Burada, nötr lipitlerin ayrılması için ince tabaka kromatografisi ile birleştirilen 14C-asetik asit ile mayanın metabolik etiketlemesi için bir protokol sunulmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Metabolik Etiketleme ve İnce Tabaka Kromatografisi ile Saccharomyces serevizisinde Nötr Lipid Sentezinin Analizi
Bu makalede
Özet
Özet
Nötr lipitler (NL'ler), enerji ve lipid homeostazında kilit roller oynayan hidrofobik, şarjsız biyomoleküller sınıfıdır. NL'ler asetil-CoA'dan sentezlenir de novo ve öncelikle ökaryotlarda trigliseritler (TG' ler) ve sterol esterleri (SE' ler) şeklinde bulunur. NL'lerin sentezinden sorumlu enzimler, Saccharomyces cerevisiae'den (maya) insanlara yüksek oranda korunur ve mayayı NL metabolizma enzimlerinin işlevini ve düzenlemesini parçalamak için yararlı bir model organizma haline getirir. Asetil-CoA'nın çeşitli NL türlerine nasıl dönüştürüldüğü hakkında çok şey bilinmesine gerek varken, NL metabolizma enzimlerini düzenleme mekanizmaları ve yanlış düzenlemenin hücresel patolojilere nasıl katkıda bulunabileceği hala keşfedilmektedir. NL türlerinin izolasyonu ve karakterizasyonu için onlarca yıllık araştırmalar boyunca çok sayıda yöntem geliştirilmiş ve kullanılmıştır; bununla birlikte, büyük NL türlerinin kapsamlı karakterizasyonu için nicel ve basit bir protokol tartışılmamıştır. Burada, mayadaki büyük NL türlerinin de novo sentezini ölçmek için basit ve uyarlanabilir bir yöntem sunulmuştur. Fizyolojik açıdan önemli NL'lerin çeşitli aralıklarını ayırmak ve ölçmek için ince tabaka kromatografisi ile birleştirilmiş 14C-asetik asit metabolik etiketleme uyguluyoruz. Ayrıca, bu yöntem NL enzimlerinin in vivo reaksiyon oranlarını veya NL türlerinin zaman içinde bozulmasını incelemek için kolayca uygulanabilir.
Giriş
Asetil-CoA, membran oluşturmak, ATP üretmek ve hücre sinyalini düzenlemek için çok yönlü bir biyomoleküler para birimi olarak hizmet veren nötr lipitler (NL' ler) dahil olmak üzere çeşitli biyomoleküllerin temel yapı taşıdır1,2. Bu ilgili yollardan herhangi birine sokılacak NL'lerin kullanılabilirliği, kısmen depolamaları tarafından düzenlenir. Lipid damlacıkları (LD'ler), trigliseritlerin hidrofobik çekirdeklerinden (TG' ler) ve sterol esterlerinden (SE) oluşan sitoplazmik organeller, çoğu hücresel NCI'nın ana depolama bölmeleridir. Bu nedenle, LD'ler, biyokimyasal ve metabolik süreçler için bozulabilen ve da....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Maya hücrelerinin 14C-asetik asit ile büyümesi ve etiketlenerek etiketlenerek
- Bir tabaktan bir koloni seçerek ve % 2 dekstroz içeren 20 mL sentetik komple (SC) ortama dağıtarak bir maya kültürünü aşılayın (BKZ. SC ortamı tarifi için Ek Dosya). 200 rpm'de sallanarak bir gece boyunca 30 °C'de kuluçkaya yaslanın.
NOT: Büyüme durumu, örnek hacmi ve tedavi, ilgi çekici lipitlere göre farklılık gösterecektir. Tam deneyler yapmadan önce, optimal büyüme koşulları ve kültür hacimleri ampirik olarak belirlenmelidir. Bu protokol, sabit faza yetiştirilen maya kültürlerinin radyolabelingini, biyo-membran ve hücre büyümesinin yavaşladığın....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu protokolde, NL türlerinin etiketlenmesi, tespiti ve niceliğinin 14C-asetik asit metabolik etiketleme ile gerçekleştirilebileceğini göstermiş olduk. Büyük NL türleri 50:40:10:1 (v/v/v%) Heksan:Petrol eter:Dietil eter:Asetik asit (Şekil 1A,B)çözücü sisteminde ayrılabilir. Fosfor görüntüleme, etiketli serbest yağ asidi (FFA), triyasilgliserol (TG), diacylglycerol (DG), kolesterol (Chol) ve squalene (SQ) görselleştirilmesine izin verir (Şekil 1.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada, mayadaki NL türlerinin sentezini nicel olarak izlemek için çok yönlü bir radyolabeling protokolü sunulmuştur. Bu protokol çok modülerdir, bu da prosedürün 3-6 gün içinde bitmesine izin verir. Ek olarak, kullanıcının TLC solvent sistemlerinin basit bir değişikliği ile ilgi çekici birkaç lipit türünü tespit etmesine izin vermeli olan lipit türlerini ve metabolitleri ayırmak için TLC kullanımı hakkında çok sayıda literatürvardır 16,19. Bu protokol radyolabel.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar bu makalenin hazırlanmasında rakip bir çıkar olmadığını beyan eder.
