Summary
Hier wird ein Protokoll zur metabolischen Markierung von Hefe mit 14C-Essigsäure vorgestellt, das mit dünnschichtiger Chromatographie zur Abtrennung neutraler Lipide gekoppelt ist.
Abstract
Neutrale Lipide (NLs) sind eine Klasse von hydrophoben, ladungslosen Biomolekülen, die eine Schlüsselrolle bei der Energie- und Lipidhomöostase spielen. NLs werden de novo aus Acetyl-CoA synthetisiert und kommen in Eukaryoten vor allem in Form von Triglyceriden (TGs) und Sterolestern (SEs) vor. Die Enzyme, die für die Synthese von NLs verantwortlich sind, sind von Saccharomyces cerevisiae (Hefe) für den Menschen hoch konserviert, was Hefe zu einem nützlichen Modellorganismus macht, um die Funktion und Regulation von NL-Stoffwechselenzymen zu analysieren. Während viel darüber bekannt ist, wie Acetyl-CoA in eine Vielzahl von NL-Spezies umgewandelt wird, werden Mechanismen zur Regulierung von NL-Stoffwechselenzymen und wie Fehlregulation zu zellulären Pathologien beitragen kann, immer noch entdeckt. Zahlreiche Methoden zur Isolierung und Charakterisierung von NL-Arten wurden in jahrzehntelanger Forschung entwickelt und eingesetzt; Ein quantitatives und einfaches Protokoll für die umfassende Charakterisierung der wichtigsten NL-Arten wurde jedoch nicht diskutiert. Hier wird eine einfache und anpassungsfähige Methode zur Quantifizierung der De-novo-Synthese wichtiger NL-Arten in Hefe vorgestellt. Wir wenden 14C-Essigsäure-Stoffwechselmarkierungen in Verbindung mit Dünnschichtchromatographie an, um eine Vielzahl physiologisch wichtiger NLs zu trennen und zu quantifizieren. Darüber hinaus kann diese Methode leicht angewendet werden, um in vivo Reaktionsraten von NL-Enzymen oder den Abbau von NL-Spezies im Laufe der Zeit zu untersuchen.
Introduction
Acetyl-CoA ist der grundlegende Baustein verschiedener Biomoleküle, einschließlich neutraler Lipide (NLs), die als vielseitige biomolekulare Währung für den Aufbau von Membranen, die Erzeugung von ATP und die Regulierung der Zellsignalisierung dienen1,2. Die Verfügbarkeit von NLs, die in einen dieser jeweiligen Pfade geschoben werden können, wird teilweise durch ihre Speicherung reguliert. Lipidtröpfchen (LDs), zytoplasmatische Organellen, die aus hydrophoben Kernen von Triglyceriden (TGs) und Sterolestern (SEs) bestehen, sind die Hauptspeicherkompartimente der meisten zellulären NLs. Als solche sequestrieren und regulieren LDs NLs, die abgebaut und anschließend für biochemische und metabolische Prozesse genutzt werden können3,4. Es ist bekannt, dass die Fehlregulation von NL- und LD-assoziierten Proteinen mit dem Auftreten von Pathologien wie Lipodystrophie und metabolischen Syndromen korreliert5,6. Aus diesem So konzentriert sich die aktuelle LD-Forschung intensiv darauf, wie die NL-Synthese räumlich, zeitlich und über verschiedene Gewebe mehrzelliger Organismen hinweg reguliert wird. Aufgrund der allgegenwärtigen zellulären Rolle für NLs sind viele Enzyme, die für die Synthese und Regulation von NLs verantwortlich sind, in allen Eukaryotenerhalten 7. Tatsächlich speichern sogar einige Prokaryoten NLs in LDs8. Daher waren genetisch traktierbare Modellorganismen wie Saccharomyces cerevisiae (Knospenhefe) für die Untersuchung der NL-Synthese und -Regulation nützlich.
