Summary

Samkultur av Glioblastoma stamliknande celler på mönstrade nervceller för att studera migration och cellulära interaktioner

Published: February 24, 2021
doi:

Summary

Här presenterar vi en lättanvänd co-culture analys för att analysera glioblastom (GBM) migration på mönstrade nervceller. Vi utvecklade ett makro i FiJi programvara för enkel kvantifiering av GBM cell migrering på nervceller, och observerade att nervceller ändra GBM cell invasiv kapacitet.

Abstract

Glioblastomas (GBMs), klass IV maligna gliomas, är en av de dödligaste typerna av mänsklig cancer på grund av deras aggressiva egenskaper. Trots betydande framsteg i genetiken hos dessa tumörer, hur GBM celler invaderar den friska hjärnan parenkym är inte väl förstådd. Det har visat sig att GBM-celler invaderar det peritumorala utrymmet via olika vägar; Huvudintresset för detta papper är rutten längs vit materiaområden (WMP). Interaktionerna mellan tumörceller och peritumorala nervcellskomponenter är inte väl karakteriserade. Häri har en metod beskrivits som utvärderar neurons inverkan på GBM cell invasion. Detta dokument presenterar en avancerad co-culture in vitro-analys som efterliknar WMT invasion genom att analysera migreringen av GBM stamliknande celler på nervceller. Beteendet hos GBM-celler i närvaro av nervceller övervakas med hjälp av en automatiserad spårningsprocedur med programvara med öppen källkod och fri åtkomst. Denna metod är användbar för många tillämpningar, särskilt för funktionella och mekanistiska studier samt för att analysera effekterna av farmakologiska medel som kan blockera GBM-cellmigration på nervceller.

Introduction

Primära maligna gliomas, inklusive GBMs, är förödande tumörer, med en medelstor överlevnadsgrad på 12 till 15 månader rapporteras för GBM patienter. Nuvarande terapi förlitar sig på stora tumör massa samband och kemoterapi i kombination med strålbehandling, som bara förlänger överlevnaden med några månader. Terapeutiska misslyckanden är intimt relaterade till dålig läkemedelstillförsel över blod – hjärnbarriären (BBB) och till invasiv tillväxt i perivaskulära utrymmen, hjärnhinnor och längs WMTs1. Perivaskulär invasion, även kallad Vaskulär co-option, är en välstuderad process, och de molekylära mekanismerna börjar belysas; Processen med GBM-cellinvasion längs WMTs är dock inte väl förstådd. Tumörceller migrerar in i den friska hjärnan längs Scherers sekundära strukturer2. För nästan ett sekel sedan beskrev Hans-Joachim Scherer de invasiva vägarna för GBM, som nu kallas perineuronal satellitosis, perivaskulär satellitosis, subpial spread och invasion längs WMT (Figur 1A).

Vissa chemokiner och deras receptorer, såsom stromal cell-härledda faktor-1α (SDF1α) och C-X-C motiv chemokine receptor 4 (CXCR4), men inte Vaskulär endotel tillväxtfaktor (VEGF), verkar vara inblandad i WMT invasion3. På senare tid har en transcellulär NOTCH1-SOX2-axel visat sig vara en viktig väg i WMT invasion av GBM celler4. Författarna beskrev hur GBM stamliknande celler invaderar hjärnan parenkym på delvis unmyelinated nervceller, vilket tyder på förstörelsen av myelin mantlar av GBM celler. En milstolpe nåddes 2019 när tre artiklar publicerades i tidskriften Nature, vilket understryker den elektriska aktivitetens roll i gliomutveckling5,6. Monjes och dess medarbetares viktiga arbete belyser den elektriska aktivitetens centrala roll i utsöndring av neuroligin-3, vilket främjar gliomutveckling.

