Co-coltura di cellule simili a staminali di glioblastoma su neuroni modellati per studiare la migrazione e le interazioni cellulari
Summary
Qui presentiamo un saggio di co-coltura facile da usare per analizzare la migrazione del glioblastoma (GBM) sui neuroni modellati. Abbiamo sviluppato una macro nel software FiJi per una facile quantificazione della migrazione cellulare GBM sui neuroni, e abbiamo osservato che i neuroni modificano la capacità invasiva delle cellule GBM.
Abstract
I glioblastomi (GBM), gliomi maligni di IV grado, sono uno dei tipi più leciti di cancro umano a causa delle loro caratteristiche aggressive. Nonostante i significativi progressi nella genetica di questi tumori, come le cellule GBM invadano il parenchima cerebrale sano non è ben compreso. In particolare, è stato dimostrato che le cellule GBM invadono lo spazio peritumorale attraverso percorsi diversi; l’interesse principale di questo documento è il percorso lungo i tratti di materia bianca (WMT). Le interazioni delle cellule tumorali con i componenti delle cellule nervose peritumorali non sono ben caratterizzate. Qui è stato descritto un metodo che valuta l’impatto dei neuroni sull’invasione cellulare del GBM. Questo articolo presenta un saggio avanzato di co-coltura in vitro che imita l’invasione wmt analizzando la migrazione delle cellule staminali GBM sui neuroni. Il comportamento delle cellule GBM in presenza di neuroni viene monitorato utilizzando una procedura di tracciamento automatizzato con software open source e ad accesso libero. Questo metodo è utile per molte applicazioni, in particolare, per studi funzionali e meccanicistici nonché per analizzare gli effetti degli agenti farmacologici che possono bloccare la migrazione cellulare GBM sui neuroni.
Introduction
I gliomi maligni primari, compresi i GBM, sono tumori devastanti, con un tasso medio di sopravvivenza da 12 a 15 mesi riportato per i pazienti affetti da GBM. La terapia attuale si basa su una grande resezione della massa tumorale e sulla chemioterapia accoppiata alla radioterapia, che estende il tasso di sopravvivenza solo di pochi mesi. I fallimenti terapeutici sono intimamente correlati allo scarso parto di farmaci attraverso la barriera ematica (BBB) e alla crescita invasiva in spazi perivascolari, meningi e lungo le WMT1. L’invasione perivascolare, chiamata anche co-opzione vascolare, è un processo ben studiato, e i meccanismi molecolari stanno iniziando ad essere chiariti; tuttavia, il processo di invasione cellulare GBM lungo le MMM non è ben compreso. Le cellule tumorali migrano nel cervello sano lungo le strutture secondarie2 diScherer . Infatti, quasi un secolo fa, Hans-Joachim Scherer descrisse le rotte invasive del GBM, che ora sono indicate come satellitosi perineuronale, satellitosi perivascolare, diffusione subpiale e invasione lungo la WMT (Figura 1A).
Alcune chemiochine e i loro recettori, come il fattore 1α derivato dalle cellule stromali (SDF1α) e il recettore della chemiochina con motivo C-X-C 4 (CXCR4), ma non il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF), sembrano essere implicati nell’invasione WMT3. Più recentemente, un asse TRANSCELLULAR NOTCH1-SOX2 ha dimostrato di essere un percorso importante nell’invasione WMT delle cellule GBM4. Gli autori hanno descritto come le cellule staminali GBM invadano il parenchima cerebrale su neuroni parzialmente non mielinati, suggerendo la distruzione delle suone di mielina da parte delle cellule GBM. Una pietra miliare è stata raggiunta nel 2019 quando tre articoli sono stati pubblicati inconsacrazione sulla rivista Nature, sottolineando il ruolo dell’attività elettrica nello sviluppo del glioma5,6. Il lavoro seminale di Monje e collaboratori fa luce sul ruolo centrale dell’attività elettrica nella secrezione di neuroligin-3, che promuove lo sviluppo del glioma.