Die Trennung und Quantifizierung von NLs aus Zellextrakten kann auf vielfältige Weise erreicht werden, einschließlich Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS), Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) und Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (UPLC-MS)9,10,11. Die vielleicht einfachste Methode zur Trennung von NLs ist die Dünnschichtchromatographie (TLC), die eine anschließende densitometrische Quantifizierung aus einer Standardkurve12,13ermöglicht. Obwohl TLC nur eine kurskörnige Trennung von NLs bietet, bleibt es eine leistungsstarke Technik, da es kostengünstig ist und die schnelle Trennung von NLs von mehreren Proben gleichzeitig ermöglicht. Zwei der größten Herausforderungen bei der Untersuchung von NLs mittels TLC sind: 1) das breite Spektrum der zellulären Häufigkeiten von NL-Spezies und ihren Zwischenprodukten und 2) das Spektrum der Hydrophilie / Hydrophobie von Lipidzwischenprodukten innerhalb der NL-Synthesewege. Folglich ist die Quantifizierung von NL-Arten über TLC typischerweise auf die am häufigsten vorkommenden Arten beschränkt; Die Einführung einer 14-C-Essigsäure-Radiomarkierung kann jedoch den Nachweis von Zwischenprodukten mit geringer Abundanz innerhalb von NL-Signalwegen erheblich verbessern. Essigsäure wird durch die Acetyl-CoA-Synthetase ACS214schnell in Acetyl-CoA umgewandelt, wodurch 14C-Essigsäure ein geeignetes Radiomarkierungssubstrat in Hefe15ist. Zusätzlich kann die Trennung sowohl von hydrophoben NLs als auch von hydrophilen Zwischenprodukten von NLs durch TLC durch den Einsatz mehrerer Lösungsmittelsysteme erreicht werden16. Hier wird ein Verfahren zur Trennung von NLs mittels 14C-Essigsäure-Stoffwechselmarkierung in Hefe vorgestellt. Lipide, die während der Pulszeit markiert werden, werden anschließend durch ein gut etabliertes Totallipidisolationsprotokoll17isoliert, gefolgt von der Trennung der NL-Spezies durch TLC. Die Entwicklung von TLC-Platten sowohl durch Autoradiographie zur Visualisierung markierter Lipide als auch durch ein chemisches Spray zur Visualisierung von Gesamtlipiden ermöglicht mehrere Quantifizierungsmethoden. Einzelne Lipidbänder können auch leicht mit einer Rasierklinge aus der TLC-Platte extrahiert werden, und die Szintillationszählung kann verwendet werden, um die Menge an radioaktiv markiertem Material innerhalb des Bandes zu quantifizieren.
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Protocol
1. Wachstum und Markierung von Hefezellen mit 14C-Essigsäure
- Impfen Sie eine Hefekultur, indem Sie eine Kolonie von einem Teller pflücken und in 20 ml synthetisches komplettes (SC) Medium mit 2% Dextrose dosieren (siehe Ergänzungsdatei für die Rezeptur von SC-Medien). Bei 30 °C über Nacht mit Schütteln bei 200 U/min inkubieren.
HINWEIS: Wachstumszustand, Probenvolumen und Behandlung unterscheiden sich je nach den lipiden von Interesse. Vor der Durchführung vollständiger Experimente sollten optimale Wachstumsbedingungen und Kulturvolumina empirisch bestimmt werden. Dieses Protokoll diskutiert die Radiomarkierung von Hefekulturen, die in eine stationäre Phase gezüchtet wurden, eine Wachstumsphase, in der sich das Wachstum von Biomembran und Zellen verlangsamt, und die NL-Synthese ist sehr aktiv. - Messen Sie den OD600 der Nachtkultur mit einem Spektralphotometer und verdünnen Sie die Hefezellkultur auf einen endgültigen OD600 von 0,2 in 50 ml frischem SC-Medium mit 2% Dextrose. Züchten Sie die Zellen für 24 h oder bis sie die stationäre Phase erreicht haben (die üblicherweise durch eine flache Auskleidung der Zellverdopplung OD600-Messung definiert wird).
- Bevor Sie die Zellen sammeln, machen Sie den Abschreckpuffer (siehe Ergänzungsdatei für Details). Machen Sie zwei 20-ml-Aliquoten Abschreckpuffer für jede Probe (d. h. 40 ml Abschreckpuffer für jede Probe) und teilen Sie sie gleichmäßig in zwei konische 50-ml-Röhrchen auf). Lagern Sie die Quenching Buffer Aliquots bei -80 °C für den zukünftigen Gebrauch.
- Sobald die Kulturen die gewünschte OD- oder Wachstumsphase erreicht haben, sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 4.100 x g für 10 min. Während sich die Proben in der Zentrifuge befinden, werden Radiomarkierungsmedien vorbereitet, indem Sie[1-14C] Essigsäure-Natriumsalz zu dextrosefreien SC-Medien in einer Endkonzentration von 10 μCi / ml hinzufügen.
ACHTUNG: Bei der Arbeit mit radioaktiven Stoffen sollte immer eine angemessene persönliche Schutzausrüstung (PSA) getragen werden. Befolgen Sie immer die lokalen Richtlinien für die ordnungsgemäße Lagerung, Verwendung und Entsorgung radioaktiver Stoffe.