Winkler och samarbetspartners beskrev samband mellan GBM-celler (mikrorör) som avgörande i invasiva steg, och på senare tid interaktioner mellan GBM-celler och nervceller via nyligen beskrivna neuroglioma synapser. Dessa strukturer gynnar glutamatergic stimulering av α-amino-3-hydroxy-5-metyl-4-isoxazolpropionsyra (AMPA) receptorer ligger vid GBM cellmembran, som främjar tumör utveckling och invasion. Tumör cell invasion är en central process i spridningen av metastaser eller avlägsna sekundära högborgar, som observerats hos GBM patienter. Flera faktorer har identifierats som viktiga i GBM invasion såsom trombospondin-1, en transformerande tillväxtfaktor beta (TGFβ-reglerat matricellular protein, eller chemokin receptorn CXCR3)7,8.

Här har en förenklad biomimetisk modell beskrivits för att studera GBM-invasion, där nervceller mönstras på spår av laminin, och GBM-celler sås på den, som encelliga celler eller som sfäroider (Figur 1B). De två experimentella inställningarna syftar till att rekapitituera invasion på nervceller, vilket observeras i GBM9,10,11. Sådana modeller har tidigare utvecklats som justerade nanofiberbiomaterial (kärnskalselektrospinning) som gör det möjligt att studera cellmigration genom att modulera mekaniska eller kemiska egenskaper12. Den samkulturmodell som beskrivs i den här artikeln möjliggör en bättre förståelse för hur GBM-celler flyr på nervceller genom att definiera nya molekylära vägar som är involverade i denna process.

Protocol

Informerat skriftligt samtycke erhölls från alla patienter (från Haukeland Hospital, Bergen, Norge, enligt lokala etikkommittébestämmelser). Detta protokoll följer riktlinjerna från Bordeaux University human- och animaliska forskningsetiska kommittéer. Gravida råttor inhysdes och behandlades i djuranläggningen vid Bordeaux University. Dödshjälp av en E18-tidsförd gång gravid råtta utfördes med hjälp av CO2. Alla djurförsök har gjorts i enlighet med de institutionella riktlinjerna och godkän…

Representative Results

Mönstrade nervceller co-cultured med fluorescerande GBM celler utarbetades som beskrivs i protokoll avsnittet och spårning experiment utfördes. GBM-celler ändrade snabbt sin form medan de migrerade på nervcellerna (Bild 1B: panel 6 och Video 1). Celler migrerade längs neuronala förlängningar, i en slumpmässig rörelse (Video 1). Fluorescerande GBM-celler och icke-fluorescerande nervceller kan lätt urskiljas, och detta gjorde det m?…

Discussion

Glioblastomas invaderar parenkymen i stor utsträckning genom att använda olika lägen: co-option av omgivande blodkärl, interstitiell invasion eller invasion på WMTs18. Detta senare läge är inte väl karakteriserat i litteraturen på grund av svårigheten att hitta lämpliga in vitro- eller in vivo-modeller relaterade till WMT-invasion. Här har en förenklad modell föreslagits där odlade gnagare neuroner var mönstrade på lamininbelagda ytor, och fluorescerande GBM stam…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes av Fondation ARC 2020, Ligue Contre le Cancer (Comite de la Gironde), ARTC, Plan Cancer 2021, INCA PLBIO. Alveole stöds av Agence Nationale de la Recherche (Grant Labex BRAIN ANR-10-LABX-43). Joris Guyon är stipendiat från Toulouse Universitetssjukhus (CHU Toulouse).

