Summary
Her presenteres en protokoll for metabolsk merking av gjær med 14C-eddiksyre, som er kombinert med tynn lagkromatografi for separasjon av nøytrale lipider.
Abstract
Nøytrale lipider (NLs) er en klasse hydrofobe, ladløse biomolekyler som spiller nøkkelroller i energi og lipid homeostase. NLs er syntetisert de novo fra acetyl-CoA og er primært til stede i eukaryoter i form av triglyserider (TGs) og sterol-estere (SE). Enzymene som er ansvarlige for syntesen av NLs er sterkt bevart fra Saccharomyces cerevisiae (gjær) til mennesker, noe som gjør gjær til en nyttig modellorganisme for å dissekere funksjonen og reguleringen av NL-metabolismenzymer. Mens mye er kjent om hvordan acetyl-CoA omdannes til et mangfoldig sett med NL-arter, oppdages mekanismer for regulering av NL-metabolismeenzymer, og hvordan feilregulering kan bidra til cellulære patologier. Tallrike metoder for isolering og karakterisering av NL-arter har blitt utviklet og brukt over flere tiår med forskning; Det er imidlertid ikke diskutert en kvantitativ og enkel protokoll for omfattende karakterisering av store NL-arter. Her presenteres en enkel og tilpasningsdyktig metode for å kvantifisere de novo-syntesen av store NL-arter i gjær. Vi bruker 14C-eddiksyre metabolsk merking kombinert med tynn lagkromatografi for å skille og kvantifisere et mangfoldig utvalg av fysiologisk viktige NLs. I tillegg kan denne metoden lett brukes til å studere in vivo reaksjonshastigheter av NL enzymer eller nedbrytning av NL-arter over tid.
Introduction
Acetyl-CoA er den grunnleggende byggesteinen i forskjellige biomolekyler, inkludert nøytrale lipider (NLs), som tjener som en allsidig biomolekylær valuta for å bygge membraner, generere ATP og regulere cellesignalering1,2. Tilgjengeligheten av NLs som skal shunted inn i noen av disse respektive veiene er delvis regulert av deres lagring. Lipiddråper (LDer), cytoplasmatiske organeller sammensatt av hydrofobe kjerner av triglyserider (TG) og sterol-estere (SE), er de viktigste lagringsrommene til de fleste cellulære NLer. Som sådan, LDs sequester og regulere NLs, som kan degraderes og deretter brukes til biokjemiske og metabolske prosesser3,4. Det er kjent at feilregulering av NL- og LD-assosierte proteiner er korrelert med utbruddet av patologier, inkludert lipodystrofi og metabolske syndromer5,6. På grunn av dette er nåværende LD-forskning intenst fokusert på hvordan NL-syntese reguleres romlig, timelig og på tvers av distinkte vev av multi-cellulære organismer. På grunn av allestedsnærværende cellulære roller for NLs, er mange enzymer som er ansvarlige for syntesen og reguleringen av NLs bevart gjennom eukaryoter7. Faktisk lagrer selv noen prokaryoter NLs i LDer8. Derfor har genetisk gjennomførbare modellorganismer som Saccharomyces cerevisiae (spirende gjær) vært nyttige for studiet av NL-syntese og regulering.