HINWEIS: Sowohl die Konzentration von 14C-Essigsäure in den Markierungsmedien als auch die Radiomarkierungszeit sollten entsprechend dem/den interessierenden Metaboliten angepasst werden. Hier wird eine 20-minütige Radiomarkierungsimpulsinkubation verwendet, die ausreicht, um NL-Arten mit einem Abundanzbereich zu kennzeichnen. - Entfernen Sie den Überstand aus den pelletierten Zellen und waschen Sie das Zellpellet einmal mit 20 ml dextrosefreiem SC-Medium, indem Sie das Pellet mit einer Pipette resusperieren. Sammeln Sie die Zellen wieder durch Zentrifugieren bei 4.100 x g für 5 min.
- Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml dextrosefreies SC-Medium und übertragen Sie die Zellen in ein markiertes 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Sammeln Sie die Zellen wieder durch Zentrifugieren bei 4.100 x g für 2 min.
- Resuspendieren Sie die Zellen erneut in 500 μL dextrosefreien SC-Medien. Kühlen Sie eine Zentrifuge vor, die für konische Rohre mit 50 ml auf -10 °C oder auf die niedrigste Temperatureinstellung ausgestattet ist.
- Beginnen Sie die Radiomarkierungsphase, indem Sie schnell 500 μL Radiomarkierungsmedien zu jeder 500 μL Zellsuspension hinzufügen (endgültige 14C-Essigsäurekonzentration = 5 μCi/ml). Inkubieren Sie die Röhrchen in einem rotierenden Inkubator bei 30 °C für 20 min. 2 min vor Ende der Etikettierzeit, geben Sie für jede Probe einen 20 mL Aliquotenabschreckpuffer aus dem -80 °C Gefrierschrank in einen Eimer Eis
- Sobald die Radiomarkierungsperiode beendet ist, verwenden Sie eine Pipette, um die gesamte 1-ml-Probe in 20 ml Kaltabschreckpuffer zu tauchen. Wirbeln Sie die konischen Röhrchen für 5-10 s vor, um sicherzustellen, dass die Probe gründlich mit dem Abschreckpuffer gemischt wurde. Inkubieren Sie die Proben im Abschreckpuffer für 2 min auf Eis.
- Sammeln Sie das Zellpellet durch Spinnen in einer Zentrifuge bei 5.000 x g für 3 min eingestellt auf -10 °C oder auf die niedrigste Temperatureinstellung. Während sich die Probenröhrchen drehen, wird ein weiterer Satz Abschreckpuffer-Aliquot aus dem Gefrierfach -80 °C in einen mit Eis gefüllten Eimer (d. h. ein 20-ml-Röhrchen Abschreckpuffer pro Probe) übertragen.
- Entfernen Sie den Abschreckpufferüberstand aus den Zellpellets und ersetzen Sie ihn durch einen frischen, kalten Abschreckpuffer von 20 ml. Wirbeln Sie die Proben aus und schütteln Sie sie, bis das Pellet vom Boden des konischen Rohrs gelöst und vollständig im Abschreckpuffer resuspendiert wurde. Zentrifugieren Sie die Proben erneut bei 5.000 x g für 3 min bei -10 °C, um die Zellen zu sammeln.
- Sobald die Zellen pelletiert sind, entfernen Sie gründlich alle Abschreckpuffer aus den Proben, indem Sie den Überstand abgießen und den Überschuss mit einer Pipette entfernen. Rohre zur Weiterverarbeitung bei -80 °C lagern.
2. Isolierung der Gesamtlipide aus Hefe
HINWEIS: Das folgende Protokoll zur Lipidisolierung basiert auf einer etablierten und häufig verwendeten Methode, die die meisten neutralen Lipidarten effizient extrahiert17,18.
VORSICHT: Wenn Sie organische Lösungsmittel verwenden, tragen Sie immer geeignete PSA und arbeiten Sie, wenn möglich, in einem Abzug. Vermeiden Sie während der Lipidextraktion die Verwendung von Kunststoffen, die mit organischen Lösungsmitteln nicht kompatibel sind. Polypropylentuben sind für das folgende Protokoll geeignet.
- Wiegen Sie für jede Probe 0,3 g säuregewaschene Glasperlen und lagern Sie sie in 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis. Entfernen Sie die Zellpellets aus dem -80 °C Gefrierschrank und halten Sie sie auf Eis. 350 μL Methanol und 700 μL Chloroform zu jeder Probe geben, resuspendieren und in Mikrozentrifugenröhrchen mit vorgewogenen Glasperlen geben.
