Summary
هنا ، يتم وصف بروتوكول منخفض التكلفة ويمكن الوصول إليه لتقييم استعادة الصدمة الباردة للفراشات في ظل الظروف البيئية المحيطة.
Abstract
علم وظائف الأعضاء الإيكولوجية، ولا سيما من ectotherms، تزداد أهمية في هذا العالم المتغير كما أنه يستخدم مقاييس الأنواع والصفات البيئية لاستكشاف التفاعلات بين الكائنات الحية والمناطق المحيطة بها لفهم أفضل لبقائها واللياقة البدنية. إن المقايسات الحرارية التقليدية مكلفة من حيث الوقت والمال والمعدات، وبالتالي غالبا ما تقتصر على أحجام العينات الصغيرة والأنواع القليلة. يقدم هنا بروتوكول جديد يولد بيانات مفصلة عن السلوك الفردي وعلم وظائف الأعضاء للحشرات الأرضية الكبيرة ، باستخدام مثال الفراشات. تصف هذه الورقة طرق اختبار استعادة الصدمات الباردة التي يمكن إجراؤها في الميدان في ظل الظروف البيئية المحيطة ولا تتطلب معدات مختبرية مكلفة. وقد استخدمت هذه الطريقة لفهم استراتيجية الاستجابة والتعافي للصدمة الباردة للفراشات الاستوائية ، وتوليد بيانات المستوى الفردي عبر مجتمعات الفراشات بأكملها. ويمكن استخدام هذه الأساليب في كل من البيئات الميدانية النائية والفصول الدراسية ويمكن استخدامها لتوليد البيانات الفسيولوجية ذات الصلة بيئيا وكأداة تعليمية.
Introduction
التكامل بين علم وظائف الأعضاء الحرارية والبيئة في أواخر 1970s وأوائل 1980s1،2 أطلقت مجال علم وظائف الأعضاء الإيكولوجية. دراسات حرارية واسعة النطاق أجريت على ectotherms تسليط الضوء على التآزر الإيكولوجية الفسيولوجية عبر سياقات متنوعة الإيكولوجية التطورية3،4،5. وقد استعادت البحوث على الفسيولوجيا الحرارية للكائنات ectothermic الاهتمام في الآونة الأخيرة في مواجهة تغير المناخ والمناظر الطبيعية الحرارية المتغيرة في جميع أنحاء العالم6،7. بالإضافة إلى الدراسات الاسترشادية في المجال الأكاديمي لعلم وظائف الأعضاء الإيكولوجية، يمكن أن تكون مقايسات الفسيولوجيا الحرارية متاحة على نطاق واسع للباحثين ويمكن أن تكون بمثابة نهج تعليمي عملي لجميع المستويات. مكونات الأداء الحراري، بما في ذلك الحدود الحرارية وآثار الصدمات في درجات الحرارة، هي أساسية للبيئة والسلوك وتاريخ حياةالحيوانات 8،9.
على وجه التحديد ، يتم استخدام ecototherms لمعالجة مسائل علم وظائف الأعضاء ، حيث يملي endothermy وجود صلة لا تنفصم بين درجة الحرارة المحيطة ودرجة حرارة الكائن الحي. غالبا ما تكون مجموعة درجات الحرارة التي يمكن للكائنات الحية تحملها (الحد الأدنى الحراري الحرج إلى النطاق الحراري الأقصى) ودرجات الحرارة التي يتم فيها تعظيم سلوكياتها وملاءمتها (optima الحرارية) متجذرة في العمليات الإيكولوجية والتطورية. هذه الصفات الفسيولوجية ذات أهمية متزايدة حيث أن درجات الحرارة ، سواء الوسائل أو التطرف ، تزداد10. على سبيل المثال ، أثرت التغيرات اللاأحيائية ، بما في ذلك ارتفاع درجات الحرارة ، التي تصاحب تدمير الموائل وتجزئتها على مجتمعات ectotherms ، بما في ذلك الأنوران ، مما يحد من الأنواع الهشة من الناحية الفسيولوجية (مع التسامح الحراري الضيق) إلى بقع الموائل الصغيرة المتبقية11،12.
