Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Генерация и расширение кардиомиоцитов человека из мононуклеарных клеток периферической крови пациента

Published: February 12, 2021 doi: 10.3791/62206
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2, 1,2,4, 1,2,5, 3, 1,2,5,6
1Center for Cardiovascular Research, The Abigail Wexner Research Institute, Nationwide Children’s Hospital, 2The Heart Center, Nationwide Children’s Hospital, 3Department of Physiology and Cell Biology, The Ohio State University College of Medicine, 4Department of Anatomy, The Ohio State University College of Medicine, 5MCDB Graduate Program, The Ohio State University, 6Department of Pediatrics, The Ohio State University College of Medicine

Summary

Здесь мы представляем протокол для надежной генерации и расширения кардиомиоцитов человека из мононуклеарных клеток периферической крови пациента.

Abstract

Получение специфических для пациента кардиомиоцитов из одного забора крови привлекло огромный интерес к прецизионной медицине сердечно-сосудистых заболеваний. Сердечная дифференцировка из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) модулируется определенными сигнальными путями, которые необходимы для эмбрионального развития сердца. Разработаны многочисленные методы сердечной дифференцировки на 2-D и 3-D платформах с различной эффективностью и выходом кардиомиоцитов. Это озадачило исследователей за пределами поля, поскольку разнообразие этих методов может быть трудно проследить. Здесь мы представляем комплексный протокол, который разрабатывает надежную генерацию и расширение специфических для пациента кардиомиоцитов из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMCs). Сначала мы опишем высокоэффективный протокол перепрограммирования iPSC из образца крови пациента с использованием неинтегрированных векторов вируса Сендай. Затем мы подробно описываем метод дифференцировки монослоя с небольшими молекулами, который может надежно производить бьющиеся кардиомиоциты из большинства линий iPSC человека. Кроме того, масштабируемый протокол расширения кардиомиоцитов вводится с использованием небольшой молекулы (CHIR99021), которая может быстро расширять кардиомиоциты, полученные от пациента, для промышленного и клинического применения. В конце изображены подробные протоколы молекулярной идентификации и электрофизиологической характеристики этих iPSC-CM. Мы ожидаем, что этот протокол будет прагматичным для новичков с ограниченными знаниями в области сердечно-сосудистого развития и биологии стволовых клеток.

Introduction

Открытие индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток произвело революцию в современной сердечно-сосудистоймедицине1,2. Человеческие ИПСК способны самообновляться и генерировать все типы клеток в сердце, включая кардиомиоциты, эндотелиальные клетки, гладкомышечные клетки и сердечные фибробласты. Кардиомиоциты пациента, полученные из iPSC (iPSC-CMs), могут служить неопределенными ресурсами для моделирования генетически наследуемых сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) и тестирования сердечной безопасности для новых лекарств3. В частности, пациенты iPSC-CMs хорошо подготовлены к исследованию генетической и молекулярной этиологии ССЗ, которые получены из дефектов кардиомиоцитов, таких как синдром удлиненного интервала QT4 и дилатационная кардиомиопатия (DCM)5. В сочетании с CRISPR/Cas9-опосредованным редактированием генома, iPSC-CM пациентов открыли беспрецедентный путь к пониманию сложной генетической основы ССЗ, включая врожденные пороки сердца (ИБС)6,7,8. Человеческие iPSC-CM также продемонстрировали потенциал служить аутологичными клеточными источниками для пополнения поврежденного миокарда во время сердечного приступа9. В последние годы первостепенное значение приобрела генерация высококачественных человеческих iPSC-CM с определенными подтипами (предсердные, желудочковые и узловые) для регенерации сердца и тестирования лекарств10.

Сердечная дифференциация от человеческих ИПСК значительно продвинулась за последнее десятилетие. Методы дифференцировки перешли от спонтанной дифференцировки на основе эмбриоидного тела (EB) к химически определенной и направленной сердечной дифференцировке11. Ключевые сигнальные молекулы, необходимые для эмбрионального развития сердца, такие как Wnt, BMP, Nodal и FGF, манипулируются для усиления дифференцировки кардиомиоцитов от ИПСК человека10,12. Значительные достижения включают последовательную модуляцию передачи сигналов Wnt (активация с последующим ингибированием) для надежной генерации кардиомиоцитов из человеческих ИПСК13,14. Химически определенные рецепты сердечной дифференцировки были изучены для облегчения крупномасштабного производства бьющихся кардиомиоцитов15,16,которые могут быть модернизированы до промышленного и клинического уровня производства. Кроме того, устойчивое расширение ранних человеческих iPSC-CM достигается воздействием конститутивной активации Wnt с использованием небольшого химического вещества (CHIR99021)17. В последнее время специфические для подтипа кардиомиоциты генерируются путем манипуляций с сигнальными путями ретиноевой кислоты (РА) и Wnt в определенных окнах дифференцировки во время приверженности линии кардиомиоцитов от человеческих ИПСК18,19,20,21,22.

В этом протоколе мы подробно описываем рабочую процедуру для надежной генерации и пролиферации человеческих КМ, происходящих из мононуклеарных клеток периферической крови пациента. Мы представляем протоколы для 1) перепрограммирования человеческих PBMC в iPSCs, 2) надежной генерации бьющихся кардиомиоцитов из человеческих IPSCs, 3) быстрого расширения ранних iPSC-CM, 4) молекулярной характеристики человеческих iPSC-CM и 5) электрофизиологического измерения человеческих iPSC-CM на уровне одноклеточных клеток с помощью зажима пластыря. Этот протокол охватывает подробные экспериментальные процедуры по преобразованию клеток крови пациента в биение кардиомиоцитов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Экспериментальные протоколы и информированное согласие для людей были одобрены Институциональным наблюдательным советом (IRB) в Национальной детской больнице.