Materials

(3-aminopropyl) triethoxysilane Sigma 440140-100ML The amino group is useful for the bioconjugation of mPEG-SVA
96-well round-bottom plate Sarstedt 2582624 Used to prepare spheroids
Accutase Gibco A11105-01 Stored at -20 °C (long-term) or 4 °C (short-term), sphere dissociation enzyme
B27 Gibco 12587 Stored at -20 °C, defrost before use
Basic Fibroblast Growth Factor Peprotech 100-18B Stored at -20 °C, defrost before use
Countess Cell Counting ChamberSlides Invitrogen C10283 Used to cell counting
Coverslips Marienfeld 111580 Cell culture substrate
Dessicator cartridges Sigma Z363456-6EA Used to reduce mosture during (3-aminopropyl) triethoxysilane treatment
DPBS 10x Pan Biotech P04-53-500 Stored at 4 °C
Fiji software, MTrack2 macro ImageJ Used to analyze pictures
Flask 75 cm² Falcon 10497302
HBSS Sigma H8264-500ML
Heparin sodium Sigma H3149-100KU Stored at 4 °C
Laminin 114956-81-9 Promotes neuronal adhesion
Leonardo software loading of envisioned micropatterns
MetaMorph Software  Molecular Devices LLC NA Microscopy automation software
Methylcellulose Sigma M0512 Diluted in NBM for a 2% final concentration
Neurobasal medium Gibco 21103-049 Stored at 4 °C
Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA) inverted microscope equipped with a motorized stage 
Penicillin – Streptomycin Gibco 15140-122 Stored at 4 °C
PLPP Alveole PLPPclassic_1ml Photoinitiator used to degrade the PEG brush
Poly(ethylene glycol)-Succinimidyl Valerate (mPEG-SVA) Laysan Bio VA-PEG-VA-5000-5g Used as an anti-fouling coating
PRIMO Alveole PRIMO1 Digital micromirror device (DMD)-based UV projection apparatus
Trypan blue 0.4% ThermoFisher T10282 Used for cell counting
Trypsin-EDTA Sigma T4049-100ML Used to detach adherent cells

References

  1. Shergalis, A., Bankhead, A., Luesakul, U., Muangsin, N., Neamati, N. Current challenges and opportunities in treating glioblastoma. Pharmacology Reviews. 70, 412-445 (2018).
  2. Scherer, H. J. The forms of growth in gliomas and their practical significance. Brain. 63, 1-35 (1940).
  3. Zagzag, D., et al. Hypoxia- and vascular endothelial growth factor-induced stromal cell-derived factor-1α/CXCR4 expression in glioblastomas. American Journal of Pathology. 173, 545-560 (2008).
  4. Wang, J., et al. Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop. Nature Neurosciences. 22, 91-105 (2019).
  5. Venkataramani, V., et al. Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression. Nature. 573, 532-538 (2019).
  6. Venkatesh, H. S., et al. Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits. Nature. 573, 539-545 (2019).
  7. Boyé, K., et al. The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors. Nature Communications. 8, 1571 (2017).
  8. Daubon, T., et al. Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development. Nature Communications. 10, 1146 (2019).
  9. Gritsenko, P. G., et al. p120-catenin-dependent collective brain infiltration by glioma cell networks. Nature Cell Biology. 22, 97-107 (2020).
  10. Guyon, J., et al. A 3D spheroid model for glioblastoma. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (158), (2020).
  11. Strale, P. O., et al. Multiprotein Printing by Light?Induced Molecular Adsorption. Advanced Materials. , (2015).
  12. Rao, S. S., et al. Mimicking white matter tract topography using core-shell electrospun nanofibers to examine migration of malignant brain tumors. Biomaterials. 34, 5181-5190 (2013).
  13. Visweshwaran, S. P., Maritzen, T. A simple 3D cellular chemotaxis assay and analysis workflow suitable for a wide range of migrating cells. MethodsX. 6, 2807-2821 (2019).
  14. Qian, H., Sheetz, M. P., Elson, E. L. Single particle tracking. Analysis of diffusion and flow in two-dimensional systems. Biophysics Journal. 60, 910-921 (1991).
  15. Pasturel, A., Strale, P. -. O., Studer, V. Tailoring common hydrogels into 3D cell culture templates. Advance Healthcare Materials. 9, 2000519 (2020).
  16. Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145, 831-834 (2011).
  17. Clark, A. J., et al. Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination. Brain. 140, 898-913 (2017).
  18. Linkous, A., et al. Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids. Cell Reports. 26, 3203-3211 (2019).
  19. Han, M., et al. Interfering with long non-coding RNA MIR22HG processing inhibits glioblastoma progression through suppression of Wnt/β-catenin signalling. Brain. 143, 512-530 (2020).

Play Video

Cite This Article
Guyon, J., Strale, P., Romero-Garmendia, I., Bikfalvi, A., Studer, V., Daubon, T. Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions. J. Vis. Exp. (168), e62213, doi:10.3791/62213 (2021).

View Video