petri dishes Sarstedt 83,39,02,500
Tris-HCl solution Sigma Aldrich (Merck) T2694
Triton-X100 Sigma Aldrich (Merck) X100

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References

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  2. Silmon de Monerri, N. C., Kim, K. Pathogens hijack the epigenome: A new twist on host-pathogen interactions. American Journal of Pathology. 184 (4), 897-911 (2014).
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Pirosu, A., Allweiss, L., Dandri, M. … More

Pirosu, A., Allweiss, L., Dandri, M. Chromatin Extraction from Frozen Chimeric Liver Tissue for Chromatin Immunoprecipitation Analysis. J. Vis. Exp. (169), e62179, doi:10.3791/62179 (2021).

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