Separasjon og kvantifisering av NLer fra celleekstrakter kan oppnås på en rekke måter, inkludert gasskromatografi-massespektrometri (GC-MS), høyytelses væskekromatografi (HPLC) og ultraytelses væskekromatografi-massespektrometri (UPLC-MS)9,10,11. Kanskje den enkleste metoden for å skille NLer er via tynn lagkromatografi (TLC), som muliggjør etterfølgende densitometrisk kvantifisering fra en standardkurve12,13. Selv om TLC bare gir en kurskornet separasjon av NLs, forblir det en kraftig teknikk fordi den er billig, og det gir mulighet for rask separasjon av NLs fra flere prøver samtidig. To av de viktigste utfordringene studien av NLs står overfor via TLC er: 1) det brede spekteret av cellulære overflod av NL-arter og deres mellomprodukter, og 2) omfanget av hydrofilisitet/hydrofobiskhet av lipid mellomprodukter innenfor NL-synteseveier. Følgelig er kvantifiseringen av NL-arter via TLC vanligvis begrenset til de mest tallrike artene; Imidlertid kan innføring av en 14C-eddiksyreradiomerket forbedre påvisning av lave overflodsforenkninger innenfor NL-veier betydelig. Eddiksyre omdannes raskt til acetyl-CoA av acetyl-CoA-syntetase ACS214, noe som gjør 14C-eddiksyre til et egnet radiomerket substrat i gjær15. I tillegg kan separasjon av både hydrofobe NLs og hydrofile mellomprodukter av NLs oppnås ved TLC ved bruk av flere løsningsmiddelsystemer16. Her presenteres en metode for separasjon av NLs ved hjelp av 14C-eddiksyre metabolsk merking i gjær. Lipider merket i løpet av pulsperioden isoleres deretter av en veletablert total lipidisolasjonsprotokoll17, etterfulgt av separasjon av NL-arter av TLC. Utvikling av TLC-plater ved både autoradiografi for å visualisere merkede lipider, og en kjemisk spray for å visualisere totale lipider, tillater flere metoder for kvantifisering. Individuelle lipidbånd kan også enkelt ekstraheres fra TLC-platen ved hjelp av et barberblad, og scintillasjonstelling kan brukes til å kvantifisere mengden radiomerket materiale i båndet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vekst og merking av gjærceller med 14C-eddiksyre
- Inokuler en gjærkultur ved å plukke en koloni fra en tallerken og dispensere den i 20 ml syntetisk komplette (SC) medier som inneholder 2% dekstrose (se Tilleggsfil for oppskrift av SC-medier). Inkuber ved 30 °C for overnatting med risting ved 200 o/min.
MERK: Veksttilstanden, prøvevolumet og behandlingen vil variere basert på lipid(er) av interesse. Før du kjører fulle eksperimenter, bør optimale vekstforhold og kulturvolumer bestemmes empirisk. Denne protokollen diskuterer radiomerking av gjærkulturer som vokser til stasjonær fase, en vekstfase når biomembran og cellevekst avtar, og NL-syntesen er veldig aktiv. - Mål OD600 av nattkulturen ved hjelp av et spektrofotometer og fortynn gjærcellekulturen til en endelig OD600 av 0,2 i 50 ml ferske SC-medier som inneholder 2% dekstrose. Øk cellene i 24 timer, eller til de har nådd den stasjonære fasen (som vanligvis defineres av en flat foring av cellen som dobler OD600-målingen).
- Før du samler inn cellene, må du lage slukkebufferen (se Tilleggsfil hvis du vil ha mer informasjon). Lag to 20 ml aliquots av slukkebuffer for hver prøve (dvs. 40 ml slukkebuffer for hver prøve) og del jevnt i to 50 ml koniske rør). Oppbevar slukkingsbufferen ved -80 °C for fremtidig bruk.
- Når kulturene har nådd ønsket OD eller vekstfase, samle cellene ved sentrifugering på 4100 x g i 10 minutter. Mens prøver er i sentrifugen, klargjør du radiomerkingsmedier ved å tilsette [1-14C] eddiksyrenatriumsalt til dekstrosefrie SC-medier med en endelig konsentrasjon på 10 μCi / ml.
FORSIKTIG: Riktig personlig verneutstyr (PVU) bør brukes hele tiden når du arbeider med radioaktive materialer. Følg alltid lokale retningslinjer for riktig lagring, bruk og avhending av radioaktive materialer.
MERK: Både konsentrasjonen av 14C-eddiksyre i merkemediet og radiomerket inkubasjonstid bør justeres i henhold til metabolitten(e) av interesse. Her brukes en 20 min radiolabeling pulsinkubasjon, som er tilstrekkelig til å merke NL-arter med en rekke overflod. - Fjern supernatanten fra pelletedcellene, og vask cellepellet en gang med 20 ml dextrosefrie SC-medier ved å bruke pelletsen på nytt med en pipette. Samle cellene igjen ved sentrifugering på 4,100 x g i 5 min.
- Resuspend cellene i 1 ml dextrose-frie SC-medier, og overfør cellene til et merket 2 ml mikrosenterfugerør. Samle cellene igjen ved sentrifugering på 4,100 x g i 2 min.
