Summary
Denne protokollen fokuserer på kromatinpreparasjon fra snapfrosne vev, og den er egnet for kryssbindende kromatinimmunoprecipitasjon (X-ChIP) etterfulgt av enten kvantitativ PCR-analyse (X-ChIP-qPCR) eller neste generasjons sekvenseringstilnærminger (X-ChIP-seq).
Abstract
Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) er en mye brukt teknikk for å vurdere nivåer av histonmerker og belegg av transkripsjonsfaktorer på verts- og / eller patogenkromatin. Kromatinpreparasjon fra vev skaper ytterligere utfordringer som må overvinnes for å oppnå reproduserbare og pålitelige protokoller som kan sammenlignes med de som brukes til cellekultur. Vevsforstyrrelser og fiksering er kritiske trinn for å oppnå effektiv skjæring av kromatin. Sameksistens av forskjellige celletyper og klynger kan også kreve forskjellige skjæringstider for å nå optimal fragmentstørrelse og hindrer reproduserbarhet av skjær. Formålet med denne metoden er å oppnå pålitelige og reproduserbare vertskromatinpreparater fra frosset vev (lever) egnet for både ChIP-qPCR og neste generasjons sekvensering (NGS) applikasjoner. Vi observerte at kombinasjonen av pulverisering av flytende nitrogenvev etterfulgt av homogenisering fører til økt reproduserbarhet sammenlignet med homogenisering, siden den gir en suspensjon som hovedsakelig består av dissosierte enkeltceller som effektivt kan skjæres. Videre bør fikseringstrinnet utføres under mild rotasjon for å gi homogen tverrbinding. Det faste materialet er da egnet for bufferbasert kjerneisolering, for å redusere forurensning av cytoplasmatisk protein og patogen-DNA og RNA (når aktuelt), og unngår tidkrevende sentrifugeringgradienter. Etterfølgende sonikering vil fullføre kjernefysisk lyse og skjære kromatinet, og produsere et bestemt størrelsesområde i henhold til de valgte skjæreforholdene. Størrelsesområdet bør falle mellom 100 og 300 nt for NGS-applikasjoner, mens det kan være høyere (300-700 nt) for ChIP-qPCR-analyse. Slike protokolltilpasninger kan i stor grad forbedre kromatinanalyser fra frosne vevsprøver.
Introduction
Siden oppdagelsen har epigenetisk regulering i pattedyrceller fått økende anerkjennelse1, med tanke på at forståelsen av slike mekanismer vil gi nøkkelinnsikt ikke bare i cellebiologi, men også i sykdom og tumorbiologi. Videre kan smittestoffer også forårsake epigenetiske endringer i verten2, mens vertscellemaskineriet også kan påvirke kromatinet til patogener, for eksempel vedvarende DNA-virus 3,4. Dette samspillet mellom vert og patogen ser ut til å spille en rolle i infeksjonsutholdenhet. 2
Gjennom en reversibel tilknytning til DNA danner histonproteiner et kompleks kalt nukleosom. Nukleosomer når i sin tur et høyere organisasjonsnivå kjent som kromatin. Kromatinremodellering er kjent for å regulere genuttrykk tett, gi eller nekte tilgang til transkripsjonsfaktorer (TF)5. Disse faktorene kan enten utløse eller blokkere rekrutteringen av RNA-polymerase II (PolII) på genpromotorer, og påvirke mRNA-syntesen fra DNA-malen6. Histonproteiner inneholder haler7, som flankerer begge ender av histonfolden, som kan bli gjenstand for posttranslasjonelle modifikasjoner (PTM), noe som muliggjør en tett regulering av gentranskripsjonen ved strukturelle kromatinendringer. De fleste histon-PTM-ene er lokalisert ved hale N-terminalen, med acetylering og metylering som de best studerte PTM-ene, selv om fosforylering8, ubiquitinering9 og ribosylering10 også er rapportert. Karakterisering og studier av slike proteiner er da viktig for å få en dyp innsikt i genregulering.
For tiden er det en håndfull veletablerte metoder og verktøy tilgjengelig for å studere direkte DNA-proteininteraksjoner: Elektroforetisk mobilitetsskiftanalyse (EMSA), gjær-en-hybridanalyse (Y1H) og DNA-fotavtrykk11. Imidlertid fokuserer disse metodene i seg selv på enkelt-DNA-proteininteraksjoner og er ikke anvendelige for genombrede studier. En annen begrensning av disse teknikkene er mangelen på histonforening med DNA-segmentene som undersøkes. Slike tilnærminger er derfor ikke ment å gjenspeile kompleksiteten til transkripsjonsmaskineriet in vivo , og de tar ikke hensyn til viktige strukturelle endringer12 eller andre nødvendige enzymer/kofaktorer13 som kan påvirke (enten fremme eller hemme) proteinbinding til DNA.
Ideen om at fiksering av celler med midler som formaldehyd (FA) kunne gi et in vivo øyeblikksbilde av protein-DNA-interaksjoner, skapte grunnlaget for utviklingen av kromatinimmunoutfellingsanalyser (ChIP)14. Dette, sammen med tilgjengeligheten av den kvantitative PCR-teknologien (qPCR) og svært spesifikke antistoffer, tillot utvikling av ChIP-qPCR-analyser. Deretter innrømmet fremkomsten av neste generasjons sekvenseringsteknikker (NGS), hvis kostnader blir rimeligere, å koble ChIP-eksperimenter med NGS-tilnærminger (ChIP-seq), og dermed gi forskere nye kraftige verktøy som muliggjør undersøkelse av kromatinregulering. I disse analysene fikseres isolerte eller dyrkede celler med disuccinimidylglutarat (DSG) og/eller FA, kjerner isoleres, kromatin fragmenteres deretter og utfelles av antistoffet av interesse. Heretter blir DNA renset og analysert ved PCR- eller NGS-tilnærminger. I motsetning til EMSA, Y1H og DNA-fotavtrykk, har ChIP-analyser evnen til å gi et globalt øyeblikksbilde av protein-DNA-interaksjon i cellen. Dette gir fleksibilitet og tillater analyse av flere steder innenfor samme utvalg. På grunn av analysens natur kan ChIP imidlertid til slutt oppdage ikke bare direkte interaksjoner, men også indirekte, og ikke tilby presisjonen til de ovennevnte metodene når de er interessert i direkte protein-DNA-interaksjoner.
