Summary
Burada, nötr lipitlerin ayrılması için ince tabaka kromatografisi ile birleştirilen 14C-asetik asit ile mayanın metabolik etiketlemesi için bir protokol sunulmaktadır.
Abstract
Nötr lipitler (NL'ler), enerji ve lipid homeostazında kilit roller oynayan hidrofobik, şarjsız biyomoleküller sınıfıdır. NL'ler asetil-CoA'dan sentezlenir de novo ve öncelikle ökaryotlarda trigliseritler (TG' ler) ve sterol esterleri (SE' ler) şeklinde bulunur. NL'lerin sentezinden sorumlu enzimler, Saccharomyces cerevisiae'den (maya) insanlara yüksek oranda korunur ve mayayı NL metabolizma enzimlerinin işlevini ve düzenlemesini parçalamak için yararlı bir model organizma haline getirir. Asetil-CoA'nın çeşitli NL türlerine nasıl dönüştürüldüğü hakkında çok şey bilinmesine gerek varken, NL metabolizma enzimlerini düzenleme mekanizmaları ve yanlış düzenlemenin hücresel patolojilere nasıl katkıda bulunabileceği hala keşfedilmektedir. NL türlerinin izolasyonu ve karakterizasyonu için onlarca yıllık araştırmalar boyunca çok sayıda yöntem geliştirilmiş ve kullanılmıştır; bununla birlikte, büyük NL türlerinin kapsamlı karakterizasyonu için nicel ve basit bir protokol tartışılmamıştır. Burada, mayadaki büyük NL türlerinin de novo sentezini ölçmek için basit ve uyarlanabilir bir yöntem sunulmuştur. Fizyolojik açıdan önemli NL'lerin çeşitli aralıklarını ayırmak ve ölçmek için ince tabaka kromatografisi ile birleştirilmiş 14C-asetik asit metabolik etiketleme uyguluyoruz. Ayrıca, bu yöntem NL enzimlerinin in vivo reaksiyon oranlarını veya NL türlerinin zaman içinde bozulmasını incelemek için kolayca uygulanabilir.
Introduction
Asetil-CoA, membran oluşturmak, ATP üretmek ve hücre sinyalini düzenlemek için çok yönlü bir biyomoleküler para birimi olarak hizmet veren nötr lipitler (NL' ler) dahil olmak üzere çeşitli biyomoleküllerin temel yapı taşıdır1,2. Bu ilgili yollardan herhangi birine sokılacak NL'lerin kullanılabilirliği, kısmen depolamaları tarafından düzenlenir. Lipid damlacıkları (LD'ler), trigliseritlerin hidrofobik çekirdeklerinden (TG' ler) ve sterol esterlerinden (SE) oluşan sitoplazmik organeller, çoğu hücresel NCI'nın ana depolama bölmeleridir. Bu nedenle, LD'ler, biyokimyasal ve metabolik süreçler için bozulabilen ve daha sonra kullanılabilecekNL'leriinzal eder ve düzenler 3,4. NL ve LD ilişkili proteinlerin yanlış düzenlenmesinin lipodystrofi ve metabolik sendromlar5,6dahil olmak üzere patolojilerin başlangıcı ile ilişkili olduğu bilinmektedir. Bu nedenle, mevcut LD araştırmaları yoğun bir şekilde NL sentezinin mekansal, zamansal ve çok hücreli organizmaların farklı dokularında nasıl düzenlendiğine odaklanmıştır. NL'ler için her yerde bulunan hücresel roller nedeniyle, NL'lerin sentezi ve düzenlenmesinden sorumlu birçok enzim ökaryotlar boyunca korunur7. Gerçekten de, bazı prokaryotes bile LD'lerde NL'leri depolar8. Bu nedenle, Saccharomyces cerevisiae (tomurcuklanan maya) gibi genetik olarak çekilebilir model organizmalar NL sentezi ve regülasyonu için yararlı olmuştur.