1. Приготовление сред клеточных культур, растворов и реагентов

  1. Подготовка носителя PBMC
    1. Смешайте 20 мл базальной питательной среды PBMC (1x) и 0,52 мл добавки. Добавьте по 20 мкл SCF и FLT3 (концентрация запаса: 100 мкг/мл), по 4 мкл IL3, IL6 и EPO (концентрация запаса: 100 мкг/мл) и 200 мкл L-глутаминовой альтернативы (100x). Тщательно перемешайте. Фильтруйте в стерильной вытяжке с помощью фильтрующего блока 0,22 мкм. Назовите это как Complete Blood Media.
    2. Смешайте 20 мл базальной питательной среды PBMC (1x) и 0,52 мл добавки. Добавьте 200 мкл альтернативного L-глутамина (100x). Тщательно перемешайте. Фильтрация с помощью фильтрующего блока 0,22 мкм. Назовите это как Supplement Blood Media.
  2. Подготовка полного носителя E8
    1. Смешайте 500 мл базальной среды E8 и 10 мл добавки E8 (размороженной в течение ночи при 4 °C), чтобы получить полную среду E8. Уравновешивайте до комнатной температуры (RT) перед использованием.
  3. Подготовка носителей для передачи iPSC
    1. Добавьте 40 мкл ингибитора породы Y-27632 (разбавление 1:5000, концентрация запаса: 10 мМ) к 200 мл полной среды E8. Тщательно перемешайте. Уравновешивайте до RT перед использованием.
  4. Подготовка сред дифференцировки кардиомиоцитов
    1. Среда I: Смешайте 500 мл RPMI1640 с 10 мл B27 минус добавка инсулина (50x).
    2. Среда II: Добавьте соответствующий объем запаса CHIR99021 (ингибитор GSK3) в среду I (конечная концентрация CHIR99021 6 мкМ). Тщательно перемешать.
    3. Среда III: Добавьте соответствующий объем запаса IWR-1 (ингибитор Wnt) в среду I (конечная концентрация IWR-1 5 мкМ). Тщательно перемешать.
    4. Носитель IV: Смешайте 500 мл RPMI1640 с 10 мл добавки B27 (50x). Тщательно перемешать.
    5. Среда V: Смешайте 500 мл RPMI1640 (без глюкозы) с 10 мл добавки B27 (50x). Тщательно перемешать.
    6. Носитель VI: Добавьте соответствующий объем запаса CHIR99021 в Media IV (конечная концентрация CHIR99021 2 мкМ). Тщательно перемешать.
  5. Подготовка носителей для передачи iPSC-CM
    1. Добавьте 10 мл нокаутирующей сыворотки (KSR) к 90 мл Media IV (конечная концентрация KSR: 10%). Хорошо перемешать.
  6. Подготовка морозильной среды iPSC-CM
    1. Добавьте 1 мл ДМСО к 9 мл KSR (конечные концентрации: 10% DMSO/90% KSR) и хорошо перемешайте.
  7. Подготовка пластин со средним покрытием фундаментной мембранной матрицы
    1. Оттаивать матричную среду базальной мембраны при 4 °C в течение ночи и аликвоту в трубках по 1,5 мл. Добавьте 1 мл этой среды к 250 мл среды DMEM/F12 (разбавление 1:250) и тщательно перемешайте их. Применяют 2 мл разбавленного раствора на лунку в 6-луночной пластине и инкубируют в 5%СО2 при 37 °С в течение 30 мин перед применением.

