Summary
Здесь представлен протокол метаболической маркировки дрожжей 14С-уксусной кислотой, которая сочетается с тонкослойной хроматографией для разделения нейтральных липидов.
Abstract
Нейтральные липиды (DL) представляют собой класс гидрофобных, незарядующих биомолекул, которые играют ключевую роль в энергетическом и липидном гомеостазе. DL синтезируются de novo из ацетил-КоА и в основном присутствуют у эукариот в виде триглицеридов (ТГ) и стерол-эфиров (ЭС). Ферменты, ответственные за синтез DL, высоко сохраняются от Saccharomyces cerevisiae (дрожжей) до человека, что делает дрожжи полезным модельным организмом для препарирования функции и регуляции ферментов метаболизма NL. Хотя многое известно о том, как ацетил-КоА превращается в разнообразный набор видов NL, механизмы регулирования ферментов метаболизма NL и как неправильная регуляция может способствовать клеточным патологиям, все еще обнаруживаются. Многочисленные методы выделения и характеристики видов NL были разработаны и использованы в течение десятилетий исследований; однако количественный и простой протокол для всеобъемлющей характеристики основных видов НЛ не обсуждался. Здесь представлен простой и адаптируемый метод количественной оценки de novo синтеза основных видов NL в дрожжах. Мы применяем метаболическую маркировку 14С-уксусной кислоты в сочетании с тонкослойной хроматографией для разделения и количественной оценки разнообразного диапазона физиологически важных DL. Кроме того, этот метод может быть легко применен для изучения скорости реакции in vivo ферментов NL или деградации видов NL с течением времени.
Introduction
Ацетил-КоА является фундаментальным строительным блоком различных биомолекул, включая нейтральные липиды (DL), которые служат универсальной биомолекулярной валютой для построения мембран, генерации АТФ и регулирования клеточной сигнализации1,2. Доступность НГ для шунтации в любой из этих соответствующих путей частично регулируется их хранением. Липидные капли (ЛД), цитоплазматические органеллы, состоящие из гидрофобных ядер триглицеридов (ТГ) и эфиров стеролов (ЭС), являются основными хранилищами большинства клеточных НГ. Таким образом, ЛД изолируют и регулируют DL, которые могут быть деградированы и впоследствии использованы для биохимических и метаболических процессов3,4. Известно, что неправильная регуляция NL и LD-ассоциированных белков коррелирует с возникновением патологий, включая липодистрофию и метаболические синдромы5,6. Из-за этого текущие исследования LD интенсивно сосредоточены на том, как синтез NL регулируется пространственно, временно и через различные ткани многоклеточных организмов. Из-за вездесущих клеточных ролей для DL многие ферменты, ответственные за синтез и регуляцию DL, сохраняются во всех эукариотах7. Действительно, даже некоторые прокариоты хранят DL в ЛД8. Поэтому генетически податливые модельные организмы, такие как Saccharomyces cerevisiae (почковые дрожжи), были полезны для изучения синтеза и регуляции NL.
