Summary
Qui viene presentato un protocollo per l'etichettatura metabolica del lievito con acido 14C-acetico, che è accoppiato con cromatografia a strato sottile per la separazione dei lipidi neutri.
Abstract
I lipidi neutri (NL) sono una classe di biomolecole idrofobiche e senza carica che svolgono un ruolo chiave nell'omeostasi energetica e lipidica. I NT sono sintetizzati de novo dall'acetil-CoA e sono presenti principalmente negli eucarioti sotto forma di trigliceridi (TG) e esteri di sterolo (SE). Gli enzimi responsabili della sintesi dei NL sono altamente conservati da Saccharomyces cerevisiae (lievito) all'uomo, rendendo il lievito un organismo modello utile per sezionare la funzione e la regolazione degli enzimi del metabolismo NL. Mentre si sa molto su come l'acetil-CoA viene convertito in un insieme diversificato di specie NL, i meccanismi per regolare gli enzimi del metabolismo NL e come la cattiva regolazione può contribuire alle patologie cellulari, sono ancora in fase di scoperta. Numerosi metodi per l'isolamento e la caratterizzazione delle specie NL sono stati sviluppati e utilizzati nel corso di decenni di ricerca; tuttavia, non è stato discusso un protocollo quantitativo e semplice per la caratterizzazione completa delle principali specie nl. Qui viene presentato un metodo semplice e adattabile per quantificare la sintesi de novo delle principali specie di NL nel lievito. Applichiamo l'etichettatura metabolica dell'acido C-acetico 14accoppiata con la cromatografia a strato sottile per separare e quantificare una vasta gamma di NL fisiologicamente importanti. Inoltre, questo metodo può essere facilmente applicato per studiare i tassi di reazione in vivo degli enzimi NL o la degradazione delle specie NL nel tempo.
Introduction
L'acetil-CoA è l'elemento fondamentale di diverse biomolecole, compresi i lipidi neutri (NL), che fungono da valuta biomolecolare versatile per la costruzione di membrane, la generazione di ATP e la regolazione della segnalazione cellulare1,2. La disponibilità di NL da deviare in uno qualsiasi di questi rispettivi percorsi è, in parte, regolata dal loro stoccaggio. Le goccioline lipidiche (LD), organelli citoplasmatici composti da nuclei idrofobici di trigliceridi (TG) ed esteri di sterolo (SE), sono i principali compartimenti di stoccaggio della maggior parte dei NL cellulari. Come tali, i LD sequestrano e regolano i NL, che possono essere degradati e successivamente utilizzati per processi biochimici e metabolici3,4. È noto che l'errata regolazione delle proteine associate a NL e LD è correlata con l'insorgenza di patologie tra cui la lipodistrofia e le sindromi metaboliche5,6. Per questo motivo, l'attuale ricerca LD è intensamente focalizzata su come la sintesi nl è regolata spazialmente, temporalmente e attraverso tessuti distinti di organismi multicellulari. A causa dei ruoli cellulari onnipresenti per i NL, molti enzimi responsabili della sintesi e della regolazione dei NL sono conservati in tutti gli eucarioti7. In effetti, anche alcuni procarioti memorizzano NL in LDs8. Pertanto, organismi modello geneticamente trattabili come Saccharomyces cerevisiae (lievito in erba) sono stati utili per lo studio della sintesi e della regolazione della NL.