2. iPSC перепрограммирование PBMC

  1. Отделите PBMC от образцов крови.
    1. Собрать образцы крови пациента (~5 мл) и перенести в трубки для разделения клеток крови (см. Таблицу материалов). Смешайте путем инвертирования 10x.
    2. Центрифуга при 1 500 х г в течение 30 мин при комнатной температуре.
    3. Осторожно выньте пробирки и распылите 70% этанола. Под капотом биобезопасности снимите колпачки, не нарушая мононуклеарные клетки (слой баффи). НБМК будут находиться в беловатом слое прямо под слоем плазмы(рисунок 1А). Соберите весь слой баффи с помощью пипетки 1000 мкл и переложите в коническую трубку объемом 15 мл.
    4. Подсчитайте номер ячейки с помощью автоматического счетчика ячеек. Раскрутите тюбик при 300 х г в течение 25 мин при RT.
    5. Выбросьте супернатант. Промывайте 10 мл DPBS (Ca2+/ Mg2 + свободно).
    6. Раскрутите тюбик при 300 х г в течение 15 мин при RT.
    7. Удалите супернатант. Повторное суспендирование клеточных гранул в 1 мл морозильной среды (KSR плюс 10% DMSO). Отрегулируйте плотность клеток, чтобы сделать 1 x 106 клеток на флакон.
    8. Поместите криовиалы PBMC в контейнер для замораживания клеток и храните при температуре -80 °C в течение ночи. Переложить в резервуар для жидкого азота для длительного хранения на следующий день.
  2. Перепрограммирование iPSC.
    1. Добавьте 3 мл добавки среды крови в коническую пробирку объемом 15 мл. Разморозьте НБМК на водяной бане при температуре 37 °C и перенесите их в коническую трубку. Отжим при 300 х г в течение 7 мин при RT.
    2. Выбросьте супернатант. Повторное суспендирование НБМК с полной средой крови. Засейте их в две лунки из 24 лунок тканевых культуральных пластин (без матрицы базальной мембраны).
    3. Инкубировать в 5% CO2 при 37 °C в течение ночи. На следующий день аккуратно удалить половину старой среды (0,5 мл) и добавить 0,5 мл свежей полной среды крови.
    4. Меняйте медиа через день, обновляя половину старых медиа.
    5. Через неделю агрессивно промыть лунку 1 мл добавки к среде крови и перенести клетки в центрифужную трубку объемом 15 мл.
    6. Подсчитайте номер ячейки. Взять 2 х 105 ячеек и центрифугу при 300 х г в течение 7 мин.
    7. Выбросьте супернатант. Повторное суспендирование клеток с 300 мкл полной среды крови. Выполните трансфекцию, добавив соответствующий объем векторов перепрограммирования вируса Сендай в соответствии с инструкциями производителя. Переложите их в одну скважину из 24-луночной пластины (без матрицы базальной мембраны). Инкубировать в 5% CO2 при 37 °C в течение ночи.
    8. На следующий день вращайтесь при 300 х г в течение 7 мин. Удаляют супернатант и повторно суспендируют в 2 мл полной среды крови. Переложить в одну лунку 6 скважин пластин, предварительно покрытую базальной мембранной матрицей. Это День 1 (D1).
    9. Не прикасайтесь к тарелке на следующий день.
    10. На D3 удалите 1 мл старого носителя. Добавьте 1 мл добавки среды крови.
    11. Повторите шаг 2.2.10 на D5.
    12. На D7 удалите 1 мл старого носителя. Добавьте 1 мл полного носителя E8.
    13. На D8 повторите шаг 2.2.12.
    14. На D9 удалите старый носитель. Добавьте 2 мл полного носителя E8. Ожидается, что полностью перепрограммированные клетки прикрепятся и начнут образовывать колонии.
    15. Обновляйте 2 мл полного носителя E8 каждый день.
    16. Примерно через 2 недели после трансдукции вируса Сендай появятся большие колонии iPSC и будут готовы к сбору.
    17. Вырежьте колонии iPSC под стереомикроскопом в капоте и переведите отдельные колонии в 24-луночную пластину с покрытием базальной мембраны с 24-луночным покрытием, предварительно загруженную 0,5 мл iPSC пассирующей среды.
    18. Обновляйте 0,5 мл полной среды E8 каждый день, пока колонии iPSC не вырастут достаточно большими для перехода в новую 6-луночную пластину с матричным покрытием с базальной мембраной.

3. Обслуживание и прохождение iPSC человеком

  1. Когда человеческие IPSC достигают слияния более 90%, удалите старые носители. Промыть 3 мл DPBS один раз.
  2. Добавьте 1 мл 0,5 мМ ЭДТА в раствор DPBS. Инкубировать в 5% CO2 при 37 °C в течение 5-8 мин.
  3. Удалить ЭДТА путем аспирации. Добавьте 1 мл носителя iPSC. Вручную вытесняйте iPSC.
  4. Возьмите 600-900 мкл одноклеточной суспензии и повторно нанесите их на 6-луночную пластину с покрытием основы мембраны с матричным покрытием (разбавление: от 1:6 до 1:10). Инкубировать в 5% CO2 при 37 °C в течение ночи.
  5. Обновляйте 2 мл полного носителя E8 каждый день. Культуры iPSC обычно достигают слияния через 3-4 дня.

4. Химически определенная дифференцировка кардиомиоцитов

  1. Культивируйте человеческие ИПСК в полных средах Е8 до 95% слива (3-4 дня).
  2. Удалите старый носитель. Добавьте 2 мл дифференцировки CM Media II (6 мкМ CHIR в RPMI1640 плюс B27 минус добавка инсулина) в каждую лунку 6-луночной пластины. Это D0. Не прикасайтесь к D1.
  3. На D2 заменить на 2 мл дифференцирующей среды CM I (RPMI1640 плюс B27 минус добавка инсулина).
  4. На D3 заменить 2 мл дифференцировки CM Media III (5 мкМ IWR-1 в RPMI1640 плюс B27 минус добавка инсулина). Не прикасайтесь к D4.
  5. На D5 заменить на 2 мл см дифференциации среды I.
  6. На D7 замените на 2 мл дифференцировки CM Media IV (RPMI1640 плюс добавка B27). После этого обновляйте средства массовой информации через день.
  7. На D11 при сокращении клеток заменяют 2 мл дифференцировки СМ средой V (без глюкозы).
  8. На D13 заменить на 2 мл дифференцированного НОСИТЕЛЯ СМ V.
  9. На D15 заменить на 2 мл дифференцирующей среды СМ IV.
  10. На D17-D21 заменить на 2 мл СМ дифференцировки Среды IV через день.

5. Прохождение человека iPSC-CM

  1. Удалите старые носители и промойте ячейки 3 мл DPBS один раз.
  2. Нанесите 1 мл раствора диссоциации КМ (см. Таблицу материалов)на каждую скважину 6-луночной пластины. Инкубировать в 5% CO2 при 37 °C в течение 5-8 мин.
  3. Механически диссоциируют iPSC-CM на одиночные ячейки путем энергичного пипетирования.
  4. Переведите клетки в коническую трубку объемом 15 мл. Добавьте 2 мл пропускающей среды CM (10% KSR в добавке RMPI1640 плюс B27) для нейтрализации раствора диссоциации КМ.
  5. Отжим при 300 х г в течение 5 мин при RT.
  6. Выбросьте супернатант. Повторное суспендирование ячеек с требуемым объемом среды пропускания СМ. Посейте их в тарелку/блюдо, покрытое базальной мембраной. Человеческие iPSC-CM возобновляют избиение через 1-3 дня после прохождения.