NL'lerin hücre özlerinden ayrılması ve nicelleştirilmesi, gaz kromatografisi-kütle spektrometresi (GC-MS), yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ve ultra performanslı sıvı kromatografi-kütle spektrometresi (UPLC-MS) 9,10,11dahil olmak üzere sayısız şekilde gerçekleştirilebilir. NL'leri ayırmak için belki de en basit yöntem, standart bir eğri12 , 13'ten sonraki densitometrik niceleme sağlayan ince tabaka kromatografisi (TLC) yoluyladır. TLC, NL'lerin yalnızca ders taneli bir ayrımını sağlasa da, ucuz olduğu için güçlü bir teknik olmaya devam eder ve AYNı anda birkaç örnekten NL'lerin hızlı bir şekilde ayrılmasına izin verir. TLC aracılığıyla NIS'lerin incelenmesinin karşılaştığı en önemli zorluklardan ikisi şunlardır: 1) NL türlerinin ve aralarının geniş hücresel bolluk yelpazesi ve 2) NL sentez yolları içindeki lipid aralarının hidrofililik / hidrofobikliği aralığı. Sonuç olarak, NL türlerinin TLC aracılığıyla nicelemesi tipik olarak en bol türlerle sınırlıdır; bununla birlikte, 14C-asetik asit radyolabelinin tanıtılması, NL yollarında düşük bolluklu ara maddelerin tespitini önemli ölçüde artırabilir. Asetik asit, asetil-CoA sentezi ACS214tarafından hızla asetil-CoA'ya dönüştürülür, bu da 14C-asetik asidi mayada uygun bir radyolabelingsubstratı yapar 15. Ek olarak, hem hidrofobik NCI'lerin hem de NL'lerin hidrofilik aralarının ayrılması, çoklu solvent sistemleri kullanılarak TLC tarafından elde edilebilir16. Burada, mayada 14C-asetik asit metabolik etiketleme kullanılarak NL'lerin ayrılması için bir yöntem sunulmuştur. Nabız döneminde etiketlenen lipitler daha sonra iyi kurulmuş bir toplam lipid izolasyon protokolü17, ardından NL türlerinin TLC ile ayrılması. Etiketli lipitleri görselleştirmek için hem otoradyografi hem de toplam lipitleri görselleştirmek için kimyasal bir sprey ile TLC plakalarının geliştirilmesi, birden fazla niceleme yöntemine izin sağlar. Bireysel lipid bantları da jilet kullanılarak TLC plakasından kolayca çıkarılabilir ve bant içindeki radyolabelli malzeme miktarını ölçmek için scintillation sayımı kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Maya hücrelerinin 14C-asetik asit ile büyümesi ve etiketlenerek etiketlenerek
- Bir tabaktan bir koloni seçerek ve % 2 dekstroz içeren 20 mL sentetik komple (SC) ortama dağıtarak bir maya kültürünü aşılayın (BKZ. SC ortamı tarifi için Ek Dosya). 200 rpm'de sallanarak bir gece boyunca 30 °C'de kuluçkaya yaslanın.
NOT: Büyüme durumu, örnek hacmi ve tedavi, ilgi çekici lipitlere göre farklılık gösterecektir. Tam deneyler yapmadan önce, optimal büyüme koşulları ve kültür hacimleri ampirik olarak belirlenmelidir. Bu protokol, sabit faza yetiştirilen maya kültürlerinin radyolabelingini, biyo-membran ve hücre büyümesinin yavaşladığında bir büyüme aşamasını ve NL sentezinin çok aktif olduğunu tartışır. - Spektrofotometre kullanarak geceleme kültürünün OD600'ünü ölçün ve maya hücre kültürünü% 2 dekstroz içeren50 mL taze SC medyasında 0,2'nin son OD 600'üne seyreltin. Hücreleri 24 saat boyunca veya sabit faza ulaşana kadar büyütün (genellikle OD600 ölçümünü iki katına çıkaran hücrenin düz bir astarı ile tanımlanır).
- Hücreleri toplamadan önce, söndürme arabelleği yapın (ayrıntılar için Ek Dosya'ya bakın). Her numune için iki adet 20 mL'lik söndürme tamponu yapın (yani, her örnek için 40 mL söndürme tamponu) ve iki adet 50 mL konik tüpe eşit olarak bölün. Söndürme tampon aliquots'u ileride kullanmak üzere -80 °C'de saklayın.
- Kültürler istenen OD veya büyüme aşamasına ulaştıktan sonra, hücreleri 10 dakika boyunca 4.100 x g'da santrifüjleyarak toplayın. Numuneler santrifüjdeyken, dekstrozsuz SC ortamına 10 μCi/mL'lik son konsantrasyonda[1- 14C] asetik asit sodyum tuzu ekleyerek radyolabeling ortamı hazırlayın.
DİkKAT: Radyoaktif malzemelerle çalışırken uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) her zaman giyilmelidir. Radyoaktif maddelerin uygun şekilde depolanmasını, kullanımını ve bertaraf edilmesini için her zaman yerel kurallara uyun.
NOT: Hem etiketleme ortamındaki 14C-asetik asit konsantrasyonu hem de radyolabeling inkübasyon süresi ilgi çekici metabolitlere göre ayarlanmalıdır. Burada, NL türlerini bir dizi bollukla etiketlemek için yeterli olan 20 dakikalık bir radyolabeling darbe inkübasyonu kullanılır. - Üstnatantı peletlenmiş hücrelerden çıkarın ve peletin pipetle yeniden canlanarak hücre peletini 20 mL dekstrozsuz SC ortamıyla bir kez yıkayın. 5 dakika boyunca 4.100 x g'da santrifüj yaparak hücreleri tekrar toplayın.
