Summary
هنا، يتم تقديم بروتوكول لتسمية الأيض من الخميرة مع 14حمض الخليك C، الذي يقترن كروماتوغرافيا طبقة رقيقة لفصل الدهون محايدة.
Abstract
الدهون المحايدة (NLs) هي فئة من الجزيئات الحيوية الكارهة للماء والتهم التي تلعب أدوارا رئيسية في الطاقة وداء الدهون. يتم توليفها NLs دي نوفو من أسيتيل-CoA ومتواجدة في المقام الأول في eukaryotes في شكل الدهون الثلاثية (TGs) وستيرول-استر (SEs). يتم الحفاظ على الإنزيمات المسؤولة عن تركيب NLs للغاية من Saccharomyces cerevisiae (الخميرة) للبشر ، مما يجعل الخميرة كائنا نموذجيا مفيدا لتشريح وظيفة وتنظيم إنزيمات التمثيل الغذائي NL. في حين يعرف الكثير عن كيفية تحويل أسيتيل-CoA إلى مجموعة متنوعة من أنواع NL، لا يزال يتم اكتشاف آليات لتنظيم إنزيمات التمثيل الغذائي NL، وكيف يمكن أن يسهم سوء التنظيم في الأمراض الخلوية. وقد تم تطوير العديد من الطرق لعزل وتوصيف أنواع الأنواع NL واستخدامها على مدى عقود من البحث؛ ومع ذلك، لم يناقش بروتوكول كمي وبسيط لتوصيف شامل لأنواع الكائنات الرئيسية في النواة. هنا، يتم تقديم طريقة بسيطة وقابلة للتكيف لتحديد تركيب دي نوفو من الأنواع الرئيسية NL في الخميرة. نحن نطبق 14C-ace حمض الوسم الأيضي إلى جانب طبقة رقيقة الكروماتوغرافيا لفصل وقياس مجموعة متنوعة من NLs الهامة من الناحية الفسيولوجية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تطبيق هذه الطريقة بسهولة لدراسة في معدلات رد فعل الجسم الحي من الإنزيمات NL أو تدهور الأنواع NL مع مرور الوقت.
Introduction
أسيتيل-CoA هو لبنة أساسية من الجزيئات الحيوية المتنوعة بما في ذلك الدهون المحايدة (NLs)، والتي هي بمثابة عملة الجزيئية الحيوية تنوعا لبناء الأغشية، وتوليد ATP، وتنظيم الإشارات الخلية1،2. وينظم تخزينها جزئيا توافر ال NLs لتحويلها إلى أي من هذه المسارات المعنية. قطرات الدهون (LDs)، العضيات السيتوبلازمية تتكون من النوى الكارهة للماء من الدهون الثلاثية (TGs) واستر الستيرول (SEs)، هي مقصورات التخزين الرئيسية لمعظم NLs الخلوية. على هذا النحو، LDs عزل وتنظيم NLs، والتي يمكن أن تتحلل وتستخدم في وقت لاحق للعمليات الكيميائية الحيوية والتمثيل الغذائي3،4. ومن المعروف أن سوء تنظيم NL والبروتينات المرتبطة LD يرتبط مع بداية الأمراض بما في ذلك ضمور الدهون ومتلازمات التمثيل الغذائي5،6. وبسبب هذا، تركز أبحاث LD الحالية بشكل مكثف على كيفية تنظيم توليف NL مكانيا وزمانيا وعبر أنسجة متميزة من الكائنات الحية متعددة الخلايا. نظرا للأدوار الخلوية في كل مكان لNLs، يتم الحفاظ على العديد من الإنزيمات المسؤولة عن توليف وتنظيم NLs في جميع أنحاء eukaryotes7. في الواقع ، حتى بعض prokaryotes مخزن NLs في LDs8. لذلك ، كانت الكائنات الحية النموذجية القابلة للسحب وراثيا مثل Saccharomyces cerevisiae (الخميرة الناشئة) مفيدة لدراسة توليف NL وتنظيمها.
