الثقافة المشتركة للخلايا الشبيهة بالورم الأرومي الدبقي على الخلايا العصبية المنقوشة لدراسة الهجرة والتفاعلات الخلوية
Summary
هنا، نقدم اختبار الثقافة المشتركة سهلة الاستخدام لتحليل الورم الأرومي الدبقي (GBM) الهجرة على الخلايا العصبية المنقوشة. قمنا بتطوير ماكرو في برنامج FiJi لسهولة تحديد كمي لهجرة خلايا GBM على الخلايا العصبية ، ولاحظنا أن الخلايا العصبية تعدل قدرة الخلايا الغازية GBM.
Abstract
الأورام الأرومية الدبقية (GBMs)، الأورام الدبقية الخبيثة من الدرجة الرابعة، هي واحدة من أكثر أنواع السرطان البشري فتكا بسبب خصائصها العدوانية. على الرغم من التقدم الكبير في علم الوراثة من هذه الأورام، كيف تغزو خلايا GBM بارنشيما الدماغ السليمة ليست مفهومة جيدا. وتجدر الإشارة إلى أنه تبين أن خلايا GBM تغزو الفضاء المحيطي عبر طرق مختلفة؛ المصلحة الرئيسية لهذه الورقة هو الطريق على طول مساحات المادة البيضاء (WMTs). لا تتميز تفاعلات الخلايا السرطانية مع مكونات الخلايا العصبية المحيطة بالورم بشكل جيد. هنا، وقد وصفت طريقة تقيم تأثير الخلايا العصبية على غزو الخلايا GBM. تقدم هذه الورقة ثقافة مشتركة متقدمة في الفحص المختبري الذي يحاكي غزو WMT من خلال تحليل هجرة الخلايا الجذعية الشبيهة ب GBM على الخلايا العصبية. يتم مراقبة سلوك خلايا GBM في وجود الخلايا العصبية باستخدام إجراء تتبع تلقائي مع برامج مفتوحة المصدر والوصول الحر. هذه الطريقة مفيدة للعديد من التطبيقات، على وجه الخصوص، للدراسات الوظيفية والميكانية وكذلك لتحليل آثار العوامل الدوائية التي يمكن أن تمنع هجرة خلايا GBM على الخلايا العصبية.
Introduction
الأورام الدبقية الخبيثة الأولية، بما في ذلك GBMs، هي أورام مدمرة، مع معدل بقاء متوسط من 12 إلى 15 شهرا لمرضى GBM. يعتمد العلاج الحالي على استئصال كتلة الورم الكبيرة والعلاج الكيميائي إلى جانب العلاج الإشعاعي ، والذي يمدد معدل البقاء على قيد الحياة لبضعة أشهر فقط. ترتبط الإخفاقات العلاجية ارتباطا وثيقا بضعف تسليم الأدوية عبر حاجز الدم في الدماغ (BBB) والنمو الغازي في المساحات المحيطة بالأوعية الدموية ، السحايا ، وعلى طول WMTs1. غزو الأوعية الدموية، وتسمى أيضا الأوعية الدموية الخيار المشترك، هو عملية مدروسة جيدا، والآليات الجزيئية بدأت في توضيح؛ ومع ذلك، فإن عملية غزو خلايا GBM على طول WMTs غير مفهومة جيدا. الخلايا السرطانية تهاجر إلى الدماغ السليم على طول الهياكل الثانوية شيرر2. في الواقع ، منذ ما يقرب من قرن واحد ، وصف هانز يواكيم شيرر الطرق الغازية ل GBM ، والتي يشار إليها الآن باسم الساتيليات البينوروانية ، وداء الشبع المحيطي والأوعية الدموية ، وانتشار تحت الحيوية ، والغزو على طول WMT (الشكل 1A).