6. Расширение человеческих iPSC-CM

  1. Промыть D10-12 взбивая iPSC-CM 3 мл DPBS для каждой скважины 6-луночной пластины один раз. Добавьте 1 мл раствора для диссоциации КМ (Шаг 5.2). Инкубировать в 5% CO2 при 37 °C в течение 7-10 мин.
  2. Механически диссоциируют iPSC-CM на одиночные ячейки путем энергичного пипетирования.
  3. Переведите клетки в коническую трубку объемом 15 мл. Добавьте 2 мл пропускающих сред CM для нейтрализации раствора диссоциации CM.
  4. Отжим при 300 х г в течение 5 мин при RT.
  5. Выбросьте супернатант. Повторное суспендирование ячеек с соответствующим объемом среды пропускания СМ. Пипетка вверх и вниз, чтобы сделать одноклеточную суспензию. Посейте один миллион iPSC-CM в блюдо с базальной мембраной, покрытое матрицей 10 см.
  6. На следующий день удалите старые носители. Добавьте 10 мл среды пролиферации кардиомиоцитов (Среда VI: 2 мкМ CHIR99021). Меняйте медиа через день.
  7. Когда iPSC-CM становятся сливающимися через 7-9 дней культуры, повторите шаг прохождения для дальнейшего расширения iPSC-CM.

7. Иммунофлуоресценция

  1. Перед иммунофлуоресцентным окрашиванием семена iPSC-CMs на покрытые базальной мембраной покрытые матрицей покровные листы, которые помещают в пластину из 24 лунок (плотность посева: 0,5-1 х 106 клеток/мл). Поддерживайте iPSC-CM в культуре не менее 4 дней.
  2. Промывайте ячейки, используя 1 мл DPBS один раз.
  3. Добавьте 0,5 мл 4% параформальдегида (PFA) и инкубируйте в течение 15 мин при RT.
  4. Мойте ячейки, используя 1 мл DPBS. Повторите один раз.
  5. Добавьте 0,5 мл 0,1% Тритона Х-100 и инкубируйте в течение 20 мин при RT.
  6. Дважды промыть 1 мл DPBS.
  7. Добавьте 0,5 мл 0,2% BSA в DPBS (блокирующий раствор). Инкубировать на РТ в течение 1 ч.
  8. Добавить 200 мкл первичного антитела, разведенного блокирующим раствором (разведение: 1:400-1:1000). Инкубировать при 4 °C в течение ночи.
  9. Промыть клетки 0,5 мл блокирующего раствора в течение 3 мин с встряхиванием. Повторите дважды.
  10. Добавляют 200 мкл вторичного антитела, разведенного в блокирующем растворе. Инкубировать на РТ в течение 1 ч.
  11. Промыть клетки три раза 0,5 мл DPBS, каждый в течение 3 мин с встряхиванием.
  12. Противодействовать ядрам с помощью DAPI (разведение 1:2000) и инкубировать в течение 5 мин при RT.
  13. Промыть клетки три раза 0,5 мл DPBS.
  14. Установите ячейки на крышках на предметное стекло микроскопа с помощью монтажного носителя объемом 5 мкл. Хранить при температуре 4 °C и защищать от света.

8. Пробоподготовка для проточной цитометрии

  1. Мойте человеческие iPSC-CM с 3 мл DPBS один раз.
  2. Добавляют 1 мл раствора для диссоциации СМ и инкубируют в 5%СО2 при 37 °С в течение 7-10 мин.
  3. Вытесняйте клетки с помощью пипетки объемом 1000 мкл. Перенесите суспензию ячейки на круглую трубку FACS через крышку сетчатого фильтра. Трубка FACS предварительно заполняется 1 мл проходной среды iPSC-CM (10% KSR) для нейтрализации активности фермента.
  4. Открутите при 300 х г в течение 5 мин.
  5. Удалите супернатант, не нарушая гранулы клеток. Добавьте 250 мкл раствора для фиксации/пермеабилизации (см. Таблицу материалов). Инкубировать в течение 20 мин при 4 °C.
  6. Добавьте 1 мл буфера Perm/Wash. Вихрь ненадолго и вращается при 300 х г в течение 4 мин.
  7. Выбросьте супернатант. Добавьте 100 мкл разбавленных первичных антител (1:200-1:500) в 1 буфер Perm/Wash. Вихрь ненадолго и насиживайте ночью при 4 °C.
  8. Промывайте ячейки, добавляя 1 мл буфера Perm/Wash. Вихрь ненадолго и вращается при 300 х г в течение 4 мин.
  9. Выбросьте супернатант. Добавьте 100 мкл разбавленных вторичных антител (1:500-1:1000). Вихрь кратковременно и насиживается при RT в течение 1 ч. Защищают от света, если вторичные антитела конъюгированы со светочувствительной флуоресценцией.
  10. Промывайте ячейки, добавляя 1 мл пермского/промывочного буфера. Вихрь ненадолго и вращается при 300 г в течение 4 мин.
  11. Выбросьте супернатант. Повторное суспендирование клеток с 400 мкл буфера окрашивания FACS (PBS/4% FBS). Хранить при температуре 4 °C до загрузки в прибор FACS.

