Summary
هنا، نقدم اختبار الثقافة المشتركة سهلة الاستخدام لتحليل الورم الأرومي الدبقي (GBM) الهجرة على الخلايا العصبية المنقوشة. قمنا بتطوير ماكرو في برنامج FiJi لسهولة تحديد كمي لهجرة خلايا GBM على الخلايا العصبية ، ولاحظنا أن الخلايا العصبية تعدل قدرة الخلايا الغازية GBM.
Abstract
الأورام الأرومية الدبقية (GBMs)، الأورام الدبقية الخبيثة من الدرجة الرابعة، هي واحدة من أكثر أنواع السرطان البشري فتكا بسبب خصائصها العدوانية. على الرغم من التقدم الكبير في علم الوراثة من هذه الأورام، كيف تغزو خلايا GBM بارنشيما الدماغ السليمة ليست مفهومة جيدا. وتجدر الإشارة إلى أنه تبين أن خلايا GBM تغزو الفضاء المحيطي عبر طرق مختلفة؛ المصلحة الرئيسية لهذه الورقة هو الطريق على طول مساحات المادة البيضاء (WMTs). لا تتميز تفاعلات الخلايا السرطانية مع مكونات الخلايا العصبية المحيطة بالورم بشكل جيد. هنا، وقد وصفت طريقة تقيم تأثير الخلايا العصبية على غزو الخلايا GBM. تقدم هذه الورقة ثقافة مشتركة متقدمة في الفحص المختبري الذي يحاكي غزو WMT من خلال تحليل هجرة الخلايا الجذعية الشبيهة ب GBM على الخلايا العصبية. يتم مراقبة سلوك خلايا GBM في وجود الخلايا العصبية باستخدام إجراء تتبع تلقائي مع برامج مفتوحة المصدر والوصول الحر. هذه الطريقة مفيدة للعديد من التطبيقات، على وجه الخصوص، للدراسات الوظيفية والميكانية وكذلك لتحليل آثار العوامل الدوائية التي يمكن أن تمنع هجرة خلايا GBM على الخلايا العصبية.
Introduction
الأورام الدبقية الخبيثة الأولية، بما في ذلك GBMs، هي أورام مدمرة، مع معدل بقاء متوسط من 12 إلى 15 شهرا لمرضى GBM. يعتمد العلاج الحالي على استئصال كتلة الورم الكبيرة والعلاج الكيميائي إلى جانب العلاج الإشعاعي ، والذي يمدد معدل البقاء على قيد الحياة لبضعة أشهر فقط. ترتبط الإخفاقات العلاجية ارتباطا وثيقا بضعف تسليم الأدوية عبر حاجز الدم في الدماغ (BBB) والنمو الغازي في المساحات المحيطة بالأوعية الدموية ، السحايا ، وعلى طول WMTs1. غزو الأوعية الدموية، وتسمى أيضا الأوعية الدموية الخيار المشترك، هو عملية مدروسة جيدا، والآليات الجزيئية بدأت في توضيح؛ ومع ذلك، فإن عملية غزو خلايا GBM على طول WMTs غير مفهومة جيدا. الخلايا السرطانية تهاجر إلى الدماغ السليم على طول الهياكل الثانوية شيرر2. في الواقع ، منذ ما يقرب من قرن واحد ، وصف هانز يواكيم شيرر الطرق الغازية ل GBM ، والتي يشار إليها الآن باسم الساتيليات البينوروانية ، وداء الشبع المحيطي والأوعية الدموية ، وانتشار تحت الحيوية ، والغزو على طول WMT (الشكل 1A).
بعض chemokines ومستقبلاتها، مثل الخلايا النجمية المستمدة من عامل-1α (SDF1α) وC-X-C عزر مستقبلات chemokine 4 (CXCR4)، ولكن ليس عامل النمو البطانية الوعائية (VEGF)، ويبدو أن متورطة في غزو WMT3. في الآونة الأخيرة ، وقد تبين أن محور NOTCH1-SOX2 عبر الخلايا ليكون مسارا هاما في غزو WMT من خلايا GBM4. وصف المؤلفون كيف تغزو الخلايا الشبيهة بالجذع GBM الدماغ parenchyma على الخلايا العصبية غير الميالينية جزئيا ، مما يشير إلى تدمير أغماد المايلين بواسطة خلايا GBM. تم الوصول إلى علامة فارقة في عام 2019 عندما تم نشر ثلاث مقالات بشكل قاطع في مجلة نيتشر ، مما يؤكد على دور النشاط الكهربائي في تطوير الورم الدبقي5،6. يلقي العمل الجوهري الذي يقوم به Monje والمتعاونون الضوء على الدور المركزي للنشاط الكهربائي في إفراز neuroligin-3 ، والذي يعزز تطور الورم الدبقي.
وصف وينكلر والمتعاونون الاتصالات بين خلايا GBM (microtubes) بأنها حاسمة في الخطوات الغازية ، وفي الآونة الأخيرة ، التفاعلات بين خلايا GBM والخلايا العصبية عبر نقاط الاشتباك العصبي الموصوفة حديثا. هذه الهياكل تفضل التحفيز الجلوتاماترجية لمستقبلات حمض α الأمينية-3-هيدروكسي-5-ميثيل-4-إيزوكسيزولبروبينيويك (AMPA) الموجودة في غشاء الخلية GBM، الذي يعزز تطور الورم والغزو. غزو الخلايا السرطانية هو عملية مركزية في نشر الانبثاث أو البؤر الثانوية البعيدة ، كما لوحظ في مرضى GBM. وقد تم تحديد عدة عوامل لتكون مهمة في غزو GBM مثل thrombospondin-1, بيتا عامل النمو تحويل (البروتين المصفوفي TGFа المنظمة, أو مستقبلات كيموكيني CXCR3)7,8.