Отделение и количественная оценка DL от клеточных экстрактов могут быть выполнены множеством способов, включая газовую хроматографию-масс-спектрометрию (GC-MS), высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) и сверхэффективную жидкостную хроматографию-масс-спектрометрию (UPLC-MS)9,10,11. Возможно, самым простым методом разделения DL является тонкослойная хроматография (TLC), которая позволяет проводить последующую денситометрическую количественную оценку из стандартной кривой12,13. Хотя TLC обеспечивает только последовательное разделение DL, он остается мощным методом, поскольку он недорог и позволяет быстро отделить DL от нескольких образцов одновременно. Двумя наиболее значительными проблемами, стоящими перед изучением НЯ с помощью TLC, являются: 1) широкий диапазон клеточных обилий видов NL и их промежуточных продуктов и 2) диапазон гидрофильности/гидрофобности липидных промежуточных продуктов в путях синтеза NL. Следовательно, количественная оценка видов NL с помощью TLC обычно ограничивается наиболее распространенными видами; однако введение радиомарки 14С-уксусной кислоты может значительно улучшить обнаружение промежуточных продуктов с низкой плотностью в путях NL. Уксусная кислота быстро превращается в ацетил-КоА с помощью ацетил-КоА-синтетазы ACS214,что делает 14С-уксусную кислоту подходящим субстратом для радиомаркировки в дрожжах15. Кроме того, разделение как гидрофобных НЯ, так и гидрофильных промежуточных продуктов ЛЛ может быть достигнуто С помощью TLC путем использования нескольких систем растворителей16. Здесь представлен метод разделения НГ с использованием метаболической маркировки 14С-уксусной кислоты в дрожжах. Липиды, меченные в течение импульсного периода, впоследствии выделяются хорошо заядлым протоколом17полной выделения липидов с последующим разделением видов NL по TLC. Разработка пластин TLC с помощью как авторедиографии для визуализации меченых липидов, так и химического спрея для визуализации общего количества липидов позволяет использовать несколько методов количественной оценки. Отдельные липидные полосы также могут быть легко извлечены из пластины TLC с помощью лезвия бритвы, а сцинтилляционный подсчет может быть использован для количественной оценки количества радиомаркированного материала в полосе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Рост и маркировка дрожжевых клеток 14С-уксусной кислотой
- Инокулируют культуру дрожжей, выбирая колонию из тарелки и распределяя ее в 20 мл синтетических полных (SC) сред, содержащих 2% декстрозы (см. Дополнительный файл для рецепта SC среды). Инкубировать при 30 °C на ночь с встряхиванием при 200 об/мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Состояние роста, объем образца и обработка будут отличаться в зависимости от интересующих липидов. Перед проведением полноценных экспериментов необходимо эмпирически определить оптимальные условия роста и объемы культуры. В этом протоколе обсуждается радиомаркировка дрожжевых культур, выращенных до стационарной фазы, фазы роста, когда биомембранный и клеточный рост замедляется, а синтез NL очень активен. - Измерьте OD600 ночной культуры с помощью спектрофотометра и разбавьте культуру дрожжевых клеток до конечного OD600 0,2 в 50 мл свежих сред SC, содержащих 2% декстрозы. Выращивайте клетки в течение 24 ч или до тех пор, пока они не достигнут стационарной фазы (которая обычно определяется плоской оболочкой измерения удвоения ячейки OD600).
- Перед сбором ячеек составьте буфер закалки (подробнее см. в разделе Дополнительный файл). Сделайте две аликвоты 20 мл закалочного буфера для каждого образца (т.е. буфер закалки 40 мл для каждого образца) и разделите равномерно на две конические пробирки по 50 мл). Храните аликвоты закалки буфера при -80 °C для будущего использования.
- Как только культуры достигнут желаемой ОД или фазы роста, соберите клетки путем центрифугирования при 4 100 х г в течение 10 мин. Пока образцы находятся в центрифуге, готовят радиомаркирующую муляжную жиму путем добавления[1-14С] натриевой соли уксусной кислоты в свободные от декстрозы среды SC при конечной концентрации 10 мкКи/мл.
ВНИМАНИЕ: При работе с радиоактивными материалами следует носить надлежащие средства индивидуальной защиты (СИЗ) все время. Всегда следуйте местным рекомендациям по надлежащему хранению, использованию и захоронению радиоактивных материалов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как концентрация 14С-уксусной кислоты в маркировочной среде, так и время инкубации радиомаркировки должны быть скорректированы в соответствии с метаболитом (метаболитами), представляющим интерес. Здесь используется 20-минутная импульсная инкубация радиомаркировки, что достаточно для маркировки видов NL с диапазоном численности. - Удалите супернатант из гранулированных клеток и промыть гранулу ячейки один раз 20 мл среды SC без декстрозы путем повторного использования гранулы с пипеткой. Соберите клетки снова путем центрифугирования при 4 100 х г в течение 5 мин.
- Повторно суспендировать клетки в 1 мл среды SC без декстрозы и перенести клетки в меченую микроцентрифужную трубку 2 мл. Соберите клетки снова путем центрифугирования при 4 100 х г в течение 2 мин.
- Повторное суспендировать клетки еще раз в 500 мкл среды SC без декстрозы. Предварительно охладите центрифугу, рассчитанную на конические трубки по 50 мл до -10 °C или при минимальной температуре.