9. qPCR в реальном времени

  1. Удалите старые носители в человеческом языке iPSC-CM. Добавьте 500-700 мкл лизисного буфера к лизатным клеткам. Инкубировать в течение 3 мин в лизате клеток RT. Scape и переложить в 1,5 мл без РНКазы. Приступайте к полной экстракции РНК немедленно или храните при -80 °C.
  2. Изолируйте общую РНК с помощью набора для экстракции РНК в соответствии с инструкцией производителя.
  3. Измерьте концентрацию РНК и оцените качество общей РНК с помощью спектрофотометра.
  4. Выполняйте реакцию обратной транскрипции с помощью набора синтеза кДНК. Общий объем реакции RT составляет 20 мкл, включая 4 мкл реакционной смеси (5x), 1 мкл обратной транскриптазы, 1 мкг общей РНК и воды без РНКазы.
  5. Инкубировать полную реакционную смесь РТ в термоциклере по следующему протоколу: 25 °C в течение 5 мин; 46 °C в течение 20 мин; 95 °C в течение 1 мин; удерживать при 4 °C.
  6. Разбавить кДНК на 1:10, используя воду без нуклеазы. Настройте реакцию qPCR в реальном времени путем смешивания 1 мкл шаблона кДНК, 1 мкл праймеров/зондов, 10 мкл мастер-смеси qPCR и 8 мкл воды без нуклеазы.
  7. Запуск в системе ПЦР в режиме реального времени. Протокол циклирования: 50 °C 2 мин (удержание), 95 °C 10 мин (удержание), 95 °C 15 сек, 60 °C 1 мин, повторите в течение 40 циклов.
  8. Соберите значения CT для каждого гена в каждом образце. Относительное содержание мРНК рассчитывается путем вычитания значения CT гена-мишени из значения CT гена домашнего хозяйства. Относительная экспрессия генов анализируется методом2 -ΔΔCT.

10. Запись зажима для целых клеток

  1. Диссоциация iPSC-CM на отдельные клетки с помощью раствора диссоциации CM, как описано ранее.
  2. Семенные клетки при низкой плотности на покрытых базальной мембраной покрытой матрицей покровных пластинках. Культивируйте их в течение 3-4 дней в Media IV.
  3. Вытягивайте пипетки (сопротивление 0,9-1,5 МОм) из боросиликатных стеклянных капилляров с помощью горизонтального микроэлектродного съемника.
  4. Инкубировать клетки в растворе Тирода (рН=7,35).
  5. Наполните пипетки раствором электрода (pH=7,3), состоящим из следующих химических веществ: 120 мМ аспарагиновой кислоты, 20 мМ KCl, 2 мМ MgCl2,5 мМ HEPES, 10 мМ NaCl, 5 мМ EGTA, 0,3 мМ Na-GTP, 14 мМ фосфокреатина, 4 мМ K-АТФ и 2 мМ креатинфосфокиназы.
  6. Поместите ячейки в режим текущего зажима с помощью диастолического порога 1,5-2 мс тока импульса тока при 1 Гц.
  7. Записывайте потенциалы действия (точки доступа) с помощью микроэлектродного усилителя и программной платы сбора данных.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Перепрограммирование iPSC человека из PBMCs
После предварительной культивации с полной средой крови в течение 7 дней НБМК становятся большими с видимыми ядрами и цитоплазмой(рисунок 1B),что указывает на то, что они готовы к трансфекции вируса. После трансфекции с помощью факторов перепрограммирования вируса Сендай, PBMCs будут подвергаться эпигенетическому процессу перепрограммирования в течение еще одной недели. Как правило, мы получаем 30-50 колоний iPSC от трансфекции 1 х 105 NBMC, а эффективность перепрограммирования составляет 0,03%-0,05%. Полностью перепрограммированные клетки будут прикрепляться и начнут образовывать колонии, когда они будут введены в полную среду E8(рисунок 1C). Эти ранние колонии iPSC расширяются еще в течение 7 дней, а затем механически разрезаются и подбираются по отдельности. Каждая колония iPSC переносится в одну скважину из 6-луночной пластины для установления отдельных линий iPSC. После 4-5 проходов колонии iPSC станут чистыми с очень небольшим количеством дифференцированных клеток вокруг(рисунок 1D). На этом этапе большинство клеток в колониях iPSC являются OCT4 и NANOG положительными(рисунок 1E),демонстрируя свою плюрипотентность. Стабильные линии iPSC устанавливаются пятым проходом.

Сердечная дифференциация
Протокол сердечной дифференцировки изображен на рисунке 1F. Сердечная дифференцировка инициируется, когда ИПСК поддерживаются в течение не менее 10 проходов. Степень слияния iPSC имеет решающее значение при применении CHIR99021. Плотность клеток составляет более 90% слияния, но не сливания. Если колонии iPSC станут слишком переполненными, они начнут спонтанную дифференцировку, что негативно скажется на эффективности направленной дифференцировки кардиомиоцитов. Биение кардиомиоцитов обычно наблюдается после 12 дня дифференцировки(Видео 1). Дата начала избиения варьируется и зависит от используемых линий iPSC. После глюкозного голодания и повторного покрытия iPSC-CMs показывают спонтанное биение(Видео 2)и выровненную саркомерную структуру с интеркалированным сердечным тропонином T (TNNT2) и α-актинином(Рисунок 1G-H). Кроме того, чистота iPSC-CM высока, причем более 93% клеток составляют TNNT2+, как показано анализом FACS(рисунок 1I).