- Hücreleri 1 mL dekstroz içermeyen SC ortamına yeniden boşaltın ve hücreleri etiketli 2 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 2 dakika boyunca 4.100 x g'da santrifüj yaparak hücreleri tekrar toplayın.
- Hücreleri 500 μL dekstroz içermeyen SC medyasında bir kez daha yeniden biriktirin. 50 mL konik borular için donatılmış bir santrifüjü -10 °C'ye veya en düşük sıcaklık ayarına önceden soğutun.
- Her 500 μL hücre süspansiyonuna (son 14C-asetik asit konsantrasyonu = 5 μCi/mL) hızlı bir şekilde 500 μL radyolabeling ortamı ekleyerek radyolabeling dönemine başlayın. Etiketleme süresinin bitiminden 2 dakika önce 30 °C'de dönen bir inkübatörde tüpleri kuluçkaya yaslanın, -80 °C dondurucudan bir kova buz için her numune için bir adet 20 mL'lik söndürme tamponu aktarın
- Radyolabeling süresi sona erdiğinde, 1 mL örneğin tamamını 20 mL soğuk söndürme tamponuna daldırmak için bir pipet kullanın. Numunenin söndürme tamponu ile iyice karıştırıldığından emin olmak için 5-10 sn konik tüpleri vorteks edin. Numuneleri buz üzerinde 2 dakika boyunca söndürme tamponunda kuluçkaya yatırın.
- -10 °C'ye ayarlanmış 3 dakika boyunca veya en düşük sıcaklık ayarında 5.000 x g'da bir santrifüjde dönerek hücre peletini toplayın. Numune tüpleri dönerken, -80 °C dondurucudan başka bir söndürme tamponu aliquot setini buzla dolu bir kovaya aktarın (yani, numune başına bir adet 20 mL'lik söndürme tamponu tüpü).
- Söndürme tamponu üstnatantı hücre peletlerinden çıkarın ve 20 mL taze, soğuk, söndürme tamponu ile değiştirin. Vorteks ve pelet konik tüpün dibinden yerinden çıkana ve söndürme tamponunda tamamen yeniden depolanana kadar örnekleri çalkalayın. Hücreleri toplamak için numuneleri -10 °C'de 3 dakika boyunca 5.000 x g'da tekrar santrifüjlayın.
- Hücreler peletlendikten sonra, üsttan dökerek ve fazlalıkları bir pipetle çıkararak tüm söndürme tamponunu numunelerden iyice çıkarın. Daha fazla işlem için tüpleri -80 °C'de saklayın.
2. Toplam lipitlerin mayadan izolesi
NOT: Lipid izolasyonu için aşağıdaki protokol, çoğu nötr lipit türünü verimli bir şekilde ayıklayan köklü ve sık kullanılan bir yönteme dayanmaktadır17,18.
DİkKAT: Organik çözücü kullanırken, her zaman uygun KKD giyin ve mümkün olduğunda bir duman davlumbazının içinde çalışın. Lipid ekstraksiyonu sırasında, organik çözücülerle uyumsuz plastikler kullanmaktan kaçının. Polipropilen tüpler aşağıdaki protokol için uygundur.
- Her numune için 0,3 g asitle yıkanmış cam boncuk tartın ve bunları buz üzerinde 2 mL mikrosantrifüj tüplerinde saklayın. Hücre topaklarını -80 °C dondurucudan çıkarın ve buzda tutun. Her numuneye 350 μL metanol ve 700 μL kloroform ekleyin, yeniden ıslatın ve önceden tartılmış cam boncuklar içeren mikrosantrifüj tüplerine aktarın.
- Lyse hücreleri, bir girdap üzerindeki tüpleri 1 dakika boyunca 3x ile ajitasyonlar arasında buz üzerinde 30 s inkübasyon ile. Alternatif olarak, hücreler üç 1 dakikalık döngüler için mini boncuk çırpıcı kullanılarak yutlanabilir. Scintillation sayımı için ayrı bir tüpte 25-30 μL tüm hücre lisatını sakla.
NOT: Kaydedilen lisat, darbe süresi boyunca her numune tarafından alınan ve TLC plakasına yüklenen her numunenin miktarını etkileyecek olan göreceli radyoizotop miktarını belirlemek için kullanılacaktır. Bu, 3.2 adımında daha fazla tartışılmıştır. - 2 mL mikrosantrifüj tüpünün tüm içeriğini 15 mL cam santrifüj tüpüne [Tüp A] dökün. 2 mL mikrosantrifüj tüplerini 1 mL metanol ekleyerek ve 10-15 sn boyunca girdaplayarak yıkayın. 1 mL metanol yıkamayı A tüpüne aktarın ve A tüpüne 2 mL kloroform ve ardından 4,45 mL'lik son numune hacmi için 400 μL su ekleyin.