هنا ، تم وصف نموذج المحاكاة الحيوية المبسطة لدراسة غزو GBM ، حيث يتم نقش الخلايا العصبية على مسارات صفمين ، ويتم بذر خلايا GBM عليه ، كخلايا واحدة أو كرويدات(الشكل 1B). وتهدف الإعدادات التجريبية اثنين في إعادة رسملة الغزو على الخلايا العصبية, الذي لوحظ في GBM9,10,11. وقد وضعت هذه النماذج في الماضي كما محاذاة المواد الحيوية nanofiber (core-shell electrospinning) التي تسمح لدراسة هجرة الخلايا عن طريق تحوير الخصائص الميكانيكية أو الكيميائية12. يسمح نموذج الثقافة المشتركة الموصوف في هذه المقالة بفهم أفضل لكيفية هروب خلايا GBM على الخلايا العصبية من خلال تحديد مسارات جزيئية جديدة تشارك في هذه العملية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من جميع المرضى (من مستشفى هاوكيلاند، بيرغن، النرويج، وفقا للوائح لجنة الأخلاقيات المحلية). يتبع هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية للجان أخلاقيات البحوث البشرية والحيوانية في جامعة بوردو. تم إيواء الفئران الحامل وعلاجها في منشأة الحيوانات في جامعة بوردو. تم تنفيذ القتل الرحيم لفأر حامل في الوقت E18 باستخدام CO2. وقد تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية ووافقت عليها لجنة الأخلاقيات المحلية. جميع المنتجات التجارية المشار إليها في جدول المواد.
1. إعداد الشرائح المنقوشة
- إعداد الركيزة للترنيخ الدقيق
- علاج 18 ملم الزجاج الدائري coverslips عن طريق تنشيط الهواء / البلازما لمدة 5 دقائق. ضع الأغطية في غرفة مغلقة مع 100 ميكرولتر من (3-aminopropyl) ثلاثي إيثوكسيسيلين في مجفف لمدة 1 ساعة.
- احتضان مع 100 ملغ / مل من بولي (الإيثيلين غليكول) - succinimidyl valerate (الوزن الجزيئي 5000 (بيغ - SVA)) في 10 M م كربونات العازلة ، > 8 ، ل1 ساعة. شطف على نطاق واسع مع المياه فائقة البور، وجافة تحت غطاء محرك السيارة الكيميائية.
ملاحظة: في هذه المرحلة، يمكن تخزين العينة عند 4 درجات مئوية في الظلام لاستخدامها بشكل أكبر. - إضافة الضوئية، 4-benzoylbenzyl-trimethylammonium كلوريد (PLPP)، في 14.7 ملغ/ مل في المالحة العازلة بالفوسفات (PBS).
ملاحظة: يمكن أيضا استخدام شكل مركز من PLPP، وهو هلام PLPP. وينتج عن ذلك وقت إضاءة أقصر للأشعة فوق البنفسجية (UV) مطلوب لإضعاف فرشاة PEG (100 mJ/mm2).
- ترسب هلام فوتونيتياتور
- إعداد خليط من 3 ميكرولتر من هلام PLPP و 50 ميكرولتر من الإيثانول المطلق لإيداعها في وسط الشريحة. ضع العينة تحت غطاء محرك السيارة الكيميائي حتى التبخر الكامل للإيثانول المطلق.
ملاحظة: في هذه المرحلة، يمكن تخزين العينة عند 4 درجات مئوية في الظلام لاستخدامها بشكل أكبر.
- إعداد خليط من 3 ميكرولتر من هلام PLPP و 50 ميكرولتر من الإيثانول المطلق لإيداعها في وسط الشريحة. ضع العينة تحت غطاء محرك السيارة الكيميائي حتى التبخر الكامل للإيثانول المطلق.
- الترباس المصغر للشرائح الزجاجية
- جبل coverlip في غرفة Ludin ، ووضعها على المرحلة الآلية من المجهر مجهزة نظام التركيز التلقائي.
- تحميل الصور المقابلة لmicropatterns المتوخاة في البرنامج. تطبيق هذه المعلمات: النسخ المتماثل 4 × 4 مرات، تباعد 200 ميكرومتر، جرعة الأشعة فوق البنفسجية من 1000 مجم / ملم2. بعد تسلسل الأشعة فوق البنفسجية التلقائي الإضاءة، شطف PLPP بعيدا مع يغسل برنامج تلفزيوني متعددة.
ملاحظة: إذا تم استخدام هلام PLPP، إزالته عن طريق يغسل واسعة مع الماء deionized، الجافة في تيار من N2،وتخزينها في 4 درجة مئوية. - حضانة مع اللامينين (50 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني) لمدة 30 دقيقة. غسل على نطاق واسع مع برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: يمكن خلط محلول فلوري من البروتين الفلوري الأخضر المنقى (GFP، 10 ميكروغرام/مل في PBS) مع اللامينين لتصور المغذيات الدقيقة عن طريق المجهر الفلوري.