Kromatinpreparasjonsprotokoller fra cellekulturmateriale er veletablerte15 og svært reproduserbare, slik at brukeren kan oppnå kromatin egnet både for qPCR- og NGS-tilnærminger på 1-2 arbeidsdager. Imidlertid representerer oppnåelse av kromatin av høy kvalitet fra hele vev fortsatt en utfordring på grunn av behovet for å dissociere cellene i vevet samtidig som man oppnår optimal fiksering og skjæring av kromatinet. I tillegg varierer sammensetning og morfologi av forskjellige vevstyper, noe som krever justering av eksisterende protokoller16,17. Bruk av kryopreservert vev gir ytterligere utfordringer i forhold til ferske prøver. Dette skyldes vanskeligheten med å oppnå en enkeltcellesuspensjon uten omfattende materialtap. Dette fører til feil skjæring, noe som hindrer nedstrøms applikasjoner. Ikke desto mindre øker tilgang til frosne vevsprøver i stedet for den ferske motparten ikke bare arbeidsfleksibiliteten, men det kan også representere det eneste alternativet for forskere som arbeider med prøver som stammer fra langsgående eller komparative studier. En håndfull protokoller for kromatinpreparasjon for frosset vev er publisert. Disse er for det meste basert på opptining av prøver etterfulgt av hakking, manuell/maskinbasert dissosiasjon eller pulveriseringstrinn for flytende nitrogen18,19,20.
Her beskriver vi en optimalisert kromatinprepareringsmetode15 for frosne ufikserte leverprøver, som kombinerer vevspulverisering i flytende nitrogen med pestelhomogenisering, for å oppnå en reproduserbar kromatinskjæring egnet for X-ChIP-tilnærminger som tar sikte på å analysere både virale og vertsgenomer.
Protocol
Vevsprøvetaking fra humane kimære levermus21 ble utført i samsvar med EU-direktiv 86/609/EØF og godkjent av den etiske komiteen i Hamburg i samsvar med prinsippene i Helsinkideklarasjonen.
1. Reagenser forberedelse
- Forbered 1,25 M glycinoppløsning i avionisert vann. Sterilt filter med 0,22 μm porestort filter. Oppbevares ved 4 °C.
- Klargjør 5 M natriumklorid (NaCl) oppløsning. Oppbevares i romtemperatur.
- Forbered CaCl2-løsning : 300 mM CaCl2og 10 mM Tris-HCl pH 8 i avionisert vann. Sterilt filter med 0,22 μm porestort filter og oppbevares ved RT.
- Forbered en 10% Triton X-100 fortynning i avionisert vann. Oppbevares hos RT.
- Forbered Tris-EDTA-buffer: 1 mM EDTA og 10 mM Tris pH 8 i avionisert vann. Oppbevares ved 4 °C.
- Forbered følgende buffere i henhold til mengden som kreves:
- Forbered buffer A: 50 mM Hepes-KOH pH 7,5, 140 mM NaCl, 1 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), 10% glyserol, 0,5% NP-40 og 0,25% Triton X-100 i avionisert vann. Sterilt filter med 0,22 μm porestort filter. Oppbevares ved 4 °C.
- Forbered buffer B: 10 mM Tris-HCl pH 8, 200 mM NaCl, 1mM EDTA, 0,5 mM egtazinsyre (EGTA). Sterilt filter med 0,22 μm porestort filter. Oppbevares ved 4 °C.
- Forbered buffer C: 1% SDS, 10 mM EDTA og 50 mM Tris-HCl pH 8 i avionisert vann. Sterilt filter med 0,22 μm porestort filter. Oppbevares hos RT.
- Forbered kromatinfortynningsbuffer: 0,01% SDS, 1,1% Triton X-100, 1,2 mM EDTA, 16,6 mM Tris-HCl pH 8 og 166 mM NaCl i avionisert vann. Sterilt filter med 0,22 μm porestort filter. Oppbevares ved 4 °C.
2. Materiell forberedelse
- Samle tørris, is og flytende nitrogen.
FORSIKTIG: Håndter tørris og flytende nitrogen med nødvendig forsiktighet for å unngå brannskader. - Forkjøl sentrifugen ved 4 °C.
NOTAT: Dette trinnet er viktig for å unngå proteinnedbrytning og de-tverrbinding under vasketrinnene, da dette vil redusere kvaliteten på kromatinet. - Legg en steril tallerken på tørris og la den avkjøles.
NOTAT: Forsikre deg om at platen er stor nok til å lette skjæreprosessen. En 100 mm petriskål/cellekulturskål anbefales. - Ta ut den nødvendige alikot av glycin 1,25 M og la den nå RT.
- Ta ut de nødvendige alikotene av buffer A, B og PBS. Legg til protease og / eller deacetylase- og fosfatasehemmere for å nå 1 ganger konsentrasjon og la dem ligge på is.
- Ta ut den nødvendige aliquot av buffer C forlater den på RT. Ikke tilsett protease- og/eller deacetylase- og fosfatasehemmere før det er spesifisert.
- Ta ut den nødvendige alikot av RT PBS.
FORSIKTIG: Buffer C inneholder natriumdodecylsulfat (SDS). Vedta passende sikkerhetstiltak når du forbereder bufferen.
MERK: SDS felles ut på is, og protease og deacetylasehemmere er ikke stabile ved RT. - Forkjøl mørtelen som helles flytende nitrogen i kammeret, strengt etter leverandørens instruksjoner. Kjøl ned metallpistolen i tørris i minst 5 min.