- Начните период радиомаркировки с быстрого добавления 500 мкл радиомаркировки к каждому 500 мкл клеточной суспензии (конечная концентрация 14С-уксусной кислоты = 5 мкКи/мл). Инкубировать трубки во вращающемся инкубаторе при 30 °C в течение 20 мин. 2 мин до окончания периода маркировки, перенести одну аликвоту закалочного буфера объемом 20 мл на каждый образец из морозильной камеры -80 °C в ведро льда
- Как только период радиомаркировки закончится, используйте пипетку, чтобы погрузить весь образец объемом 1 мл в 20 мл буфера холодного закалки. Вихрьте конические трубки в течение 5-10 с, чтобы убедиться, что образец был тщательно перемешан с буфером закалки. Инкубировать образцы в закалке буфера в течение 2 мин на льду.
- Соберите гранулу ячейки, вращая в центрифуге при 5000 х г в течение 3 мин, установленных на -10 °C или при самых низких температурных настройках. Пока пробоотборники вращаются, перенесите другой набор закалочной буферной аликвоты из морозильной камеры -80 °C в ведро, заполненное льдом (т.е. одну 20 мл пробирку закалочного буфера на образец).
- Удалите супернатант закалочного буфера из гранул ячейки и замените его 20 мл свежим, холодным, закалочным буфером. Вихрь и встряхивайте образцы до тех пор, пока гранула не будет смещена со дна конической трубки и полностью повторно суспендирована в закалочном буфере. Центрифугирование образцов снова при 5000 х г в течение 3 мин при -10 °C для сбора клеток.
- После того, как клетки гранулированы, тщательно удалите весь закалочный буфер из образцов, выливая супернатант и удаляя излишки пипеткой. Храните тубы при -80 °C для дальнейшей обработки.
2. Выделение общих липидов из дрожжей
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол выделения липидов основан на хорошо заявленный и часто используемый метод, который эффективно извлекает большинство нейтральных липидных видов17,18.
ВНИМАНИЕ: При использовании органического растворителя всегда носите соответствующие СИЗ и работайте внутри вытяжки, когда это возможно. Во время экстракции липидов избегайте использования пластмасс, несовместимых с органическими растворителями. Полипропиленовые трубки подходят для следующего протокола.
- Взвесьте 0,3 г вымытых кислотой стеклянных шариков для каждого образца и храните их в микроцентрифужных пробирках по 2 мл на льду. Извлеките гранулы клеток из морозильной камеры при -80 °C и держите их на льду. Добавляйте 350 мкл метанола и 700 мкл хлороформа в каждый образец, повторно суспендировать и переносить в микроцентрифужные трубки, содержащие предварительно взвешенные стеклянные шарики.
- Разжижают клетки путем перемешивания трубок на вихре 3x в течение 1 мин, с 30 с инкубациями на льду между перемешиваниями. Альтернативно, клетки могут быть лизированы с использованием мини-бисера-избивателя в течение трех 1-минутных циклов. Сохраните 25-30 мкл лизалица целых клеток в отдельной пробирке для сцинтилляции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сохраненный лисат будет использоваться для определения относительного количества радиоизотопа, захваченного каждым образцом в течение импульсного периода, что будет влиять на количество каждого образца, загруженного на пластину TLC. Этот вопрос рассматривается далее на этапе 3.2. - Перелейте все содержимое трубки микроцентрифуги объемом 2 мл в стеклянную центрифужную трубку объемом 15 мл [трубка А]. Промыть трубки микроцентрифуги 2 мл, добавив 1 мл метанола и вихрь в течение 10-15 с. Переложите промывку метанола объемом 1 мл в пробирку А и добавьте 2 мл хлороформа в пробирку А, а затем 400 мкл воды для окончательного объема образца 4,45 мл.
- Вихревые образцы в течение 1 мин с последующим 5-минутным центрифугированием при 1000 х г. После центрифугирования водные (верхняя) и органическая (нижняя) фазы должны быть четко визуально разделены клеточным мусором, лежащим на границе раздела.