- Lyse Zellen durch Rühren von Röhrchen auf einem Wirbel 3x für 1 min, mit 30 s Inkubationen auf Eis zwischen den Agitationen. Alternativ können Zellen mit einem Mini-Perlenschläger für drei 1-minütige Zyklen lysiert werden. Speichern Sie 25-30 μL ganzzelliges Lysat in einem separaten Röhrchen für die Szintillationszählung.
HINWEIS: Das gespeicherte Lysat wird verwendet, um die relative Menge an Radioisotop zu bestimmen, die von jeder Probe während der Pulsperiode aufgenommen wird, was die Menge jeder auf die TLC-Platte geladenen Probe beeinflusst. Dies wird in Schritt 3.2 weiter erläutert. - Gießen Sie den gesamten Inhalt des 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchens in ein 15-ml-Glaszentrifugenröhrchen [Röhrchen A]. Waschen Sie die 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen durch Zugabe von 1 ml Methanol und Wirbel für 10-15 s. Die 1-ml-Methanolwäsche wird in Rohr A gegeben und 2 ml Chloroform in Rohr A gegeben, gefolgt von 400 μL Wasser für ein endgültiges Probenvolumen von 4,45 ml.
- Wirbelproben für 1 min, gefolgt von einer 5 min Zentrifugation bei 1.000 x g. Nach der Zentrifugation sollten die wässrige (obere) und organische (untere) Phase visuell klar getrennt werden, wobei Zelltrümmer an der Grenzfläche liegen.
- Sammeln Sie mit einer Pasteur-Pipette aus Glas die organische Phase von Rohr A und wechseln Sie zu einem neuen 15-ml-Glaszentrifugenrohr (Rohr B). 1 ml 1M KCl in Röhre B geben. Zu Rohr A werden 1 ml Methanol und 2 ml Chloroform sowie 200 μL MiliQ-Wasser hinzugefügt. Wiederholen Sie die Wirbel- und Zentrifugationsschritte auf Rohr A.
- Sammeln Sie erneut die organische Phase von Röhre A und geben Sie sie in Röhre B. Entsorgen Sie Rohr A in einem geeigneten Behälter. Wirbelrohr B für 1 min gefolgt von einer 5 min Zentrifugation bei 1.000 x g.
- Entfernen Sie die obere wässrige Schicht aus Rohr B und entsorgen Sie sie. Fügen Sie 1 ml frisches 1 M KCl zurück in rohr B und wiederholen Sie den Vortexing/Zentrifugationsschritt. Sobald die Schichten getrennt sind, sammeln Sie vorsichtig die gesamte untere organische Schicht in einer markierten 4-ml-Glasfläschchen.
HINWEIS: In diesem Schritt können Lipidextrakte bei -80 °C gelagert oder das Protokoll für die TLC-Trennung von Lipiden fortgesetzt werden.
3. Trennung und Quantifizierung von radioisotopenmarkierten NLs durch Dünnschichtchromatographie
- Wenn Lipidextrakte bei -80 °C platziert wurden, langsam auf Raumtemperatur bringen, indem Sie auf Eis und anschließend auf einer Tischplatte inkubieren. Lösungsmittel aus Lipidextrakten durch Vakuumtrocknung oder unter Verwendung eines sanften Inertgasstroms (z. B. Argon oder Stickstoff) vollständig verdampfen. In der Zwischenzeit einen Backofen auf 145 °C vorheizen, um die TLC-Platte zu erhitzen.