MERK: Det er mulig å bruke en alternativ mørtel til den som er foreslått. Imidlertid tillater enheten som brukes i denne protokollen, på grunn av sin særegne konstruksjon, å arbeide med liten mengde vev uten betydelig tap under pulveriseringsprosessen. - Forkjøl Dounce-homogenisatoren med tilhørende pestle A på is.
MERK: Pestle A har en løs passform med homogenisatoren. Dette gjør det mulig å oppnå en enkeltcellesuspensjon uten signifikant cellelyse.
3. Vev tverrbinding
- Skjær ca 50 mg frosset vev direkte på fatet på tørris ved hjelp av en skalpell og pinsett.
MERK: Det foreslås å holde skalpellen på RT, da dette vil lette skjæreprosessen. Unngå å legge for mye press på skalpellen, da dette vil øke risikoen for å spre vevsbiter utenfor skjæreområdet. For å merke seg, bør 50 mg vev (lever i dette tilfellet) gi rundt 5 millioner celler. Legg merke til at det varme bladet tiner kanten. Tatt i betraktning den relativt store størrelsen på vevstykket, bør dette imidlertid ha en begrenset effekt. Når mindre biter kuttes, kan det være fordelaktig å bruke en kald skalpell for å unngå spredning av vevet. - Sett det kuttede vevet i et 1,5 ml rør som allerede er avkjølt på tørris. Unngå tining av vev.
- Flytt røret som inneholder vevet til mørtelen, la den sitte der i 5 minutter.
MERK: Hvis du lar prøven hvile i mørtelen, reduseres temperaturen (fra -80 °C til -196 °C). Dette øker seigheten og gjør pulveriseringstrinnet enklere. - Påfør trykk på prøven ved hjelp av den forkjølte stammen til det ikke er mer faste smuldrer er synlige.
MERK: Det er viktig å unngå pestle oppvarming ved overdreven rotasjonskrefter, da dette vil tine prøven. Etter hver prøvepulverisering rengjør pestelen med 70% etanol (EtOH) og la den avkjøle igjen på tørris. - Fjern røret som inneholder prøven fra mørtelen og tilsett 950 μL iskald PBS med de nødvendige hemmerne. Pipett forsiktig opp og ned til prøven er fullstendig resuspendert. Gå umiddelbart til trinn 3.6.
- Overfør vevssuspensjonen til homogenisatoren og påfør 20-30 slag med pestle A for å oppnå en finere suspensjon. Unngå skumdannelse.
MERK: Slagmengden skal optimaliseres i henhold til vevskonsistensen. Dette trinnet dissosierer videre de små klyngene av celler oppnådd etter pulverisering. En feil homogenisering kan påvirke skjæreffektiviteten. - Overfør homogenatet til et nytt 1,5 ml rør, allerede forkjølt på is.
- Sentrifuge i 5 minutter ved 1 300 x g ved 4 °C og fjern supernatanten forsiktig.
- Resuspender pelleten fullstendig i 950 μL RT PBS ved forsiktig pipettering og tilsett 63,6 μL 16% MeOH-fri FA for å ha en 1% endelig konsentrasjon. Gå umiddelbart til trinn 3.10.
FORSIKTIG: FA er et giftig kjemikalie. Håndter den under en avtrekkshette med riktige sikkerhetstiltak.
MERK: Ufullstendig resuspensjon kan provosere celleaggregering under fikseringstrinnet. Dette hindrer lysis og skjæringsprosessen. - Roter 10 min ved RT. Fortsett deretter umiddelbart til trinn 3.11
MERK: Rotasjon er nødvendig for å unngå aggregater. Tiden som kreves for fiksering, bør optimaliseres, i henhold til målet for interesse og prøvetypen. Det er viktig å merke seg at overdreven fikseringstid kan hindre riktig skjæring. - Tilsett 113 μL 1,25 M glycin ved RT for å oppnå en 125 mM endelig konsentrasjon og roter i 5 minutter.
MERK: Glycin slukker fikseringsreaksjonen og unngår over-tverrbinding. - Sentrifuge ved 1 300 x g i 3 minutter ved 4 °C.
- Kast supernatanten og resuspender pelleten forsiktig ved å pipettere i 950 mikrol iskald PBS med de nødvendige hemmerne.
- Sentrifuge ved 1 300 x g i 3 minutter ved 4 °C.
- Gjenta trinn 3.13-3.14 og fortsett umiddelbart til kromatinisolasjonstrinnene.
4. Kromatin isolasjon
- Tilsett 950 μL buffer A med de nødvendige hemmere til pelleten. Bland forsiktig med pipettering til pelleten er helt resuspendert og roter 10 minutter ved 4 °C.
MERK: Dette trinnet lyser den faste enkeltcellesuspensjonen, uten kjernelysis. Dette gjør det mulig å kvitte prøven av cytosoliske proteiner og RNAer. Forlengelse av lysistid kan være gunstig for vanskelige å lyse celler, og øke imidlertid håndteringstiden til vevet. På dette tidspunktet er det mulig å kontrollere preparatet under mikroskopet etter trypanblå/DAPI-farging for å kontrollere størrelsen på klyngene og tilstedeværelsen av enkeltceller. Imidlertid kan de enkelte kjernene ikke være lett å sette pris på på grunn av det faste vevsmaterialet. - Sentrifuge ved 2000 x g i 5 minutter ved 4 °C og fjern supernatanten forsiktig.
- Tilsett 950 μL buffer B med de nødvendige hemmere til pelleten. Bland forsiktig med pipettering til pelleten er helt resuspendert og roter 10 minutter ved 4 °C.
MERK: Dette trinnet vasker ut lysisbufferen fra kjernepreparatet for å unngå ytterligere uønsket lysis. - Sentrifuge ved 2000 x g i 5 minutter ved 4 °C. I mellomtiden legger du til de nødvendige hemmere (samme som trinn 2.5) til buffer C.
- Fjern supernatanten forsiktig.
- Tilsett 300 μL RT-buffer C til pelleten og pipetten kraftig.
- Vortex prøven i 15-30 s og spinn røret kort for å samle dråpene på lokket.