- Используя стеклянную пипетку Пастера, соберите органическую фазу из трубки А и перейдите к новой стеклянной центрифужной трубке емкостью 15 мл (трубка В). Добавьте 1 мл 1 мл KCl в трубку B. В пробирку А добавляют 1 мл метанола и 2 мл хлороформа, а также 200 мкл воды MiliQ. Повторите этапы вихрей и центрифугирования на трубке А.
- Еще раз соберите органическую фазу из трубки А и добавьте ее в трубку Б. Утилизируйте трубку А в соответствующем контейнере. Вихревая трубка B в течение 1 мин с последующей 5-минутной центрифугированием при 1000 х г.
- Снимите верхний водный слой с трубки В и утилизируйте. Добавьте 1 мл свежего 1 M KCl обратно в трубку B и повторите этап вихря/центрифугирования. После того, как слои разделены, тщательно соберите весь нижний органический слой в помеченный стеклянный флакон объемом 4 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе липидные экстракты могут храниться при -80 °C, или протокол может быть продолжен для разделения липидов TLC.
3. Разделение и количественная оценка радиоизотопных меченых НГ с помощью тонкослойной хроматографии
- Если липидные экстракты помещали при -80 °C, медленно доводят до комнатной температуры путем инкубации на льду и впоследствии на столешнице. Полностью испарить растворитель из липидных экстрактов вакуумной сушкой или с помощью мягкого потока инертного газа (например, аргона или азота). Между тем, предварительно нагрейте духовку до 145 °C для нагрева пластины TLC.
- Прежде чем образцы могут быть загружены на пластину TLC, определите относительное количество радиомеблоки, захваченных клетками. Пипетка 10 мкл всего клеточного лисата со ступени 2.2 в стеклянный сцинтилляционный флакон 6 мл, добавляют 6 мл сцинтилляционной жидкости и помещают флаконы в стойку. Используйте сцинтилляционный счетчик для измерения cpm или dpm каждого образца с помощью параметра count single rack, установленного на время подсчета 1 мин. Измерьте каждый целостный листат клетки в двух экземплярах, чтобы получить среднее значение для каждого образца. Настройка величины загрузки в соответствии с диким типом или эталонным образцом
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество каждого образца для загрузки на пластину TLC может быть определено с использованием следующего уравнения: (среднее количество выборок)/(среднее количество ссылок) x желаемый объем загрузки. Например, если 20 мкл эталонного образца должно быть загружено на пластину TLC и имеет среднее количество 1000, то экспериментальный образец со средним количеством 2000 будет иметь 10 мкл, загруженный на пластину TLC. - Восстановить образец липидов в 40-50 мкл 1:1 (v/v%) хлороформ:метанол путем вихря в течение 5 мин. Приготовьте 101 мл растворителя подвижной фазы в стеклянном градуированном цилиндре (см. раздел «Репрезентативные результаты» для примера разделения основных видов NL на 50:40:10:1 (v/v/v/v%) Гексан:Нефтяной эфир:Диэтиловый эфир:Растворитель уксусной кислоты).
- Налейте растворитель в стеклянную камеру TLC, содержащую прокладку для насыщения 20 x 20 TLC и плотно прилегающую крышку. Подготовьте канальный кремнезем 20 x 20 силикагеля 60 г, аккуратно обозначив карандашом линию на 1,5 см выше нижней части пластины. Линия обозначает происхождение и место, куда будут загружаться липиды. Ниже линии аккуратно обозначьте образец, который будет загружен в каждую полосу. После того, как пластина TLC будет предварительно подготовка, инкубировать пластину в духовке с температурой 145 °C в течение не менее 30 минут, чтобы предварительно нагреть пластину и удалить лишнюю влагу.
- После того, как пластина будет достаточно нагрета, а прокладка для насыщения TLC насытится растворителем, снимите пластину TLC из печи и немедленно приступайте к загрузке пластины TLC. Загрузка пластины в тепле обеспечивает быстрое испарение растворителя. Для каждого интересуемого вида липидов загрузите 5-20 мкг очищенного липидного стандарта на полосу пластины TLC для отслеживания разделения и ожидаемого расстояния миграции. Используя пипетку, нанесите 5 мкл образца на начало каждой полосы, расположенной на 1,5 см выше нижней части пластины TLC. Повторная загрузка пятен по 5 мкл до тех пор, пока в каждую полосу не будет загружено 20-40 мкл образца.