La separazione e la quantificazione dei NL dagli estratti cellulari può essere realizzata in una miriade di modi, tra cui gascromatografia-spettrometria di massa (GC-MS), cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) e cromatografia liquida ultra-performante-spettrometria di massa (UPLC-MS)9,10,11. Forse il metodo più semplice per separare i NL è tramite cromatografia a strato sottile (TLC), che consente la successiva quantificazione densitometrica da una curva standard12,13. Sebbene TLC fornisca solo una separazione granulare dei NL, rimane una tecnica potente perché è poco costosa e consente la rapida separazione dei NL da più campioni contemporaneamente. Due delle sfide più considerevoli che lo studio delle NL tramite TLC devono affrontare sono: 1) l'ampia gamma di abbondanze cellulari delle specie NL e dei loro intermedi e 2) la gamma di idrofilia / idrofobicità degli intermedi lipidici all'interno delle vie di sintesi NL. Di conseguenza, la quantificazione delle specie NL tramite TLC è tipicamente limitata alle specie più abbondanti; tuttavia, l'introduzione di una radiomarcatore di acido C-acetico 14può migliorare significativamente l'individuazione di intermedi a bassa abbondanza all'interno delle vie NL. L'acido acetico viene rapidamente convertito in acetil-CoA dall'acetil-CoA sintetasi ACS214, che rende l'acido 14C-acetico un substrato di radioetichettatura adatto nel lievito15. Inoltre, la separazione sia dei NL idrofobici che degli intermedi idrofili dei NL può essere ottenuta mediante TLC attraverso l'uso di sistemi a solvente multipli16. Qui, viene presentato un metodo per la separazione dei NL utilizzando l'etichettatura metabolica dell'acido C-acetico 14nel lievito. I lipidi marcati durante il periodo di impulso vengono successivamente isolati da un protocollo di isolamento lipidico totale ben consolidato17, seguito dalla separazione delle specie NL mediante TLC. Lo sviluppo di piastre TLC sia mediante autoradiografia per visualizzare i lipidi marcati, sia uno spray chimico per visualizzare i lipidi totali, consente molteplici metodi di quantificazione. Le singole bande lipidiche possono anche essere facilmente estratte dalla piastra TLC usando una lama di rasoio e il conteggio della scintillazione può essere utilizzato per quantificare la quantità di materiale radiomarcato all'interno della banda.
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Protocol
1. Crescita ed etichettatura delle cellule di lievito con acido 14C-acetico
- Inoculare una coltura di lievito raccogliendo una colonia da un piatto ed erogandola in 20 ml di mezzi sintetici completi (SC) contenenti il 2% di destrosio (vedere File supplementare per la ricetta dei mezzi SC). Incubare a 30 °C per la notte con agitazione a 200 giri/min.
NOTA: le condizioni di crescita, il volume del campione e il trattamento differiranno in base ai lipidi di interesse. Prima di eseguire esperimenti completi, le condizioni di crescita ottimali e i volumi di coltura dovrebbero essere determinati empiricamente. Questo protocollo discute la radioetichettatura di colture di lievito cresciute in fase stazionaria, una fase di crescita in cui la crescita della biomestra e cellulare rallenta e la sintesi nl è molto attiva. - Misurare l'OD600 della coltura notturna utilizzando uno spettrofotometro e diluire la coltura cellulare di lievito a un OD600 finale di 0,2 in 50 mL di mezzi SC freschi contenenti il 2% di destrosio. Far crescere le cellule per 24 ore, o fino a quando non hanno raggiunto la fase stazionaria (che è comunemente definita da un rivestimento piatto della cella raddoppiando la misurazione OD600).
- Prima di raccogliere le celle, creare il buffer di tempra (vedere File supplementare per i dettagli). Fare due aliquote da 20 mL di tampone di tempra per ciascun campione (cioè 40 mL di tampone di tempra per ciascun campione) e dividere uniformemente in due tubi conici da 50 mL). Conservare le aliquote tampone di tempra a -80 °C per un uso futuro.
- Una volta che le colture hanno raggiunto l'OD o la fase di crescita desiderata, raccogliere le cellule centrifugando a 4.100 x g per 10 min. Mentre i campioni sono nella centrifuga, preparare mezzi di radioetichettatura aggiungendo[1-14C] sale sodico di acido acetico a mezzi SC privi di destrosio ad una concentrazione finale di 10 μCi/mL.
ATTENZIONE: i dispositivi di protezione individuale (DPI) adeguati devono essere indossati sempre quando si lavora con materiali radioattivi. Seguire sempre le linee guida locali per il corretto stoccaggio, utilizzo e smaltimento dei materiali radioattivi.