ويمكن أن يكون تقييم المكونات الرئيسية للأداء الحراري مكلفا من حيث الوقت والموارد على حد سواء، ويتطلب عادة معدات مختبرية وظروفا موحدة. وعلاوة على ذلك، فإن المقايسات التقليدية لا تعكس في كثير من الأحيان اتساع نطاق الظروف المحيطة التي يعاني منها معين في الطبيعة13 حيث يتم التحكم بعناية في درجة الحرارة في تجارب فسيولوجيا مماثلة وغالبا ما لا علاقة لها بالظروف المحيطة التي يعاني منها الحيوان. هذا التحكم في درجة الحرارة يمكن أن يقلل من فهم الاختلاف في الاستجابات الفردية2،14. وقد اعتمد علماء وظائف الأعضاء على تجارب التدفئة والتبريد المختبرية ، وذلك باستخدام حمامات المياه القابلة للبرمجة لتسخين أو تبريد بيئة الحيوان بثبات لإعلام منحنيات الأداء الحراري15.
عادة، يتم وضع الحيوانات في قوارير مع الحرارية، ويتم تغيير درجة حرارتها المحيطة باطراد عن طريق التحكم في درجة حرارة حمام المياه المحيطة بها. يقيس الباحثون الوقت الذي يستغرقه تحقيق حالة فسيولوجية متغيرة (على سبيل المثال ، غيبوبة البرد ، الضربة القاضية) ودرجة الحرارة التي حدث فيها تغيير الحالة16،17. تبدأ هذه الأدوات بمبلغ لا يقل عن 500 دولار أمريكي، وهي كبيرة وثقيلة وتتطلب معدات تقنية إضافية (على سبيل المثال، الكمبيوتر، الزج الحراري). وبالتالي، فإن الأدوات الأساسية لتنفيذ الأساليب الكلاسيكية لتقييم الأداء الحراري هي 1) غير متاحة اقتصاديا للجميع، 2) غير مناسبة لتقييم الحيوانات كبيرة جدا بحيث لا يمكن احتواؤها في قوارير العرفي المستخدمة لdipterans الصغيرة، و 3) غير المحمولة للاستخدام في بيئات الحقل البعيد. وقد أدى الالتزام بالممارسة الشائعة إلى تمثيل محدود عبر التصنيف والشروط التجريبية18و19و20.
في حين أن منحنيات الأداء الحراري الكامل يمكن أن تسترشد توزيع الأنواع، والصفات تاريخ الحياة، والسلوك، من بين سمات أخرى، يمكن أن يكون القياس الكمي للمقاييس الحرارية أقل وأبسط أكثر كفاءة ولا تزال غنية بالمعلومات للغاية. المقايسات الفسيولوجية، وقياس بداية غيبوبة البرد والانتعاش صدمة الباردة اللاحقة، تصلب الباردة، والسلوك الصحيح، هي وكلاء فعالة وقابلة للتنفيذ للحد الأدنى الحراري الحرجة من كائنحي 8. الموصوف هنا هو اختبار الصدمة الباردة مفيدة للحصول على البيانات الفسيولوجية من الحشرات ectothermic الأرضية الكبيرة. إن المقايسة ميسورة التكلفة، ويمكن الوصول إليها، وسهلة التنفيذ في ظل ظروف ميدانية أو في الفصول الدراسية. يمكن أن تقترن البيانات المتعلقة باستعادة الصدمة الباردة الناتجة عن هذا البروتوكول ببيانات الأنواع أو السمات الفردية لمتابعة الأسئلة المتعلقة بالفيزيولوجيا الإيكولوجية و /أو استخدامها لتعليم الطلاب حول المبادئ الفسيولوجية.
Protocol
1. تحديد الأنواع ذات الاهتمام
- تحديد الأنواع ذات الأهمية لتحديد وقت التعافي من الصدمة الباردة. ضع في اعتبارك أن كل مجموعة ستختلف في الوقت الذي يستغرقه الحث على غيبوبة البرد (أي النقطة التي لا تزال فيها الحشرة على قيد الحياة ، ولكنها لا تتحرك ولا تستجيب). وبالمثل، واستنادا إلى الكائن الحي واستخدام البيانات، اختر نقاط قطع مختلفة لوقف التجربة إذا لم يطير الشخص البؤري (الأفراد البؤريين) (انظر القسم 4).
ملاحظة: تم تصميم هذا البروتوكول وتطويره للاستخدام على Lepidoptera. ومع ذلك ، فإنه ينطبق على الحشرات الأرضية الكبيرة ، على وجه الخصوص ، تلك التي يمكن تخزينها مسطحة في مغلفات زجاجية تقيد الحركة والضرر (على سبيل المثال ، الفراشات واليعسوب / damselflies).
2. إجراء محاكمة تمهيدية
- إجراء ما قبل المحاكمة على عينة صغيرة من الأفراد لتحديد المعلمات الرئيسية. اتبع الأقسام من 3 إلى 5 من البروتوكول أدناه مع 5-10 أفراد لمرحلة ما قبل المحاكمة.