- Resuspend cellene igjen i 500 μL av dextrose-frie SC-medier. Forkjøl en sentrifuge utstyrt for 50 ml koniske rør til -10 °C eller på laveste temperaturinnstilling.
- Start radiomerkingsperioden ved raskt å legge til 500 μL radiomerkingsmedier til hver 500 μL cellefjæring (endelig 14C-eddiksyrekonsentrasjon = 5 μCi/ml). Inkuber rørene i en roterende inkubator ved 30 °C i 20 min. 2 min før slutten av merkeperioden, overfør en 20 ml aliquot slukkingsbuffer for hver prøve fra -80 °C fryseren til en bøtte med is
- Når radiomerkingsperioden er over, bruker du en pipette til å kaste hele 1 ml prøven i 20 ml kald slukkebuffer. Virvel de koniske rørene i 5-10 s for å sikre at prøven er grundig blandet med slukkebufferen. Inkuber prøvene i slukkebuffer i 2 min på is.
- Samle cellepellet ved å spinne i en sentrifuge ved 5000 x g i 3 min satt til -10 °C eller på laveste temperaturinnstilling. Mens prøverørene spinner, kan du overføre et annet sett med slukkebuffer aliquot fra -80 °C fryseren til en bøtte fylt med is (dvs. ett 20 ml rør med slukkebuffer per prøve).
- Fjern slukkingsbufferen supernatant fra cellepellets og erstatt den med 20 ml frisk, kald, slukkebuffer. Virvel og rist prøvene til pelletsen er løsnet fra bunnen av det koniske røret og resuspendert helt i slukkebufferen. Sentrifuger prøvene igjen ved 5000 x g i 3 min ved -10 °C for å samle cellene.
- Når cellene er pelletert, fjern grundig all slukkebuffer fra prøvene ved å helle av supernatanten og fjerne overskuddet med en pipette. Oppbevar rør ved -80 °C for videre bearbeiding.
2. Isolering av totale lipider fra gjær
MERK: Følgende protokoll for lipidisolasjon er basert på en veletablert og ofte brukt metode som effektivt trekker ut de fleste nøytrale lipidarter17,18.
FORSIKTIG: Når du bruker organisk løsningsmiddel, må du alltid bruke egnet verneutstyr og arbeide inne i en avtrekkshette når det er mulig. Unngå bruk av plast som er uforenlig med organiske løsemidler under lipidekstraksjon. Polypropylenrør er egnet for følgende protokoll.
- Vei 0,3 g syrevaskede glassperler for hver prøve og oppbevar dem i 2 ml mikrosenterrør på is. Fjern cellepellets fra -80 °C fryseren og hold dem på is. Tilsett 350 μL metanol og 700 μL kloroform i hver prøve, resuspend og overfør til mikrocentrifugerør som inneholder forhåndsveide glassperler.
- Lyse celler ved agitating rør på en virvel 3x i 1 min, med 30 s inkubasjoner på is mellom agitasjoner. Alternativt kan celler lyses ved hjelp av en mini bead-beater i tre 1-minutters sykluser. Spar 25-30 μL hele cellelysat i et eget rør for scintillasjonstelling.
MERK: Det lagrede lysatet vil bli brukt til å bestemme den relative mengden radioisotop som tas opp av hver prøve i løpet av pulsperioden, noe som vil påvirke mengden av hver prøve som lastes på TLC-platen. Dette drøfter videre i trinn 3.2. - Hell hele innholdet i det 2 ml mikrosenterfugerøret i et sentrifugerør på 15 ml glass [rør A]. Vask de 2 ml mikrocentrifugerørene ved å tilsette 1 ml metanol og virvel i 10-15 s. Overfør 1 ml metanolvask til rør A og tilsett 2 ml kloroform til rør A etterfulgt av 400 μL vann for et endelig prøvevolum på 4,45 ml.
- Virvelprøver i 1 min etterfulgt av en 5 min sentrifugering ved 1000 x g. Etter sentrifugering skal de vandige (øvre) og organiske (nedre) fasene tydelig skilles visuelt med cellerester som ligger ved grensesnittet.