NOTA: Sia la concentrazione di acido 14C-acetico nel mezzo di etichettatura che il tempo di incubazione della radioetichettatura devono essere regolati in base al metabolita o ai metaboliti di interesse. Qui viene utilizzata un'incubazione a impulsi radioetichettatura di 20 minuti, che è sufficiente per etichettare le specie NL con una gamma di abbondanza. - Rimuovere il surnatante dalle celle pellettate e lavare il pellet una volta con 20 ml di media SC privo di destrosio riconsegrendo il pellet con una pipetta. Raccogliere nuovamente le cellule centrifugando a 4.100 x g per 5 min.
- Risuspenare le cellule in 1 mL di mezzi SC privi di destrosio e trasferire le cellule in un tubo microcentrifuga da 2 mL etichettato. Raccogliere nuovamente le cellule centrifugando a 4.100 x g per 2 min.
- Risuspendare le cellule ancora una volta in 500 μL di mezzi SC privi di destrosio. Pre-raffreddare una centrifuga equipaggiata per tubi conici da 50 ml a -10 °C o alla temperatura più bassa.
- Iniziare il periodo di radioelabosione aggiungendo rapidamente 500 μL di mezzi di radioetichettatura a ogni 500 μL di sospensione cellulare (concentrazione finale di acido C-acetico 14= 5 μCi/mL). Incubare i tubi in un incubatore rotante a 30 °C per 20 minuti e 2 minuti prima della fine del periodo di etichettatura, trasferire un'aliquota di tampone di tempra da 20 ml per ciascun campione dal congelatore a -80 °C a un secchio di ghiaccio
- Una volta terminato il periodo di radioetichettatura, utilizzare una pipetta per immergere l'intero campione da 1 mL in 20 mL di tampone di tempra a freddo. Vortex i tubi conici per 5-10 s per assicurarsi che il campione sia stato accuratamente miscelato con il tampone di tempra. Incubare i campioni in tampone di tempra per 2 minuti sul ghiaccio.
- Raccogliere il pellet cellulare ruotando in una centrifuga a 5.000 x g per 3 minuti impostato a -10 °C o alla temperatura più bassa. Mentre le provette del campione girano, trasferire un altro set di aliquote tampone di tempra dal congelatore a -80 °C a un secchio pieno di ghiaccio (cioè un tubo da 20 ml di tampone di tempra per campione).
- Rimuovere il tampone di tempra surnatante dai pellet cellulari e sostituirlo con 20 ml di tampone fresco, freddo e temprante. Vortice e agitare i campioni fino a quando il pellet non è stato rimosso dal fondo del tubo conico e sospeso completamente nel tampone di tempra. Centrifugare nuovamente i campioni a 5.000 x g per 3 minuti a -10 °C per raccogliere le cellule.
- Una volta che le cellule sono state pelletizzate, rimuovere accuratamente tutto il tampone di tempra dai campioni versando via il surnatante e rimuovendo l'eccesso con una pipetta. Conservare i tubi a -80 °C per un'ulteriore lavorazione.
2. Isolamento dei lipidi totali dal lievito
NOTA: Il seguente protocollo per l'isolamento lipidico si basa su un metodo ben consolidato e frequentemente utilizzato che estrae in modo efficiente la maggior parte delle specie lipidiche neutre17,18.
ATTENZIONE: Quando si utilizza solvente organico, indossare sempre DPI appropriati e lavorare all'interno di una cappa aspirante quando possibile. Durante l'estrazione dei lipidi, evitare di utilizzare materie plastiche incompatibili con solventi organici. I tubi in polipropilene sono adatti per il seguente protocollo.
- Pesare 0,3 g di perle di vetro lavate con acido per ogni campione e conservarle in 2 mL di microcentrifuga su ghiaccio. Rimuovere i pellet di cella dal congelatore a -80 °C e tenerli sul ghiaccio. Aggiungere 350 μL di metanolo e 700 μL di cloroformio a ciascun campione, riconsocidare e trasferire in tubi di microcentrifuga contenenti perle di vetro pre-pesate.