2. إعداد الخلايا العصبية وخلايا GBM لثقافة مشتركة
- ثقافة الخلايا العصبية فرس النهر الفئران الجنينية
- تشريح قرن آمون من الفئران الجنينية (E18)، ونقل الأنسجة إلى محلول الملح المتوازن هانك (HBSS)/1 mM 4-(2-هيدروكسي إيثيل)-1-بيبيرازينيثانسولفونيك حمض (HEPES)/البنسلين-streptomycin الحل في أنبوب 15 مل. إزالة الحل الزائد دون تجفيف قرن آمون.
- إضافة 5 مل من حمض التربسين-الإيثيلينديامين رباعي الأسيتيك (EDTA) المكمل بالبنسلين (10,000 وحدة/مل)/الستربتومايسين (10,000 ميكروغرام/مل) و1 مليون هيبس، واحتضانه لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. غسل 2x مع HBSS / HEPES / البنسلين - streptomycin الحل ، والسماح للأنسجة تبقى في هذا الحل لمدة 2-3 دقائق.
- فصل الأنسجة باستخدام اثنين من ماصة باستور مصقول اللهب، عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 10x مع كل الأنسجة، مع الحرص على تقليل رغوة. عد الخلايا، وتقييم جدوى تعليق الخلية. لوحة الخلايا العصبية على الأغطية micropatterned كما هو مبين أدناه.
ملاحظة: معدل صلاحية الخلية هو 85-90٪ بعد الاستخراج.
- ثقافة الخلية للخلايا العصبية على الأغطية micropatterned
- إعادة ترطيب الشرائح الزجاجية micropatterned مع برنامج تلفزيوني، واحتضان كامل الخلايا العصبية ثقافة المتوسطة.
- بذور الخلايا العصبية فرس النهر التي تم الحصول عليها من الفئران E18 سبراغ دولي مباشرة على غطاء الزجاج micropatterned في كثافة 50،000 خلية لكل سم2 في المتوسط العصبي القاعدي (NBM) المخصب مع 3٪ مصل الحصان. ضع الخلايا العصبية المصغرة في الحاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ CO2)لمدة 48 ساعة.
ملاحظة: بعد ~ 6 ح, ويمكن رؤية الخلايا العصبية فرس النهر الأولية التمسك micropatterns صفح.
- الثقافة المشتركة للخلايا الجذعية مثل GBM الإنسان على الخلايا العصبية
ملاحظة: لهذه الدراسة، نمت الغشاء GFP إيجابية والنووية الطماطم خلايا GBM المشتقة من المريض وفقا للبروتوكولات المنشورة السابقة10.- كما تنمو الخلايا على شكل كروية في التعليق، والطرد المركزي تعليق لمدة 5 دقائق في 200 × ز. غسل كرويدات مع 5 مل من برنامج تلفزيوني، واحتضان الخلايا مع 0.5 مل من كاشف تفكك الخلية (انظر جدول المواد) لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية.
- إضافة 4.5 مل من NBM كاملة (تكملها B27 الملحق, الهيبارين, عامل نمو الخلايا الليفية 2, البنسلين, والستريبتوميسين, كما هو موضح سابقا8), وعد الخلايا باستخدام تقنية العد التلقائي.
- البذور 1000 GBM الخلايا على ثقافة الخلايا العصبية micropatterned في NBM المخصب مع 3٪ مصل الحصان. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2،و 95٪ الرطوبة.
3. تصوير الخلايا الحية
- مباشرة بعد GBM زرع الخلية، ضع العينة على خشبة المسرح من المجهر مقلوب مجهزة غرفة الحرارة. إجراء التصوير بالخلايا الحية على المجهر المجهزة بمرحلة آلية لتسجيل مواقف متعددة باستخدام مربع أدوات الاستحواذ متعدد الأبعاد في البرنامج. الحصول على صور GFP/Tomato ذات الحقول الساطعة والفلورية كل 5 دقائق على مدار 12 ساعة مع هدف 20x في درجة حرارة (37 درجة مئوية) وبيئة يتم التحكم فيها بالغاز (5٪ CO2).
4. تحليل الصور
ملاحظة: باستخدام فيجي، تم معالجة مكدس الصور ثنائي الأبعاد (ثنائي الأبعاد) بشكل شبه تلقائي أو معالجته باستخدام أداة محلية الصنع وسهلة الاستخدام (متوفرة في هذا العنوان: https://github.com/Guyon-J/Coculture_Gliomas-Neurons/blob/main/README.md)، والتي تتم كتابتها بلغة الماكرو IJ1(الشكل 2A). يتم تلخيص سير العمل الآلي والإجراءات في الشكل 2B.
- تحليل شبكة العصبية (الشكل 2Bi)
- حدد صورة واحدة للكدسة. انقر بزر الماوس الأيمن على أداة الشبكة لفتح مربع الحوار خيارات المقابلة وضبط الإعدادات (على سبيل المثال، عتبة = المثلث، لي، هوانغ...، غاوسي طمس،ومرشحات الوسيط = 1، 2، 3...) لإنتاج تجزئة دقيقة من الصور. ثم انقر فوق موافق.
- انقر بزر الماوس الأيسر على أداة الشبكة لتنشيط الإجراء التالي تلقائيا.
- تكرار الصورة المحددة، وتقسيمها إلى ثلاث قنوات ملونة (الأحمر الرمادي والأخضر).
- حدد القناة الرمادية (brightfield)، واؤدي تحسين امتداد التباين (CSE) لتحسين الفصل بين المناطق المختلفة. استخدم كاشف حافة سوبيل (SED) لتنفيذ عملية التواء معالجة الإشارات 2D المجمعة بالفعل تحت أمر Find Edge.