يمكن فصل وتكميم NLs من مستخلصات الخلايا بطرق لا تعد ولا تحصى ، بما في ذلك قياس الطيف اللوني الكتلي للغاز (GC-MS) ، والكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) ، وقياس الطيف الكتلي السائل فائق الأداء (UPLC-MS)9و10و11. ولعل أبسط طريقة لفصل NLs هو عن طريق طبقة رقيقة الكروماتوغرافيا (TLC)، والذي يسمح للقياس الكمي الكثافة اللاحقة من منحنى قياسي12،13. على الرغم من أن TLC يوفر فقط فصل مسار الحبيبات من NLs، فإنه لا يزال تقنية قوية لأنها غير مكلفة، وأنه يسمح لفصل سريع من NLs من عدة عينات في وقت واحد. اثنين من أكبر التحديات التي تواجه دراسة NLs عبر TLC هي: 1) مجموعة واسعة من وفرة الخلوية من الأنواع NL وسيطة لها، و 2) مجموعة من الميل المائي / hydrophobicity من وسيطة الدهون داخل مسارات توليف NL. وبالتالي، فإن التحديد الكمي لأنواع الأنواع من الكائنات البرية عبر TLC يقتصر عادة على أكثر الأنواع وفرة؛ ومع ذلك، يمكن إدخال 14C-خليك حمض شعري يعزز بشكل كبير الكشف عن وسيطة وفرة منخفضة داخل مسارات NL. يتم تحويل حمض الخليك بسرعة إلى أسيتيل-CoA بواسطة أسيتيل-CoA synthetase ACS214، مما يجعل 14حمض C-الخليك ركيزة مناسبة للتكبيل الإشعاعي في الخميرة15. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تحقيق فصل كل من NLs الكارهة للماء والوسيطة المائية من NLs من قبل TLC من خلال استخدام أنظمة المذيبات المتعددة16. هنا، يتم تقديم طريقة لفصل NLs باستخدام 14C-ace حمض التمثيل الغذائي وضع العلامات في الخميرة. يتم عزل الدهون المسماة خلال فترة النبض في وقت لاحق من خلال بروتوكول عزل الدهون الكلي الراسخ17، يليه فصل أنواع NL بواسطة TLC. تطوير لوحات TLC من قبل كل من التصوير الشعاعي التلقائي لتصور الدهون المسماة ، ورذاذ كيميائي لتصور مجموع الدهون ، ويسمح لطرق متعددة للقياس الكمي. يمكن أيضا استخراج أشرطة الدهون الفردية بسهولة من لوحة TLC باستخدام شفرة حلاقة ، ويمكن استخدام عد التلألؤ لتحديد كمية المواد التي تحمل علامة إشعاعية داخل النطاق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. نمو ووضع العلامات على خلايا الخميرة مع 14حمض الخليك C
- تلقيح ثقافة الخميرة عن طريق اختيار مستعمرة من لوحة والاستغناء عنها في 20 مل من الوسائط الاصطناعية كاملة (SC) التي تحتوي على 2٪ dextrose (انظر الملف التكميلي لوصفة وسائل الإعلام SC). احتضان عند 30 درجة مئوية لليلة واحدة مع اهتزاز في 200 دورة في الدقيقة.
ملاحظة: تختلف حالة النمو وحجم العينة والعلاج استنادا إلى الدهون (الدهون) ذات الاهتمام. قبل إجراء التجارب الكاملة، ينبغي تحديد ظروف النمو المثلى وحجم الثقافة تجريبيا. يناقش هذا البروتوكول التسمية الإشعاعية لثقافات الخميرة التي تزرع إلى مرحلة ثابتة ، وهي مرحلة نمو عندما يتباطأ نمو الغشاء الحيوي والخلايا ، وتوليف NL نشط للغاية. - قياس OD600 من ثقافة بين عشية وضحاها باستخدام مطياف وتمييع ثقافة خلايا الخميرة إلى ODالنهائي 600 من 0.2 في 50 مل من وسائل الإعلام SC الطازجة التي تحتوي على 2٪ dextrose. تنمو الخلايا لمدة 24 ساعة، أو حتى أنها قد وصلت إلى مرحلة ثابتة (والتي تعرف عادة من قبل بطانة مسطحة من الخلية مضاعفة قياس OD600).
- قبل تجميع الخلايا، قم بإجراء المخزن المؤقت للإرواء (راجع ملف تكميلي للحصول على التفاصيل). جعل اثنين من aliquots 20 مل من المخزن المؤقت للإرواء لكل عينة (أي 40 مل إخماد العازلة لكل عينة) وتقسيم بالتساوي إلى اثنين من أنابيب مخروطية 50 مل). تخزين الاقتباسات العازلة التبريد في -80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.
- بمجرد أن تصل الثقافات إلى مرحلة OD أو النمو المطلوبة ، اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 4100 × غرام لمدة 10 دقائق. بينما توجد العينات في جهاز الطرد المركزي، قم بإعداد وسائط التسبيس الإشعاعي بإضافة ملح الصوديوم بحمض الخليك[1-14C] إلى وسائط SC الخالية من الدكستروز بتركيز نهائي قدره 10 ميكروسي/مل.
تنبيه: يجب ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) في جميع الأوقات عند العمل مع المواد المشعة. اتبع دائما الإرشادات المحلية لتخزين واستخدام والتخلص من المواد المشعة بشكل صحيح.
ملاحظة: يجب تعديل تركيز 14حمض C-acetic في وسائط وضع العلامات ووقت حضانة التسمية الإشعاعية وفقا للم المستقلب (المستقلب) المثير للاهتمام. هنا ، يتم استخدام حضانة نبض 20 دقيقة من العلامات الإشعاعية ، وهو ما يكفي لتسمية أنواع NL بمجموعة من الوفرة. - إزالة supernatant من الخلايا بيليه، وغسل بيليه الخلية مرة واحدة مع 20 مل من وسائل الإعلام SC خالية من دكستروز عن طريق إعادة تعليق بيليه مع ماصة. جمع الخلايا مرة أخرى عن طريق الطرد المركزي في 4100 × ز لمدة 5 دقائق.