- Lisi delle cellule agitando i tubi su un vortice 3x per 1 min, con 30 s incubazioni sul ghiaccio tra le agitazioni. In alternativa, le cellule possono essere lysed utilizzando un mini bead-beater per tre cicli di 1 minuto. Risparmiare 25-30 μL di llisi cellulare intera in un tubo separato per il conteggio della scintillazione.
NOTA: Il lisiato salvato verrà utilizzato per determinare la quantità relativa di radioisotopo assorbita da ciascun campione durante il periodo di impulso, che influenzerà la quantità di ciascun campione caricato sulla piastra TLC. Questo è discusso ulteriormente nel passaggio 3.2. - Versare l'intero contenuto del tubo microcentrifuga da 2 mL in un tubo centrifugo di vetro da 15 mL [Tubo A]. Lavare i tubi microcentrifuga da 2 ml aggiungendo 1 mL di metanolo e vorticoso per 10-15 s. Trasferire il lavaggio a metanolo da 1 ml nel tubo A e aggiungere 2 mL di cloroformio nel tubo A seguito da 400 μL di acqua per un volume finale del campione di 4,45 ml.
- Campioni di vortice per 1 minuto seguiti da una centrifugazione di 5 minuti a 1.000 x g. Dopo la centrifugazione, le fasi acquosa (superiore) e organica (inferiore) devono essere chiaramente separate visivamente con detriti cellulari che giacciono all'interfaccia.
- Utilizzando una pipetta Pasteur di vetro, raccogliere la fase organica dal tubo A e passare a un nuovo tubo centrifugo in vetro da 15 ml (tubo B). Aggiungere 1 mL di 1M KCl al tubo B. Per il tubo A, aggiungere 1 mL di metanolo e 2 mL di cloroformio e 200 μL di acqua MiliQ. Ripetere le fasi di vortice e centrifugazione sul tubo A.
- Ancora una volta raccogliere la fase organica dal tubo A e aggiungerla al tubo B. Smaltire il tubo A in un contenitore appropriato. Tubo Vortex B per 1 min seguito da una centrifugazione di 5 min a 1.000 x g.
- Rimuovere lo strato acquoso superiore dal tubo B e smaltire. Aggiungere 1 mL di KCl fresco da 1 M KCl al tubo B e ripetere la fase di vortice/centrifugazione. Una volta separati gli strati, raccogliere con cura l'intero strato organico inferiore in un flaconcino di vetro da 4 ml etichettato.
NOTA: In questa fase, gli estratti lipidici possono essere conservati a -80 °C, oppure il protocollo può essere continuato per la separazione TLC dei lipidi.
3. Separazione e quantificazione dei NL radioisotopici mediante cromatografia su strato sottile
- Se gli estratti lipidici sono stati posti a -80 °C, portare lentamente a temperatura ambiente incubando su ghiaccio e successivamente su un banco. Evaporare completamente il solvente dagli estratti lipidici mediante essiccazione sottovuoto o utilizzando un flusso delicato di gas inerte (ad esempio, argon o azoto). Nel frattempo, preriscaldare un forno a 145 °C per riscaldare la piastra TLC.
- Prima che i campioni possano essere caricati sulla piastra TLC, determinare le quantità relative di radiomarcatore assorbite dalle cellule. Pipettare 10 μL dell'intero lisato cellulare dal punto 2.2 in un flaconcino di scintillazione di vetro da 6 mL, aggiungere 6 mL di liquido di scintillazione e posizionare i flaconcini in un rack. Utilizzare un contatore di scintillazione per misurare il cpm o il dpm di ciascun campione utilizzando l'opzione di conteggio singolo rack impostata su un tempo di conteggio di 1 minuto. Misurare ogni intero lisi cellulare in duplice copia per ottenere una media per ogni campione. Regolare la quantità di carico in base a un tipo wild o a un campione di riferimento
NOTA: La quantità di ciascun campione da caricare sulla piastra TLC può essere determinata utilizzando la seguente equazione: (conteggi medi dei campioni) / (conteggi medi di riferimento) x volume di carico desiderato. Ad esempio, se 20 μL del campione di riferimento devono essere caricati sulla piastra TLC e hanno un conteggio medio di 1.000, allora un campione sperimentale con un conteggio medio di 2.000 avrà 10 μL caricati sulla piastra TLC. - Ricostituire i lipidi del campione in 40-50 μL di cloroformio:metanolo 1:1 (v/v%) mediante vortice per 5 min. Preparare 101 mL del solvente di fase mobile in un cilindro graduato di vetro (vedere la sezione Risultati rappresentativi per un esempio di separazione delle principali specie NL mediante un solvente di acido acetico 50:40:10:1 (v/v/v/v%) esano:etere di petrolio:etere etilico:solvente di acido acetico).