MERK: Dette trinnet er viktig for å frigjøre og lyse de faste kjernene. For å bevare prøveintegriteten og samtidig unngå SDS-nedbør, hold prøven før sonikering i et plaststativ som holdes på is for å opprettholde en temperatur på 9-11 ° C.
5. Kromatinfragmentering
- Overfør prøven til tre rene 0,65 ml sonikeringssertifiserte rør som sikrer 100 μL lyserte kjernesuspensjon per rør.
MERK: Det er mulig å bruke 1,5 ml sonikeringssertifiserte rør med et maksimalt volum på 300 μL. En spesifikk holder for disse rørene er nødvendig. 0,65 ml bør gi mer homogen skjæring på grunn av mindre volum av prøven per rør. - Sonikere kromatinet i 28 sykluser med høy intensitet med 30 s ON og 30 s OFF-innstillingen. Forsikre deg om at sonikatorbadet er riktig avkjølt (is eller kjøleanordning).
MERK: Dette trinnet må optimaliseres i nesten alle tilfeller. Brukeren bør huske på at økt skjæringstid vil gi mindre og mer homogene fragmenter; Dette kan imidlertid øke sjansen for å senke kromatinkvaliteten. Velg det laveste antall sykluser som gir den nødvendige fragmentstørrelsen. Under optimaliseringen av dette trinnet er det nyttig å utføre kjernefysisk farging for å sjekke om antall sykluser var tilstrekkelig til å lyse flertallet av kjernene. - Overfør sonikert kromatin til et nytt 1,5 ml rør som tidligere er kjølt på is.
- Tilsett 30 μL Triton X-100 10% løsning og virvel i 5-10 s.
MERK: Triton X-100 binder SDS og forhindrer ytterligere nedbør ved 4 °C. Den endelige mengden Triton X-100 skal alltid være 1%. - Sentrifuge ved 16 000 x g i 15 minutter ved 4 °C.
- Overfør supernatanten til et rent 1,5 ml rør som er forkjølt på is.
- MERK: Supernatanten inneholder det avskårne kromatinet og skal være tydelig. Pelleten inneholder "ikke skjærbare" hviler, og den skal forbli ganske liten (for det meste brun i tilfelle levervev). Se etter indikasjon på mislykket skjæring: kromatinløsning som ikke ble klarere og lignende pelletsdimensjoner som de fra trinn 4.5.
6. DNA-rensing
- Overfør 10-25 μl skjæret kromatin til et nytt rør og tilsett buffer C for å nå et endelig volum på 200 μL. Oppbevar resten av kromatinet ved -80 °C til videre bruk. Om nødvendig kan prosedyren avbrytes på dette trinnet og prøven lagres ved -20 °C.
- Tilsett 8 μL 5 M NaCl og inkuber minst 6 timer ved 65 °C i en varmeblokk under risting ved 1000 o / min.
MERK: Dette trinnet de-kryssbinder kromatinet. Det er tryggere å forlenge tverrbindingen over natten når det er mulig. Tilstedeværelsen av NaCl gjør prosessen mer effektiv. - La prøvene avkjøles ved RT i 5 min og tilsett 2 μL RNase A.
- Inkuber i 1 time ved 37 °C under risting ved 1000 o / min.
- Fjern prøvene fra varmeblokken og tilsett 7 μL 300 mMCaCl2 og 2 μL proteinase K.
- Sett varmeblokken på 56 °C og inkuber i 30 minutter under risting ved 1000 o / min. I mellomtiden forbereder du ett faseseparasjonsrør for hver prøve ved å sentrifugere dem ned ved 16 000 x g i 1 minutt ved 4 °C.
MERK: Disse spesielle rørene gjør faseseparasjonen under nukleinsyrefenol-kloroformekstraksjon enklere. - Fjern rørene fra varmeblokken og la dem balansere ved RT i 3 min.
- Overfør 400 μL av prøven til et tidligere sentrifugert faseseparasjonsrør.
- Tilsett 400 μL fenol-kloroform-isoamylalkoholoppløsning (PCI) og virvel i 5 s.
FORSIKTIG: PCI er en svært flyktig og giftig forbindelse. Håndter den med nødvendige sikkerhetstiltak under en avtrekkshette. - Sentrifuge ved 16 000 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Tilsett 400 μL kloroform og virvel i 5 s.
FORSIKTIG: Kloroform er en svært flyktig og giftig forbindelse. Håndter den med nødvendige sikkerhetstiltak under en avtrekkshette.
MERK: Dette trinnet vasker ut mulige rester av fenol, som kan forstyrre nedstrøms PCR-applikasjoner. - Sentrifuge ved 16 000 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Overfør 400 μL av den øvre fasen til et nytt 1,5 ml rør hvor 24 μL 5 M NaCl og 0,75 μL glykogen ble tilsatt. Kort virvel.
- Tilsett 1,055 μL av 100% EtOH og vortex grundig. Sørg for riktig blanding.
- Inkuber ved -80 °C i 1 time eller ved -20 °C over natten (ON).
MERK: Dette trinnet utfeller det avskårne DNA; For å maksimere utbyttet foreslås det å velge ON-inkubasjonen. - Sentrifuge ved 16 000 x g i 30 minutter ved 4 °C.
- Fjern forsiktig supernatanten og vær oppmerksom på at du ikke forskyver pelleten.
- Tilsett 500 μL kald 70% EtOH. Vipp røret forsiktig for å sikre at pelleten vaskes.
MERK: Dette trinnet er viktig for å fjerne saltrester som kan ha felles ut med nukleinsyrene. Salter kan forstyrre andre nedstrøms applikasjoner. - Sentrifuge ved 16 000 x g i 15 minutter ved 4 °C.
- Fjern forsiktig hele supernatanten og la pelleten tørke ved RT.
MERK: Inkubering av røret på en varmeblokk ved 37 °C vil redusere tørketiden. - Tilsett 50 μL Tris-EDTA-løsning (TE-Buffer) og sett røret på varmeblokken ved 37 °C i 5-10 minutter under risting ved 300 o / min.