- Bevor Proben auf die TLC-Platte geladen werden können, bestimmen Sie die relativen Mengen an Radiomarkierung, die von den Zellen aufgenommen werden. 10 μL des gesamten Zelllysats aus Schritt 2.2 in eine 6 mL Glasszintillationsfläschchen pipetten, 6 ml Szintillationsflüssigkeit hinzufügen und Fläschchen in ein Rack legen. Verwenden Sie einen Szintillationszähler, um den cpm oder dpm jeder Probe mit der Option count single rack zu messen, die auf eine Zählzeit von 1 minute eingestellt ist. Messen Sie jedes ganze Zelllysat in doppelter Ausfertigung, um einen Durchschnitt für jede Probe zu erhalten. Passen Sie die Lademenge entsprechend einem Wildtyp oder einer Referenzprobe an
HINWEIS: Die Menge jeder Probe, die auf die TLC-Platte geladen werden soll, kann mit der folgenden Gleichung bestimmt werden: (durchschnittliche Probenanzahl)/(durchschnittliche Referenzanzahl) x gewünschtes Ladevolumen. Wenn beispielsweise 20 μL der Referenzprobe auf die TLC-Platte geladen werden sollen und eine durchschnittliche Anzahl von 1.000 aufwies, dann werden in einer experimentellen Probe mit einer durchschnittlichen Anzahl von 2.000 10 μL auf die TLC-Platte geladen. - Rekonstituieren Sie die Probenlipide in 40-50 μL von 1:1 (v/v%) Chloroform:Methanol durch Wirbeln für 5 min. Bereiten Sie 101 ml des mobilen Phasenlösungsmittels in einem Glasmesszylinder vor (siehe Abschnitt Repräsentative Ergebnisse für ein Beispiel für eine Trennung der wichtigsten NL-Spezies durch ein 50:40:10:1 (v/v/v/v%) Hexan:Petrolether:Diethylether:Essigsäurelösungsmittel).
- Gießen Sie das Lösungsmittel in eine TLC-Glaskammer, die ein 20 x 20 TLC-Sättigungspad und einen eng anliegenden Deckel enthält. Bereiten Sie eine kanalierte 20 x 20 Kieselgel 60 G Platte vor, indem Sie vorsichtig eine Linie 1,5 cm über dem Boden der Platte mit einem Bleistift markieren. Die Linie bezeichnet den Ursprung und wo die Lipide geladen werden. Beschriften Sie unterhalb der Linie vorsichtig die Probe, die in jeder Spur geladen wird. Sobald die TLC-Platte vorbereitet wurde, inkubieren Sie die Platte in einem 145 °C-Ofen für mindestens 30 Minuten, um die Platte vorzuwärmen und überschüssige Feuchtigkeit zu entfernen.
- Sobald die Platte ausreichend erhitzt wurde und das TLC-Sättigungspad mit Lösungsmittel gesättigt ist, entfernen Sie die TLC-Platte aus dem Ofen und fahren Sie sofort mit dem Laden der TLC-Platte fort. Das Beladen der Platte während des Warms sorgt für eine schnelle Lösungsmittelverdampfung. Laden Sie für jede Lipidart von Interesse 5-20 μg eines gereinigten Lipidstandards auf eine Spur der TLC-Platte, um die Trennung und den erwarteten Migrationsabstand zu verfolgen. Mit einer Pipette können Sie 5 μL Der Probe auf den Ursprung jeder Spur stellen, die sich 1,5 cm über dem Boden der TLC-Platte befindet. Wiederholtes Laden von 5 μL-Spots, bis 20-40 μL Probe in jede Spur geladen wurden.
HINWEIS: 5-20 μg unmarkierte gereinigte Lipide können jeder Probenspur als Tracer zugesetzt werden, die nach TLC-Trennung von Lipiden gefärbt und visualisiert werden können. Das Vorhandensein eines gefärbten Standards ermöglicht eine einfache Verfolgung und Exzision von radioaktiv markierten Lipidbändern für die anschließende Szintillationszählung. Welche gereinigten Standards auf die Platte geladen werden, wird von der interessierenden NL-Spezies bestimmt. Im Abschnitt Repräsentatives Ergebnis finden Sie Beispiele für die Trennung von Ölsäure (FFA), 1,2 Dioleoylglycerin (DG), Triolein (TG), Cholesterin (Chol), Cholesteryl-Linoleat (SE) und Squalen in Bahnen neben den Probenbahnen. - Sobald die Standard- und die Experimentellen proben geladen wurden, legen Sie die Platte in die Entwicklungskammer und warten Sie, bis das Lösungsmittel die Oberseite der Platte erreicht hat (40-60 min). Sobald die Platte vollständig entwickelt ist, entfernen Sie sie aus der Kammer und lassen Sie sie 20 Minuten im Abzug trocknen.
- Nachdem die Platte getrocknet ist, bedecken Sie sie mit Kunststofffolie und legen Sie sie in eine Entwicklungskassette mit einem Autoradiographie-Bildschirm. Lassen Sie die Platte mit dem Bildschirm für 24-48 h entwickeln.
4. Visualisierung und Quantifizierung von TLC-getrennten Lipiden
- Entfernen Sie den Bildschirm von der Entwicklungskassette und legen Sie ihn in einen Phosphor-Imager. Wählen Sie die Option Phosphor Imaging und entwickeln Sie bei 800-1000 V.