بعض chemokines ومستقبلاتها، مثل الخلايا النجمية المستمدة من عامل-1α (SDF1α) وC-X-C عزر مستقبلات chemokine 4 (CXCR4)، ولكن ليس عامل النمو البطانية الوعائية (VEGF)، ويبدو أن متورطة في غزو WMT3. في الآونة الأخيرة ، وقد تبين أن محور NOTCH1-SOX2 عبر الخلايا ليكون مسارا هاما في غزو WMT من خلايا GBM4. وصف المؤلفون كيف تغزو الخلايا الشبيهة بالجذع GBM الدماغ parenchyma على الخلايا العصبية غير الميالينية جزئيا ، مما يشير إلى تدمير أغماد المايلين بواسطة خلايا GBM. تم الوصول إلى علامة فارقة في عام 2019 عندما تم نشر ثلاث مقالات بشكل قاطع في مجلة نيتشر ، مما يؤكد على دور النشاط الكهربائي في تطوير الورم الدبقي5،6. يلقي العمل الجوهري الذي يقوم به Monje والمتعاونون الضوء على الدور المركزي للنشاط الكهربائي في إفراز neuroligin-3 ، والذي يعزز تطور الورم الدبقي.
وصف وينكلر والمتعاونون الاتصالات بين خلايا GBM (microtubes) بأنها حاسمة في الخطوات الغازية ، وفي الآونة الأخيرة ، التفاعلات بين خلايا GBM والخلايا العصبية عبر نقاط الاشتباك العصبي الموصوفة حديثا. هذه الهياكل تفضل التحفيز الجلوتاماترجية لمستقبلات حمض α الأمينية-3-هيدروكسي-5-ميثيل-4-إيزوكسيزولبروبينيويك (AMPA) الموجودة في غشاء الخلية GBM، الذي يعزز تطور الورم والغزو. غزو الخلايا السرطانية هو عملية مركزية في نشر الانبثاث أو البؤر الثانوية البعيدة ، كما لوحظ في مرضى GBM. وقد تم تحديد عدة عوامل لتكون مهمة في غزو GBM مثل thrombospondin-1, بيتا عامل النمو تحويل (البروتين المصفوفي TGFа المنظمة, أو مستقبلات كيموكيني CXCR3)7,8.
هنا ، تم وصف نموذج المحاكاة الحيوية المبسطة لدراسة غزو GBM ، حيث يتم نقش الخلايا العصبية على مسارات صفمين ، ويتم بذر خلايا GBM عليه ، كخلايا واحدة أو كرويدات(الشكل 1B). وتهدف الإعدادات التجريبية اثنين في إعادة رسملة الغزو على الخلايا العصبية, الذي لوحظ في GBM9,10,11. وقد وضعت هذه النماذج في الماضي كما محاذاة المواد الحيوية nanofiber (core-shell electrospinning) التي تسمح لدراسة هجرة الخلايا عن طريق تحوير الخصائص الميكانيكية أو الكيميائية12. يسمح نموذج الثقافة المشتركة الموصوف في هذه المقالة بفهم أفضل لكيفية هروب خلايا GBM على الخلايا العصبية من خلال تحديد مسارات جزيئية جديدة تشارك في هذه العملية.
Protocol
Representative Results
Discussion
جليوبلاستوماس غزو واسع النطاق parenchyma باستخدام وسائط مختلفة: الخيار المشترك للأوعية الدموية المحيطة بها, غزو الخلالي, أو الغزو على WMTs18. هذا الوضع الأخير لا يتميز بشكل جيد في الأدب بسبب صعوبة في العثور على نماذج مناسبة في المختبر أو في الجسم الحي المتعلقة بغزو WMT. هنا ، ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة ARC 2020 ، Ligue Contre le Cancer (Comite de la Gironde) ، ARTC ، خطة السرطان 2021 ، INCA PLBIO. ويدعم Alveole من قبل وكالة الوطنية دي لا ريشرش (غرانت لابيكس الدماغ ANR-10-LABX-43). جوريس غيون هو حاصل على زمالة من مستشفى جامعة تولوز (CHU تولوز).