MERK: Dette trinnet sikrer pelletsoppløsningen. Protokollen kan settes på pause her, og prøven kan oppbevares ved 4 °C i opptil 1 uke eller ved -20 °C for lengre lagring. - Utfør DNA-analyse på 1% agarosegel.
7. Analyse av DNA-størrelse
- Forbered en 1% agarosegel ved å blande 1 g agarose per 100 ml løpende buffer (dvs. Tris-acetat-EDTA (TAE) eller Tris-borat-EDTA (TBE)). Varm suspensjonen til agarosen er fullstendig oppløst. Tilsett 10 μl EtBr for hver 100 ml agaroseoppløsning før geloppløsningen helles.
FORSIKTIG: EtBr er et DNA-interkaleringsmiddel kjent for å være kreftfremkallende. Håndter den med nødvendige sikkerhetstiltak under en avtrekkshette.
MERK: EtBr-farging (direkte i gel eller etter løpeturen) anbefales sterkt. Andre DNA-interkalerende fargestoffer fungerte dårlig i våre hender når vi jobbet med DNA-utstryk. Smale lastebrønner gir bedre oppløsning sammenlignet med bredere. - Bland 10 μL av prøven med 2 μL 6x lastfargestoff. Deretter legger du 10 μL av prøven i gelen og kjører den til det siste båndet av lastefargestoffet løp for 2/3 av gelen. Sørg for å legge til en DNA-stige.
- Bilde gelen og kontroller om smørestørrelsen faller i området for ønsket påføring.
Hvis kromatinet passerer kvalitetskontrollen, kan den brukes til nedstrøms applikasjoner.
Representative Results
Forberedelse av kromatin er et avgjørende skritt for å oppnå en vellykket ChIP. For å forberede kromatin av god kvalitet fra frosne prøver, bør vi sikre effektiv vevsforstyrrelse før fiksering for å unngå tilstedeværelse av vevsklumper som kan hindre effektiv skjæring. Figur 1 viser en oppsummert pipeline av protokollen. Pulverisering alene er ikke tilstrekkelig til å dissosiere vevet fullstendig, siden det produserer celleklynger av variabel størrelse og få enkeltceller (figur 1a). Ved å knytte det første pulveriseringstrinnet til Dounce-homogenisering, reduseres mengden vevsklumper kraftig og de resterende er mindre (figur 1b). Etter fikserings- og lyseringstrinnene øker antallet synlige enkeltkjerner (figur 1c), mens det typiske sfæriske utseendet går tapt. Etter sonikering i 28 sykluser er atomfargingen (Hoechst 33258 / DAPI) for det meste ikke synlig lenger. Dette er faktisk et tegn på vellykket skjæring (figur 1d). Etter de-tverrbinding av en kromatinalikvot og visualisering av DNA på agarosegel, kan vellykket skjæring gjenkjennes ved tilstedeværelse av fragmenter i området 100-300 bp. (Figur 2a) Mengden DNA kan variere i henhold til sammensetningen av det fremstilte vevstykket. Slike kromatin kan med hell brukes til ChIP-qPCR. Som vist i figur 2b kan kromatinet utløses med H3K4me3, H3K27ac (aktive genrelaterte modifikasjoner) og H3K27me3 (silenced genes related modification) antistoffer. Kromosom 1 Open Reading Frame 43 (C1orf43), Proteasom 20S Subunit Beta 2 (PSMB2) og Glyceraldehyd 3-fosfat dehydrogenase (mGapdh) promotorregioner resulterte anriket i H3K4me3 og H3K27ac sammenlignet med Homeobox C13 (HOXC13), Homeobox C12 (HOXC12) og mus Myelin Transcription Factor 1 (mMyt1) promotorregioner (tabell 1). Dette skyldes at C1orf43, PSMB2 og mGapdh transkriberes konstitutivt i leveren, mens HOXC13, HOXC12 og mMyt1 blir stilnet. H3K27me3 viser motsatt oppførsel som bekrefter suksessen til ChIP-analysen. Det faktum at leveren til disse musene er en kimær, tillot oss å analysere både murine og humant kromatin. I tillegg kan det samme kromatinet med hell brukes til ChIP-seq-eksperimenter. Etter sekvenseringstrinnet ble avlesningene justert til en indeks sammensatt av både murine og humane genomer for å redusere mengden ujusterte fragmenter. Deretter ble lesningene skilt etter art og videre analysert med EaSeq22 . Signalintensiteten ble deretter målt på transkripsjonsstartstedet (TSS) for hvert gen og resultatet sortert for H3K4me3-signalintensitet. Figur 3a og figur 3c viser både markert tilstedeværelse av H3K4me3 og H3K27ac ved TSS for en betydelig del av genene i både mus og humant kromatin. I tillegg til dette korrelerer H3K27me3 med H3K4me3/H3K27ac. H3K27me3 er tilstede på hele genets lengde og ikke bare ved TSS, som forventet fra denne PTM. Figur 3b og figur3d viser HOXC / HoxC-klyngen kjent for å være beriket for H3K27me3 og transkripsjonelt inaktiv i både mus og humane lever. Profileringen av H3K4me3 og H3K27ac viser topper for disse to PTM-ene, mens signalintensiteten til H3K27me3 har en tendens til å være lavere og mer distribuert.
På grunn av kompleksiteten av kromatinpreparasjon kan overfiksering skje, lyse eller sonikeringstid kan være suboptimal, store celleklumper kan vedvare, eller utilstrekkelig håndtering av prøven kan være utilstrekkelig. Dette er alle hendelser som påvirker kvaliteten på preparatet. I noen tilfeller vil anrikningen av kromatinfragmenter i riktig størrelse fortsatt være tilstede eller vil bli skiftet til en høyere størrelse. I andre tilfeller kan det være tap av materiale på grunn av for tidlig lyse eller mislykket skjæring. Figur 4 viser noen eksempler på slike negative og suboptimale resultater. Lane 3 og 4 viser en anrikning av fragmentstørrelsen mellom 200 bp og 800 bp. Det er imidlertid klart at fragmentstørrelsen spenner fra 100 bp til > 10.000 bp. I bane 5 og 6 er en anrikning i området 100-250 bp tilstede med et klart tap av materiale under forberedelsen. Dette kan forklare hvorfor sonikeringen produserte mindre fragmenter. Lane 7 viser en litt suboptimal forberedelse med fragmentområdet økt, mens bane 8 viser et nesten fullstendig tap av materiale. Dette kan skyldes prematur nukleær lyse eller utilstrekkelig vevsdissosiasjon med påfølgende tap etter trinn 5.5.