- إعادة تشغيل الخلايا في 1 مل من وسائط SC خالية من dextrose، ونقل الخلايا إلى أنبوب الطرد الدقيق 2 مل المسمى. جمع الخلايا مرة أخرى عن طريق الطرد المركزي في 4100 × ز لمدة 2 دقيقة.
- إعادة تشغيل الخلايا مرة أخرى في 500 ميكرولتر من وسائط SC الخالية من دكستروز. تبريد جهاز طرد مركزي مجهز بأنابيب مخروطية سعة 50 مل إلى -10 درجات مئوية أو على أقل درجة حرارة.
- ابدأ فترة التسمية الإشعاعية بإضافة 500 ميكرولتر بسرعة من وسائط التهيؤ الإشعاعي إلى كل 500 ميكرولتر من تعليق الخلية (تركيز حمض C-acetic النهائي 14= 5 μCi/mL). احتضان الأنابيب في حاضنة دوارة عند 30 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة و 2 دقيقة قبل نهاية فترة وضع العلامات ، ونقل واحد 20 مل من الكوت من عازل التبريد لكل عينة من الفريزر -80 درجة مئوية إلى دلو من الثلج
- بمجرد انتهاء فترة التسمية الإشعاعية ، استخدم ماصة لإغراق عينة 1 مل بأكملها في 20 مل من المخزن المؤقت لإرواء التبريد. دوامة أنابيب مخروطية لمدة 5-10 ق لضمان أن العينة قد تم خلطها تماما مع المخزن المؤقت التبريد. احتضان العينات في إخماد العازلة لمدة 2 دقيقة على الجليد.
- جمع بيليه الخلية عن طريق الغزل في جهاز طرد مركزي في 5000 × ز لمدة 3 دقائق تعيين إلى -10 درجة مئوية أو على الإعداد أدنى درجة حرارة. بينما تدور أنابيب العينة ، قم بنقل مجموعة أخرى من المغذيات العازلة من الفريزر -80 درجة مئوية إلى دلو مليء بالثلج (أي أنبوب واحد سعة 20 مل من المخزن المؤقت لإرواء العينة).
- إزالة سعة التخزين المؤقت التبريد من الكريات الخلية واستبداله مع 20 مل الطازجة والباردة، والتخزين المؤقت التبريد. دوامة ويهز العينات حتى تم طرد بيليه من الجزء السفلي من الأنبوب المخروطي وإعادة الإنفاق بالكامل في إخماد العازلة. طرد العينات مرة أخرى في 5000 x ز لمدة 3 دقائق في -10 درجة مئوية لجمع الخلايا.
- مرة واحدة هي بيليه الخلايا، وإزالة تماما كل عازلة التبريد من العينات عن طريق صب قبالة supernatant وإزالة الزائدة مع ماصة. تخزين الأنابيب عند -80 درجة مئوية لمزيد من المعالجة.
2. عزل مجموع الدهون من الخميرة
ملاحظة: يستند البروتوكول التالي لعزل الدهون على طريقة راسخة ومستعملة بشكل متكرر تستخرج بكفاءة معظم أنواع الدهون المحايدة17،18.
تنبيه: عند استخدام المذيبات العضوية، ارتد دائما معدات الوقاية الشخصية المناسبة واعمل داخل غطاء الدخان عندما يكون ذلك ممكنا. أثناء استخراج الدهون، تجنب استخدام البلاستيك التي لا تتوافق مع المذيبات العضوية. أنابيب البولي بروبلين مناسبة للبروتوكول التالي.
- وزن 0.3 غرام من الخرز الزجاجي الحمضية غسلها لكل عينة وتخزينها في أنابيب الطرد المركزي 2 مل على الجليد. إزالة الكريات الخلية من الفريزر -80 درجة مئوية والاحتفاظ بها على الجليد. إضافة 350 ميكرولتر الميثانول و 700 ميكرولتر الكلوروفورم إلى كل عينة، وإعادة الإنفاق، ونقلها إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيق التي تحتوي على حبات زجاجية وزنها مسبقا.
- خلايا الليس عن طريق تحريك الأنابيب على دوامة 3x لمدة 1 دقيقة، مع حضانات 30 ق على الجليد بين التحريضات. بدلا من ذلك، يمكن أن يتم lysed الخلايا باستخدام الخافض حبة مصغرة لمدة ثلاث دورات 1 دقيقة. حفظ 25-30 ميكرولتر من lysate الخلية بأكملها في أنبوب منفصل لعد التلألؤ.