- Bruk en pasteurpipette i glass, samle den organiske fasen fra rør A og flytt til et nytt sentrifugerør i 15 ml glass (rør B). Tilsett 1 ml 1M KCl i rør B. Til rør A, tilsett 1 ml metanol og 2 ml kloroform og 200 μL MiliQ vann. Gjenta trinnene for virvel- og sentrifugering på rør A.
- Samle igjen den organiske fasen fra rør A og legg den til rør B. Kast rør A i en passende beholder. Vortex rør B i 1 min etterfulgt av en 5 min sentrifugering ved 1000 x g.
- Fjern det øvre vandige laget fra rør B og kast det. Tilsett 1 ml frisk 1 M KCl tilbake til rør B og gjenta virvel-/sentrifugeringstrinnet. Når lagene er separert, samle du forsiktig hele det nederste organiske laget i et merket 4 ml hetteglass.
MERK: På dette trinnet kan lipidekstrakter lagres ved -80 °C, eller protokollen kan fortsettes for TLC-separasjon av lipider.
3. Separasjon og kvantifisering av radioisotopmerkede NLs ved tynn lagkromatografi
- Hvis lipidekstrakter ble plassert ved -80 °C, må du sakte bringe til romtemperatur ved å inkubere på is og deretter på en benkeplate. Fordampe løsemiddel helt fra lipidekstrakter ved vakuumtørking eller ved hjelp av en skånsom strøm av inertgass (f.eks. argon eller nitrogen). I mellomtiden forvarmer du en ovn til 145 °C for oppvarming av TLC-platen.
- Før prøver kan lastes på TLC-platen, må du bestemme relative mengder radiomerke som tas opp av cellene. Pipette 10 μL av hele cellelyset fra trinn 2,2 til et 6 ml hetteglass med glassscullering, tilsett 6 ml scintillasjonsvæske og legg hetteglassene i et stativ. Bruk en scintillation counter til å måle cpm eller dpm for hver prøve ved hjelp av telle enkelt rack-alternativet satt til en 1 min telletid. Mål hver hel celle lysat i duplikat for å få et gjennomsnitt for hver prøve. Juster lastemengden i henhold til en villtype eller referanseprøve
MERK: Mengden av hver prøve som skal lastes på TLC-platen, kan bestemmes ved hjelp av følgende ligning: (gjennomsnittlige utvalgstall)/(gjennomsnittlige referanseantall) x ønsket lastevolum. Hvis for eksempel 20 μL av referanseprøven skal lastes på TLC-platen, og har et gjennomsnittlig antall på 1000, vil en eksperimentell prøve med et gjennomsnittlig antall på 2000 ha 10 μL lastet på TLC-platen. - Rekonstituer prøvelipidene i 40-50 μL 1:1 (v/v%) kloroform:metanol ved virveling i 5 minutter. Forbered 101 ml av det mobile faseløsningsmidlet i en glassutdannet sylinder (se avsnittet Representative Resultater for eksempel om større NL-artsseparasjon med et 50:40:10:1 (v/v/v/v%) Hexane:Petroleum eter:Diethyl ether:Acetic acid solvent).
- Hell oppløsningsvæsken i et TLC-kammer i glass som inneholder en 20 x 20 TLC metningspute og et tettsittende lokk. Forbered en kanalisert 20 x 20 silikagel 60 G plate ved å forsiktig markere en linje 1,5 cm over bunnen av platen med en blyant. Linjen angir opprinnelsen og hvor lipidene skal lastes. Under linjen merker du forsiktig prøven som skal lastes i hvert kjørefelt. Når TLC-platen er klargjort, inkuberer du platen i en ovn på 145 °C i minst 30 minutter for å forvarme platen og fjerne overflødig fuktighet.
- Når platen er tilstrekkelig oppvarmet, og TLC-metningsputen er mettet med løsningsmiddel, fjern TLC-platen fra ovnen og fortsett umiddelbart å laste TLC-platen. Lasting av platen mens den er varm sikrer rask fordampning av løsemiddelet. For hver lipidart av interesse, last 5-20 μg av en renset lipidstandard på en bane av TLC-platen for å spore separasjon og forventet migrasjonsavstand. Bruk en pipette, spot 5μL prøve på opprinnelsen til hvert kjørefelt som ligger 1,5 cm over bunnen av TLC-platen. Gjenta lasting av 5 μL flekker til 20-40 μL prøve er lastet inn i hver kjørefelt.