- Versare il solvente in una camera TLC di vetro contenente un tampone di saturazione 20 x 20 TLC e un coperchio aderente. Preparare una piastra in gel di silice 20 x 20 G canalizzata segnando delicatamente una linea 1,5 cm sopra il fondo del piatto usando una matita. La linea indica l'origine e dove verranno caricati i lipidi. Sotto la linea, etichetta delicatamente il campione che verrà caricato in ogni corsia. Una volta che la piastra TLC è stata predisposta, incubare la piastra in un forno a 145 °C per almeno 30 minuti per preriscaldare la piastra e rimuovere l'umidità in eccesso.
- Una volta che la piastra è stata sufficientemente riscaldata e il tampone di saturazione TLC è saturo di solvente, rimuovere la piastra TLC dal forno e procedere immediatamente al caricamento della piastra TLC. Il caricamento della piastra mentre è calda garantisce una rapida evaporazione del solvente. Per ogni specie lipidica di interesse, caricare 5-20 μg di uno standard lipidico purificato su una corsia della piastra TLC per tracciare la separazione e la distanza di migrazione prevista. Utilizzando una pipetta, individuare 5 μL di campione sull'origine di ciascuna corsia situata a 1,5 cm sopra il fondo della piastra TLC. Ripetere il caricamento di spot da 5 μL fino a quando 20-40 μL di campione non sono stati caricati in ciascuna corsia.
NOTA: 5-20 μg di lipidi purificati non etichettati possono essere aggiunti a ciascuna corsia del campione come traccianti che possono essere colorati e visualizzati dopo la separazione TLC dei lipidi. La presenza di uno standard colorato consente un facile tracciamento ed escissione delle bande lipidiche radiomarcate per il successivo conteggio della scintillazione. Quali standard purificati vengono caricati sulla piastra saranno determinati dalle specie nl di interesse. Vedere la sezione Risultato rappresentativo per esempi di separazione di acido oleico (FFA), 1,2 dioleoil-glicerolo (DG), trioleina (TG), colesterolo (Chol), colesteril-linoleato (SE) e squalene nelle corsie adiacenti alle corsie campione. - Una volta caricati i campioni standard e sperimentali, posizionare la piastra nella camera di sviluppo e attendere che il solvente abbia raggiunto la parte superiore della piastra (40-60 min). Una volta che la piastra è completamente sviluppata, rimuoverla dalla camera e lasciarla asciugare nella cappa aspirante per 20 minuti.
- Dopo che la piastra è stata asciugata, coprirla con pellicola di plastica e metterla in una cassetta in via di sviluppo con uno schermo di autoradiografia. Lasciare che la piastra si sviluppi con lo schermo per 24-48 ore.
4. Visualizzazione e quantificazione dei lipidi separati da TLC
- Rimuovere lo schermo dalla cassetta di sviluppo e posizionare all'interno di un imager al fosforo. Selezionare l'opzione Imaging al fosforo e sviluppare a 800-1000 V.
NOTA: l'imaging al fosforo fornisce una visione qualitativa dei lipidi radiomarcelati sulla piastra TLC. Tuttavia, la quantificazione dei lipidi radiomarcati è meglio realizzata dal conteggio a scintillazione, che viene descritto successivamente. - Miscelare 100 mL di reagente p-anisaldeide (vedere File supplementare) e depositare in un flacone spray di vetro. Spruzzare la piastra TLC con il reagente p-anisaldeide fino a quando la silice non è satura. Cuocere la piastra in forno a 145 °C per 5 minuti o fino a quando non sono apparse delle fasce.