Хотя iPSC-CMs относительно незрелы по сравнению со взрослыми кардиомиоцитами, они показывают желудочковые и предсердные потенциалы действия, измеренные цельноклеточным зажимом пластыря(рисунок 2A,B). В типичной сердечной дифференцировке iPSC-CM 30-го дня представляют собой смесь желудочково-, предсердных и узлововидных подтипов, причем на желудочковые ХМ приходится большинство (60%, рисунок 2C)с использованием вышеупомянутого протокола дифференцировки(рисунок 1F). Различные протоколы дифференцировки дают различный процент подтипов кардиомиоцитов из-за активации различных сигнальных путей при определении клеточной линии10. Желудочковые КМ помечены MYL2 (MLC2v, рисунок 2D),тогда как предсердные iPSC-CM помечены NR2F2 (COUP-TFII, рисунок 2E). Эти маркеры высоко выражены в более зрелых iPSC-CM (>D30), а не на ранней стадии.

Расширение iPSC-CM путем активации Wnt
У млекопитающих взрослые кардиомиоциты активно не делятся для самообновления. Это явление также имеет место для человеческих iPSC-CM. После созревания за пределами D30 деление клеток iPSC-CM является редким событием, что ограничивает их способность к массовому производству на клиническом и промышленном уровне. Чтобы имитировать среду развития во время пролиферации эмбриональных кардиомиоцитов, мы активируем путь Wnt CHIR99021, чтобы стимулировать размножение ранних iPSC-CM. D12-14 iPSC-CMs (после очистки путем депривации глюкозы) высевают при низкой плотности в присутствии 2 мкМ CHIR99021. Активация Wnt стимулирует деление клеток iPSC-CM и способствует экспрессии регуляторов клеточного цикла, таких как циклин D1(рисунок 3A),которые могут подтолкнуть клеточный цикл к продвижению через фазу G1. Интересно, что CHIR99021 обеспечивает надежное распространение ранних iPSC-CM в течение 2 проходов по сравнению с контролем(рисунок 3B). Однако пролиферационная способность iPSC-CMs уменьшается при обширном прохождении(рисунок 3B),что согласуется с ограниченной и хорошо контролируемой сердечной пролиферацией во время эмбрионального развития сердца. Кроме того, не похоже, что CHIR99021 способен стимулировать расширение более зрелых iPSC-CMs, когда они достигают более 30 дней дифференцировки и развивают стабильные саркомерные структуры.

Figure 1
Рисунок 1:Перепрограммирование iPSC человека и дифференцировка кардиомиоцитов. (A) Принципиальная схема, показывающая слой PBMC после разделения образцов крови пациента. (B) Увеличенные МПК готовы к трансфекции. (C) Ранние человеческие колонии iPSC. (D)Установленная линия iPSC в проходе 5. (E)Человеческие ИПСК положительны для маркеров плюрипотентности OCT4 (зеленый) и NANOG (красный). Ядра удерживаются DAPI (синий). (F) Обзор протокола дифференцировки кардиомиоцитов. (Г-Н) Саркомерная структура iPSC-CMs выявляется иммунофлуоресцентным окрашиванием с использованием антител против TNNT2 (зеленый) и α-актинина (красный). Ядра удерживаются DAPI (синий). (I)FACS анализ iPSC-CMs с использованием антитела против TNNT2. Шкала стержней: 200 мкм(B-D),50 мкм(E и G)и 20 мкм(H). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2:Подтипы кардиомиоцитов у человека iPSC-CMs. (A-B)Репрезентативные потенциальные продолжительности действия для желудочковых(A)и предсердных(B)iPSC-CMs. (C) Репрезентативные проценты желудочковых, предсердных и узловых подтипов в iPSC-CM человека. (D-E) D30 iPSC-CMs окрашиваются антителами против желудочкового кардиомиоцитарного маркера MYL2(D)и предсердного маркера NR2F2(E). Клетки одновременно окрашиваются антителом TNNT2. Ядра удерживаются DAPI (синий). Шкала стержней: 50 мкм(D-E). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3:Расширение человеческих iPSC-CM путем активации Wnt. (A) Процент cyclin D1 положительных iPSC-CM увеличивается в присутствии CHIR99021. Клетки дважды окрашиваются антителами против TNNT2 (красный) и циклин D1 (зеленый). Ядра удерживаются DAPI (синий). (B)Изменения клеточного числа во время расширения человеческих iPSC-CM с CHIR99021 или без него в первых 3 проходах. Ось Y показывает изменения числа ячеек. CHIR99021 стимулирует устойчивое распространение ранних iPSC-CM. Шкала стержней: 50 мкм(A). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Видео 1. Победа над человеческими iPSC-CM на 18 день дифференциации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Видео 2. Избиение человека iPSC-CMs на 25 день после метаболической очистки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Во время перепрограммирования iPSC крайне важно культивировать PBMC в течение 1 недели, пока они не будут увеличены прозрачными ядрами и цитоплазмой. Поскольку PBMC не размножаются, соответствующий номер клеток для вирусной трансдукции важен для успешного перепрограммирования iPSC. Количество клеток PBMCs, множественность инфекции (MOI) и титр вируса должны быть рассмотрены и скорректированы для достижения оптимальных результатов трансдукции. Для сердечной дифференцировки начальная плотность посева имеет решающее значение для того, чтобы ИПСК достигали более 90% слива в день введения CHIR99021. С одной стороны, если иПСК менее сливаются во время сердечной дифференцировки, CHIR99021 будет токсичным и приведет к существенной гибели клеток. С другой стороны, если иПСК чрезмерно сливаются, они будут подвергаться спонтанной дифференцировке, что поставит под угрозу эффективность направленной сердечной дифференцировки. Для расширения ранних iPSC-CMs следует учитывать сроки и качество кардиомиоцитов. Ранние iPSC-CM могут надежно размножаться только тогда, когда чистота кардиомиоцитов достаточно высока. Существующие некардиомиоциты в культуре также могут размножаться в ответ на лечение CHIR99021, что негативно повлияет на пролиферацию ранних iPSC-CMs. Кроме того, крайне важно стимулировать расширение кардиомиоцитов к 20-му дню дифференцировки. Как только iPSC-CM пройдут через 30-й день, им будет трудно возобновить надежное разделение.