ملاحظة: سيتم استخدام اللوات المحفوظة لتحديد الكمية النسبية من النظائر المشعة التي تناولتها كل عينة خلال فترة النبض، والتي ستؤثر على كمية كل عينة محملة على لوحة TLC. وقد نوقش هذا الأمر في الخطوة 3-2. - صب كامل محتويات أنبوب الطرد المركزي 2 مل في أنبوب الطرد المركزي الزجاج 15 مل [أنبوب A]. اغسل أنابيب الطرد المركزي الدقيق سعة 2 مل بإضافة 1 مل من الميثانول والدوامات لمدة 10-15 s. نقل 1 مل من الميثانول يغسل إلى أنبوب A وإضافة 2 مل من الكلوروفورم إلى أنبوب A تليها 400 ميكرولتر من الماء لحجم عينة النهائي من 4.45 مل.
- عينات دوامة لمدة دقيقة واحدة تليها 5 دقائق الطرد المركزي في 1000 x ز. بعد الطرد المركزي، يجب فصل المراحل المائية (العلوية) والعضوية (السفلية) بوضوح بصريا مع وجود حطام الخلية في الواجهة.
- باستخدام ماصة باستور زجاجية، اجمع المرحلة العضوية من الأنبوب A وانتقل إلى أنبوب طرد مركزي زجاجي جديد سعة 15 مل (الأنبوب B). إضافة 1 مل من 1M KCl إلى أنبوب B. إلى أنبوب A، إضافة 1 مل من الميثانول و 2 مل من الكلوروفورم، و 200 ميكرولتر ميليل مياه ميليكيو. كرر خطوات الدوامة والطرد المركزي على الأنبوب A.
- مرة أخرى جمع المرحلة العضوية من أنبوب A وإضافته إلى أنبوب B. التخلص من أنبوب A في حاوية مناسبة. دوامة أنبوب B لمدة 1 دقيقة تليها 5 دقيقة الطرد المركزي في 1000 x ز.
- إزالة الطبقة المائية العليا من أنبوب B والتخلص منها. إضافة 1 مل من 1 M KCl الطازجة مرة أخرى إلى أنبوب B وتكرار دوامة / خطوة الطرد المركزي. بمجرد فصل الطبقات، اجمع الطبقة العضوية السفلية بأكملها بعناية في قارورة زجاجية تحمل علامة 4 مل.
ملاحظة: في هذه الخطوة، يمكن تخزين مستخلصات الدهون عند -80 درجة مئوية، أو يمكن متابعة البروتوكول لفصل TLC من الدهون.
3. فصل وتكميم NLs المسمى بالنظائر المشعة بواسطة اللونيات طبقة رقيقة
- إذا وضعت مقتطفات الدهون في -80 درجة مئوية، وجلب ببطء إلى درجة حرارة الغرفة عن طريق احتضان على الجليد وبعد ذلك على مقاعد البدلاء. تتبخر تماما المذيبات من مقتطفات الدهون عن طريق فراغ التجفيف أو باستخدام تيار لطيف من الغاز الخامل (على سبيل المثال، الأرجون أو النيتروجين). وفي الوقت نفسه، قبل تسخين الفرن إلى 145 درجة مئوية لتسخين لوحة TLC.
- قبل تحميل العينات على لوحة TLC، حدد الكميات النسبية من البيل المشع التي تناولتها الخلايا. ماصة 10 ميكرولتر من lysate الخلية بأكملها من الخطوة 2.2 إلى قارورة 6 مل زجاج التلألؤ، إضافة 6 مل من السائل التلألؤ ووضع قوارير في رف. استخدم عداد التلألؤ لقياس cpm أو dpm لكل عينة باستخدام خيار العد الحامل الواحد المحدد لوقت عد 1 دقيقة. قياس كل خلية كاملة lysate في مكررة للحصول على متوسط لكل عينة. ضبط مقدار التحميل وفقا لنوع أو عينة مرجعية برية
ملاحظة: يمكن تحديد مقدار كل عينة لتحميلها على لوحة TLC باستخدام المعادلة التالية: (متوسط عدد العينات)/(متوسط عدد المراجع) x حجم التحميل المطلوب. فعلى سبيل المثال، إذا كان من المقرر تحميل 20 ميكرولتر من العينة المرجعية على لوحة TLC، ويبلغ متوسط عددها 000 1، فإن عينة تجريبية يبلغ متوسط عددها 000 2 ميلليون سيكون لها 10 ميكرولتر محملة على لوحة TLC. - إعادة تشكيل عينة الدهون في 40-50 ميكرولتر من 1:1 (v/v٪) الكلوروفورم: الميثانول عن طريق الدوامة لمدة 5 دقائق. إعداد 101 مل من المذيبات المرحلة المتنقلة في اسطوانة تخرج الزجاج (انظر قسم النتائج التمثيلية للحصول على مثال على فصل الأنواع NL الرئيسية من قبل 50:40:10:1 (v/v/v/v٪) Hexane:البترول الأثير:ديثيل الأثير: مذيب حمض الخليك).