Figur 1: Oversikt over protokollen for kromatinpreparering. Bilder ble tatt etter vevspulverisering (a), ytterligere manuell homogenisering (b), etter nukleær lyse (c) og etter sonikering (før sentrifugering) (d). Nukleær farging ble utført med Hoechst 33258/DAPI. Skala bar = 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representativ kromatinskjæring, og dens kvalitet vurdert med ChIP-qPCR . 1% agarosegel med fragmenterte kromatinprøver i henhold til protokoller fra forskjellige kromatinpreparater. En kontroll av uskåret kromatin er tilsatt for å sikre ingen kromatin / DNA-nedbrytning på forhånd (a). Skjæret kromatin har blitt testet for kvalitet ved å utføre en ChIP-qPCR-analyse. H3K4me3, H3K27ac og H3K27me3 antistoffer ble brukt til å utfelle det nytilberedte kromatinet. qPCR-analyse ble utført på humane (C1orf43 og PSMB2), murine (Gapdh) aktive promotorer og humane (HOXC13, HOXC12), murine (Myt1) inaktive promotorer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representativ ChIP-seq-analyse. Lesningene er justert etter en indeks laget med både humane og musegenomer (hg19 og mm10). Etter justering ble menneskelige og murine avlesninger separert og videre analysert. Varmekart over humane gener hvor signalet ble kvantifisert ved TSS og vist i synkende rekkefølge for H3K4me3-intensitet (a). Eksempel på menneskelig genklynge av undertrykte gener (HOX-klynge) omgitt av aktive gener (b). Varmekart over murine gener hvor signalet ble kvantifisert ved TSS og vist i synkende rekkefølge for H3K4me3 intensitet (c). Eksempel på en murine gen klynge av undertrykte gener (Hox cluster) omgitt av aktive gener (d). Alle dataene som vises er normalisert av EaSeq per million leser. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Suboptimale og mislykkede kromatinpreparater. 1% agarosegel med fragmenterte kromatinprøver i henhold til protokoll. Figuren inneholder uskåret kromatin brukt som kontroll (Lane 2), ikke optimal skjæring (Lane 3-4), optimal skjæring med tydelig materialtap (Lane 5-6), suboptimal skjæring (Lane 7) og omfattende materialtap (Lane 8). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Primer navn | Sekvens | |
| C1orf43 promotor | Fremover | AGTGGGTGGAGAATGCAGAC |
| Omvendt | GAGATTACCCCACCACCATTC | |
| PSMB2 promotor | Fremover | CTTATTCAACCCCCGACAAA |
| Omvendt | GATGAAGGACGGTGAGAGGA | |
| HOXC13 distal promotor | Fremover | GAGCCCGAGATTCACTCAAC |
| Omvendt | TTATGCCCAGTTTTGGGGTA | |
| HOXC12 distal promotor | Fremover | AAAGCTTCCCACTGCAAAGA |
| Omvendt | AAATCTGGGGGCGAACTACT | |
| mGAPDH-promotor | Fremover | GGTCCAAAGAGAGGGAGGAG |
| Omvendt | GCCCTGCTTATCCAGTCCTA | |
| mMYT promotor | Fremover | CAGCCCAATTCTAGCCACAT |
| Omvendt | CCAAAGCAGGGGAGTAGGAG |
Tabell 1: qPCR-primerliste for aktive og inaktive gener brukt til ChIP-qPCR-analyser.
Discussion
Kromatinpreparasjon fra snapfrosset vev er fortsatt en utfordring på grunn av antall trinn som må optimaliseres for å oppnå reproduserbare og pålitelige resultater. De fleste av de allerede publiserte protokollene16,23 krever vevshakking før manuell dissosiasjon (douncing). Vi prøvde å unngå trinn som kunne provosere proteinnedbrytning før fiksering av prøven så mye som mulig. Pulveriseringstrinnet brukes allerede i frosne leverpreparater24 og gjør den manuelle dissosiasjonen enklere og reproduserbar (se figur 2a). Ved bruk av en mørtel spesielt designet for 1,5 ml rør (se protokoller), reduseres prøvetapet under pulveriseringsprosessen, noe som gjør det mulig å behandle små mengder vev som leverbiopsiprøver. I prinsippet er det mulig å bruke direkte vevshomogenisering uten slipetrinn; Imidlertid har vevshomogenisering uten tidligere pulverisering en dårligere reproduserbarhet i vår erfaring, og utseendet på problemer for nedstrøms applikasjoner var høyere (data ikke vist).
De fleste problemene som oppstår ved å fremstille kromatin fra vev, stammer fra naturen til disse prøvene og manglende evne til å kontrollere ordentlig om celleklyngene er små nok til fiksering uten å miste kvalitet. Videre vil det være tidkrevende å sjekke hver alikot ved hvert trinn, noe som øker sjansen for proteinnedbrytning.