ПРИМЕЧАНИЕ: 5-20 мкг немаркированных очищенных липидов могут быть добавлены к каждой полосе образца в качестве индикаторов, которые могут быть окрашены и визуализированы после разделения липидов TLC. Наличие окрашенного стандарта позволяет легко отслеживать и иссекать радиомаркированные липидные полосы для последующего сцинтилляционного подсчета. Какие очищенные стандарты загружаются на пластину, будет определяться интересующих NL видами. В разделе «Репрезентативный результат» приведены примеры разделения олеиновой кислоты (FFA), 1,2 диолеоилглицерина (DG), триолеина (TG), холестерина (Chol), холестерина (Chol), холестерина-линолеата (SE) и сквалена в полосах, прилегающих к полосам отбора проб. - После загрузки стандартного и экспериментального образцов поместите пластину в развивающуюся камеру и подождите, пока растворитель не достигнет верхней части пластины (40-60 мин). Как только пластина будет полностью разработана, извлеките ее из камеры и дайте ей высохнуть в вытяжном вытяжке в течение 20 минут.
- После того, как пластина высохнет, накройте ее полиэтиленовой пленкой и поместите в развивающуюся кассету с экраном для авторерадиографии. Дайте пластине развиваться вместе с экраном в течение 24-48 ч.
4. Визуализация и количественная оценка разделенных TLC липидов
- Снимите экран с развивающейся кассеты и поместите внутрь люминофорного изобразителя. Выберите опцию Phosphor Imaging и развивайте при 800-1000 В.
ПРИМЕЧАНИЕ: Люминофорная визуализация дает качественный вид радиомаркированных липидов на пластине TLC. Однако количественная оценка радиомаркированных липидов лучше всего осуществляется сцинтилляционным подсчетом, который описывается ниже. - Смешайте 100 мл реагента п-анизальдегида (см. Дополнительный файл)и положите в стеклянный баллончик. Опрыскивайте пластину TLC реагентом p-анисальдегида до тех пор, пока кремнезем не насытится. Выпекайте тарелку в духовке при 145 °C в течение 5 минут или до появления полос.
- Для количественной оценки отдельных видов липидов с помощью сцинтилляции радиомарки, используйте лезвие бритвы, чтобы соскоблить силикагель со стеклянной пластины TLC. Перенесите каждую полосу силикагеля, соответствующую одному радиомаркированному липидному виду, в стеклянный сцинтилляционный флакон и добавьте 6 мл сцинтилляционной жидкости. Энергично вихряйте до тех пор, пока кремнеземная полоса не будет уменьшена до мелких кусочков.
- Альтернативно, липиды могут быть извлечены из силикагелевой полосы с использованием протокола экстракции липидов в разделе 3. Если липиды экстрагируются из силикагеля, испарите растворитель полностью, как на этапе 3.1, и добавьте 6 мл сцинтилляционной жидкости к высушенным липидам. Поместите стойку со сцинтилляционными флаконами в сцинтилляционный счетчик. Выберите опцию «Подсчитывать одну стойку» и отрегулируйте время подсчета до 2 минут на флакон. Результаты сцинтилляции счетчика будут напечатаны и могут быть визуализированы в виде гистограммы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом протоколе мы продемонстрировали, что маркировка, обнаружение и количественная оценка видов NL могут быть выполнены путем метаболической маркировки 14С-уксусной кислоты. Основные виды NL могут быть разделены в системе растворителей 50:40:10:1 (v/v/v/v%) Гексан:Нефтяной эфир:Диэтиловый эфир:Уксусная кислота(Рисунок 1A,B). Люминофорная визуализация позволяет визуализировать меченые свободные жирные кислоты (FFA), триацилглицерин (TG), диацилглицерин (DG), холестерин (Chol) и сквален (SQ)(рисунок 1A). Хотя СЭ могут быть отделены от других видов NL в этом растворителе, ни один из них не обнаруживается в ауторадиограмме после 20-минутного импульса. Это может быть связано с медленным синтезом SE во время стационарной фазы роста дрожжей. Также показано, что очищенные липидные виды могут быть отделены в этом методе и впоследствии визуализированы путем распыления пластины TLC реагентом p-анисальдегида(фиг.1B). В то время как виды NL хорошо разделены в этом растворителе, полярные виды, такие как фосфатидилхолин (PC), остаются в начале(рисунок 1B). Применяя период погони в свободных от радиолентов сред после импульса, можно измерить относительный поток через пути NL(рисунок 1C). После 10-минутной погони основной пул SQ исчез, а общий Чол поднялся. Аналогично, появление DG в период погони коррелирует с уменьшением сигнала FFA.