Materials
| (3-aminopropyl) triethoxysilane | Sigma | 440140-100ML | The amino group is useful for the bioconjugation of mPEG-SVA |
| 96-well round-bottom plate | Sarstedt | 2582624 | Used to prepare spheroids |
| Accutase | Gibco | A11105-01 | Stored at -20 °C (long-term) or 4 °C (short-term), sphere dissociation enzyme |
| B27 | Gibco | 12587 | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Basic Fibroblast Growth Factor | Peprotech | 100-18B | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Countess Cell Counting ChamberSlides | Invitrogen | C10283 | Used to cell counting |
| Coverslips | Marienfeld | 111580 | Cell culture substrate |
| Dessicator cartridges | Sigma | Z363456-6EA | Used to reduce mosture during (3-aminopropyl) triethoxysilane treatment |
| DPBS 10x | Pan Biotech | P04-53-500 | Stored at 4 °C |
| Fiji software, MTrack2 macro | ImageJ | Used to analyze pictures | |
| Flask 75 cm² | Falcon | 10497302 | |
| HBSS | Sigma | H8264-500ML | |
| Heparin sodium | Sigma | H3149-100KU | Stored at 4 °C |
| Laminin | 114956-81-9 | Promotes neuronal adhesion | |
| Leonardo software | loading of envisioned micropatterns | ||
| MetaMorph Software | Molecular Devices LLC | NA | Microscopy automation software |
| Methylcellulose | Sigma | M0512 | Diluted in NBM for a 2% final concentration |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | Stored at 4 °C |
| Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA) | inverted microscope equipped with a motorized stage | ||
| Penicillin – Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Stored at 4 °C |
| PLPP | Alveole | PLPPclassic_1ml | Photoinitiator used to degrade the PEG brush |
| Poly(ethylene glycol)-Succinimidyl Valerate (mPEG-SVA) | Laysan Bio | VA-PEG-VA-5000-5g | Used as an anti-fouling coating |
| PRIMO | Alveole | PRIMO1 | Digital micromirror device (DMD)-based UV projection apparatus |
| Trypan blue 0.4% | ThermoFisher | T10282 | Used for cell counting |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ML | Used to detach adherent cells |
References
- Shergalis, A., Bankhead, A., Luesakul, U., Muangsin, N., Neamati, N. Current challenges and opportunities in treating glioblastoma. Pharmacology Reviews. 70, 412-445 (2018).
- Scherer, H. J. The forms of growth in gliomas and their practical significance. Brain. 63, 1-35 (1940).
- Zagzag, D., et al. Hypoxia- and vascular endothelial growth factor-induced stromal cell-derived factor-1α/CXCR4 expression in glioblastomas. American Journal of Pathology. 173, 545-560 (2008).
- Wang, J., et al. Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop. Nature Neurosciences. 22, 91-105 (2019).
- Venkataramani, V., et al. Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression. Nature. 573, 532-538 (2019).
- Venkatesh, H. S., et al. Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits. Nature. 573, 539-545 (2019).
- Boyé, K., et al. The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors. Nature Communications. 8, 1571 (2017).
- Daubon, T., et al. Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development. Nature Communications. 10, 1146 (2019).
- Gritsenko, P. G., et al. p120-catenin-dependent collective brain infiltration by glioma cell networks. Nature Cell Biology. 22, 97-107 (2020).
- Guyon, J., et al. A 3D spheroid model for glioblastoma. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (158), (2020).
- Strale, P. O., et al. Multiprotein Printing by Light?Induced Molecular Adsorption. Advanced Materials. , (2015).
- Rao, S. S., et al. Mimicking white matter tract topography using core-shell electrospun nanofibers to examine migration of malignant brain tumors. Biomaterials. 34, 5181-5190 (2013).
- Visweshwaran, S. P., Maritzen, T. A simple 3D cellular chemotaxis assay and analysis workflow suitable for a wide range of migrating cells. MethodsX. 6, 2807-2821 (2019).
- Qian, H., Sheetz, M. P., Elson, E. L. Single particle tracking. Analysis of diffusion and flow in two-dimensional systems. Biophysics Journal. 60, 910-921 (1991).
- Pasturel, A., Strale, P. -. O., Studer, V. Tailoring common hydrogels into 3D cell culture templates. Advance Healthcare Materials. 9, 2000519 (2020).
- Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145, 831-834 (2011).
- Clark, A. J., et al. Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination. Brain. 140, 898-913 (2017).
- Linkous, A., et al. Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids. Cell Reports. 26, 3203-3211 (2019).
- Han, M., et al. Interfering with long non-coding RNA MIR22HG processing inhibits glioblastoma progression through suppression of Wnt/β-catenin signalling. Brain. 143, 512-530 (2020).