- 1 dakika boyunca Vortex örnekleri ve ardından 1.000 x g'da5 dakikalık bir santrifüjleme. Santrifüjlemeden sonra, sulu (üst) ve organik (alt) aşamalar, arayüzde yatan hücre kalıntıları ile açıkça görsel olarak ayrılmalıdır.
- Cam pastör pipet kullanarak, organik fazı A tüpünden toplayın ve yeni bir 15 mL cam santrifüj tüpüne (Tüp B) geçin. B tüpüne 1 mL 1M KCl ekleyin. A tüpüne 1 mL metanol ve 2 mL kloroform ve 200 μL MiliQ su ekleyin. A tüpündeki girdap ve santrifüj adımlarını tekrarlayın.
- Organik fazı bir kez daha A tüpünden toplayın ve B tüpüne ekleyin. Vortex tüp B 1 dakika boyunca 1.000 x g'da5 dk santrifüjleme.
- Üst sulu tabakayı B tüpünden çıkarın ve atın. B tüpüne 1 mL taze 1 M KCl ekleyin ve girdap/santrifüjleme adımını tekrarlayın. Katmanlar ayrıldıktan sonra, tüm alt organik tabakayı etiketli 4 mL cam şişeye dikkatlice toplayın.
NOT: Bu adımda, lipid özleri -80 °C'de saklanabilir veya lipitlerin TLC ayrımı için protokole devam edilebilir.
3. Radyoizotop etiketli NL'lerin ince tabaka kromatografisi ile ayrılması ve nicelleştirilmesi
- Lipid özleri -80 ° C'ye yerleştirilmişse, yavaşça buzda ve daha sonra bir tezgahta inkübe ederek oda sıcaklığına getirin. Lipid özlerinden elde edilen çözücüyü vakumla kurutarak veya hafif bir inert gaz akışı (örneğin, argon veya azot) kullanarak tamamen buharlaştır. Bu arada, TLC plakasını ısıtmak için fırını 145 °C'ye ısıtın.
- Numuneler TLC plakasına yüklenmeden önce, hücreler tarafından alınan göreceli radyolabel miktarlarını belirleyin. Pipet 10 μL tüm hücrenin 2.2 adımından 6 mL cam scintillation şişesine dökülür, 6 mL scintillation sıvısı ekleyin ve şişeleri bir rafa yerleştirin. 1 dakika sayım süresine ayarlanmış sayım tek raf seçeneğini kullanarak her numunenin cpm veya dpm'sini ölçmek için bir scintillation sayacı kullanın. Her örnek için bir ortalama elde etmek için her hücrenin tamamını yinelenen olarak ölçün. Yükleme miktarını vahşi bir türe veya referans örneğine göre ayarlama
NOT: TLC plakasına yüklenecek her numunenin miktarı aşağıdaki denklem kullanılarak belirlenebilir: (ortalama örnek sayıları)/(ortalama referans sayıları) x istenen yükleme hacmi. Örneğin, referans örneğinin 20 μL'si TLC plakasına yüklenecekse ve ortalama 1.000 sayısına sahipse, ortalama sayısı 2.000 olan deneysel bir numunenin TLC plakasına 10 μL'si yüklenecektir. - Örnek lipitleri 40-50 μL 1:1 (v/v%) kloroform:methanol içinde 5 dakika boyunca girdapla yeniden inşa edin. Cam mezunu bir silindirde mobil faz çözücüsünü 101 mL hazırlayın (50:40:10:1 (v/v%) Hexane:Petrol eter:Dietil eter:Asetik asit çözücü) ile büyük NL türlerinin ayrılması örneği için Temsili Sonuçlar bölümüne bakın).
- Çözücüyü 20 x 20 TLC doygunluk pedi ve sıkı oturan bir kapak içeren bir cam TLC haznesine dökün. Bir kalem kullanarak plakanın altından 1,5 cm yukarıda bir çizgiyi hafifçe işaretleyerek kanallı 20 x 20 silika jel 60 G plaka hazırlayın. Hat, kökeni ve lipitlerin nereye yüklendiğini belirler. Çizginin altında, her şeride yüklenecek örneği hafifçe etiketle. TLC plakası hazırlandıktan sonra, plakayı önceden ısıtmak ve fazla nemi gidermek için plakayı 145 °C fırında en az 30 dakika kuluçkaya bırakın.