- اختبار الوقت المطلوب على الجليد للحث على غيبوبة البرد (لا تتحرك)، ولكن ليس قتل الأنواع المحورية باتباع الخطوة 5.1 باستخدام علاجات من 30 دقيقة، 60 دقيقة، و 90 دقيقة.
ملاحظة: الوقت اللازم للحث على غيبوبة البرد سوف تعتمد على حجم وموقع وتاريخ طبيعي / سلوك الأفراد. - استنادا إلى النتائج من الخطوات 4.1-4.4 واستخدام المعرفة بإيكولوجيا الحشرات البؤرية ، اختر الوقت الذي تنتهي فيه التجربة إذا لم يتعافى فرد معين تماما. قاعدة هذه المرة قطع على علم البيئة من الأنواع أيضا، مع الأخذ في الاعتبار أنه بعد عدة دقائق من كونها غير قادرة على الطيران، يتم قبل العديد من الحشرات.
ملاحظة: على سبيل المثال، إذا كانت معظم التجارب الأولية تنتهي في الرحلة بعد 15 دقيقة، يمكن للمرء أن يقرر إنهاء التجارب بعد 25 دقيقة لضمان أن القيم المتطرفة حتى لديها فرصة للتعافي بشكل كامل (أي الطيران). ويستند هذا البروتوكول على 30 دقيقة وقت قطع (الخطوة 5.4).
- اختبار الوقت المطلوب على الجليد للحث على غيبوبة البرد (لا تتحرك)، ولكن ليس قتل الأنواع المحورية باتباع الخطوة 5.1 باستخدام علاجات من 30 دقيقة، 60 دقيقة، و 90 دقيقة.
- استخدم معلمات من بيانات ما قبل المحاكمة لإعلام عملية جمع البيانات للتجارب. تعديل البروتوكول الموضح أدناه استنادا إلى احتياجات الكائنات البؤرية ، بما في ذلك الوقت في الطين الجليدي ، والوقت الذي يمكن فيه استدعاء التجارب إلى نهايتها ، والسلوكيات الموثقة على ورقة البيانات (على سبيل المثال ، قد تكون الرعشة سلوكا غير مناسب للحشرة المفضلة).
- حدد أسئلة بحثية محددة يجب الإجابة عليها باستخدام هذه البيانات أثناء تحسين المعلمات.
ملاحظة: على سبيل المثال، إذا كان الباحث مهتما بتأثير التعرض لفترات طويلة على التعافي، فإن الوقت في الجليد هو متغير رئيسي للتعديل. إذا كان الباحثون مهتمين بالاختلافات في علم وظائف الأعضاء بين الأنواع الملونة الفاتحة والداكنة ، يمكنهم اختيار نوعين ملونين بشكل واضح أو تعديل لون جناح الحشرة لقياس تأثير لون الجناح على وقت التعافي. والأهم من ذلك، أن هذه الطريقة قابلة للتخصيص بدرجة كبيرة لتلبية الاحتياجات وأسئلة البحث المطروحة (انظر قسم المناقشة).
- حدد أسئلة بحثية محددة يجب الإجابة عليها باستخدام هذه البيانات أثناء تحسين المعلمات.
3. مجموعة من الحشرات
- جمع الحشرات باستخدام الطرق المناسبة مثل الفخاخ الطعم والشباك الحشرات ،(الشكل التكميلي 1). عند جمعها، ضع كل فرد في مغلف زجاجي منفصل مع معرف فريد.
- تخزين الحيوانات في مكان مظلل وبارد بعد التقاطها وقبل التعرض لتجربة الصدمة الباردة. دائما تعريض الحيوان للعلاج التجريبي في غضون 24 ساعة من القبض عليه، وتوحيد هذه المرة قدر الإمكان عبر التجارب.
- على الرغم من أن ظروف التخزين قد تختلف ، إلا أنها تبقي الحشرات بعيدة عن الشمس المباشرة. إذا كان ذلك ممكنا، وضعها في الداخل في غرفة باردة ومظلمة.
- في الميدان، تأكد من أنها ستكون مظللة أثناء تخزينها وحمايتها من الرياح (تهب بعيدا) وغيرها من الحيوانات المفترسة الحشرات التي قد تدخل المغلفات.
4. إعداد تجربة الصدمة الباردة
- ملء برودة مع الثلج والماء. تأكد من وجود جليد كاف للاستمرار لمدة ساعة واحدة على الأقل، وإضافة الجليد بشكل دوري حسب الحاجة بهدف الحفاظ على البيئة في الماء عند 0 درجة مئوية.