Fiksering (trinn 3.9) er en grunnleggende og avgjørende del av kromatinpreparatet. På grunn av vevets natur har fikseringstrinnet blitt forsinket til vevet ble homogenisert. Et slikt utsatt fikseringstrinn har fordelen av å produsere en mer homogen cellesuspensjon. Vi erkjenner imidlertid at i tilfelle spesielt manipulasjonsfølsomme mål, kan det være nødvendig å utføre fikseringen like før trinn 3.6. Dette vil bidra til å beskytte ekstremt følsomme proteiner eller PTM, selv om det kan øke størrelsen på celleklyngene, som når de er faste kan resultere i ikke-homogen skjæring. Konsentrasjonen av FA-løsningen som brukes i protokollen er standard, men den kan endres for å prøve å forbedre den generelle fikseringen. Fikseringstiden som er valgt her, gjenspeiler også standardbetingelser som vanligvis brukes i feltet. Ved høyere konsentrasjon av fikseringsløsningen kan fikseringstiden reduseres, mens den i tilfelle av en lavere mengde bør økes. Operatøren bør vurdere at en endring av fikseringstiden enten kan føre til overfiksering av prøven eller gi rom for proteinnedbrytning. I tilfelle sikte på å utfelle store komplekser (eller deler av det) og TFer, vil det være fordelaktig å utføre en dobbelttrinns fiksering ved hjelp av en DSG-løsning etterfulgt av en FA en25,26. DSG i dette tilfellet vil stabilisere protein-protein-interaksjoner, mens formaldehyd virker hovedsakelig på direkte DNA-protein-interaksjoner27.
Operatøren bør ta hensyn til muligheten for å implementere et kolonnebasert sett for DNA-rensing fra trinn 6.7, som er raskere og ikke bruker giftige forbindelser. Imidlertid vil det alltid være en viss mengde ubundet DNA som vil gå tapt. Av denne grunn foreslår vi å bruke den klassiske fenol-kloroformekstraksjonen etterfulgt av EtOH-utfelling. Videre, før du kjører agarosegelen (trinn 7.2), kan det være fordelaktig å måle DNA-konsentrasjonen og laste samme mengde for hver brønn for å få et klarere bilde.
En begrensning av denne protokollen stammer fra det faktum at vi utforsket og benyttet denne protokollen bare ved hjelp av leverprøver avledet fra kimære mus fra mennesker28. I seg selv består leveren av epitel og bindevev29. Ved sykdom kan fibrotisk vev og fettvev være til stede30,31 noe som skaper ytterligere utfordringer under vevsforstyrrelser. Vi erkjenner imidlertid at protokollen vår ikke kan brukes på bein, muskel og fettvev uten optimalisering av dissosiasjons- og sonikeringstrinnene. Å merke seg er at hvert vev krever en slags optimalisering på grunn av fraværet av en protokoll som passer for dem alle, som for cellekulturprøver15. Vi tror imidlertid at med liten eller ingen optimalisering i det hele tatt, kan denne protokollen med hell brukes på andre vev som deler likheter med leveren i sammensetningen, som lunge, tarm, mage, bukspyttkjertel eller nyrevev.
Vår protokoll har også blitt brukt til å analysere TF og histonmodifikasjoner på HBV kovalent lukket DNA-episom (cccDNA)32. Dette åpner sjansen for å anvende en slik tilnærming for andre virale genomer som påvirker leveren, for eksempel humant cytomegalovirus33 (hCMV) og humant adenovirus34 (HAdV). Det er ikke utelukket at det ville være mulig å analysere andre DNA-virus som etablerer en vedvarende infeksjon i andre vev som Kaposi Sarcoma Herpes Virus35 (KHSV), Herpes Simplex Virus 36 (HSV1/2) Polyoma-virus, Epstein-Barr Virus37 (EBV).
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Studien ble støttet av German Research Foundation (DFG) med et stipend til Maura Dandri (SFB 841 A5) og av staten Hamburg med forskningsprogrammet (LFF-FV44: EPILOG).
Vi takker Dr. Tassilo Volz, Yvonne Ladiges og Annika Volmari for teknisk hjelp og kritisk lesing av manuskriptet. Dr. Thomas Günther og Prof. Adam Grundhoff for å gi svært nyttige forslag og primersettene for ChIP-qPCR-analysen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22µm sterile syringe filter | Labsolute | 7699822 | |
| 1.5 mL Safeseal tubes | Sarstedt | 7,27,06,400 | |
| 6x orange loading dye | Thermofisher | R0631 | |
| Benchtop refrigerated centrifuge | |||
| Bioruptor NGS | Diagenode | ||
| Blade or Scalpel | |||
| Calcium chloride dihydrate | Carl Roth | HN04 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich (Merck) | C2432 | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | |
| Deacetylase Inhibitor | Active Motif | 37494 | |
| Dounce tissue grinder set | Sigma Aldrich (Merck) | DWK885300-0001-1EA | |
| EDTA 500 mM solution | PanReac AppliChem | A4892 | |
| EGTA | Sigma Aldrich (Merck) | E4378 | |
| EtBr | Carl Roth | 2218 | Concentration 10mg/mL |
| Ethanol absolute | CHEMSOLUTE | 2273 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich (Merck) | G9012 | |
| Glycin | Carl Roth | 0079 | |
| Glycogen | Roche | 10901393001 | Concentration: 20mg/mL |
| Heating block | |||
| HEPES | Sigma Aldrich (Merck) | H4034 | |
| LE Agarose | Biozym | 840000 | |
| Liquid nitrogen cooled mini mortar | Bel-Art | H37260-0100 | |
| MeOH free Formaldehyde 16% | Thermofisher | 28908 | |
| NP-40 | Roche | 11332473001 | |
| PBS 1x | Thermofisher | 10010015 | |
| Pefabloc SC-Protease-Inhibitor | Sigma Aldrich (Merck) | 11429868001 | |
| Phase Lock Gel - Heavy | QuantaBio | 2302830 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol 25:24:1 | Sigma Aldrich (Merck) | P3803 | |
| Potassium chloride | Carl Roth | 6781 | |
| Potassium hydroxyde | Merck | 105033 | |
| Proteinase K | Lucigen | MPRK092 | Concentration: 50 µg/µL |
| RNAse A | Lucigen | MRNA092 | Concentration: 5 mg/mL |
| SDS 10% solution | PanReac AppliChem | A3950 | |
| Sodium carbonate anhydrous | Carl Roth | A135 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich (Merck) | S7653 | |
| Sterile Petri dishes | Sarstedt | 83,39,02,500 | |
| Tris-HCl solution | Sigma Aldrich (Merck) | T2694 | |
| Triton-X100 | Sigma Aldrich (Merck) | X100 |
References
- Waddington, C. H., Pantelouris, E. M.