Рисунок 1: 14Радиомаркировка С-уксусной кислотой позволяет обнаружить несколько видов NL. (A)Ауторадиограмма липидов, отделенных TLC, выделенных из дрожжей, помеченных радиомаркированной 14С-уксусной кислотой в стационарной фазе. Четко обнаруживаемые виды включают свободные жирные кислоты (FFA), триглицериды (TG), диацилглицерин (DG), холестерин (Chol) и сквален (SQ). Немаркированные полосы являются неидентифицируемыми видами NL. (B) Очищенные липидные виды, разделенные TLC и визуализированные окрашиванием p-анисальдегидом. Визуализированные виды включают все липиды, упомянутые в (А), в дополнение к стерилам (SE) и фосфатидилхолину (PC). (C)Ауторадиограмма липидов, отделенных TLC, выделенных из дрожжей, импульсированных 14-уксуснойкислотой в стационарной фазе с последующим 10-минутным периодом погони в средах, свободных от радиометок. Исчезновение SQ встречается с увеличением Чол. Повышение ДГ в период погони сопровождается уменьшением видов ФФА. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный файл: Рецепты буферов, носителей и растворов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь представлен универсальный протокол радиомаркировки для количественного мониторинга синтеза видов NL в дрожжах. Этот протокол очень модульный, что позволяет закончить процедуру в течение 3-6 дней. Кроме того, существует множество литературы по использованию TLC для разделения липидных видов и метаболитов, что должно позволить пользователю обнаружить несколько липидных видов, представляющих интерес, с простым изменением систем растворителей TLC16,19. Этот протокол способствует разделению, обнаружению и количественной оценке радиомаркированных липидов. Это также может сочетаться с периодом погони в немаркированных носителях для определения времени оборота меченых DL. В совокупности эта процедура дает полезную структуру для начала изучения радиомаркировки видов NL.
Другие методы, такие как ВЭЖХ, GC-MS и UPLC-MS, обеспечивают более высокое разрешение разделения и количественного определения липидов; однако, как правило, неоптимально запускать радиомаркированные образцы через MS, хотя это может быть преодолено с помощью стабильных изотопов. Тем не менее, этот метод радиомеблок обеспечивает высокую чувствительность обнаружения и универсальность для многих видов липидов. Еще одним преимуществом этого протокола по сравнению с MS является его доступность. TLC разделение липидов относительно простое, не требует экстравагантного оборудования и опирается на обычные лабораторные материалы. Что касается ограничений: некоторые виды с низкой численностью, такие как лизолипиды, могут быть не обнаружены даже после включения метки 14C. Кроме того, большинство подходов TLC не подходят для «липидомических» характеристик из-за курсового разделения липидных видов в данном растворителе.