Teşekkürler
Yazarlar, bu çalışmanın tamamlanmasında yardım ve kavramsal tavsiyeler için Henne laboratuvarı üyelerine teşekkür eder. W.M.H., Welch Vakfı (I-1873), NIH NIGMS (GM119768), Ara Paresghian Tıbbi Araştırma Fonu ve UT Southwestern Endowed Scholars Programı'ndan fonlarla desteklenmektedir. S.R, bir T32 programı hibesi (5T32GM008297) tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| [1-C14] Asetik asit sodyum tuzu spesifik aktivite: 45-60mCi | PerkinElmer | NEC084H001MC | |
| 18: 1 1,2 dioleoil-sn-gliserol | Avanti | 800811O | |
| 200 kanıt mutlak etanol | Sigma | 459836 | |
| Asitle yıkanmış cam boncuklar 425-600um | Sigma | G8772 | |
| Pastuer pipetler için kehribar ampuller | Fisher | 03-448-24 | |
| Amonyum Sülfat >% 99 | Sigma | A4418 | |
| Beckman LS6500 sintilasyon sayacı | PerkinElmer | A481000 | |
| Kloroform (HPLC sınıfı) | Fisher | C607SK | |
| Kolesterol >% 99 | Sigma | C8667 | |
| Kolesteril-linoleat >% 98 | Sigma | C0289 | |
| Konsantre sülfürik asit | Sigma | 339741 | |
| Corning 50mL konik borular, santrifüj kapaklı polipropilen | Sigma | CLS430829 | |
| Dekstroz, susuz sınıf | Sigma | D9434 | |
| Dietil eter susuz sınıf | Sigma | 296082 | |
| Kurutma fırını | Fisher | 11-475-155 | |
| EcoLume sintilasyon sıvısı | VWR | IC88247001 | |
| Eppendorf 5424R santrifüj | Fisher | 05-401-205 | |
| GE Depolama fosfor ekranı | Sigma | GE28-9564-75 | |
| GE Typhoon FLA9500 görüntüleyici | |||
| Buzlu asetik asit, ACS sınıfı | Sigma | 695092 | |
| Cam 6mL sintilasyon şişeleri | Sigma | M1901 | |
| Cam santrifüj tüp kapakları | Fisher | 14-595-36A | |
| Cam santrifüj tüpleri | Fisher | 14-595-35A | |
| Cam Pastör pipeti | Fisher | 13-678-20C | |
| Hekzan, susuz sınıf | Sigma | 296090 | |
| L-Adenin >%99 | Sigma | A8626 | |
| L-Alanin %>98 | Sigma | A7627 | |
| L-Arginin %>99 | Sigma | A1270000 | |
| L-Asparagin %>98 | Sigma | A0884 | |
| L-Aspartat %>98 | Sigma | A9256 | |
| L-Sistein %>97 | Sigma | W326305 | |
| L-Glutamik asit monosodyum tuzu monohidrat %>98 | Sigma | 49621 | |
| L-Glutamin % | >99Sigma | G3126 | |
| L-Glisin %>99 | Sigma | G8898 | |
| L-Histidin %>99 | Sigma | H8000 | |
| L-İzolösin %>98 | Sigma | I2752 | |
| L-Lösin %>98 | Sigma | L8000 | |
| L-Lizin %>98 | Sigma | L5501 | |
| L-Metionin, HPLC sınıfı | Sigma | M9625 | |
| L-Fenilalanin, reaktif sınıfı | Sigma | P2126 | |
| L-Prolin %>99 | Sigma | P0380 | |
| L-Serin >%99 | Sigma | S4500 | |
| L-Theronine, reaktif sınıfı | Sigma | T8625 | |
| L-Triptofan %>98 | Sigma | T0254 | |
| L-Tirozin %>98 | Sigma | T3754 | |
| L-Urasil %>99 | Sigma | U0750 | |
| L-Valin %>98 | Sigma | V0500 | |
| Metanol, ACS sınıfı | Fisher | A412 | |
| Oleik asit >%99 | Sigma | O1008 | |
| p-anyaldehit | Sigma | A88107 | |
| Petrol eteri, ACS sınıfı | Sigma | 184519 | |
| Fosfatidilkolin, dipalmitoil >%99 | Sigma | P1652 | |
| Pipetler | Eppendorf | 2231000713 | |
| Potasyum klorür, ACS sınıfı | Sigma | P3911 | |
| Sodyum Hidroksit peletleri, sertifikalı ACS | Fisher | S318-100 | |
| Skualen %>98 | Sigma | S3626 | |
| Süksinik Asit kristal/sertifikalı | Fisher | 110-15-6 | |
| TLC doygunluk pedi | Sigma | Z265225 | |
| TLC silika jel 60G cam kanallı plaka | Fisher | NC9825743 | Floresan gösterge yok |
| Şeffaf plastik film | Apollo | 829903 | |
| Trisin | Sigma | T0377 | |
| Triolein >% 99 | Sigma | T7140 | |
| Vorteks karıştırıcı | Fisher | 02-215-414 | |
| Whatman pozlama kaseti | Sigma | WHA29175523 | |
| Amonyum sülfat ve amino asitler içermeyen maya azot bazı | Sigma | Y1251 |
Kaynaklar
- Konige, M., Wang, H., Sztalryd, C. Role of adipose specific lipid droplet proteins in maintaining whole body energy homeostasis. Biochimica Et Biophysica Acta. 1842 (3), 393-401 (2014).
- Arrese, E. L., Saudale, F. Z., Soulages, J. L.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