- Plaka yeterince ısıtıldıktan ve TLC doygunluk pedi çözücü ile doyurulursa, TLC plakasını fırından çıkarın ve hemen TLC plakasını yüklemeye devam edin. Plakanın sıcakken yüklenmesi hızlı çözücü buharlaşmasını sağlar. İlgi alan her lipit türü için, ayırmayı ve beklenen göç mesafesini izlemek için TLC plakasının bir şeridine 5-20 μg saflaştırılmış lipit standardı yükleyin. Bir pipet kullanarak, TLC plakasının altından 1,5 cm yukarıda bulunan her şeridin kökenine 5μL numuneyi noktalayın. Her şeride 20-40 μL numune yüklenene kadar 5 μL noktanın tekrar yüklenmesi.
NOT: 5-20 μg etiketsiz saflaştırılmış lipitler, lipitlerin TLC ayrımından sonra boyanabilen ve görselleştirilebilen izleyiciler olarak her örnek şeride eklenebilir. Lekeli bir standardın varlığı, sonraki scintillation sayımı için radyolabeled lipid bantlarının kolay izlenmesini ve eksizyonunu sağlar. Plakaya hangi saflaştırılmış standartların yüklendiği NL ilgi gören türler tarafından belirlenecektir. Oleik asit (FFA), 1,2 dioleoyl-gliserol (DG), trilein (TG), kolesterol (Chol), kolesteril-linoleat (SE) ve örnek şeritlere bitişik şeritlerde squalene ayırma örnekleri için Temsili Sonuç bölümüne bakın. - Standart ve deneysel numuneler yüklendikten sonra, plakayı gelişmekte olan odaya yerleştirin ve çözücü plakanın tepesine ulaşana kadar bekleyin (40-60 dk). Plaka tamamen geliştikten sonra, hazneden çıkarın ve duman kaputunda 20 dakika kurumasını bekleyin.
- Plaka kuruduktan sonra plastik filmle örtün ve otoradyografi ekranı ile gelişmekte olan bir kasete yerleştirin. Plakanın 24-48 saat boyunca ekranla gelişmesine izin verin.
4. TLC ayrılmış lipitlerin görselleştirilmesi ve nicelleştirilmesi
- Ekranı gelişmekte olan kasetten çıkarın ve fosfor görüntüleyicinin içine yerleştirin. Fosfor Görüntüleme seçeneğini seçin ve 800-1000 V'ta geliştirin.
NOT: Fosfor görüntüleme, TLC plakasındaki radyolabelli lipitlerin nitel bir görünümünü verir. Bununla birlikte, radyolabelli lipitlerin nicelemesi en iyi daha sonra açıklanan scintillation sayımı ile gerçekleştirilir. - 100 mL p-anisaldehit reaktifini karıştırın (ek dosyayabakın) ve bir cam sprey şişesinde biriktirin. Silika doyurulana kadar TLC plakasını p-anisaldehit reaktifi ile püskürtün. Tabağı 145 °C fırında 5 dakika veya bantlar ortaya çıkana kadar pişirin.
- Radyolabel scintillation sayma kullanarak bireysel lipid türlerini ölçmek için, silika jelini cam TLC plakasından kazımak için bir jilet kullanın. Tek bir radyolabeled lipid türüne karşılık gelen her silika jel bandını bir cam scintillation şişesine aktarın ve 6 mL scintillation sıvısı ekleyin. Silika bandı küçük parçalara indirgenene kadar güçlü bir şekilde girdap.