Winkler e collaboratori hanno descritto le connessioni tra cellule GBM (microtubi) cruciali in passaggi invasivi e, ultimamente, interazioni tra cellule GBM e neuroni attraverso sinapsi di neuroglioma appena descritte. Queste strutture favoriscono la stimolazione glutattergica dei recettori dell’acido α-ammino-3-idrossi-5-metil-4-isoxazolepropionico (AMPA) situati nella membrana cellulare GBM, che promuove lo sviluppo e l’invasione del tumore. L’invasione delle cellule tumorali è un processo centrale nella diffusione di metastasi o focolai secondari distanti, come osservato nei pazienti affetti da GBM. Diversi fattori sono stati identificati come importanti nell’invasione gbm come la trombospondina-1, un fattore di crescita beta trasformante (proteina matricellulare regolata da TGFβ o il recettore delle chemiochine CXCR3)7,8.
Qui, è stato descritto un modello biomimetico semplificato per lo studio dell’invasione GBM, in cui i neuroni sono modellati su tracce di laminina, e le cellule GBM sono seminate su di essa, come singole cellule o come sferoidi (Figura 1B). Le due impostazioni sperimentali sono finalizzate a ricapitolare l’invasione sui neuroni, che si osserva in GBM9,10,11. Tali modelli sono stati sviluppati in passato come biomateriali in nanofibra allineati (elettrofilatura a guscio centrale) che consentono di studiare la migrazione cellulare modulando le proprietà meccanicheo chimiche 12. Il modello di co-coltura descritto in questo articolo consente una migliore comprensione di come le cellule GBM fuggono sui neuroni definendo nuove vie molecolari coinvolte in questo processo.
Protocol
Representative Results
Discussion
I glioblastomi invadono ampiamente il parenchima usando diverse modalità: co-opzione dei vasi sanguigni circostanti, invasione interstiziale o invasione sulleRM 18. Quest’ultima modalità non è ben caratterizzata in letteratura a causa della difficoltà di trovare modelli adatti in vitro o in vivo relativi all’invasione WMT. Qui, è stato proposto un modello semplificato in cui i neuroni roditori coltivati sono stati modellati su superfici rivestite di laminina, e le cellule fl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da Fondation ARC 2020, Ligue Contre le Cancer (Comite de la Gironde), ARTC, Plan Cancer 2021, INCA PLBIO. Alveole è supportato da Agence Nationale de la Recherche (Grant Labex BRAIN ANR-10-LABX-43). Joris Guyon è un destinatario di una borsa di studio presso l’ospedale universitario di Tolosa (CHU Toulouse).
Materials
| (3-aminopropyl) triethoxysilane | Sigma | 440140-100ML | The amino group is useful for the bioconjugation of mPEG-SVA |
| 96-well round-bottom plate | Sarstedt | 2582624 | Used to prepare spheroids |
| Accutase | Gibco | A11105-01 | Stored at -20 °C (long-term) or 4 °C (short-term), sphere dissociation enzyme |
| B27 | Gibco | 12587 | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Basic Fibroblast Growth Factor | Peprotech | 100-18B | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Countess Cell Counting ChamberSlides | Invitrogen | C10283 | Used to cell counting |
| Coverslips | Marienfeld | 111580 | Cell culture substrate |
| Dessicator cartridges | Sigma | Z363456-6EA | Used to reduce mosture during (3-aminopropyl) triethoxysilane treatment |
| DPBS 10x | Pan Biotech | P04-53-500 | Stored at 4 °C |
| Fiji software, MTrack2 macro | ImageJ | Used to analyze pictures | |
| Flask 75 cm² | Falcon | 10497302 | |
| HBSS | Sigma | H8264-500ML | |
| Heparin sodium | Sigma | H3149-100KU | Stored at 4 °C |
| Laminin | 114956-81-9 | Promotes neuronal adhesion | |
| Leonardo software | loading of envisioned micropatterns | ||
| MetaMorph Software | Molecular Devices LLC | NA | Microscopy automation software |
| Methylcellulose | Sigma | M0512 | Diluted in NBM for a 2% final concentration |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | Stored at 4 °C |
| Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA) | inverted microscope equipped with a motorized stage | ||
| Penicillin – Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Stored at 4 °C |
| PLPP | Alveole | PLPPclassic_1ml | Photoinitiator used to degrade the PEG brush |
| Poly(ethylene glycol)-Succinimidyl Valerate (mPEG-SVA) | Laysan Bio | VA-PEG-VA-5000-5g | Used as an anti-fouling coating |
| PRIMO | Alveole | PRIMO1 | Digital micromirror device (DMD)-based UV projection apparatus |
| Trypan blue 0.4% | ThermoFisher | T10282 | Used for cell counting |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ML | Used to detach adherent cells |
References
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