パターン化ニューロン上の神経膠芽腫幹細胞の共培養による移動と細胞相互作用の研究
Summary
ここでは、パターン化されたニューロン上で神経膠芽腫(GBM)の移行を分析するための使いやすい共培養アッセイを提示する。我々は、ニューロン上のGBM細胞移動を容易に定量化するためのFiJiソフトウェアでマクロを開発し、ニューロンがGBM細胞侵襲能力を変更することを観察した。
Abstract
グレードIV悪性神経膠腫(GBM)は、その積極的な特性のためにヒト癌の最も致命的なタイプの一つです。これらの腫瘍の遺伝学の有意な進歩にもかかわらず、GBM細胞が健康な脳のパレンチマに侵入する方法はよく理解されていない。特に、GBM細胞が異なる経路を介して心房に侵入することが示されている。本稿の主な関心事は、白物庫(WMT)に沿った経路である。腫瘍細胞と腹分神経細胞成分との相互作用は十分に特徴付けられていない。本明細書において、GBM細胞浸潤に対するニューロンの影響を評価する方法が記載されている。本論文は、ニューロン上のGBM幹細胞様細胞の移動を解析することによってWMTの侵入を模倣する、高度な共培養イン・ニューロンを紹介する。ニューロンの存在下でのGBM細胞の挙動は、オープンソースおよびフリーアクセスソフトウェアを用いた自動追跡手順を使用して監視される。この方法は、多くの用途、特に機能的および機械学的研究、ならびにニューロンに対するGBM細胞の移動をブロックすることができる薬理学的薬剤の影響を分析するのに有用である。
Introduction
GBMを含む原発性悪性神経膠腫は壊滅的な腫瘍であり、GBM患者の中生存率は12〜15ヶ月である。現在の治療は、大規模な腫瘍大量切除術と化学療法に依存し、放射線療法と相まって、生存率を数ヶ月しか延長していない。治療障害は、血液脳関門(BBB)を横切る薬物送達不良と、血管内腔、髄液、およびWMTs1に沿った侵襲的な成長に密接に関連している。血管内侵入は血管の共同オプションとも呼ばれ、よく研究されたプロセスであり、分子機構が解明され始めています。しかし、WMTに沿ったGBM細胞浸潤のプロセスは十分に理解されていません。腫瘍細胞は、シェラーの二次構造に沿って健康な脳に移行する2.確かに、ほぼ1世紀前、ハンス・ヨアヒム・シェラーは、現在、脳血管内サテリトーシス、血管内サテリアトーシス、亜脈広がり、WMTに沿った侵略と呼ばれているGBMの侵襲的なルートを説明しました(図1A)。
一部のケモカインおよびその受容体は、例えば、間質細胞由来因子-1α(SDF1α)およびC-X-Cモチーフケモカイン受容体4(CXCR4)など、血管内皮増殖因子(VEGF4)には関与していないが、WMT浸潤因子3に関与しているようである。さらに最近では、細胞内NOTCH1-SOX2軸がGBM細胞4のWMT浸潤において重要な経路であることが示されている。著者らは、GBM幹細胞が部分的に非髄鞘のニューロン上で脳のパレンチマに侵入する方法を説明し、GBM細胞によるミエリン鞘の破壊を示唆した。2019年に3つの論文が連続してネイチャージャーナルに掲載され、グリオーマ開発における電気活動の役割を強調したマイルストーンに達しました5,6.Monjeと共同研究者による精細な研究は、神経膠腫の発達を促進するニューロリジン-3の分泌における電気活動の中心的な役割に光を当てた。
ウィンクラーと共同研究者は、侵襲的なステップにおいて重要であるGBM細胞(マイクロチューブ)間の接続、および最近、新たに記述された神経神経膠腫シナプスを介したGBM細胞とニューロン間の相互作用について説明した。これらの構造は、α-アミノ-3-ヒドロキシ-メチル-4-イソキサゾアプロピオン酸(AMPA)受容体のグルタミン酸刺激を好み、腫瘍の発生と浸潤を促進するGBM細胞膜に位置する。腫瘍細胞浸潤は、GBM患者において観察される転移または遠隔二次病巣の普及における中心的なプロセスである。トロンボシン−1のようなGBMの浸潤において重要であることがいくつかの要因が同定されている、変換成長因子β(TGFβ調節されたマトリセルタンパク質、またはケモカイン受容体CXCR3)7、8。
ここでは、ニューロンがラミニンの軌跡にパターン化され、GBM細胞が単一細胞またはスフェロイドとして播種されるGBMの浸潤を研究するための単純化されたバイオミメティックモデルが説明されている(図1B)。2つの実験設定は、GBM9、10、11で観察されるニューロンへの侵入を再現することを目的としています。このようなモデルは、機械的または化学的特性12を調節することによって細胞移動を研究することを可能にするアライメントナノファイバー生体材料(コアシェルエレクトロスピニング)として過去に開発されてきた。この記事で説明する共培養モデルは、このプロセスに関与する新しい分子経路を定義することによって、GBM細胞がニューロン上で脱出する方法をよりよく理解することを可能にする。
Protocol
Representative Results
Discussion