- Alternatif olarak, lipitler bölüm 3'teki lipit ekstraksiyon protokolü kullanılarak silika jel bandından çıkarılabilir. Lipitler silika jelden çıkarılırsa, çözücüyü tamamen adım 3.1'deki gibi buharlaştırın ve kurutulmuş lipitlere 6 mL scintillation sıvısı ekleyin. Scintillation şişeleri içeren rafı bir scintillation sayacına yerleştirin. Tek rafı say seçeneğini belirleyin ve sayım süresini şişe başına 2 dakika olarak ayarlayın. Scintillation sayacından elde edilen sonuçlar yazdırılır ve çubuk grafik olarak görselleştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokolde, NL türlerinin etiketlenmesi, tespiti ve niceliğinin 14C-asetik asit metabolik etiketleme ile gerçekleştirilebileceğini göstermiş olduk. Büyük NL türleri 50:40:10:1 (v/v/v%) Heksan:Petrol eter:Dietil eter:Asetik asit (Şekil 1A,B)çözücü sisteminde ayrılabilir. Fosfor görüntüleme, etiketli serbest yağ asidi (FFA), triyasilgliserol (TG), diacylglycerol (DG), kolesterol (Chol) ve squalene (SQ) görselleştirilmesine izin verir (Şekil 1A). SE'ler bu çözücüdeki diğer NL türlerinden ayrılabilse de, 20 dakikalık bir nabızdan sonra otoradyogramda hiçbiri tespit edilememektedir. Bu, mayadaki büyümenin sabit aşamasında yavaş SE sentezine bağlanabilir. Ayrıca saflaştırılmış lipit türlerinin bu yöntemde ayrılabileceği ve daha sonra TLC plakasının p-anisaldehit reaktifi ile püskürtülmesiyle görselleştirilebileceği gösterilmiştir (Şekil 1B). NL türleri bu çözücüde iyi ayrışırken, fosfatidiylcholine (PC) gibi kutup türleri kökeninde kalır (Şekil 1B). Nabzı takip eden radyolabel içermeyen medyada bir kovalama süresi uygulanarak, NL yollarından geçen göreceli akı ölçülebilir (Şekil 1C). 10 dakikalık bir kovalamacadan sonra, SQ'nun ana havuzu kayboldu ve toplam Chol yükseldi. Benzer şekilde, DG'nin kovalama dönemindeki görünümü, FFA sinyallerindeki düşüşle ilişkilidir.
Şekil 1: 14C-Asetik asit radyolabeling, birden fazla NL türünün tespitini sağlar. (A) Sabit fazda 14C-asetik asit ile etiketlenmiş maya radyolabeled mayadan izole edilmiş TLC ile ayrılmış lipitlerin otoradyogramı. Açıkça tespit edilebilen türler arasında serbest yağ asidi (FFA), trigliserit (TG), diacylglycerol (DG), kolesterol (Chol) ve squalene (SQ) bulunur. Etiketlenmemiş bantlar tanımlanamayan NL türleridir. (B) TLC ile ayrılan ve p-anisaldehit lekeleme ile görselleştirilen saflaştırılmış lipit türleri. Görselleştirilmiş türler, sterol-esterler (SE) ve fosfatidylcholine 'a (PC) ek olarak (A)'da belirtilen tüm lipitleri içerir. (C) Sabit fazda 14-asetik asit ile darbeli mayadan izole edilen TLC ile ayrılan lipitlerin otoradyogramı ve ardından radyolabel içermeyen medyada 10 dakikalık bir kovalama süresi. SQ'nun ortadan kalkması Chol'da artışla karşılanıyor. Kovalama döneminde DG'deki artışa FFA türlerinde azalma eşlik ediyor. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tamamlayıcı Dosya: Arabellekler, ortam ve çözümler için tarifler. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, mayadaki NL türlerinin sentezini nicel olarak izlemek için çok yönlü bir radyolabeling protokolü sunulmuştur. Bu protokol çok modülerdir, bu da prosedürün 3-6 gün içinde bitmesine izin verir. Ek olarak, kullanıcının TLC solvent sistemlerinin basit bir değişikliği ile ilgi çekici birkaç lipit türünü tespit etmesine izin vermeli olan lipit türlerini ve metabolitleri ayırmak için TLC kullanımı hakkında çok sayıda literatürvardır 16,19. Bu protokol radyolabeled lipitlerin ayrılmasına, algılenmesine ve nicelleştirilmesine elverişlidir. Etiketli NL'lerin ciro süresini toplu olarak tespit etmek için etiketlenmemiş medyada bir kovalama süresi ile de birleştirilmiş olabilir, bu prosedür NL türlerinin radyolabelingini keşfetmeye başlamak için yararlı bir yapı sağlar.
HPLC, GC-MS ve UPLC-MS gibi diğer yöntemler lipid ayırma ve nicelemenin daha yüksek çözünürlüğünü sağlar; ancak, radyolabelli örnekleri MS aracılığıyla çalıştırmak genellikle en uygun değildir, ancak bu kararlı izotoplar kullanılarak üstesinden gelinebilir. Bununla birlikte, bu radyolabel yöntemi birçok lipit türü için yüksek algılama hassasiyeti ve çok yönlülük sağlar. Bu protokolün MS'e kıyasla bir diğer avantajı da uygun fiyatlı olmasıdır. Lipitlerin TLC ayrımı nispeten basittir, abartılı ekipman gerektirmez ve ortak laboratuvar malzemelerine dayanır. Sınırlamalarla ilgili olarak: lizo-lipitler gibi bazı düşük bolluklu türler, 14C etiketinin dahil edilmesine rağmen tespit edilemeyebilir. Ek olarak, çoğu TLC yaklaşımı, lipit türlerinin belirli bir çözücü içinde seyrini tahıllı ayırması nedeniyle 'lipidomik' karakterizasyonlar için uygun değildir.