MERK: 5-20 μg umerkede rensede lipider kan legges til hver prøvefelt som sporstoffer som kan farges og visualiseres etter TLC-separasjon av lipider. Tilstedeværelsen av en farget standard gir enkel sporing og eksisjon av radiomerkede lipidbånd for etterfølgende scintillasjonstelling. Hvilke rensede standarder som lastes på platen, bestemmes av NL-arten av interesse. Se delen Representativt resultat for eksempler på separering av oljesyre (FFA), 1,2 dioleoyl-glyserol (DG), triolein (TG), kolesterol (Chol), cholesteryl-linoleate (SE) og squalene i baner ved siden av prøvebanene. - Når standarden og de eksperimentelle prøvene er lastet, plasserer du platen i utviklingskammeret og venter til løsningsmidlet har nådd toppen av platen (40-60 min). Når platen er ferdig utviklet, fjern den fra kammeret og la den tørke i avtrekkshetten i 20 minutter.
- Etter at platen er tørket, dekk den med plastfilm og legg den i en utviklende kassett med en autoradiografiskjerm. La platen utvikle seg med skjermen i 24-48 timer.
4. Visualisering og kvantifisering av TLC separerte lipider
- Fjern skjermen fra den utviklende kassetten og plasser innsiden av en fosforbilde. Velg Fosforavbildningsalternativet og utvikle ved 800-1000 V.
MERK: Fosforavbildning gir en kvalitativ visning av radiomerkede lipider på TLC-platen. Kvantifisering av radiomerkede lipider oppnås imidlertid best ved scintillasjonstelling, som beskrives senere. - Bland 100 ml p-anisaldehydreagens (se Tilleggsfil) og deponer i en glasssprayflaske. Spray TLC-platen med p-anisaldehydreagens til silikaen er mettet. Stek platen i en ovn på 145 °C i 5 minutter, eller til båndene har dukket opp.
- For å kvantifisere individuelle lipidarter ved hjelp av radiolabel scintillation counting, bruk et barberblad for å skrape silikagelen fra glasset TLC-platen. Overfør hvert silikagelbånd som tilsvarer en enkelt radiomerket lipidart til et hetteglass med glassscullering og tilsett 6 ml scintillasjonsvæske. Virvel kraftig til silikabåndet er redusert til små biter.
- Alternativt kan lipider ekstraheres fra silikagelbåndet ved hjelp av lipidekstraksjonsprotokollen i avsnitt 3. Hvis lipider ekstraheres fra silikagelen, fordamper du løsningsmidlet helt som i trinn 3.1, og tilsett 6 ml scintillasjonsvæske til de tørkede lipidene. Plasser stativet som inneholder scintillation hetteglass i en scintillation counter. Velg alternativet Tell enkeltstativ og juster telletiden til 2 min per hetteglass. Resultater fra scintillation telleren vil bli skrevet ut og kan visualiseres som en stolpe graf.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne protokollen har vi vist at merking, deteksjon og kvantifisering av NL-arter kan oppnås ved 14C-eddiksyre metabolsk merking. Store NL-arter kan separeres i et løsningsmiddelsystem på 50:40:10:1 (v/v/v/v%) Hexane:Petroleum eter:Diethyl ether:Acetic acid (Figur 1A,B). Fosforavbildning gjør det mulig å visualisere merket fri fettsyre (FFA), triacylglyserol (TG), diacylglyserol (DG), kolesterol (Chol) og squalene (SQ) (Figur 1A). Selv om SEs kan skilles fra andre NL-arter i dette løsningsmidlet, oppdages ingen i autoradiogrammet etter en 20-minutters puls. Dette kan tilskrives langsom SE-syntese i den stasjonære vekstfasen i gjær. Det er også demonstrert at rensede lipidarter kan separeres i denne metoden og deretter visualiseres ved sprøyting av TLC-platen med p-anisaldehydreagens (Figur 1B). Mens NL-arter er godt separert i dette løsningsmidlet, holder polare arter som fosfatidylkolin (PC) seg ved opprinnelsen (Figur 1B). Ved å bruke en jaktperiode i radiomerkefrie medier etter pulsen, kan relativ flux gjennom NL-veier måles (Figur 1C). Etter en 10-minutters jakt har det store bassenget med SQ forsvunnet, og total Chol er forhøyet. På samme måte korrelerer utseendet til DG i jaktperioden med en nedgang i FFA-signalet.