- Per quantificare le singole specie lipidiche utilizzando il conteggio a scintillazione radiomarcatore, utilizzare una lama di rasoio per raschiare il gel di silice dalla piastra TLC di vetro. Trasferire ogni banda di gel di silice corrispondente a una singola specie lipidica radiomarcata in una fiala di scintillazione di vetro e aggiungere 6 mL di liquido di scintillazione. Vortice vigorosamente fino a quando la banda di silice è stata ridotta a piccoli pezzi.
- In alternativa, i lipidi possono essere estratti dalla banda del gel di silice utilizzando il protocollo di estrazione lipidica nella sezione 3. Se i lipidi vengono estratti dal gel di silice, evaporare completamente il solvente come nel passaggio 3.1 e aggiungere 6 ml di liquido di scintillazione ai lipidi essiccati. Posizionare il rack contenente flaconcini di scintillazione in un contatore di scintillazione. Selezionare l'opzione Conta rack singolo e regolare il tempo di conteggio a 2 minuti per flaconcino. I risultati del contatore di scintillazione verranno stampati e potranno essere visualizzati come un grafico a barre.
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Representative Results
In questo protocollo, abbiamo dimostrato che l'etichettatura, il rilevamento e la quantificazione delle specie NL possono essere realizzati mediante l'etichettatura metabolica dell'acido C-acetico 14. Le principali specie di NL possono essere separate in un sistema solvente di 50:40:10:1 (v/v/v/v%) Esano:Etere di petrolio:Etere etilico:Acido acetico (Figura 1A,B). L'imaging al fosforo consente la visualizzazione di acidi grassi liberi etichettati (FFA), triacilglicerolo (TG), diacilglicerolo (DG), colesterolo (Chol) e squalene (SQ) (Figura 1A). Sebbene le SE possano essere separate da altre specie nl in questo solvente, nessuna viene rilevata nell'autoradiogramma dopo un impulso di 20 minuti. Ciò può essere attribuito alla lenta sintesi di SE durante la fase stazionaria di crescita nel lievito. È anche dimostrato che le specie lipidiche purificate possono essere separate in questo metodo e successivamente visualizzate spruzzando la piastra TLC con reagente p-anisaldeide (Figura 1B). Mentre le specie NL sono ben separate in questo solvente, le specie polari come la fosfatidilcolina (PC) rimangono all'origine (Figura 1B). Applicando un periodo di inseguimento in mezzi privi di radiomarcatore dopo l'impulso, è possibile misurare il flusso relativo attraverso le vie NL (Figura 1C). Dopo un inseguimento di 10 minuti, il pool principale di SQ è scomparso e il Chol totale è elevato. Allo stesso modo, la comparsa di DG nel periodo di inseguimento è correlata a una diminuzione del segnale FFA.
Figura 1: 14La radioetichettatura dell'acido C-acetico consente di rilevare più specie di NL. (A) Autoradiogramma di lipidi separati da TLC isolati da lieviti radiomarcati con acido 14C-acetico in fase stazionaria. Le specie chiaramente rilevabili includono acido grasso libero (FFA), trigliceridi (TG), diacilglicerolo (DG), colesterolo (Chol) e squalene (SQ). Le bande non etichettate sono specie NL non identificate. (B) Specie lipidiche purificate separate da TLC e visualizzate mediante colorazione di p-anisaldeide. Le specie visualizzate includono tutti i lipidi menzionati in (A) oltre agli esteri di sterolo (SE) e alla fosfatidilcolina (PC). (C) Autoradiogramma di lipidi separati da TLC isolati da lievito pulsato con acido 14-aceticoin fase stazionaria seguita da un periodo di inseguimento di 10 minuti in mezzi privi di radiomarcatore. La scomparsa di SQ è accolta con un aumento di Chol. L'aumento della DG nel periodo di inseguimento è accompagnato da una diminuzione delle specie FFA. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Fascicolo integrativo: Ricette per buffer, supporti e soluzioni. Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
Qui viene presentato un versatile protocollo di radioelabazione per monitorare quantitativamente la sintesi delle specie NL nel lievito. Questo protocollo è molto modulare, il che consente di terminare la procedura entro 3-6 giorni. Inoltre, esiste una vasta letteratura sull'uso di TLC per separare specie lipidiche e metaboliti, che dovrebbe consentire all'utente di rilevare diverse specie lipidiche di interesse con un semplice cambiamento dei sistemi solventi TLC16,19. Questo protocollo è favorevole alla separazione, al rilevamento e alla quantificazione dei lipidi radiomarcati. Può anche essere abbinato a un periodo di inseguimento in mezzi non etichettati per rilevare il tempo di rotazione delle NL etichettate. Collettivamente, questa procedura fornisce una struttura utile per iniziare ad esplorare la radioetichettatura delle specie NL.