Человеческие ИПСК первоначально были получены из дермальных и легочных фибробластов с помощью ретровирус-опосредованной трансфекции1,2. Существуют две основные проблемы с этими методами перепрограммирования, которые препятствуют прогрессу в клинической трансляции ИПСК пациента: 1) ретровирус интегрируется в геном хозяина, тем самым вводя потенциальные генетические мутации; 2) полученные от пациента фибробласты требуют биопсии кожи, которая у многих пациентов может уменьшиться. В этом протоколе мы описываем протокол, который использует коммерческий неинтеграционный вирус Sendai23 и PBMCs для надежного получения IPSC пациента. Эти ИПСК свободны от экзогенных векторов перепрограммирования и могут поддерживаться с самообновлением и плюрипотентностью бесконечно. Кроме того, образцы крови пациента легко собираются в клинических лабораториях. Наш протокол является универсальным и может быть использован для массового производства ИПСК для пациентов и заболеваний для крупномасштабных репозиторийных и клинических переводов24.

Надежная дифференцировка кардиомиоцитов достигается путем последовательной модуляции специфических сигнальных путей во время сердечной дифференцировки от иПСК человека. Ключевые пути, участвующие в сердечной спецификации и пролиферации, включают Wnt, BMP, Activin, NOTCH, VEGF и ретиноевую кислоту (RA) 10,12. Здесь мы представляем эффективный протокол сердечной дифференцировки путем последовательной модуляции передачи сигналов Wnt мелкими химическими веществами: сначала активация CHIR99021, а затем ингибирование IWR-113,14. Небольшие химические вещества стабильны и дают последовательные результаты дифференциации по сравнению с теми, которые используют факторы роста. Большинство iPSC-КМ, генерируемых этим протоколом, являются желудочковыми кардиомиоцитами, смешанными с предсердными и узловыми клетками. Прецизионная генерация подтип-специфических кардиомиоцитов достигается за счет тонкой настройки последующих этапов дифференцировки10,12. Например, добавление РА сразу после лечения IWR-1 дает высокий процент предсердоподобных кардиомиоцитов, тогда как ингибирование РА способствует генерации желудочковых iPSC-CMs18,22. Активация сигналов Wnt на более позднем этапе дифференцировки способствует индукции клеток-предшественников сердца к узловоподобным кардиомиоцитам19,21,что является перспективным для генерации специфических для пациента биологических кардиостимуляторных клеток.

Человеческие iPSC-CM незрелы и имеют ограниченную способность к пролиферации25. Во время эмбрионального сердечного развития созревание продолжается, в то время как пролиферация уменьшается. Существует узкое окно, когда iPSC-CMs могут быть стимулированы для надежной пролиферации, которая отражает расширение эмбриональных кардиомиоцитов. Здесь мы используем активатор Wnt CHIR99021 для содействия распространению ранних iPSC-CM в течение ограниченного периода, что согласуется с недавним докладом17. Предполагается, что сигнальный путь Wnt влияет на пролиферацию кардиомиоцитов, возможно, через перекрестные помехи с несколькими восходящими путями, такими как NOTCH и Hippo26,27. Передача сигналов NOTCH способствует пролиферации кардиомиоцитов, тогда как путь Гиппо ограничивает сердечный рост и размер сердца28,29,30. До сих пор неизвестно, как взаимодействие между NOTCH и Hippo определяет последующую активность Wnt и точно настраивает соответствующую степень сердечной пролиферации. Наш протокол предоставил интересную модель для пролиферации кардиомиоцитов для изучения механизмов заболевания врожденных пороков сердца, которые вызваны гипоплазией желудочковых кардиомиоцитов, таких как гипопластический синдром левого сердца (HLHS) и легочная атрезия с интактной желудочковой перегородкой (PA-IVS).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано премией Американской кардиологической ассоциации (AHA) за развитие карьеры 18CDA34110293 (M-T.Z.), наградами AVIF и SVRF (M-T.Z.), грантами Национальных институтов здравоохранения (NIH / NHLBI) 1R01HL124245, 1R01HL132520 и R01HL096962 (I.D.). Доктор Мин-Тао Чжао также получил поддержку стартовых фондов из Исследовательского института Эбигейл Векснер при Национальной детской больнице.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ABI 7300 Fast Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific
Axon Axopatch 200B Microelectrode Amplifier Molecular Devices Microelectrode Amplifier
B27 supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
B27 supplement minus insulin Thermo Fisher Scientific A1895601
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit BD Biosciences 554714 Fixation/Permeabilization solution, Perm/Wash buffer
BD Vacutainer CPT tube BD Biosciences 362753 Blood cell separation tube
CHIR99021 Selleck Chemicals S2924
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit Thermo Fisher Scientific A16517 Sendai virus reprogramming kit
Digidata 1200B Axon Instruments Acquisition board
Direct-zol RNA Miniprep kit Zymo Research R2050 RNA extraction kit
DMEM/F12 Thermo Fisher Scientific 11330057
Essential 8 medium Thermo Fisher Scientific A1517001 E8 media for iPSC culture
GlutaMAX supplement Thermo Fisher Scientific 35050061 L-glutamine alternative
Growth factor reduced Matrigel Corning 356231 Basement membrane matrix
iScript cDNA Snythesis Kit Bio-Rad 1708891 cDNA synthesis
IWR-1-endo Selleck Chemicals S7086
KnockOut Serum Replacement (KSR) Thermo Fisher Scientific 10828028
pCLAMP 7.0 Molecular Devices Electrophysiology data acquisition & analysis software
Recombinant human EPO Thermo Fisher Scientific PHC9631
Recombinant human FLT3 Thermo Fisher Scientific PHC9414
Recombinant human IL3 Peprotech 200-03
Recombinant human IL6 Thermo Fisher Scientific PHC0065
Recombinant human SCF Peprotech 300-07
RPMI 1640 medium Thermo Fisher Scientific 11875093
RPMI 1640 medium, no glucose Thermo Fisher Scientific 11879020
SlowFade Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific S36936 Mounting media
StemPro-34 SFM Thermo Fisher Scientific 10639011 PBMC culture media
TaqMan Fast Advanced Master Mix Thermo Fisher Scientific 4444964 qPCR master mix
TrypLE Select Enzyme 10x, no phenol red Thermo Fisher Scientific A1217703 CM dissociation solution
UltraPure 0.5 M EDTA Thermo Fisher Scientific 15575020 iPSC dissociation solution
Y-27632 2HCl Selleck Chemicals S1049