- للتصفية المزدوجة (F)، قم بتطبيق ضبابية غاوسية ومرشح متوسط لتقليل الضوضاء وتجانس إشارة الكائن. قم بالتحويل إلى قناع (CM) بتنفيذ خوارزميات العتبة المكيفة للحصول على صورة ثنائية (BIN-grey) مع بكسل أسود (منطقة الخلية) وبيكسلات بيضاء (خلفية). الهيكل العظمي (Sk) منطقة الخلية في شبكة بسيطة (NET)، والجزيئات تصفية (EP) في صورة NET عن طريق إزالة جزيئات صغيرة، غير شبكية.
- للقنوات الحمراء والخضراء (النواة والغشاء) ، وإجراء التصفية المزدوجة، وتحويلها إلى قناع باستخدام طريقة العتبة المكيفة ، والسماح BIN -green لتحديد مورفولوجيا الخلية مع الأمر تحليل الجسيمات.
- دمج كافة القنوات باستخدام منطقة الاهتمام الخاصة بها (ROI) مع عامل التشغيل OR (الجمع)، وإعادة ضبط لونها الأولي في صورة RGB بسيطة.
- تحليل الحركة أحادي الخلية (الشكل 2Bii)
- انقر بزر الماوس الأيمن على أداة تتبع الخلية الواحدة لفتح مربع الحوار خيارات المقابلة، وضبط الإعدادات (على سبيل المثال، نوع تريل = النواة أو الغشاء، عتبة = المثلث، لي، هوانغ...، Z الإسقاط = كثافة ماكس، شرائح المجموع...، ضبابية غاوسية ومرشحات الوسيط = 1، 2، 3...) لإنتاج تجزئة دقيقة من الصور. ثم انقر فوق موافق.
- انقر بزر الماوس الأيسر على أداة تتبع الخلية المفردة لتنشيط الإجراء التالي تلقائيا.
- إزالة القناة الرمادية. تطبيق إسقاط Z على المكدس، والتي سوف تولد صورة المقابلة لمكدس الصورة وفقا للوقت (تي كومة). تصفية مزدوجة وتحويلها إلى قناع المسارات التي خلفتها الخلايا. إزالة جزيئات صغيرة إلى صورة BIN-الأحمر /الأخضر.
- باستخدام ROI حدد كل contour من تتبع الخلية ثم حدد مربع الكشف عن حافة تخطي في مربع الحوار خيارات لتخطي هذه الخطوة preprocessing للخطوات اللاحقة.
- عزل القناة الحمراء (نوع تريل = Nucleus) على المكدس الأصلي. حدد عائد استثمار واحد وأزل المنطقة الخارجية. تصفية مزدوجة لجميع الصور وتحويلها إلى قناع (BIN-الأحمر). تحديد موضع السنترويد X/Y لكل نواة ثنائية.
- باستخدام ماكرو منشور مسبقا لبرنامج جدول البيانات13، احسب متوسط الإزاحة المربعة ونسبة الاتجاه ومتوسط السرعة لهذه الخلية.
- تحليل تتبع متعدد الخلايا (الشكل 2Biii)
- انقر بزر الماوس الأيمن على أداة التتبع لفتح مربع الحوار خيارات المقابلة وضبط الإعدادات (على سبيل المثال، عتبة = المثلث، لي، هوانغ...، غاوسي طمس وفلاتر الوسيط = 1، 2، 3...) لإنتاج تجزئة دقيقة من الصور. ثم انقر فوق موافق.
- انقر بزر الماوس الأيسر على أداة التتبع لتنشيط الإجراء التالي تلقائيا.
- إزالة القناة الرمادية.
- تقسيم القنوات الحمراء والخضراء، مزدوجة تصفية، وتحويل إلى قناع.
- دمج القنوات باستخدام حاسبة الصور... مع عامل التشغيل AND، تاركا فقط إشارة النواة الموجودة في الأغشية.
ملاحظة: يمكن استخدام العديد من المكونات الإضافية في فيجي لتحديد موضع X/Y لعدة خلايا في هذه الصورة الثنائية المعالجة مسبقا في نفس الوقت (انظر جدول المواد).
- باستخدام ماكرو13الموصوف سابقا ، احسب مؤامرة المسار ، ومتوسط الإزاحة المربعة ، ونسبة الاتجاه ، ومتوسط السرعة لهذه الخلايا.
- هجرة كروية على حصيرة العصبية (الشكل 2بيف)
- انقر بزر الماوس الأيمن على أداة الترحيل لفتح مربع الحوار خيارات المقابلة وضبط الإعدادات (على سبيل المثال، عتبة = المثلث، لي، هوانغ...، ضبابية غاوسية ومرشحات الوسيط = 1، 2، 3...) لإنتاج تجزئة دقيقة من الصور. ثم انقر فوق موافق.
- انقر بزر الماوس الأيسر على أداة الترحيل لتنشيط الإجراء التالي تلقائيا.
- إزالة القناة الحمراء.
- تقسيم القنوات الخضراء والرمادية.
- للقناة الرمادية، رسم يدويا كفاف حصيرة العصبية، وقياس مساحتها.
- للقناة الخضراء، قم بتصفية المكدس مرتين وتحويله إلى قناع. إزالة المنطقة خارج النقش (BIN) وتحديد منطقة الخلية ثنائية لكل صورة.