- صب المذيبات في غرفة TLC الزجاج تحتوي على 20 × 20 TLC وسادة التشبع وغطاء ضيق المناسب. إعداد توجيه 20 × 20 هلام السيليكا 60 G لوحة عن طريق وضع علامة بلطف خط 1.5 سم فوق الجزء السفلي من لوحة باستخدام قلم رصاص. يحدد الخط الأصل ومكان تحميل الدهون. أسفل الخط، قم بتسمية العينة التي سيتم تحميلها في كل حارة بلطف. بمجرد إعداد لوحة TLC ، احتضن الطبق في فرن 145 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل لتسخين الطبق مسبقا وإزالة أي رطوبة زائدة.
- بمجرد تسخين اللوحة بما فيه الكفاية ، وتشبع لوحة التشبع TLC بالمذيبات ، قم بإزالة لوحة TLC من الفرن وشرع على الفور في تحميل لوحة TLC. تحميل لوحة في حين أنها دافئة يضمن تبخر المذيبات السريعة. لكل نوع من أنواع الدهون ذات الاهتمام، قم بتحميل 5-20 ميكروغرام من معيار الدهون المنقى على ممر من لوحة TLC لتتبع الانفصال والمسافة المتوقعة للهجرة. باستخدام ماصة، بقعة 5μL من العينة على أصل كل حارة تقع 1.5 سم فوق الجزء السفلي من لوحة TLC. تكرار تحميل 5 بقع ميكرولتر حتى 20-40 ميكرولتر من العينة قد تم تحميلها في كل حارة.
ملاحظة: يمكن إضافة 5-20 ميكروغرام من الدهون المنقية غير المبطنة إلى كل مسار عينة كمقتفيات يمكن تلطيخها وتصورها بعد فصل TLC من الدهون. وجود معيار ملطخ يسمح لتتبع سهلة واختناق من عصابات الدهون ذات اللاتى لالاشعاعية لعد التلألؤ اللاحقة. سيتم تحديد المعايير المنقى التي يتم تحميلها على لوحة من قبل الأنواع NL من الفائدة. راجع قسم النتائج التمثيلية للحصول على أمثلة لفصل حمض الأوليك (FFA)، 1,2 ديوليويل-غليسيرول (DG)، تريولين (TG)، الكوليسترول (تشول)، كوليستيريل لينوليات (SE)، والسكوالين في الممرات المجاورة لممرات العينة. - بمجرد تحميل العينات القياسية والتجريبية ، ضع اللوحة في الغرفة النامية وانتظر حتى يصل المذيب إلى أعلى اللوحة (40-60 دقيقة). بمجرد تطوير اللوحة بالكامل، قم بإزالتها من الغرفة واتركها تجف في غطاء الدخان لمدة 20 دقيقة.
- بعد تجفيف اللوحة، قم بتغطيتها بفيلم بلاستيكي ووضعها في كاسيت متطور بشاشة تصوير تلقائي. السماح للوح لتطوير مع الشاشة لمدة 24-48 ساعة.
4. التصور وتكميم الدهون TLC فصل
- قم بإزالة الشاشة من شريط كاسيت متطور ووضعها داخل صورة الفوسفور. حدد خيار التصوير الفوسفوري وطوره على 800-1000 فولت.
ملاحظة: يعطي التصوير الفوسفوري رؤية نوعية للدهون التي تحمل علامات إشعاعية على لوحة TLC. ومع ذلك ، فإن التحديد الكمي للدهون التي تم تسميتها إشعاعيا يتم تحقيقه على أفضل وجه من خلال عد التلألؤ ، والذي يتم وصفه لاحقا. - مزيج 100 مل من ع anisaldehyde الكاشف (انظر الملف التكميلي)وإيداع في زجاجة رذاذ. رش لوحة TLC مع ع أنيسالدهيد الكاشف حتى تشبع السيليكا. خبز لوحة في فرن 145 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، أو حتى ظهرت العصابات.
- لقياس الأنواع الدهنية الفردية باستخدام العد التلألؤ باللاحم الإشعاعي، استخدم شفرة حلاقة لكشط هلام السيليكا من لوحة TLC الزجاجية. نقل كل السيليكا هلام الفرقة المقابلة لنوع واحد من الدهون التي وصفت إشعاعا إلى قارورة التلألؤ الزجاج وإضافة 6 مل السائل التلألؤ. دوامة بقوة حتى تم تخفيض الفرقة السيليكا إلى قطع صغيرة.