Figur 1: 14C-eddiksyreradiomerking gjør det mulig å oppdage flere NL-arter. (A) Autoradiogram lipider separert av TLC isolert fra gjær radiomerket med 14C-eddiksyre i stasjonær fase. Klart påvisbare arter inkluderer fri fettsyre (FFA), triglyserid (TG), diacylglyserol (DG), kolesterol (Chol) og squalene (SQ). Umerkede bånd er uidentifiserte NL-arter. (B) Rensede lipidarter adskilt av TLC og visualisert ved p-anisaldehydfarging. Visualiserte arter inkluderer alle lipider nevnt i (A) i tillegg til sterol-estere (SE) og fosfatidylkolin (PC). (C) Autoradiogram lipider separert av TLC isolert fra gjær pulsert med 14-eddiksyrei stasjonær fase etterfulgt av en 10 min jaktperiode i radiolabelfrie medier. Forsvinning av SQ blir møtt med økning i chol. Økningen i DG i jaktperioden ledsages av nedgang i FFA-arter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil: Oppskrifter på buffere, medier og løsninger. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her presenteres en allsidig radiomerkingsprotokoll for kvantitativ overvåking av syntesen av NL-arter i gjær. Denne protokollen er veldig modulær, noe som gjør at prosedyren kan fullføres innen 3-6 dager. I tillegg eksisterer et vell av litteratur om bruk av TLC for å skille lipidarter og metabolitter, noe som bør tillate brukeren å oppdage flere lipidarter av interesse med en enkel endring av TLC løsningsmiddelsystemer16,19. Denne protokollen bidrar til separasjon, deteksjon og kvantifisering av radiomerkede lipider. Det kan også kombineres med en jaktperiode i ikke-merkede medier for å oppdage omsetningstiden til merkede NLs. Samlet gir denne prosedyren en nyttig struktur for å begynne å utforske radiomerking av NL-arter.
Andre metoder, for eksempel HPLC, GC-MS og UPLC-MS, gir høyere oppløsning av lipidseparasjon og kvantifisering. Det er imidlertid vanligvis ikke optimalt å kjøre radiomerkede prøver gjennom MS, selv om dette kan overvinnes ved hjelp av stabile isotoper. Likevel gir denne radiomerket metoden høy deteksjonsfølsomhet og allsidighet for mange lipidarter. En annen fordel med denne protokollen sammenlignet med MS er overkommelig pris. TLC-separasjon av lipider er relativt enkelt, krever ikke ekstravagant utstyr, og er avhengig av vanlige laboratoriematerialer. Når det gjelder begrensninger: Visse lav-overflod arter, som lyso-lipider, kan ikke påvises selv etter inkorporering av en 14C etikett. I tillegg er de fleste TLC-tilnærminger ikke egnet for 'lipidomiske' karakteriseringer, på grunn av den kurskornede separasjonen av lipidarter i et gitt løsningsmiddel.
Gjær tilbyr et praktisk, genetisk gjennomførbart modellsystem for studiet av lipider via radiolabel biokjemiske tilnærminger. Det skal imidlertid bemerkes at i spesifikke genetiske bakgrunner, eller under en bestemt metabolsk vekstforhold, kan det cellulære opptaket av radiomerket eddiksyre eller andre radioplater reduseres. Merking av celler med 14C-eddiksyre i fravær av glukose øker opptaket av radiomerket kraftig. Lange inkubasjoner i fravær av glukose vil proporsjonalt øke radiolabelopptaket; Dette kan imidlertid også påvirke de aktuelle veiene. Derfor bør merkingseffektivitet for en bestemt veksttilstand etableres før du følger 14C-eddiksyreradiomerkingsprotokollen i sin helhet. Vær spesielt oppmerksom på lengden på radiomerkingsperioden. Merketiden bør holdes så kort som mulig for å oppdage lipidartene av interesse. Til sammen åpner denne prosedyren for studiet av viktige lipidsyntesereaksjoner og bør tillate undersøkelse av NL-regulering i intakte celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at det ikke er konkurrerende interesser i utarbeidelsen av dette manuskriptet.