ملاحظة: يتم معايرة المعلمات الموضحة أعلاه عن طريق تغيير قيمها بالنقر بزر الماوس الأيسر فوق رمز الاهتمام. يمكن إجراء هذه المعالجة يدويا. ومع ذلك ، بالنسبة لعدد كبير من الصور (حوالي مائة لكل عملية استحواذ) ، والقنوات (عادة 3 قنوات) ، وخطوات المعالجة ، سيكون من الأفضل استخدام أداة آلية أو شبه آلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم إعداد الخلايا العصبية المنقوشة المشاركة في استزراع خلايا GBM الفلورية كما هو موضح في قسم البروتوكول ، وأجريت تجارب التتبع. الخلايا GBM تعديل شكلها بسرعة أثناء الهجرة على الخلايا العصبية (الشكل 1B: لوحة 6 والفيديو 1). هاجرت الخلايا على طول امتدادات الخلايا العصبية، في حركة عشوائية (فيديو 1). يمكن تمييز خلايا GBM الفلورية والخلايا العصبية غير الفلورية بسهولة ، وهذا سمح بتتبع حركات الخلايا باستخدام الماكرو فيجي ، كما هو موضح في قسم البروتوكول(الشكل 2). فيجي هي برنامج ترخيص مفتوح يسهل معالجة الصور وتحليلها. يمكن أن يتم تلقائيا الإجراءات اليدوية التي تستغرق وقتا طويلا نسبيا لتحليل العديد من الصور في ماكرو. يتم استيراد الصور بواسطة إجراء السحب والإفلات ومعالجتها وتحديدها كميا، مما يؤدي إلى إنشاء بيانات متوفرة باستخدام مدير عائد الاستثمار.
عند إيداعها في وحدات الماكرو Fiji.app | | مجلد مجموعة أدوات، كانت أداة Gliomas-Neurons متوفرة في قائمة أدوات أكثر وعرضت العديد منالرموز (الشكل 2A). يتم توضيح سير عمل معالجة الصور ، الذي تم الحصول عليه بالنقر على الرموز ، في الشكل 2B (i-iv). يمكن تحليل شكل الخلية على الشبكة العصبية (الشكل 2B، i). يمكن الحصول على عدة معلمات من تتبع الخلية لواحد (الشكل 2B، ii) أو عدة خلايا ( الشكل2B،iii) باستخدام عمليتين متميزتين للصور. ويمكن أيضا سرعة الانتعاش بواسطة خلايا GBM كروية على الخلايا العصبية يمكن تحليلها(الشكل 2B، رابعا). الخلايا المصنفة على الخلايا العصبية عرض شكل ممدود مع نتوءات متعددة بعد مساحات الخلايا العصبية (الشكل 3A, ط), ولكن كان شكل مستدير عندما مثقف مباشرة على صفمين ( الشكل3A, ii). الخلايا المستزرعة على الخلايا العصبية تعديل شكلها بكفاءة، على الرغم من أنها لم تكن ممدود عندما مثقف على صفمين(الشكل 3A،iii-v). وشوهدت نتوءات رقيقة، تربط أحيانا بين زرتين، في خلايا تشارك في استزراعها مع الخلايا العصبية في مراحل لاحقة(فيديو 1).
تمت مقارنة قدرة الهجرة لخلايا GBM المصنفة على الخلايا العصبية بالخلايا المصنفة مباشرة على صفمينين. الخلايا المصنفة على الخلايا العصبية لديها قدرات هجرة أكبر من على صفمين وحدها (الشكل 3B، i،ii). تم الكشف عن حركة عشوائية من خلايا P3 في كلا الشرطين، مع مسافة أكبر لخلايا P3 على الخلايا العصبية، كما هو مبين في مؤامرة مسار(الشكل 3B،i،ii). تم تقدير حركة الخلية كميا من خلال متوسط الإزاحة المربعة (MSD) ، وتم تزويد تمثيل السجل الخاص بها بدالة خطية14 (الشكل 3B، iii). كما تم حساب الاتجاه ومتوسط السرعة لكلا الشرطين(الشكل 3B، iv ،v). كما أعقب هجرة الخلايا من كرويدات P3 من خلال الكشف عن منطقة الفلورسنت مع مرور الوقت على الخلايا العصبية ومقارنة مع الهجرة على صفمين وحدها (الشكل 3C، i ،ii و Video 2). نصف النمط مع الخلايا العصبية كانت مغطاة بخلايا GBM بعد 500 دقيقة في ملف خطي. ومع ذلك، لم تلتزم كرويدات لنمط صفين (الشكل 3D، iii و Video 2).