HINWEIS: Die Phosphorbildgebung bietet eine qualitative Ansicht der radioaktiv markierten Lipide auf der TLC-Platte. Die Quantifizierung radioaktiv markierter Lipide erfolgt jedoch am besten durch Szintillationszählung, die anschließend beschrieben wird. - 100 ml p-Anisaldehyd-Reagenz mischen (siehe Ergänzungsdatei)und in einer Glassprühflasche abfüllen. Besprühen Sie die TLC-Platte mit p-Anisaldehyd-Reagenz, bis die Kieselsäure gesättigt ist. Backen Sie den Teller in einem 145 °C Ofen für 5 min, oder bis Bänder erschienen sind.
- Um einzelne Lipidspezies mit Hilfe der Radiolabel-Szintillationszählung zu quantifizieren, verwenden Sie eine Rasierklinge, um das Kieselgel von der Glas-TLC-Platte abzukratzen. Übertragen Sie jedes Kieselgelband, das einer einzelnen radioaktiv markierten Lipidspezies entspricht, in eine Glasszintillationsfläschchen und fügen Sie 6 ml Szintillationsflüssigkeit hinzu. Wirbeln Sie kräftig, bis das Kieselsäureband auf kleine Stücke reduziert wurde.
- Alternativ können Lipide aus dem Kieselgelband mit dem Lipidextraktionsprotokoll in Abschnitt 3 extrahiert werden. Wenn Lipide aus dem Kieselgel extrahiert werden, verdampfen Sie das Lösungsmittel vollständig wie in Schritt 3.1 und fügen Sie den getrockneten Lipiden 6 mL Szintillationsflüssigkeit hinzu. Legen Sie das Rack mit den Szintillationsfläschchen in einen Szintillationszähler. Wählen Sie die Option Einzelrack zählen und passen Sie die Zählzeit auf 2 Minuten pro Durchstechflasche an. Die Ergebnisse des Szintillationszählers werden gedruckt und können als Balkendiagramm visualisiert werden.
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Representative Results
In diesem Protokoll haben wir gezeigt, dass die Markierung, Detektion und Quantifizierung von NL-Spezies durch 14C-Essigsäure-Stoffwechselmarkierung erreicht werden kann. Wichtige NL-Spezies können in einem Lösungsmittelsystem von 50:40:10:1 (v/v/v/v%) Hexan:Petrolether:Diethylether:Essigsäure(Abbildung 1A,B)getrennt werden. Die Phosphorbildgebung ermöglicht die Visualisierung von markierten freien Fettsäuren (FFA), Triacylglycerin (TG), Diacylglycerin (DG), Cholesterin (Chol) und Squalen (SQ)(Abbildung 1A). Obwohl SEs in diesem Lösungsmittel von anderen NL-Spezies getrennt werden können, werden im Autoradiogramm nach einem 20-minütigen Puls keine nachgewiesen. Dies kann auf eine langsame SE-Synthese während der stationären Wachstumsphase in Hefe zurückgeführt werden. Es wird auch gezeigt, dass gereinigte Lipidspezies bei diesem Verfahren getrennt und anschließend durch Besprühen der TLC-Platte mit p-Anisaldehyd-Reagenz visualisiert werden können (Abbildung 1B). Während NL-Spezies in diesem Lösungsmittel gut getrennt sind, bleiben polare Spezies wie Phosphatidylcholin (PC) am Ursprung (Abbildung 1B). Durch Anwendung einer Verfolgungsperiode in radioaktiv markierten Medien nach dem Puls kann der relative Fluss durch NL-Signalwege gemessen werden (Abbildung 1C). Nach einer 10-minütigen Verfolgungsjagd ist der Hauptpool von SQ verschwunden und der gesamte Chol ist erhöht. In ähnlicher Weise korreliert das Auftreten von DG in der Verfolgungsperiode mit einer Abnahme des FFA-Signals.