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  3. Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine. Journal of American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
  4. Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
  5. Hinson, J. T., et al. Titin mutations in iPS cells define sarcomere insufficiency as a cause of dilated cardiomyopathy. Science. 349 (6251), 982-986 (2015).
  6. Deacon, D. C., et al. Combinatorial interactions of genetic variants in human cardiomyopathy. Nature Biomedical Engineering. 3 (2), 147-157 (2019).
  7. Gifford, C. A., et al. Oligogenic inheritance of a human heart disease involving a genetic modifier. Science. 364 (6443), 865-870 (2019).
  8. Lo Sardo, V., et al. Unveiling the role of the most impactful cardiovascular risk locus through haplotype editing. Cell. 175 (7), 1796-1810 (2018).
  9. Liu, Y. W., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates. Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).
  10. Zhao, M. T., Shao, N. Y., Garg, V. Subtype-specific cardiomyocytes for precision medicine: where are we now. Stem Cells. 38, 822-833 (2020).
  11. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
  12. Protze, S. I., Lee, J. H., Keller, G. M. Human pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells: from developmental biology to therapeutic applications. Cell Stem Cell. 25 (3), 311-327 (2019).
  13. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).
  14. Zhao, M. T., et al. Molecular and functional resemblance of differentiated cells derived from isogenic human iPSCs and SCNT-derived ESCs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (52), 11111-11120 (2017).
  15. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  16. Lian, X., et al. Chemically defined, albumin-free human cardiomyocyte generation. Nature Methods. 12 (7), 595-596 (2015).
  17. Buikema, J. W., et al. Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human ipsc-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).
  18. Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. Human pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes develop from distinct mesoderm populations. Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).
  19. Liang, W., et al. Canonical Wnt signaling promotes pacemaker cell specification of cardiac mesodermal cells derived from mouse and human embryonic stem cells. Stem Cells. 38 (3), 352-368 (2020).
  20. Protze, S. I., et al. Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker. Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).
  21. Ren, J., et al. Canonical Wnt5b signaling directs outlying Nkx2.5+ mesoderm into pacemaker cardiomyocytes. Developmental Cell. 50 (6), 729-743 (2019).
  22. Zhang, Q., et al. Direct differentiation of atrial and ventricular myocytes from human embryonic stem cells by alternating retinoid signals. Cell Research. 21 (4), 579-587 (2011).
  23. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proceedings of the Japan Academy, Seriers B, Physical and Biological Sciences. 85 (8), 348-362 (2009).
  24. Stacey, G. N., Crook, J. M., Hei, D., Ludwig, T. Banking human induced pluripotent stem cells: lessons learned from embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (4), 385-388 (2013).
  25. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  26. Zhao, L., Ben-Yair, R., Burns, C. E., Burns, C. G. Endocardial notch signaling promotes cardiomyocyte proliferation in the regenerating zebrafish heart through Wnt pathway antagonism. Cell Reports. 26 (3), 546-554 (2019).
  27. Heallen, T. R., Kadow, Z. A., Wang, J., Martin, J. F. Determinants of cardiac growth and size. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (3), 037150 (2020).
  28. Campa, V. M., et al. Notch activates cell cycle reentry and progression in quiescent cardiomyocytes. Journal of Cell Biology. 183 (1), 129-141 (2008).
  29. Collesi, C., Zentilin, L., Sinagra, G., Giacca, M. Notch1 signaling stimulates proliferation of immature cardiomyocytes. Journal of Cell Biology. 183 (1), 117-128 (2008).
  30. Heallen, T., et al. Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size. Science. 332 (6028), 458-461 (2011).

Tags

Биология развития выпуск 168 мононуклеарные клетки периферической крови PBMCs индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки iPSCs сердечная дифференцировка перепрограммирование iPSC расширение кардиомиоцитов.
Генерация и расширение кардиомиоцитов человека из мононуклеарных клеток периферической крови пациента
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ye, S., Wan, X., Su, J., Patel, A.,… More

Ye, S., Wan, X., Su, J., Patel, A., Justis, B., Deschênes, I., Zhao, M. T. Generation and Expansion of Human Cardiomyocytes from Patient Peripheral Blood Mononuclear Cells. J. Vis. Exp. (168), e62206, doi:10.3791/62206 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter