Här presenterar vi en lättanvänd co-culture analys för att analysera glioblastom (GBM) migration på mönstrade nervceller. Vi utvecklade ett makro i FiJi programvara för enkel kvantifiering av GBM cell migrering på nervceller, och observerade att nervceller ändra GBM cell invasiv kapacitet.
Glioblastomas (GBMs), klass IV maligna gliomas, är en av de dödligaste typerna av mänsklig cancer på grund av deras aggressiva egenskaper. Trots betydande framsteg i genetiken hos dessa tumörer, hur GBM celler invaderar den friska hjärnan parenkym är inte väl förstådd. Det har visat sig att GBM-celler invaderar det peritumorala utrymmet via olika vägar; Huvudintresset för detta papper är rutten längs vit materiaområden (WMP). Interaktionerna mellan tumörceller och peritumorala nervcellskomponenter är inte väl karakteriserade. Häri har en metod beskrivits som utvärderar neurons inverkan på GBM cell invasion. Detta dokument presenterar en avancerad co-culture in vitro-analys som efterliknar WMT invasion genom att analysera migreringen av GBM stamliknande celler på nervceller. Beteendet hos GBM-celler i närvaro av nervceller övervakas med hjälp av en automatiserad spårningsprocedur med programvara med öppen källkod och fri åtkomst. Denna metod är användbar för många tillämpningar, särskilt för funktionella och mekanistiska studier samt för att analysera effekterna av farmakologiska medel som kan blockera GBM-cellmigration på nervceller.
Primära maligna gliomas, inklusive GBMs, är förödande tumörer, med en medelstor överlevnadsgrad på 12 till 15 månader rapporteras för GBM patienter. Nuvarande terapi förlitar sig på stora tumör massa samband och kemoterapi i kombination med strålbehandling, som bara förlänger överlevnaden med några månader. Terapeutiska misslyckanden är intimt relaterade till dålig läkemedelstillförsel över blod – hjärnbarriären (BBB) och till invasiv tillväxt i perivaskulära utrymmen, hjärnhinnor och längs WMTs1. Perivaskulär invasion, även kallad Vaskulär co-option, är en välstuderad process, och de molekylära mekanismerna börjar belysas; Processen med GBM-cellinvasion längs WMTs är dock inte väl förstådd. Tumörceller migrerar in i den friska hjärnan längs Scherers sekundära strukturer2. För nästan ett sekel sedan beskrev Hans-Joachim Scherer de invasiva vägarna för GBM, som nu kallas perineuronal satellitosis, perivaskulär satellitosis, subpial spread och invasion längs WMT (Figur 1A).
Vissa chemokiner och deras receptorer, såsom stromal cell-härledda faktor-1α (SDF1α) och C-X-C motiv chemokine receptor 4 (CXCR4), men inte Vaskulär endotel tillväxtfaktor (VEGF), verkar vara inblandad i WMT invasion3. På senare tid har en transcellulär NOTCH1-SOX2-axel visat sig vara en viktig väg i WMT invasion av GBM celler4. Författarna beskrev hur GBM stamliknande celler invaderar hjärnan parenkym på delvis unmyelinated nervceller, vilket tyder på förstörelsen av myelin mantlar av GBM celler. En milstolpe nåddes 2019 när tre artiklar publicerades i tidskriften Nature, vilket understryker den elektriska aktivitetens roll i gliomutveckling5,6. Monjes och dess medarbetares viktiga arbete belyser den elektriska aktivitetens centrala roll i utsöndring av neuroligin-3, vilket främjar gliomutveckling.
Winkler och samarbetspartners beskrev samband mellan GBM-celler (mikrorör) som avgörande i invasiva steg, och på senare tid interaktioner mellan GBM-celler och nervceller via nyligen beskrivna neuroglioma synapser. Dessa strukturer gynnar glutamatergic stimulering av α-amino-3-hydroxy-5-metyl-4-isoxazolpropionsyra (AMPA) receptorer ligger vid GBM cellmembran, som främjar tumör utveckling och invasion. Tumör cell invasion är en central process i spridningen av metastaser eller avlägsna sekundära högborgar, som observerats hos GBM patienter. Flera faktorer har identifierats som viktiga i GBM invasion såsom trombospondin-1, en transformerande tillväxtfaktor beta (TGFβ-reglerat matricellular protein, eller chemokin receptorn CXCR3)7,8.
Här har en förenklad biomimetisk modell beskrivits för att studera GBM-invasion, där nervceller mönstras på spår av laminin, och GBM-celler sås på den, som encelliga celler eller som sfäroider (Figur 1B). De två experimentella inställningarna syftar till att rekapitituera invasion på nervceller, vilket observeras i GBM9,10,11. Sådana modeller har tidigare utvecklats som justerade nanofiberbiomaterial (kärnskalselektrospinning) som gör det möjligt att studera cellmigration genom att modulera mekaniska eller kemiska egenskaper12. Den samkulturmodell som beskrivs i den här artikeln möjliggör en bättre förståelse för hur GBM-celler flyr på nervceller genom att definiera nya molekylära vägar som är involverade i denna process.
Glioblastomas invaderar parenkymen i stor utsträckning genom att använda olika lägen: co-option av omgivande blodkärl, interstitiell invasion eller invasion på WMTs18. Detta senare läge är inte väl karakteriserat i litteraturen på grund av svårigheten att hitta lämpliga in vitro- eller in vivo-modeller relaterade till WMT-invasion. Här har en förenklad modell föreslagits där odlade gnagare neuroner var mönstrade på lamininbelagda ytor, och fluorescerande GBM stam…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Fondation ARC 2020, Ligue Contre le Cancer (Comite de la Gironde), ARTC, Plan Cancer 2021, INCA PLBIO. Alveole stöds av Agence Nationale de la Recherche (Grant Labex BRAIN ANR-10-LABX-43). Joris Guyon är stipendiat från Toulouse Universitetssjukhus (CHU Toulouse).
(3-aminopropyl) triethoxysilane | Sigma | 440140-100ML | The amino group is useful for the bioconjugation of mPEG-SVA |
96-well round-bottom plate | Sarstedt | 2582624 | Used to prepare spheroids |
Accutase | Gibco | A11105-01 | Stored at -20 °C (long-term) or 4 °C (short-term), sphere dissociation enzyme |
B27 | Gibco | 12587 | Stored at -20 °C, defrost before use |
Basic Fibroblast Growth Factor | Peprotech | 100-18B | Stored at -20 °C, defrost before use |
Countess Cell Counting ChamberSlides | Invitrogen | C10283 | Used to cell counting |
Coverslips | Marienfeld | 111580 | Cell culture substrate |
Dessicator cartridges | Sigma | Z363456-6EA | Used to reduce mosture during (3-aminopropyl) triethoxysilane treatment |
DPBS 10x | Pan Biotech | P04-53-500 | Stored at 4 °C |
Fiji software, MTrack2 macro | ImageJ | Used to analyze pictures | |
Flask 75 cm² | Falcon | 10497302 | |
HBSS | Sigma | H8264-500ML | |
Heparin sodium | Sigma | H3149-100KU | Stored at 4 °C |
Laminin | 114956-81-9 | Promotes neuronal adhesion | |
Leonardo software | loading of envisioned micropatterns | ||
MetaMorph Software | Molecular Devices LLC | NA | Microscopy automation software |
Methylcellulose | Sigma | M0512 | Diluted in NBM for a 2% final concentration |
Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | Stored at 4 °C |
Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA) | inverted microscope equipped with a motorized stage | ||
Penicillin – Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Stored at 4 °C |
PLPP | Alveole | PLPPclassic_1ml | Photoinitiator used to degrade the PEG brush |
Poly(ethylene glycol)-Succinimidyl Valerate (mPEG-SVA) | Laysan Bio | VA-PEG-VA-5000-5g | Used as an anti-fouling coating |
PRIMO | Alveole | PRIMO1 | Digital micromirror device (DMD)-based UV projection apparatus |
Trypan blue 0.4% | ThermoFisher | T10282 | Used for cell counting |
Trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ML | Used to detach adherent cells |