- بدلا من ذلك، يمكن استخراج الدهون من شريط هلام السيليكا باستخدام بروتوكول استخراج الدهون في القسم 3. إذا تم استخراج الدهون من هلام السيليكا، تتبخر المذيب تماما كما هو الحال في الخطوة 3.1، وإضافة 6 مل سائل التلألؤ إلى الدهون المجففة. ضع الحامل الذي يحتوي على قنينات التلألؤ في عداد التلألؤ. حدد خيار العد حامل واحد وضبط وقت العد إلى 2 دقيقة لكل قارورة. ستتم طباعة النتائج من عداد التلألؤ ويمكن تصورها كرسم بياني شريطي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذا البروتوكول، أثبتنا أن وضع العلامات والكشف والتحديد الكمي لأنواع NL يمكن تحقيقه من خلال وضع علامات أيضية لحامضC-acetic. يمكن فصل الأنواع الرئيسية NL في نظام المذيبات من 50:40:10:1 (v/v/v/v٪) هيكسان:الأثير البترولي:ديثيل الأثير:حمض الخليك (الشكل 1A, B). التصوير الفوسفوري يسمح لتصور الأحماض الدهنية الحرة المسمى (FFA), triacylglycerol (TG), diacylglycerol (DG), الكوليسترول (تشول), والسكوالين (SQ) (الشكل 1A). على الرغم من أنه يمكن فصل SEs عن الأنواع الأخرى من NL في هذا المذيب ، إلا أنه لا يتم اكتشاف أي منها في التصوير الشعاعي التلقائي بعد نبضة مدتها 20 دقيقة. ويمكن أن يعزى هذا إلى تخليق SE بطيئة خلال المرحلة الثابتة من النمو في الخميرة. كما ثبت أن الأنواع الدهنية النقية يمكن فصلها في هذه الطريقة وتصور في وقت لاحق عن طريق رش لوحة TLC مع ع-anisaldehyde كاشف (الشكل 1B). في حين يتم فصل الأنواع NL بشكل جيد في هذا المذيبات، والأنواع القطبية مثل فوسفاتيديلكولين (PC) البقاء في الأصل(الشكل 1B). من خلال تطبيق فترة مطاردة في وسائل الإعلام الخالية من البيل الإشعاعي بعد النبض ، يمكن قياس التدفق النسبي عبر مسارات NL(الشكل 1C). بعد مطاردة لمدة 10 دقائق ، اختفت المجموعة الرئيسية من SQ ، وارتفع إجمالي تشول. وبالمثل، يرتبط ظهور المدير العام في فترة المطاردة بانخفاض في إشارة FFA.
الشكل 1: 14C-اسيتيك حمض التكسيد الإشعاعي يسمح للكشف عن أنواع NL متعددة. (أ) Autoradiogram من الدهون مفصولة TLC معزولة عن الخميرة تسمية إشعاعية مع 14حمض الخليك C في مرحلة ثابتة. وتشمل الأنواع التي يمكن اكتشافها بوضوح الأحماض الدهنية الحرة (FFA)، والدهون الثلاثية (TG)، دياسيلجليسيرول (DG)، والكوليسترول (تشول)، والسكوالين (SQ). العصابات غير الملساء هي أنواع NL غير معروفة. (ب) الأنواع الدهون النقية مفصولة TLC وتصورها تلطيخ ف أنيسالدهيد. وتشمل الأنواع المرئية جميع الدهون المذكورة في (A) بالإضافة إلى ستيرول-إسترز (SE) والفوسفاتيديلكولين (PC). (ج) Autoradiogram من الدهون مفصولة TLC معزولة عن الخميرة نبض مع 14-حمضالخليك في مرحلة ثابتة تليها فترة مطاردة 10 دقيقة في وسائل الإعلام الخالية من البيل الإشعاعي. ويقابل اختفاء SQ مع زيادة في تشول. ويرافق ارتفاع في المدير العام في فترة مطاردة انخفاض في أنواع FFA. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ملف تكميلي: وصفات للمخازن المؤقتة والوسائط والحلول. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا، يتم تقديم بروتوكول تسمية إشعاعية متعددة لمراقبة كميا توليف الأنواع NL في الخميرة. هذا البروتوكول هو وحدات جدا، والذي يسمح لهذا الإجراء أن ينتهي في غضون 3-6 أيام. بالإضافة إلى ذلك ، توجد ثروة من الأدب على استخدام TLC لفصل أنواع الدهون والأيض ، والتي يجب أن تسمح للمستخدم بالكشف عن العديد من أنواع الدهون ذات الاهتمام مع تغيير بسيط في أنظمة المذيبات TLC16،19. هذا البروتوكول يؤدي إلى فصل وكشف وتكميم الدهون التي تم تسميتها إشعاعيا. ويمكن أيضا أن يقترن فترة مطاردة في وسائل الإعلام غير المسمى للكشف عن وقت دوران NLs المسمى.
وهناك طرق أخرى، مثل HPLC وGC-MS و UPLC-MS توفر دقة أعلى لفصل الدهون وتحديد كميتها؛ ومع ذلك، فإنه عادة ما لا يكون الأمثل لتشغيل عينات ال تسمية إشعاعية من خلال مرض التصلب العصبي المتعدد، على الرغم من أن هذا يمكن التغلب عليها باستخدام النظائر المستقرة. ومع ذلك، توفر طريقة البيلة المشعة هذه حساسية عالية للكشف وبراعة للعديد من أنواع الدهون. ميزة أخرى لهذا البروتوكول مقارنة بالتصلب المتعدد هي القدرة على تحمل التكاليف. TLC فصل الدهون بسيط نسبيا، لا يتطلب معدات باهظة، ويعتمد على المواد المختبرية المشتركة. فيما يتعلق بالقيود: قد لا يمكن اكتشاف بعض الأنواع منخفضة الوفرة، مثل الدهون الليسو، حتى بعد دمج علامة 14C. بالإضافة إلى ذلك ، فإن معظم نهج TLC ليست مناسبة لأوصاف "الدهون" ، بسبب الفصل المحبب للأنواع الدهنية داخل مذيب معين.