Altri metodi, come HPLC, GC-MS e UPLC-MS forniscono una maggiore risoluzione della separazione e della quantificazione dei lipidi; tuttavia, in genere non è ottimale eseguire campioni radiomarcati attraverso la SM, sebbene ciò possa essere superato utilizzando isotopi stabili. Tuttavia, questo metodo di radiomarcazione fornisce un'elevata sensibilità di rilevamento e versatilità per molte specie lipidiche. Un altro vantaggio di questo protocollo rispetto alla SM è la sua convenienza. La separazione TLC dei lipidi è relativamente semplice, non richiede attrezzature stravaganti e si basa su materiali di laboratorio comuni. Per quanto riguarda le limitazioni: alcune specie a bassa abbondanza, come i lipidi, potrebbero non essere rilevabili anche dopo l'incorporazione di un'etichetta 14C. Inoltre, la maggior parte degli approcci TLC non sono adatti per caratterizzazioni "lipidomiche", a causa della separazione a grana di corso delle specie lipidiche all'interno di un determinato solvente.
Il lievito offre un sistema modello conveniente e geneticamente trattabile per lo studio dei lipidi tramite approcci biochimici a radiomarca. Tuttavia, va notato che in specifici background genetici, o durante una particolare condizione di crescita metabolica, l'assorbimento cellulare di acido acetico radiomartica o altre radioetichele può essere ridotto. L'etichettatura delle cellule con acido 14C-acetico in assenza di glucosio aumenta in modo robusto l'assorbimento della radiomarcatura. Lunghe incubazioni in assenza di glucosio aumenteranno proporzionalmente l'assorbimento dei radiomarcatori; tuttavia, ciò può anche influenzare i percorsi in questione. Pertanto, l'efficienza di etichettatura per una particolare condizione di crescita dovrebbe essere stabilita prima di seguire integralmente il protocollo di radioelabazione dell'acido C-acetico 14. In particolare, prestare attenzione alla durata del periodo di radioelabografia. Il tempo di etichettatura dovrebbe essere mantenuto il più breve possibile per rilevare le specie lipidiche di interesse. Complessivamente, questa procedura consente lo studio di importanti reazioni di sintesi lipidica e dovrebbe consentire lo studio della regolazione NL in cellule intatte.