Acknowledgments
Forfatterne vil takke medlemmene av Henne-laboratoriet for hjelp og konseptuelle råd i gjennomføringen av denne studien. W.M.H. støttes av midler fra Welch Foundation (I-1873), NIH NIGMS (GM119768), Ara Paresghian Medical Research Fund og UT Southwestern Endowed Scholars Program. S.R har blitt støttet av et T32-programstipend (5T32GM008297).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [1-C14] Acetic acid sodium salt specific activity: 45-60mCi | PerkinElmer | NEC084H001MC | |
| 18:1 1,2 dioleoyl-sn-glycerol | Avanti | 800811O | |
| 200 proof absolute ethanol | Sigma | 459836 | |
| Acid washed glass beads 425-600um | Sigma | G8772 | |
| Amber bulbs for Pastuer pipettes | Fisher | 03-448-24 | |
| Ammonium Sulfate >99% | Sigma | A4418 | |
| Beckman LS6500 scintillation counter | PerkinElmer | A481000 | |
| Chloroform (HPLC grade) | Fisher | C607SK | |
| Cholesterol >99% | Sigma | C8667 | |
| Cholesteryl-linoleate >98% | Sigma | C0289 | |
| Concentrated sulfuric acid | Sigma | 339741 | |
| Corning 50mL conical tubes, polypropylene with centristar cap | Sigma | CLS430829 | |
| Dextrose, anhydrous grade | Sigma | D9434 | |
| Diethyl ether anhydrous grade | Sigma | 296082 | |
| Drying oven | Fisher | 11-475-155 | |
| EcoLume scintillation liquid | VWR | IC88247001 | |
| Eppendorf 5424R centrifuge | Fisher | 05-401-205 | |
| GE Storage phosphor screen | Sigma | GE28-9564-75 | |
| GE Typhoon FLA9500 imager | |||
| Glacial acetic acid, ACS grade | Sigma | 695092 | |
| Glass 6mL scintillation vials | Sigma | M1901 | |
| Glass centrifuge tube caps | Fisher | 14-595-36A | |
| Glass centrifuge tubes | Fisher | 14-595-35A | |
| Glass Pasteur pipette | Fisher | 13-678-20C | |
| Hexane, anhydrous grade | Sigma | 296090 | |
| L-Adenine >99% | Sigma | A8626 | |
| L-Alanine >98% | Sigma | A7627 | |
| L-Arginine >99% | Sigma | A1270000 | |
| L-Asparagine >98% | Sigma | A0884 | |
| L-Aspartate >98% | Sigma | A9256 | |
| L-Cysteine >97% | Sigma | W326305 | |
| L-Glutamic acid monosodium salt monohydrate >98% | Sigma | 49621 | |
| L-Glutamine >99% | Sigma | G3126 | |
| L-Glycine >99% | Sigma | G8898 | |
| L-Histidine >99% | Sigma | H8000 | |
| L-Isoleucine >98% | Sigma | I2752 | |
| L-Leucine >98% | Sigma | L8000 | |
| L-Lysine >98% | Sigma | L5501 | |
| L-Methionine, HPLC grade | Sigma | M9625 | |
| L-Phenylalanine, reagent grade | Sigma | P2126 | |
| L-Proline >99% | Sigma | P0380 | |
| L-Serine >99% | Sigma | S4500 | |
| L-Theronine, reagent grade | Sigma | T8625 | |
| L-Tryptophan >98% | Sigma | T0254 | |
| L-Tyrosine >98% | Sigma | T3754 | |
| L-Uracil >99% | Sigma | U0750 | |
| L-Valine >98% | Sigma | V0500 | |
| Methanol, ACS grade | Fisher | A412 | |
| Oleic acid >99% | Sigma | O1008 | |
| p-anisaldehyde | Sigma | A88107 | |
| Petroleum ether, ACS grade | Sigma | 184519 | |
| Phosphatidylcholine, dipalmitoyl >99% | Sigma | P1652 | |
| Pipettes | Eppendorf | 2231000713 | |
| Potassium chloride, ACS grade | Sigma | P3911 | |
| Sodium Hydroxide pellets, certified ACS | Fisher | S318-100 | |
| Squalene >98% | Sigma | S3626 | |
| Succinic Acid crystalline/certified | Fisher | 110-15-6 | |
| TLC saturation pad | Sigma | Z265225 | |
| TLC silica gel 60G glass channeled plate | Fisher | NC9825743 | No fluorescent indicators |
| Transparency plastic film | Apollo | 829903 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Triolein >99% | Sigma | T7140 | |