Abbildung 1: 14Die C-Essigsäure-Radiomarkierung ermöglicht den Nachweis mehrerer NL-Spezies. (A) Autoradiogramm der Lipide, die durch TLC getrennt sind, isoliert aus Hefe, radioaktiv markiert mit 14C-Essigsäure in stationärer Phase. Zu den eindeutig nachweisbaren Spezies gehören freie Fettsäuren (FFA), Triglycerid (TG), Diacylglycerin (DG), Cholesterin (Chol) und Squalen (SQ). Nicht gekennzeichnete Bänder sind nicht identifizierte NL-Arten. (B) Gereinigte Lipidspezies, die durch TLC getrennt und durch p-Anisaldehydfärbung visualisiert werden. Zu den visualisierten Arten gehören alle in (A) genannten Lipide sowie Sterolester (SE) und Phosphatidylcholin (PC). (C) Autoradiogramm der Lipide, die durch TLC getrennt wurden, isoliert aus Hefe, die mit 14-Essigsäurein stationärer Phase gepulst wurde, gefolgt von einer 10-minütigen Verfolgungsperiode in radioaktiv markierten Medien. Das Verschwinden von SQ wird mit einem Anstieg von Chol getroffen. Der Anstieg der DG in der Verfolgungsperiode geht mit einer Abnahme der FFA-Arten einher. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Datei: Rezepte für Puffer, Medien und Lösungen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Hier wird ein vielseitiges Radiolabeling-Protokoll zur quantitativen Überwachung der Synthese von NL-Arten in Hefe vorgestellt. Dieses Protokoll ist sehr modular aufgebaut, so dass das Verfahren innerhalb von 3-6 Tagen abgeschlossen werden kann. Darüber hinaus gibt es eine Fülle von Literatur über die Verwendung von TLC zur Trennung von Lipidspezies und Metaboliten, die es dem Benutzer ermöglichen sollte, mehrere Lipidspezies von Interesse mit einem einfachen Wechsel der TLC-Lösungsmittelsysteme nachzuweisen16,19. Dieses Protokoll ist förderlich für die Trennung, Detektion und Quantifizierung von radioaktiv markierten Lipiden. Es kann auch mit einer Verfolgungsperiode in nicht gekennzeichneten Medien gekoppelt werden, um die Umsatzzeit von markierten NLs zu erkennen.
Andere Methoden wie HPLC, GC-MS und UPLC-MS bieten eine höhere Auflösung der Lipidtrennung und -quantifizierung; Es ist jedoch in der Regel nicht optimal, radioaktiv markierte Proben durch MS zu führen, obwohl dies durch die Verwendung stabiler Isotope überwunden werden kann. Dennoch bietet diese Radiolabel-Methode eine hohe Nachweisempfindlichkeit und Vielseitigkeit für viele Lipidspezies. Ein weiterer Vorteil dieses Protokolls gegenüber MS ist seine Erschwinglichkeit. Die TLC-Trennung von Lipiden ist relativ einfach, erfordert keine extravagante Ausrüstung und stützt sich auf gängige Labormaterialien. Zu den Einschränkungen: Bestimmte Arten mit geringer Häufigkeit, wie Lysolipide, sind möglicherweise auch nach der Einarbeitung eines 14-C-Labelsnicht nachweisbar. Darüber hinaus sind die meisten TLC-Ansätze aufgrund der kurskörnigen Trennung von Lipidspezies innerhalb eines bestimmten Lösungsmittels nicht für "lipidomische" Charakterisierungen geeignet.
Hefen bieten ein praktisches, genetisch handhabbares Modellsystem zur Untersuchung von Lipiden mittels radioaktiver biochemischer Ansätze. Es sollte jedoch beachtet werden, dass in bestimmten genetischen Hintergründen oder während bestimmter metabolischer Wachstumsbedingungen die zelluläre Aufnahme von radioaktiv markierter Essigsäure oder anderen Radiomarkierungen reduziert sein kann. Die Markierung von Zellen mit 14C-Essigsäure in Abwesenheit von Glukose erhöht robust die Aufnahme der Radiomarkierung. Lange Inkubationen in Abwesenheit von Glukose erhöhen proportional die Aufnahme von Radiomarkierungen; Dies kann jedoch auch die betreffenden Wege beeinflussen. Daher sollte die Markierungseffizienz für eine bestimmte Wachstumsbedingung festgelegt werden, bevor das 14-C-Essigsäure-Radiomarkierungsprotokoll vollständig befolgt wird. Achten Sie insbesondere auf die Länge der Radiomarkierungsdauer. Die Markierungszeit sollte so kurz wie möglich gehalten werden, um die interessierenden Lipidarten nachzuweisen. Insgesamt ermöglicht dieses Verfahren die Untersuchung wichtiger Lipidsynthesereaktionen und soll die Untersuchung der NL-Regulation in intakten Zellen ermöglichen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass es keine konkurrierenden Interessen an der Erstellung dieses Manuskripts gibt.