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Disclosures
Gli autori dichiarano che non ci sono interessi concorrenti nella preparazione di questo manoscritto.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare i membri del laboratorio Henne per l'aiuto e la consulenza concettuale nel completamento di questo studio. W.M.H. è sostenuta da fondi della Welch Foundation (I-1873), del NIH NIGMS (GM119768), dell'Ara Paresghian Medical Research Fund e dell'UT Southwestern Endowed Scholars Program. S.R è stata supportata da una sovvenzione del programma T32 (5T32GM008297).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [1-C14] Acetic acid sodium salt specific activity: 45-60mCi | PerkinElmer | NEC084H001MC | |
| 18:1 1,2 dioleoyl-sn-glycerol | Avanti | 800811O | |
| 200 proof absolute ethanol | Sigma | 459836 | |
| Acid washed glass beads 425-600um | Sigma | G8772 | |
| Amber bulbs for Pastuer pipettes | Fisher | 03-448-24 | |
| Ammonium Sulfate >99% | Sigma | A4418 | |
| Beckman LS6500 scintillation counter | PerkinElmer | A481000 | |
| Chloroform (HPLC grade) | Fisher | C607SK | |
| Cholesterol >99% | Sigma | C8667 | |
| Cholesteryl-linoleate >98% | Sigma | C0289 | |
| Concentrated sulfuric acid | Sigma | 339741 | |
| Corning 50mL conical tubes, polypropylene with centristar cap | Sigma | CLS430829 | |
| Dextrose, anhydrous grade | Sigma | D9434 | |
| Diethyl ether anhydrous grade | Sigma | 296082 | |
| Drying oven | Fisher | 11-475-155 | |
| EcoLume scintillation liquid | VWR | IC88247001 | |
| Eppendorf 5424R centrifuge | Fisher | 05-401-205 | |
| GE Storage phosphor screen | Sigma | GE28-9564-75 | |
| GE Typhoon FLA9500 imager | |||
| Glacial acetic acid, ACS grade | Sigma | 695092 | |
| Glass 6mL scintillation vials | Sigma | M1901 | |
| Glass centrifuge tube caps | Fisher | 14-595-36A | |
| Glass centrifuge tubes | Fisher | 14-595-35A | |
| Glass Pasteur pipette | Fisher | 13-678-20C | |
| Hexane, anhydrous grade | Sigma | 296090 | |
| L-Adenine >99% | Sigma | A8626 | |
| L-Alanine >98% | Sigma | A7627 | |
| L-Arginine >99% | Sigma | A1270000 | |
| L-Asparagine >98% | Sigma | A0884 | |
| L-Aspartate >98% | Sigma | A9256 | |
| L-Cysteine >97% | Sigma | W326305 | |
| L-Glutamic acid monosodium salt monohydrate >98% | Sigma | 49621 | |
| L-Glutamine >99% | Sigma | G3126 | |
| L-Glycine >99% | Sigma | G8898 | |
| L-Histidine >99% | Sigma | H8000 | |
| L-Isoleucine >98% | Sigma | I2752 | |
| L-Leucine >98% | Sigma | L8000 | |
| L-Lysine >98% | Sigma | L5501 | |
| L-Methionine, HPLC grade | Sigma | M9625 | |
| L-Phenylalanine, reagent grade | Sigma | P2126 | |
| L-Proline >99% | Sigma | P0380 | |
| L-Serine >99% | Sigma | S4500 | |
| L-Theronine, reagent grade | Sigma | T8625 | |
| L-Tryptophan >98% | Sigma | T0254 | |
| L-Tyrosine >98% | Sigma | T3754 | |
| L-Uracil >99% | Sigma | U0750 | |
| L-Valine >98% | Sigma | V0500 | |
| Methanol, ACS grade | Fisher | A412 | |
| Oleic acid >99% | Sigma | O1008 | |
| p-anisaldehyde | Sigma | A88107 | |
| Petroleum ether, ACS grade | Sigma | 184519 | |
| Phosphatidylcholine, dipalmitoyl >99% | Sigma | P1652 | |
| Pipettes | Eppendorf | 2231000713 | |
| Potassium chloride, ACS grade | Sigma | P3911 | |
| Sodium Hydroxide pellets, certified ACS | Fisher | S318-100 | |
| Squalene >98% | Sigma | S3626 | |
| Succinic Acid crystalline/certified | Fisher | 110-15-6 | |
| TLC saturation pad | Sigma | Z265225 | |
| TLC silica gel 60G glass channeled plate | Fisher | NC9825743 | No fluorescent indicators |
| Transparency plastic film | Apollo | 829903 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Triolein >99% | Sigma | T7140 | |
| Vortex mixer | Fisher | 02-215-414 | |
| Whatman exposure cassette | Sigma | WHA29175523 | |
| Yeast nitrogen base without ammonium sulfate and amino acids | Sigma | Y1251 |
References
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