الخميرة توفر مريحة، ونظام نموذج قابل للسحب وراثيا لدراسة الدهون عن طريق النهج الكيميائية الحيوية التسمية الإشعاعية. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أنه في خلفيات وراثية محددة، أو خلال ظروف نمو التمثيل الغذائي معينة، يمكن تقليل امتصاص الخلوية من حمض الخليك المشع أو غيرها من الخلايا المشعة. وضع العلامات على الخلايا مع 14حمض الخليك C في غياب الجلوكوز يزيد بقوة امتصاص العلامة المشعة. والحضانات الطويلة في غياب الجلوكوز تزيد نسبيا امتصاص البيلة المشعة؛ ومع ذلك، قد يؤثر هذا أيضا على المسارات المعنية. ولذلك، ينبغي تحديد كفاءة وضع العلامات لحالة نمو معينة قبل اتباع بروتوكول الوسم الإشعاعي لحمض C-acetic ال 14بالكامل. على وجه الخصوص، إيلاء الاهتمام لطول فترة التسمية الإشعاعية. وينبغي أن يبقى وقت وضع العلامات قصيرا قدر الإمكان للكشف عن الأنواع الدهنية ذات الاهتمام. بالإجمال, يسمح هذا إجراء لدراسة من مهمة [دهوند] توليف تفاعلات وينبغي سمحت التحقيق من [نل] تنظيم في خلايا سليمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلفون أنه لا توجد مصالح متنافسة في إعداد هذه المخطوطة.
Acknowledgments
ويود المؤلفون أن يشكروا أعضاء مختبر هين على المساعدة والمشورة المفاهيمية في إنجاز هذه الدراسة. W.M.H. مدعوم بأموال من مؤسسة ويلش (I-1873)، وNIGMS المعاهد القومية للصحة (GM119768)، وصندوق البحوث الطبية آرا Paresghian، وبرنامج العلماء الموهوبين جنوب غرب UT. تم دعم S.R بمنحة برنامج T32 (5T32GM008297).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [1-C14] Acetic acid sodium salt specific activity: 45-60mCi | PerkinElmer | NEC084H001MC | |
| 18:1 1,2 dioleoyl-sn-glycerol | Avanti | 800811O | |
| 200 proof absolute ethanol | Sigma | 459836 | |
| Acid washed glass beads 425-600um | Sigma | G8772 | |
| Amber bulbs for Pastuer pipettes | Fisher | 03-448-24 | |
| Ammonium Sulfate >99% | Sigma | A4418 | |
| Beckman LS6500 scintillation counter | PerkinElmer | A481000 | |
| Chloroform (HPLC grade) | Fisher | C607SK | |
| Cholesterol >99% | Sigma | C8667 | |
| Cholesteryl-linoleate >98% | Sigma | C0289 | |
| Concentrated sulfuric acid | Sigma | 339741 | |
| Corning 50mL conical tubes, polypropylene with centristar cap | Sigma | CLS430829 | |
| Dextrose, anhydrous grade | Sigma | D9434 | |
| Diethyl ether anhydrous grade | Sigma | 296082 | |
| Drying oven | Fisher | 11-475-155 | |
| EcoLume scintillation liquid | VWR | IC88247001 | |
| Eppendorf 5424R centrifuge | Fisher | 05-401-205 | |
| GE Storage phosphor screen | Sigma | GE28-9564-75 | |
| GE Typhoon FLA9500 imager | |||
| Glacial acetic acid, ACS grade | Sigma | 695092 | |
| Glass 6mL scintillation vials | Sigma | M1901 | |
| Glass centrifuge tube caps | Fisher | 14-595-36A | |
| Glass centrifuge tubes | Fisher | 14-595-35A | |
| Glass Pasteur pipette | Fisher | 13-678-20C | |
| Hexane, anhydrous grade | Sigma | 296090 | |
| L-Adenine >99% | Sigma | A8626 | |
| L-Alanine >98% | Sigma | A7627 | |
| L-Arginine >99% | Sigma | A1270000 | |
| L-Asparagine >98% | Sigma | A0884 | |
| L-Aspartate >98% | Sigma | A9256 | |
| L-Cysteine >97% | Sigma | W326305 | |
| L-Glutamic acid monosodium salt monohydrate >98% | Sigma | 49621 | |
| L-Glutamine >99% | Sigma | G3126 | |
| L-Glycine >99% | Sigma | G8898 | |
| L-Histidine >99% | Sigma | H8000 | |
| L-Isoleucine >98% | Sigma | I2752 | |
| L-Leucine >98% | Sigma | L8000 | |
| L-Lysine >98% | Sigma | L5501 | |
| L-Methionine, HPLC grade | Sigma | M9625 | |
| L-Phenylalanine, reagent grade | Sigma | P2126 | |
| L-Proline >99% | Sigma | P0380 | |
| L-Serine >99% | Sigma | S4500 | |
| L-Theronine, reagent grade | Sigma | T8625 | |
| L-Tryptophan >98% | Sigma | T0254 | |
| L-Tyrosine >98% | Sigma | T3754 | |
| L-Uracil >99% | Sigma | U0750 | |
| L-Valine >98% | Sigma | V0500 | |
| Methanol, ACS grade | Fisher | A412 | |
| Oleic acid >99% | Sigma | O1008 | |
| p-anisaldehyde | Sigma | A88107 | |
| Petroleum ether, ACS grade | Sigma | 184519 | |
| Phosphatidylcholine, dipalmitoyl >99% | Sigma | P1652 | |
| Pipettes | Eppendorf | 2231000713 | |
| Potassium chloride, ACS grade | Sigma | P3911 | |
| Sodium Hydroxide pellets, certified ACS | Fisher | S318-100 | |
| Squalene >98% | Sigma | S3626 | |
| Succinic Acid crystalline/certified | Fisher | 110-15-6 | |
| TLC saturation pad | Sigma | Z265225 | |
| TLC silica gel 60G glass channeled plate | Fisher | NC9825743 | No fluorescent indicators |
| Transparency plastic film | Apollo | 829903 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Triolein >99% | Sigma | T7140 | |
| Vortex mixer | Fisher | 02-215-414 | |
| Whatman exposure cassette | Sigma | WHA29175523 | |
| Yeast nitrogen base without ammonium sulfate and amino acids | Sigma | Y1251 |
References
- Konige, M., Wang, H., Sztalryd, C. Role of adipose specific lipid droplet proteins in maintaining whole body energy homeostasis. Biochimica Et Biophysica Acta. 1842 (3), 393-401 (2014).
- Arrese, E. L., Saudale, F. Z., Soulages, J. L. Lipid droplets as signaling platforms linking metabolic and cellular functions. Lipid Insights. 7, 7-16 (2014).
- Walther, T. C., Chung, J., Farese, R. V. Lipid droplet biogenesis. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 491-510 (2017).
- Olzmann, J. A., Carvalho, P. Dynamics and functions of lipid droplets. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (3), 137-155 (2019).
- Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. Balancing the fat: lipid droplets and human disease. EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).
- Ross, R. The pathogenesis of atherosclerosis: A perspective for the 1990s. Nature. 362 (6423), 801-809 (1993).
- Zhang, C., Liu, P. The lipid droplet: A conserved cellular organelle. Protein & Cell. 8 (11), 796-800 (2017).
- Wältermann, M., et al. Mechanism of lipid-body formation in prokaryotes: How bacteria fatten up: Lipid-body formation in prokaryotes. Molecular Microbiology. 55 (3), 750-763 (2004).
- Borrull, A., López-Martínez, G., Poblet, M., Cordero-Otero, R., Rozès, N. A simple method for the separation and quantification of neutral lipid species using GC-MS. European Journal of Lipid Science and Technology. 117 (3), 274-280 (2015).
- Kotapati, H. K., Bates, P. D. Normal phase HPLC method for combined separation of both polar and neutral lipid classes with application to lipid metabolic flux. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1145, 122099 (2020).
- Knittelfelder, O. L., Weberhofer, B. P., Eichmann, T. O., Kohlwein, S. D., Rechberger, G. N. A versatile ultra-high performance LC-MS method for lipid profiling. Journal of Chromatography B. 951-952, 119-128 (2014).
- Ruiz, J. I., Ochoa, B. Quantification in the subnanomolar range of phospholipids and neutral lipids by monodimensional thin-layer chromatography and image analysis. Journal of Lipid Research. 38 (7), 1482-1489 (1997).
- Bui, Q., Sherma, J., Hines, J. K. Using high performance thin layer chromatography-densitometry to study the influence of the prion [RNQ+] and its determinant prion protein Rnq1 on yeast lipid profiles. Separations. 5 (1), 5010006 (2018).
- Pronk, J. T., de Steensma, H., Van Dijken, J. P. Pyruvate metabolism in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 12 (16), Chichester, England. 1607-1633 (1996).
- Buttke, T. M., Pyle, A. L. Effects of unsaturated fatty acid deprivation on neutral lipid synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Bacteriology. 152 (2), 747-756 (1982).
- Touchstone, J. C. Thin-layer chromatographic procedures for lipid separation. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 671 (1-2), 169-195 (1995).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. "Bligh and Dyer" and Folch methods for solid-liquid-liquid extraction of lipids from microorganisms. Comprehension of solvatation mechanisms and towards substitution with alternative solvents. International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 708 (2017).
- Fuchs, B., Süß, R., Teuber, K., Eibisch, M., Schiller, J. Lipid analysis by thin-layer chromatography-A review of the current state. Journal of Chromatography A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).