Maya, lipitlerin radyolabel biyokimyasal yaklaşımlarla incelenmesi için uygun, genetik olarak çekilebilir bir model sistemi sunar. Bununla birlikte, belirli genetik geçmişlerde veya belirli bir metabolik büyüme koşullarında, radyolabeled-asetik asit veya diğer radyolabellerin hücresel alımının azaltılabileceğini belirtilmelidir. Glikoz yokluğunda hücrelerin 14C-asetik asit ile etiketlenerek radyolabelin alımını sağlam bir şekilde arttırır. Glikoz yokluğunda uzun inkübasyonlar radyolabel alımını orantılı olarak artıracaktır; ancak, bu söz konusu yolları da etkileyebilir. Bu nedenle, 14C-asetik asit radyolabeling protokolünü tam olarak takip etmeden önce belirli bir büyüme durumu için etiketleme verimliliği oluşturulmalıdır. Özellikle, radyolabeling süresinin uzunluğuna dikkat edin. İlgi çekici lipid türlerini tespit etmek için etiketleme süresi mümkün olduğunca kısa tutulmalıdır. Tamamen, bu prosedür önemli lipid sentez reaksiyonlarının incelenmesine izin verir ve sağlam hücrelerde NL regülasyonunun araştırılmasına izin vermelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar bu makalenin hazırlanmasında rakip bir çıkar olmadığını beyan eder.
Acknowledgments
Yazarlar, bu çalışmanın tamamlanmasında yardım ve kavramsal tavsiyeler için Henne laboratuvarı üyelerine teşekkür eder. W.M.H., Welch Vakfı (I-1873), NIH NIGMS (GM119768), Ara Paresghian Tıbbi Araştırma Fonu ve UT Southwestern Endowed Scholars Programı'ndan fonlarla desteklenmektedir. S.R, bir T32 programı hibesi (5T32GM008297) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [1-C14] Acetic acid sodium salt specific activity: 45-60mCi | PerkinElmer | NEC084H001MC | |
| 18:1 1,2 dioleoyl-sn-glycerol | Avanti | 800811O | |
| 200 proof absolute ethanol | Sigma | 459836 | |
| Acid washed glass beads 425-600um | Sigma | G8772 | |
| Amber bulbs for Pastuer pipettes | Fisher | 03-448-24 | |
| Ammonium Sulfate >99% | Sigma | A4418 | |
| Beckman LS6500 scintillation counter | PerkinElmer | A481000 | |
| Chloroform (HPLC grade) | Fisher | C607SK | |
| Cholesterol >99% | Sigma | C8667 | |
| Cholesteryl-linoleate >98% | Sigma | C0289 | |
| Concentrated sulfuric acid | Sigma | 339741 | |
| Corning 50mL conical tubes, polypropylene with centristar cap | Sigma | CLS430829 | |
| Dextrose, anhydrous grade | Sigma | D9434 | |
| Diethyl ether anhydrous grade | Sigma | 296082 | |
| Drying oven | Fisher | 11-475-155 | |
| EcoLume scintillation liquid | VWR | IC88247001 | |
| Eppendorf 5424R centrifuge | Fisher | 05-401-205 | |
| GE Storage phosphor screen | Sigma | GE28-9564-75 | |
| GE Typhoon FLA9500 imager | |||
| Glacial acetic acid, ACS grade | Sigma | 695092 | |
| Glass 6mL scintillation vials | Sigma | M1901 | |
| Glass centrifuge tube caps | Fisher | 14-595-36A | |
| Glass centrifuge tubes | Fisher | 14-595-35A | |
| Glass Pasteur pipette | Fisher | 13-678-20C | |
| Hexane, anhydrous grade | Sigma | 296090 | |
| L-Adenine >99% | Sigma | A8626 | |
| L-Alanine >98% | Sigma | A7627 | |
| L-Arginine >99% | Sigma | A1270000 | |
| L-Asparagine >98% | Sigma | A0884 | |
| L-Aspartate >98% | Sigma | A9256 | |
| L-Cysteine >97% | Sigma | W326305 | |
| L-Glutamic acid monosodium salt monohydrate >98% | Sigma | 49621 | |
| L-Glutamine >99% | Sigma | G3126 | |
| L-Glycine >99% | Sigma | G8898 | |
| L-Histidine >99% | Sigma | H8000 | |
| L-Isoleucine >98% | Sigma | I2752 | |
| L-Leucine >98% | Sigma | L8000 | |
| L-Lysine >98% | Sigma | L5501 | |
| L-Methionine, HPLC grade | Sigma | M9625 | |
| L-Phenylalanine, reagent grade | Sigma | P2126 | |
| L-Proline >99% | Sigma | P0380 | |
| L-Serine >99% | Sigma | S4500 | |
| L-Theronine, reagent grade | Sigma | T8625 | |
| L-Tryptophan >98% | Sigma | T0254 | |
| L-Tyrosine >98% | Sigma | T3754 | |
| L-Uracil >99% | Sigma | U0750 | |
| L-Valine >98% | Sigma | V0500 | |
| Methanol, ACS grade | Fisher | A412 | |
| Oleic acid >99% | Sigma | O1008 | |
| p-anisaldehyde | Sigma | A88107 | |
| Petroleum ether, ACS grade | Sigma | 184519 | |