神経膠芽腫は、周囲の血管のコオプション、間質の侵略、またはWMTs18への侵入など、さまざまなモードを使用して広くパレンチマに侵入する。この後者のモードは、WMTの侵略に関連するインビトロまたはインビボモデルで適切な発見に困難があるため、文献で十分に特徴付けられていない。ここでは、培養げっ歯類ニューロンをラミニンコーティングされた表?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究はフォンダシオンARC 2020、リーグ・コントル・ル・ガン(コミテ・ド・ラ・ジロンド)、ARTC、プランガン2021、INCA PLBIOによって支えられていました。アルベオールはアジェンス・ナショナル・デ・ラ・レシェルシュ(グラント・ラベックス・ブレインANR-10-LABX-43)によってサポートされています。ジョリス・ギヨンはトゥールーズ大学病院(CHUトゥールーズ)からフェローシップを受けています。
Materials
| (3-aminopropyl) triethoxysilane | Sigma | 440140-100ML | The amino group is useful for the bioconjugation of mPEG-SVA |
| 96-well round-bottom plate | Sarstedt | 2582624 | Used to prepare spheroids |
| Accutase | Gibco | A11105-01 | Stored at -20 °C (long-term) or 4 °C (short-term), sphere dissociation enzyme |
| B27 | Gibco | 12587 | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Basic Fibroblast Growth Factor | Peprotech | 100-18B | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Countess Cell Counting ChamberSlides | Invitrogen | C10283 | Used to cell counting |
| Coverslips | Marienfeld | 111580 | Cell culture substrate |
| Dessicator cartridges | Sigma | Z363456-6EA | Used to reduce mosture during (3-aminopropyl) triethoxysilane treatment |
| DPBS 10x | Pan Biotech | P04-53-500 | Stored at 4 °C |
| Fiji software, MTrack2 macro | ImageJ | Used to analyze pictures | |
| Flask 75 cm² | Falcon | 10497302 | |
| HBSS | Sigma | H8264-500ML | |
| Heparin sodium | Sigma | H3149-100KU | Stored at 4 °C |
| Laminin | 114956-81-9 | Promotes neuronal adhesion | |
| Leonardo software | loading of envisioned micropatterns | ||
| MetaMorph Software | Molecular Devices LLC | NA | Microscopy automation software |
| Methylcellulose | Sigma | M0512 | Diluted in NBM for a 2% final concentration |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | Stored at 4 °C |
| Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA) | inverted microscope equipped with a motorized stage | ||
| Penicillin – Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Stored at 4 °C |
| PLPP | Alveole | PLPPclassic_1ml | Photoinitiator used to degrade the PEG brush |
| Poly(ethylene glycol)-Succinimidyl Valerate (mPEG-SVA) | Laysan Bio | VA-PEG-VA-5000-5g | Used as an anti-fouling coating |
| PRIMO | Alveole | PRIMO1 | Digital micromirror device (DMD)-based UV projection apparatus |
| Trypan blue 0.4% | ThermoFisher | T10282 | Used for cell counting |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ML | Used to detach adherent cells |
References
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