| Vortex mixer | Fisher | 02-215-414 | |
| Whatman exposure cassette | Sigma | WHA29175523 | |
| Yeast nitrogen base without ammonium sulfate and amino acids | Sigma | Y1251 |
References
- Konige, M., Wang, H., Sztalryd, C. Role of adipose specific lipid droplet proteins in maintaining whole body energy homeostasis. Biochimica Et Biophysica Acta. 1842 (3), 393-401 (2014).
- Arrese, E. L., Saudale, F. Z., Soulages, J. L. Lipid droplets as signaling platforms linking metabolic and cellular functions. Lipid Insights. 7, 7-16 (2014).
- Walther, T. C., Chung, J., Farese, R. V.
- Olzmann, J. A., Carvalho, P. Dynamics and functions of lipid droplets. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (3), 137-155 (2019).
- Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. Balancing the fat: lipid droplets and human disease. EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).
- Ross, R. The pathogenesis of atherosclerosis: A perspective for the 1990s. Nature. 362 (6423), 801-809 (1993).
- Zhang, C., Liu, P. The lipid droplet: A conserved cellular organelle. Protein & Cell. 8 (11), 796-800 (2017).
- Wältermann, M., et al. Mechanism of lipid-body formation in prokaryotes: How bacteria fatten up: Lipid-body formation in prokaryotes. Molecular Microbiology. 55 (3), 750-763 (2004).
- Borrull, A., López-Martínez, G., Poblet, M., Cordero-Otero, R., Rozès, N. A simple method for the separation and quantification of neutral lipid species using GC-MS. European Journal of Lipid Science and Technology. 117 (3), 274-280 (2015).
- Kotapati, H. K., Bates, P. D. Normal phase HPLC method for combined separation of both polar and neutral lipid classes with application to lipid metabolic flux. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1145, 122099 (2020).
- Knittelfelder, O. L., Weberhofer, B. P., Eichmann, T. O., Kohlwein, S. D., Rechberger, G. N. A versatile ultra-high performance LC-MS method for lipid profiling. Journal of Chromatography B. 951-952, 119-128 (2014).
- Ruiz, J. I., Ochoa, B. Quantification in the subnanomolar range of phospholipids and neutral lipids by monodimensional thin-layer chromatography and image analysis. Journal of Lipid Research. 38 (7), 1482-1489 (1997).
- Bui, Q., Sherma, J., Hines, J. K. Using high performance thin layer chromatography-densitometry to study the influence of the prion [RNQ+] and its determinant prion protein Rnq1 on yeast lipid profiles. Separations. 5 (1), 5010006 (2018).
- Pronk, J. T., de Steensma, H., Van Dijken, J. P.
- Buttke, T. M., Pyle, A. L. Effects of unsaturated fatty acid deprivation on neutral lipid synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Bacteriology. 152 (2), 747-756 (1982).
- Touchstone, J. C. Thin-layer chromatographic procedures for lipid separation. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 671 (1-2), 169-195 (1995).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. "Bligh and Dyer" and Folch methods for solid-liquid-liquid extraction of lipids from microorganisms. Comprehension of solvatation mechanisms and towards substitution with alternative solvents. International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 708 (2017).
- Fuchs, B., Süß, R., Teuber, K., Eibisch, M., Schiller, J. Lipid analysis by thin-layer chromatography-A review of the current state. Journal of Chromatography A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).