الشكل 1:الإعداد التجريبي لخلايا الورم الأرومي الدبقي المهاجرة على الخلايا العصبية المنقوشة. (أ)تمثيل خلايا الورم الأرومي الدبقي التي تغزو نصف الكرة الأرضية من خلال الكوسوم الجسمي. (ب) الإعداد التجريبي. في الخطوة 1، سطح اللوحة مغلف بطبقة PEG مضادة للتعارض. تتم إضافة photoinitiator في الخطوة 2، التي تغطي كامل الطلاء. في الخطوة 3 ، يتم إسقاط صورة واسعة النطاق للأشعة فوق البنفسجية من خلال هدف المجهر ، الذي ينشط محليا جزيئات الفوتوينيتياتور. الفوتوينيتيات المنشطة تلتصق محليا جزيئات PEG ويسمح الامتزاز اللاحقة من اللامينين. في الخطوة 5، يتم بذر الخلايا العصبية وتلتزم صفائف صفح. P3 (GFP / الطماطمالنووية)ثم تودع خلايا الورم الأرومي الدبقي على نمط الخلايا العصبية، ويتم الحصول على الصور (الخطوة 6). المختصرات: PEG = بولي إيثيلين غليكول؛ الأشعة فوق البنفسجية = الأشعة فوق البنفسجية؛ GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: فيجي أداة العرض وتحليل سير العمل. (أ) الأداة تسمى Gliomas-Neurons متوفرة في قائمة أدوات إضافية عند إضافة الماكرو إلى المجلد Fiji.app | وحدات الماكرو | toolsets (اللوحة اليسرى). وتتكون من عدة أدوات العمل المبينة أدناه (لوحة الحق). (ب) i. أداة الشبكة: معالجة الصور، والتي تستخدم لرسم الشبكة العصبية وخلايا الورم الدبقي في تمثيل مبسط. ii. أداة تتبع الخلية الواحدة: معالجة الصور ، والتي تستخدم لرسم وتحديد منطقة حركة الخلية لتحليل إزاحة الخلايا المفردة. iii. أداة التتبع: خطوات المعالجة المسبقة للصور لاستخدام المكونات الإضافية لتتبع فيجي المثبتة مسبقا. iv. أداة الترحيل النسبي: معالجة الصور، والتي تستخدم لتحديد ترحيل الخلية النسبية على نمط محدد يدويا. يمكن معايرة بعض المعلمات بنقرة يسرى على زر الأداة. الاختصارات: CSE = تحسين امتداد التباين؛ SED = سوبيل حافة كاشف; F = التصفية المزدوجة؛ CM = تحويل إلى قناع; Sk = الهيكل العظمي; EP = القضاء على الجسيمات؛ OR (الجمع) = عامل تشغيل الاتحاد على ROIs المحددة؛ AND = عامل التشغيل اقتران على ROIs المحددة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مقارنة بين الخلايا P3 أو كرويدات على الخلايا العصبية المنقوشة مقابل طلاء اللامينين. (أ) واصفات شكل P3 GFP/ الطماطم الخلاياالنووية على الخلايا العصبية أو على صفح. مثال على الشبكات المجهزة من خلايا P3 على i. الخلايا العصبية المنقوشة أو على الثاني. طلاء اللامينين. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. متوسط مساحة الخلية على الخلايا العصبية المنقوشة أو على صفح. iv. Formfactor هو نسبة محيط إلى المنطقة تطبيع إلى دائرة، وتوفير المعلمات على استطالة الخلية وتفريع الخلية. v. نسبة العرض إلى الارتفاع هي نسبة المحور الرئيسي إلى المحور الثانوي للخلية. في iii, iv, و v, تم تحليل 15 خلية لكل حقل; 4 أنماط مستقلة؛ يتم تمثيل البيانات على أنها متوسط ± S.E.M. (B) تحليل تتبع الخلايا P3 المفككة. رسم بياني تمثيلي واحد من الخلايا على (1) الخلايا العصبية المنقوشة و (2) على طلاء صفح. III. MSD من خلايا P3 المهاجرة على الخلايا العصبية أو على طلاء صفح. قيم X/Y في مقاييس لوغاريتمية. iv. نسبة الاتجاه. v. متوسط ترحيل سرعة الخلية. في iii, iv, و v, تم تحليل 15 خلية لكل حقل; 4 أنماط مستقلة؛ يتم تمثيل البيانات على أنها متوسط ± S.E.M. (C) تحليل الهجرة من كرويدات P3 GFP. صور تمثيلية في نقاط زمنية مختلفة من كرويدات P3 على (1) الخلايا العصبية المنقوشة أو على (ii) طلاء صفح. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الهجرة الكروية ممثلة بالتقاء النمط؛ 4 أنماط مستقلة؛ يتم تمثيل البيانات على أنها متوسط ± S.E.M. الاختصارات: GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر؛ S.E.M. = خطأ قياسي في المتوسط؛ MSD = متوسط الإزاحة المربعة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
فيديو 1: P3 الخلايا على الخلايا العصبية أو صفح سجلت أكثر من 8 ح (في الصورة كل 5 دقائق). يظهر الفيديو هجرة الخلية الواحدة P3 على الخلايا العصبية (يسار) وعلى طلاء صفح (يمين). وأعربت الخلايا عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP، اللون الأخضر) والطماطم النووية (اللون الأحمر). شريط = 50 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.
فيديو 2: P3 كرويدات على الخلايا العصبية أو صفح سجلت أكثر من 8 ساعة (في الصورة كل 5 دقائق). يظهر الفيديو هجرة كروية P3 على الخلايا العصبية (يسار) وعلى طلاء صفح (يمين). عبرت الخلايا عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP، اللون الأخضر). شريط = 100 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
جليوبلاستوماس غزو واسع النطاق parenchyma باستخدام وسائط مختلفة: الخيار المشترك للأوعية الدموية المحيطة بها, غزو الخلالي, أو الغزو على WMTs18. هذا الوضع الأخير لا يتميز بشكل جيد في الأدب بسبب صعوبة في العثور على نماذج مناسبة في المختبر أو في الجسم الحي المتعلقة بغزو WMT. هنا ، تم اقتراح نموذج مبسط تم فيه نقش الخلايا العصبية القوارض المستزرعة على الأسطح المغلفة باللحنين ، وتم بذر الخلايا الفلورية الشبيهة بالجذع GBM فوق الخلايا العصبية. تم استخدام نمط على شكل شبكة في هذه الدراسة لتحسين تحليل ارتباط الخلايا السرطانية والغزو والانتشار. هاجرت خلايا GBM بشكل أكثر كفاءة على رأس الخلايا العصبية من مباشرة على المصفوفة ، والتي كانت صفح في هذه التجارب. تغير شكل الخلية خلال عملية التسجيل، وزادت مساحة سطح الخلية في نفس الوقت. من المرجح أن تنجذب الخلايا الشبيهة بالنبع GBM من قبل مساحات الخلايا العصبية عن طريق تنشيط مسارات إشارات محددة (أي NOTCH2/SOX2)4 أو العوامل والإشارات المفرزة من الخلايا العصبية نفسها. هذا النظام مناسب تماما لتحليل التبادلات الجزيئية بين خلايا GBM والخلايا العصبية ، والتي قد تشمل الأيض ، الناقلات العصبية ، أو السيتوكينات.