| Phosphatidylcholine, dipalmitoyl >99% | Sigma | P1652 | |
| Pipettes | Eppendorf | 2231000713 | |
| Potassium chloride, ACS grade | Sigma | P3911 | |
| Sodium Hydroxide pellets, certified ACS | Fisher | S318-100 | |
| Squalene >98% | Sigma | S3626 | |
| Succinic Acid crystalline/certified | Fisher | 110-15-6 | |
| TLC saturation pad | Sigma | Z265225 | |
| TLC silica gel 60G glass channeled plate | Fisher | NC9825743 | No fluorescent indicators |
| Transparency plastic film | Apollo | 829903 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Triolein >99% | Sigma | T7140 | |
| Vortex mixer | Fisher | 02-215-414 | |
| Whatman exposure cassette | Sigma | WHA29175523 | |
| Yeast nitrogen base without ammonium sulfate and amino acids | Sigma | Y1251 |
References
- Konige, M., Wang, H., Sztalryd, C. Role of adipose specific lipid droplet proteins in maintaining whole body energy homeostasis. Biochimica Et Biophysica Acta. 1842 (3), 393-401 (2014).
- Arrese, E. L., Saudale, F. Z., Soulages, J. L. Lipid droplets as signaling platforms linking metabolic and cellular functions. Lipid Insights. 7, 7-16 (2014).
- Walther, T. C., Chung, J., Farese, R. V.
- Olzmann, J. A., Carvalho, P. Dynamics and functions of lipid droplets. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (3), 137-155 (2019).
- Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. Balancing the fat: lipid droplets and human disease. EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).
- Ross, R. The pathogenesis of atherosclerosis: A perspective for the 1990s. Nature. 362 (6423), 801-809 (1993).
- Zhang, C., Liu, P. The lipid droplet: A conserved cellular organelle. Protein & Cell. 8 (11), 796-800 (2017).
- Wältermann, M., et al. Mechanism of lipid-body formation in prokaryotes: How bacteria fatten up: Lipid-body formation in prokaryotes. Molecular Microbiology. 55 (3), 750-763 (2004).
- Borrull, A., López-Martínez, G., Poblet, M., Cordero-Otero, R., Rozès, N. A simple method for the separation and quantification of neutral lipid species using GC-MS. European Journal of Lipid Science and Technology. 117 (3), 274-280 (2015).
- Kotapati, H. K., Bates, P. D. Normal phase HPLC method for combined separation of both polar and neutral lipid classes with application to lipid metabolic flux. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1145, 122099 (2020).
- Knittelfelder, O. L., Weberhofer, B. P., Eichmann, T. O., Kohlwein, S. D., Rechberger, G. N. A versatile ultra-high performance LC-MS method for lipid profiling. Journal of Chromatography B. 951-952, 119-128 (2014).
- Ruiz, J. I., Ochoa, B. Quantification in the subnanomolar range of phospholipids and neutral lipids by monodimensional thin-layer chromatography and image analysis. Journal of Lipid Research. 38 (7), 1482-1489 (1997).
- Bui, Q., Sherma, J., Hines, J. K. Using high performance thin layer chromatography-densitometry to study the influence of the prion [RNQ+] and its determinant prion protein Rnq1 on yeast lipid profiles. Separations. 5 (1), 5010006 (2018).
- Pronk, J. T., de Steensma, H., Van Dijken, J. P.
- Buttke, T. M., Pyle, A. L. Effects of unsaturated fatty acid deprivation on neutral lipid synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Bacteriology. 152 (2), 747-756 (1982).
- Touchstone, J. C. Thin-layer chromatographic procedures for lipid separation. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 671 (1-2), 169-195 (1995).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. "Bligh and Dyer" and Folch methods for solid-liquid-liquid extraction of lipids from microorganisms. Comprehension of solvatation mechanisms and towards substitution with alternative solvents. International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 708 (2017).
- Fuchs, B., Süß, R., Teuber, K., Eibisch, M., Schiller, J. Lipid analysis by thin-layer chromatography-A review of the current state. Journal of Chromatography A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).