- Silmon de Monerri, N. C., Kim, K. Pathogens hijack the epigenome: A new twist on host-pathogen interactions. American Journal of Pathology. 184 (4), 897-911 (2014).
- Knipe, D. M., et al.
- Tropberger, P., et al. Mapping of histone modifications in episomal HBV cccDNA uncovers an unusual chromatin organization amenable to epigenetic manipulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (42), 5715-5724 (2015).
- Sproul, D., Gilbert, N., Bickmore, W. A. The role of chromatin structure in regulating the expression of clustered genes. Nature Reviews Genetics. 6 (10), 775-781 (2005).
- Fischle, W., Wang, Y., Allis, C. D.
- Ling, X., Harkness, T. A., Schultz, M. C., Fisher-Adams, G., Grunstein, M. Yeast histone H3 and H4 amino termini are important for nucleosome assembly in vivo and in vitro: redundant and position-independent functions in assembly but not in gene regulation. Genes & Development. 10 (6), 686-699 (1996).
- Zhang, L., Eugeni, E. E., Parthun, M. R., Freitas, M. A. Identification of novel histone post-translational modifications by peptide mass fingerprinting. Chromosoma. 112 (2), 77-86 (2003).
- Wang, H., et al. Role of histone H2A ubiquitination in Polycomb silencing. Nature. 431 (7010), 873-878 (2004).
- Hassa, P. O., Haenni, S. S., Elser, M., Hottiger, M. O. Nuclear ADP-ribosylation reactions in mammalian cells: where are we today and where are we going. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 70 (3), 789-829 (2006).
- Dey, B., et al. DNA-protein interactions: methods for detection and analysis. Molecular and Cellular Biochemistry. 365 (1-2), 279-299 (2012).
- Hager, G. L., McNally, J. G., Misteli, T.
- Nagy, Z., Tora, L. Distinct GCN5/PCAF-containing complexes function as co-activators and are involved in transcription factor and global histone acetylation. Oncogene. 26 (37), 5341-5357 (2007).
- Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
- Gunther, T., Theiss, J. M., Fischer, N., Grundhoff, A. Investigation of viral and host chromatin by ChIP-PCR or ChIP-Seq analysis. Current Protocols in Microbiology. 40, 11-21 (2016).
- Cotney, J. L., Noonan, J. P. Chromatin immunoprecipitation with fixed animal tissues and preparation for high-throughput sequencing. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (4), 419 (2015).
- Haim, Y., Tarnovscki, T., Bashari, D., Rudich, A. A chromatin immunoprecipitation (ChIP) protocol for use in whole human adipose tissue. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 305 (9), 1172-1177 (2013).
- Castellano-Castillo, D., et al. Chromatin immunoprecipitation improvements for the processing of small frozen pieces of adipose tissue. PLoS One. 13 (2), 0192314 (2018).
- Savic, D., Gertz, J., Jain, P., Cooper, G. M., Myers, R. M. Mapping genome-wide transcription factor binding sites in frozen tissues. Epigenetics Chromatin. 6 (1), 30 (2013).
- Perna, A., Alberi, L. A. TF-ChIP method for tissue-specific gene targets. Frontiers Cell Neuroscience. 13, 95 (2019).
- Allweiss, L., et al. Proliferation of primary human hepatocytes and prevention of hepatitis B virus reinfection efficiently deplete nuclear cccDNA in vivo. Gut. 67 (3), 542-552 (2018).
- Lerdrup, M., Johansen, J. V., Agrawal-Singh, S., Hansen, K. An interactive environment for agile analysis and visualization of ChIP-sequencing data. Nature Structural & Molecular Biology. 23 (4), 349-357 (2016).
- Perna, A., Alberi, L. A. TF-ChIP Method for Tissue-Specific Gene Targets. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 95 (2019).
- Liang, N., Fan, R., Goni, S., Treuter, E. Preparation of Frozen Liver Tissues for Integrated Omics Analysis. Methods in Molecular Biology. 1951, 167-178 (2019).
- Liu, Z., et al. Proteomic and network analysis of human serum albuminome by integrated use of quick crosslinking and two-step precipitation. Scientific Reports. 7 (1), 9856 (2017).
- Singh, A. A., et al. Optimized ChIP-seq method facilitates transcription factor profiling in human tumors. Life Science Alliance. 2 (1), 201800115 (2019).
- Aoki, T., et al. Bi-functional cross-linking reagents efficiently capture protein-DNA complexes in Drosophila embryos. Fly. 8 (1), 43-51 (2014).
- Allweiss, L., Dandri, M. Experimental in vitro and in vivo models for the study of human hepatitis B virus infection. Journal of Hepatology. 64, 1 Suppl 17-31 (2016).
- Krishna, M.
- Tannapfel, A., et al. Histopathological diagnosis of non-alcoholic and alcoholic fatty liver disease. Virchows Archiv. 458 (5), 511-523 (2011).
- Schuppan, D., Afdhal, N. H.
- Allweiss, L., et al. Therapeutic shutdown of HBV transcripts promotes reappearance of the SMC5/6 complex and silencing of the viral genome in vivo. Gut. , 322571 (2021).
- Gerna, G., Kabanova, A., Lilleri, D. Human cytomegalovirus cell tropism and host cell receptors. Vaccines. 7 (3), (2019).
- Echavarria, M.
- Frohlich, J., Grundhoff, A. Epigenetic control in Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection and associated disease. Seminars in Immunopathology. 42 (2), 143-157 (2020).
- Nicoll, M. P., Proenca, J. T., Efstathiou, S. The molecular basis of herpes simplex virus latency. FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 684-705 (2012).
- Thorley-Lawson, D. A., Hawkins, J. B., Tracy, S. I., Shapiro, M. The pathogenesis of Epstein-Barr virus persistent infection. Current Opinion in Virology. 3 (3), 227-232 (2013).