في الآونة الأخيرة، وصف فينكاتيش والمتعاونين تشكيل المشبك العصبي الذي الجلوتامات ينشط مستقبلاته، AMPAR6. هل العمليات المماثلة التي تنطوي عليها عملية غزو WMT لخلايا GBM؟ ويمكن التحقيق في هذا مع هذا النظام التجريبي باستخدام تثبيط الدوائية أو النهج الوراثية.
10 - وتجدر الإشارة إلى النقاط الحرجة التالية. أولا ، خلال خطوات PEGylation ، لا ينبغي السماح للركيزة بالجفاف لتجنب التأثير على سلامة الطلاء المضاد لللصق. وتجدر الإشارة إلى أنه من الممكن غسل محلول PEG-SVA على نطاق واسع بالماء فائق السعة وتجفيفه تحت تيار من النيتروجين قبل تخزينه عند درجة حرارة 4 درجات مئوية في الظلام. ثانيا، الماكرو الذي تم تطويره لتحليل ترحيل خلايا GBM على الخلايا العصبية هو في وضع الوصول المفتوح ومتوافق مع برنامج FiJi. على الرغم من أن هذا الماكرو وتحديثاته متوفرة على GitHub ، إلا أنه يتطلب معايرة مناسبة للكشف عن الخلايا. ومن ثم، قد يكون من المفيد التحقق من العينات يدويا كرقابة على الجودة أثناء بدء التحليل. مرونة النظام المستخدم هنا يسمح أشكال مختلفة من نمط, مع خطوط متوازية تفصل بين الخلايا العصبية إلى مستويات مختلفة. مع هذا النهج، يمكن محاكاة شكل العديد من الهياكل الدماغية، كما لوحظ في الجسم كالوسوم- أكبر بنية المادة البيضاء في الدماغ البشري حيث لوحظ غزو WMT أساسا. بدلا من ذلك، وقد ثبت أن نفس جهاز الإسقاط الأشعة فوق البنفسجية لهيكلة الأشعة فوق البنفسجية الحساسة غير لاصقة hydrogels بطريقة z التي تسيطر عليها15،مما يسمح لتوحيد تشكيل كروية.
وفي هذا السياق، يمكن توليد الغلاف العصبي ثلاثي الأبعاد لاختبار غزو GBM. ويمكن أيضا تطبيق هذه التقنية لتكتك الخلايا الدماغية الأخرى، مثل خلايا بطانة الدماغ، لإعادة إنتاج شكل يشبه الأوعية أو تقليد الخلايا المناعية المجهرية أو غيرها. وهكذا، يمكن ملاحظة الآثار التآزرية أو المثبطة للخلايا الدماغية عند المشاركة في استزراع خلايا GBM. أحد قيود هذه الدراسة هو استخدام الخلايا العصبية الفئران الجنينية في الثقافة المشتركة مع خلايا GBM البشرية ، والتي قد لا تحاكي الظروف الفسيولوجية الحقيقية. إحدى الطرق للتغلب على هذا العيب هو استخدام الخلايا العصبية المستحثة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات لتجنب الأنواع عبر التفاعل16. ومع ذلك ، فإن خلايا GBM تلتزم بسرعة وتهاجر بكفاءة على الخلايا العصبية للفئران ، كما هو موضح في هذه التجارب. وقد ثبت أيضا من خلايا الدماغ الفئران (خلايا شوان) يمكن أن تشارك بكفاءة مع الخلايا العصبية البشرية17. وتشمل الطرق الأخرى استخدام ألياف النانو ثلاثية الأبعاد، والتي تقدم نموذجا جيدا لدراسة هجرة الخلايا الدبقية12،ولكن الحد من الاتصال بين الخلايا والخلايا كما تعتبر الألياف النانوية هياكل غير حية.