Дрожжи предлагают удобную, генетически поддающегося моделированию систему для изучения липидов с помощью биохимических подходов с помощью радиомебельных. Однако следует отметить, что в определенных генетических фонах или во время определенных условий метаболического роста клеточное поглощение радиомеченной уксусной кислотой или другими радиотрудами может быть снижено. Маркировка клеток 14С-уксусной кислотой в отсутствие глюкозы надежно увеличивает поглощение радиометки. Длительные инкубации в отсутствие глюкозы будут пропорционально увеличивать поглощение радиомеблок; однако это может также повлиять на рассматриваемые пути. Поэтому эффективность маркировки для конкретного состояния роста должна быть установлена до полного соблюдения протокола радиомаркировки 14С-уксусной кислоты. В частности, обратите внимание на продолжительность периода радиомаркировки. Время маркировки должно быть как можно короче, чтобы обнаружить интересующие виды липидов. В целом, эта процедура позволяет изучать важные реакции синтеза липидов и должна позволить исследование регуляции NL в интактных клетках.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов при подготовке данной рукописи.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить членов лаборатории Хенне за помощь и концептуальные советы в завершении этого исследования. W.M.H. поддерживается фондами Фонда Уэлча (I-1873), NIH NIGMS (GM119768), Фонда медицинских исследований Ара Паресгиана и Программы стипендиатов Юго-Западного университета Юты. S.R была поддержана грантом программы T32 (5T32GM008297).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [1-C14] Acetic acid sodium salt specific activity: 45-60mCi | PerkinElmer | NEC084H001MC | |
| 18:1 1,2 dioleoyl-sn-glycerol | Avanti | 800811O | |
| 200 proof absolute ethanol | Sigma | 459836 | |
| Acid washed glass beads 425-600um | Sigma | G8772 | |
| Amber bulbs for Pastuer pipettes | Fisher | 03-448-24 | |
| Ammonium Sulfate >99% | Sigma | A4418 | |
| Beckman LS6500 scintillation counter | PerkinElmer | A481000 | |
| Chloroform (HPLC grade) | Fisher | C607SK | |
| Cholesterol >99% | Sigma | C8667 | |
| Cholesteryl-linoleate >98% | Sigma | C0289 | |
| Concentrated sulfuric acid | Sigma | 339741 | |
| Corning 50mL conical tubes, polypropylene with centristar cap | Sigma | CLS430829 | |
| Dextrose, anhydrous grade | Sigma | D9434 | |
| Diethyl ether anhydrous grade | Sigma | 296082 | |
| Drying oven | Fisher | 11-475-155 | |
| EcoLume scintillation liquid | VWR | IC88247001 | |
| Eppendorf 5424R centrifuge | Fisher | 05-401-205 | |
| GE Storage phosphor screen | Sigma | GE28-9564-75 | |
| GE Typhoon FLA9500 imager | |||
| Glacial acetic acid, ACS grade | Sigma | 695092 | |
| Glass 6mL scintillation vials | Sigma | M1901 | |
| Glass centrifuge tube caps | Fisher | 14-595-36A | |
| Glass centrifuge tubes | Fisher | 14-595-35A | |
| Glass Pasteur pipette | Fisher | 13-678-20C | |
| Hexane, anhydrous grade | Sigma | 296090 | |
| L-Adenine >99% | Sigma | A8626 | |
| L-Alanine >98% | Sigma | A7627 | |
| L-Arginine >99% | Sigma | A1270000 | |
| L-Asparagine >98% | Sigma | A0884 | |
| L-Aspartate >98% | Sigma | A9256 | |
| L-Cysteine >97% | Sigma | W326305 | |
| L-Glutamic acid monosodium salt monohydrate >98% | Sigma | 49621 | |
| L-Glutamine >99% | Sigma | G3126 | |
| L-Glycine >99% | Sigma | G8898 | |
| L-Histidine >99% | Sigma | H8000 | |
| L-Isoleucine >98% | Sigma | I2752 | |
| L-Leucine >98% | Sigma | L8000 | |
| L-Lysine >98% | Sigma | L5501 | |
| L-Methionine, HPLC grade | Sigma | M9625 | |
| L-Phenylalanine, reagent grade | Sigma | P2126 | |
| L-Proline >99% | Sigma | P0380 | |
| L-Serine >99% | Sigma | S4500 | |
| L-Theronine, reagent grade | Sigma | T8625 | |
| L-Tryptophan >98% | Sigma | T0254 | |
| L-Tyrosine >98% | Sigma | T3754 | |
| L-Uracil >99% | Sigma | U0750 | |
| L-Valine >98% | Sigma | V0500 | |
| Methanol, ACS grade | Fisher | A412 | |
| Oleic acid >99% | Sigma | O1008 | |
| p-anisaldehyde | Sigma | A88107 | |
| Petroleum ether, ACS grade | Sigma | 184519 | |
| Phosphatidylcholine, dipalmitoyl >99% | Sigma | P1652 | |
| Pipettes | Eppendorf | 2231000713 | |
| Potassium chloride, ACS grade | Sigma | P3911 | |
| Sodium Hydroxide pellets, certified ACS | Fisher | S318-100 | |
| Squalene >98% | Sigma | S3626 | |
| Succinic Acid crystalline/certified | Fisher | 110-15-6 | |
| TLC saturation pad | Sigma | Z265225 | |
| TLC silica gel 60G glass channeled plate | Fisher | NC9825743 | No fluorescent indicators |
| Transparency plastic film | Apollo | 829903 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Triolein >99% | Sigma | T7140 | |
| Vortex mixer | Fisher | 02-215-414 | |
| Whatman exposure cassette | Sigma | WHA29175523 | |
| Yeast nitrogen base without ammonium sulfate and amino acids | Sigma | Y1251 |
References
- Konige, M., Wang, H., Sztalryd, C. Role of adipose specific lipid droplet proteins in maintaining whole body energy homeostasis. Biochimica Et Biophysica Acta. 1842 (3), 393-401 (2014).