Acknowledgments
Die Autoren danken den Mitgliedern des Henne-Labors für die Hilfe und konzeptionelle Beratung bei der Fertigstellung dieser Studie. W.M.H. wird durch Mittel der Welch Foundation (I-1873), des NIH NIGMS (GM119768), des Ara Paresghian Medical Research Fund und des UT Southwestern Endowed Scholars Program unterstützt. S.R wurde durch einen T32-Programmzuschuss (5T32GM008297) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [1-C14] Acetic acid sodium salt specific activity: 45-60mCi | PerkinElmer | NEC084H001MC | |
| 18:1 1,2 dioleoyl-sn-glycerol | Avanti | 800811O | |
| 200 proof absolute ethanol | Sigma | 459836 | |
| Acid washed glass beads 425-600um | Sigma | G8772 | |
| Amber bulbs for Pastuer pipettes | Fisher | 03-448-24 | |
| Ammonium Sulfate >99% | Sigma | A4418 | |
| Beckman LS6500 scintillation counter | PerkinElmer | A481000 | |
| Chloroform (HPLC grade) | Fisher | C607SK | |
| Cholesterol >99% | Sigma | C8667 | |
| Cholesteryl-linoleate >98% | Sigma | C0289 | |
| Concentrated sulfuric acid | Sigma | 339741 | |
| Corning 50mL conical tubes, polypropylene with centristar cap | Sigma | CLS430829 | |
| Dextrose, anhydrous grade | Sigma | D9434 | |
| Diethyl ether anhydrous grade | Sigma | 296082 | |
| Drying oven | Fisher | 11-475-155 | |
| EcoLume scintillation liquid | VWR | IC88247001 | |
| Eppendorf 5424R centrifuge | Fisher | 05-401-205 | |
| GE Storage phosphor screen | Sigma | GE28-9564-75 | |
| GE Typhoon FLA9500 imager | |||
| Glacial acetic acid, ACS grade | Sigma | 695092 | |
| Glass 6mL scintillation vials | Sigma | M1901 | |
| Glass centrifuge tube caps | Fisher | 14-595-36A | |
| Glass centrifuge tubes | Fisher | 14-595-35A | |
| Glass Pasteur pipette | Fisher | 13-678-20C | |
| Hexane, anhydrous grade | Sigma | 296090 | |
| L-Adenine >99% | Sigma | A8626 | |
| L-Alanine >98% | Sigma | A7627 | |
| L-Arginine >99% | Sigma | A1270000 | |
| L-Asparagine >98% | Sigma | A0884 | |
| L-Aspartate >98% | Sigma | A9256 | |
| L-Cysteine >97% | Sigma | W326305 | |
| L-Glutamic acid monosodium salt monohydrate >98% | Sigma | 49621 | |
| L-Glutamine >99% | Sigma | G3126 | |
| L-Glycine >99% | Sigma | G8898 | |
| L-Histidine >99% | Sigma | H8000 | |
| L-Isoleucine >98% | Sigma | I2752 | |
| L-Leucine >98% | Sigma | L8000 | |
| L-Lysine >98% | Sigma | L5501 | |
| L-Methionine, HPLC grade | Sigma | M9625 | |
| L-Phenylalanine, reagent grade | Sigma | P2126 | |
| L-Proline >99% | Sigma | P0380 | |
| L-Serine >99% | Sigma | S4500 | |
| L-Theronine, reagent grade | Sigma | T8625 | |
| L-Tryptophan >98% | Sigma | T0254 | |
| L-Tyrosine >98% | Sigma | T3754 | |
| L-Uracil >99% | Sigma | U0750 | |
| L-Valine >98% | Sigma | V0500 | |
| Methanol, ACS grade | Fisher | A412 | |
| Oleic acid >99% | Sigma | O1008 | |
| p-anisaldehyde | Sigma | A88107 | |
| Petroleum ether, ACS grade | Sigma | 184519 | |
| Phosphatidylcholine, dipalmitoyl >99% | Sigma | P1652 | |
| Pipettes | Eppendorf | 2231000713 | |
| Potassium chloride, ACS grade | Sigma | P3911 | |
| Sodium Hydroxide pellets, certified ACS | Fisher | S318-100 | |
| Squalene >98% | Sigma | S3626 | |
| Succinic Acid crystalline/certified | Fisher | 110-15-6 | |
| TLC saturation pad | Sigma | Z265225 | |
| TLC silica gel 60G glass channeled plate | Fisher | NC9825743 | No fluorescent indicators |
| Transparency plastic film | Apollo | 829903 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Triolein >99% | Sigma | T7140 | |
| Vortex mixer | Fisher | 02-215-414 | |
| Whatman exposure cassette | Sigma | WHA29175523 | |
| Yeast nitrogen base without ammonium sulfate and amino acids | Sigma | Y1251 |
References
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