وعلاوة على ذلك، الثقافات 2D هي اختزالية، وتبسيط مراقبة العمليات الخلوية، ويمكن أن تحد من صلاحيتها للسياق في الجسم الحي 10. وهكذا، 3D الثقافات المشتركة من الخلايا والخلايا العصبية GBM هي أفضل ممثلي الوضع في الجسم الحي. وقد استخدمت organoids الدماغ المعقدة، مثل العقول الصغيرة18،في المواجهة الثقافة غزو المقايسات19. والميزة الرئيسية للاستراتيجية الموصوفة هنا هي إمكانية إعادة إنتاج نهج الثقافة المشتركة، أي أن الخلايا العصبية الأولية مقيدة هندسيا على الخلايا الدقيقة التي يتم التحكم في حجمها، ولا يمكن أن يحدث التفاعل مع خلايا GBM المحقونة في مكان آخر. وعلاوة على ذلك، يمكن ضبطها التنظيم المكاني للخلايا العصبية بسبب براعة نظام الأشعة فوق البنفسجية الإسقاط، مما يسمح لمزيد من التحسين. وفي نهاية المطاف، يمكن أن يساعد تطوير هذه النهج المحاكاة الحيوية والتحقق من صحتها أيضا في الحد من عدد النماذج الحيوانية المستخدمة في البحوث الطبية الحيوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس بينهما تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة ARC 2020 ، Ligue Contre le Cancer (Comite de la Gironde) ، ARTC ، خطة السرطان 2021 ، INCA PLBIO. ويدعم Alveole من قبل وكالة الوطنية دي لا ريشرش (غرانت لابيكس الدماغ ANR-10-LABX-43). جوريس غيون هو حاصل على زمالة من مستشفى جامعة تولوز (CHU تولوز).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-aminopropyl) triethoxysilane | Sigma | 440140-100ML | The amino group is useful for the bioconjugation of mPEG-SVA |
| 96-well round-bottom plate | Sarstedt | 2582624 | Used to prepare spheroids |
| Accutase | Gibco | A11105-01 | Stored at -20 °C (long-term) or 4 °C (short-term), sphere dissociation enzyme |
| B27 | Gibco | 12587 | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Basic Fibroblast Growth Factor | Peprotech | 100-18B | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Countess Cell Counting ChamberSlides | Invitrogen | C10283 | Used to cell counting |
| Coverslips | Marienfeld | 111580 | Cell culture substrate |
| Dessicator cartridges | Sigma | Z363456-6EA | Used to reduce mosture during (3-aminopropyl) triethoxysilane treatment |
| DPBS 10x | Pan Biotech | P04-53-500 | Stored at 4 °C |
| Fiji software, MTrack2 macro | ImageJ | Used to analyze pictures | |
| Flask 75 cm² | Falcon | 10497302 | |
| HBSS | Sigma | H8264-500ML | |
| Heparin sodium | Sigma | H3149-100KU | Stored at 4 °C |
| Laminin | 114956-81-9 | Promotes neuronal adhesion | |
| Leonardo software | loading of envisioned micropatterns | ||
| MetaMorph Software | Molecular Devices LLC | NA | Microscopy automation software |
| Methylcellulose | Sigma | M0512 | Diluted in NBM for a 2% final concentration |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | Stored at 4 °C |
| Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA) | inverted microscope equipped with a motorized stage | ||
| Penicillin - Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Stored at 4 °C |
| PLPP | Alveole | PLPPclassic_1ml | Photoinitiator used to degrade the PEG brush |
| Poly(ethylene glycol)-Succinimidyl Valerate (mPEG-SVA) | Laysan Bio | VA-PEG-VA-5000-5g | Used as an anti-fouling coating |
| PRIMO | Alveole | PRIMO1 | Digital micromirror device (DMD)-based UV projection apparatus |
| Trypan blue 0.4% | ThermoFisher | T10282 | Used for cell counting |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ML | Used to detach adherent cells |
References
- Shergalis, A., Bankhead, A., Luesakul, U., Muangsin, N., Neamati, N. Current challenges and opportunities in treating glioblastoma. Pharmacology Reviews. 70, 412-445 (2018).
- Scherer, H. J. The forms of growth in gliomas and their practical significance. Brain. 63, 1-35 (1940).
- Zagzag, D., et al. Hypoxia- and vascular endothelial growth factor-induced stromal cell-derived factor-1α/CXCR4 expression in glioblastomas. American Journal of Pathology. 173, 545-560 (2008).
- Wang, J., et al. Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop. Nature Neurosciences. 22, 91-105 (2019).
- Venkataramani, V., et al. Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression. Nature. 573, 532-538 (2019).
- Venkatesh, H. S., et al. Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits. Nature. 573, 539-545 (2019).
- Boyé, K., et al. The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors. Nature Communications. 8, 1571 (2017).
- Daubon, T., et al. Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development. Nature Communications. 10, 1146 (2019).
- Gritsenko, P. G., et al. p120-catenin-dependent collective brain infiltration by glioma cell networks. Nature Cell Biology. 22, 97-107 (2020).
- Guyon, J., et al. A 3D spheroid model for glioblastoma. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (158), (2020).
- Strale, P. O., et al. Multiprotein Printing by Light?Induced Molecular Adsorption. Advanced Materials. , (2015).
- Rao, S. S., et al. Mimicking white matter tract topography using core-shell electrospun nanofibers to examine migration of malignant brain tumors. Biomaterials. 34, 5181-5190 (2013).
- Visweshwaran, S. P., Maritzen, T. A simple 3D cellular chemotaxis assay and analysis workflow suitable for a wide range of migrating cells. MethodsX. 6, 2807-2821 (2019).
- Qian, H., Sheetz, M. P., Elson, E. L. Single particle tracking. Analysis of diffusion and flow in two-dimensional systems. Biophysics Journal. 60, 910-921 (1991).
- Pasturel, A., Strale, P. -O., Studer, V. Tailoring common hydrogels into 3D cell culture templates. Advance Healthcare Materials. 9, 2000519 (2020).
- Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145, 831-834 (2011).
- Clark, A. J., et al. Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination. Brain. 140, 898-913 (2017).
- Linkous, A., et al. Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids. Cell Reports. 26, 3203-3211 (2019).
- Han, M., et al. Interfering with long non-coding RNA MIR22HG processing inhibits glioblastoma progression through suppression of Wnt/β-catenin signalling. Brain. 143, 512-530 (2020).