- Arrese, E. L., Saudale, F. Z., Soulages, J. L. Lipid droplets as signaling platforms linking metabolic and cellular functions. Lipid Insights. 7, 7-16 (2014).
- Walther, T. C., Chung, J., Farese, R. V.
- Olzmann, J. A., Carvalho, P. Dynamics and functions of lipid droplets. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (3), 137-155 (2019).
- Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. Balancing the fat: lipid droplets and human disease. EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).
- Ross, R. The pathogenesis of atherosclerosis: A perspective for the 1990s. Nature. 362 (6423), 801-809 (1993).
- Zhang, C., Liu, P. The lipid droplet: A conserved cellular organelle. Protein & Cell. 8 (11), 796-800 (2017).
- Wältermann, M., et al. Mechanism of lipid-body formation in prokaryotes: How bacteria fatten up: Lipid-body formation in prokaryotes. Molecular Microbiology. 55 (3), 750-763 (2004).
- Borrull, A., López-Martínez, G., Poblet, M., Cordero-Otero, R., Rozès, N. A simple method for the separation and quantification of neutral lipid species using GC-MS. European Journal of Lipid Science and Technology. 117 (3), 274-280 (2015).
- Kotapati, H. K., Bates, P. D. Normal phase HPLC method for combined separation of both polar and neutral lipid classes with application to lipid metabolic flux. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1145, 122099 (2020).
- Knittelfelder, O. L., Weberhofer, B. P., Eichmann, T. O., Kohlwein, S. D., Rechberger, G. N. A versatile ultra-high performance LC-MS method for lipid profiling. Journal of Chromatography B. 951-952, 119-128 (2014).
- Ruiz, J. I., Ochoa, B. Quantification in the subnanomolar range of phospholipids and neutral lipids by monodimensional thin-layer chromatography and image analysis. Journal of Lipid Research. 38 (7), 1482-1489 (1997).
- Bui, Q., Sherma, J., Hines, J. K. Using high performance thin layer chromatography-densitometry to study the influence of the prion [RNQ+] and its determinant prion protein Rnq1 on yeast lipid profiles. Separations. 5 (1), 5010006 (2018).
- Pronk, J. T., de Steensma, H., Van Dijken, J. P.
- Buttke, T. M., Pyle, A. L. Effects of unsaturated fatty acid deprivation on neutral lipid synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Bacteriology. 152 (2), 747-756 (1982).
- Touchstone, J. C. Thin-layer chromatographic procedures for lipid separation. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 671 (1-2), 169-195 (1995).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. "Bligh and Dyer" and Folch methods for solid-liquid-liquid extraction of lipids from microorganisms. Comprehension of solvatation mechanisms and towards substitution with alternative solvents. International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 708 (2017).
- Fuchs, B., Süß, R., Teuber, K., Eibisch, M., Schiller, J. Lipid analysis by thin-layer chromatography-A review of the current state. Journal of Chromatography A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).