- اختر بين 1 و4 أفراد محوريين لجولة من التجارب، مع التأكد من أن كل فرد يمكن التعرف عليه.
- إذا كنت تستخدم أنواعا متعددة، فاستخدم واحدا فقط من كل منها لتجنب الخلط بين الأفراد في ورقة البيانات. إذا جربت نوعا واحدا فقط، فاستخدم فقط أفرادا يمكن تمييزهم بسهولة، على سبيل المثال عن طريق جناح مكسور أو علامة مميزة.
- إذا كان هدف التجربة لا علاقة له بتلوين الجناح ، فسجل الأجنحة بأرقام فريدة (على سبيل المثال ، أرقام) مع علامة ذات رؤوس شعر ناعمة لتمييز الأفراد.
- إذا لم تف التجارب بأحد المعايير المذكورة أعلاه، قم بإجراء التجربة على فرد واحد في كل مرة.
- ملء صفوف ورقة البيانات بالمعلومات ذات الصلة بكل حشرة تم فحصها بما في ذلك معرفها الفريد ومعرف مفيد في الملاحظات مثل اسم النوع أو الحرف المميز(الجدول التكميلي 1).
- وضع جميع الأفراد البؤريين (لا يزالون في مغلفاتهم المميزة بشكل فردي) في كيس بلاستيكي مختوم بوزن(جدول المواد)، ووضع الكيس في الماء المثلج لمدة 60 دقيقة (أو حتى يتم تحريض غيبوبة البرد ؛ انظرالمناقشة)( الشكل التكميلي 2 ).
- تأكد من أن الوزن ثقيل (على سبيل المثال ، عملات كبيرة ، غسالات كبيرة ، أو صخور ناعمة) وكبير بما يكفي للحفاظ على كيس الحشرات غارقا في الماء الجليدي وم عموديا على سطح الماء. استخدام الوزن الذي لا يسبب تسرب في كيس من البلاستيك مختومة.
ملاحظة: في حين أن الحشرات لا تزال قادرة على التعافي إذا تعرضت مباشرة للمياه أثناء غمرها ، فإن المغلفات الرطبة تعقد إزالة كل فرد. من الأفضل الحفاظ على جفاف الحشرات في حقيبتها.
- تأكد من أن الوزن ثقيل (على سبيل المثال ، عملات كبيرة ، غسالات كبيرة ، أو صخور ناعمة) وكبير بما يكفي للحفاظ على كيس الحشرات غارقا في الماء الجليدي وم عموديا على سطح الماء. استخدام الوزن الذي لا يسبب تسرب في كيس من البلاستيك مختومة.
- سجل درجة الحرارة والبيانات الخفيفة.
- استخدم مسجل بيانات (راجع جدول المواد)لتسجيل درجة الحرارة المحيطة وبيانات الضوء باستخدام الخطوة 5.1 أو 5.2.
- برمجة مسجل البيانات لجمع بيانات درجة الحرارة والضوء على فترات 10 s ، بدءا من الوقت الذي سيتم فيه إطلاق الحشرات.
- قاعدة وقت بدء تسجيل البيانات على عندما وضعت الحشرات في الماء المثلج. تأكد من مزامنة معلومات مسجل البيانات (التاريخ والوقت) بحيث يمكن مطابقة البيانات المتعلقة بالظروف المحيطة لاحقا مع كل حشرة بؤرية فردية.
- استخدم ميزان حرارة بسيط لتسجيل بيانات درجة الحرارة والضوء على فترات قصيرة باليد (من قبل باحث ثان).
- اتخاذ قرار بشأن المعلمات التجريبية لربط مع وقت الاسترداد التي يمكن قياسها دون مسجل البيانات. استخدام علاجات متميزة: الظل / الشمس; الشفق / منتصف النهار.
- استخدم مسجل بيانات (راجع جدول المواد)لتسجيل درجة الحرارة المحيطة وبيانات الضوء باستخدام الخطوة 5.1 أو 5.2.
- ضع قفصا شبكيا للحشرات في موقع مناسب بحيث تكون بيئات درجة الحرارة والضوء متجانسة قدر الإمكان داخل القفص ، وحتى يتم رفع قاعدة القفص ويمكن استغلالها من قبل المراقب.
- ضع مسجل البيانات خارج القفص مباشرة، أو داخل القفص بحيث لا يتم طرقه أو تأثره بخلاف ذلك بالحركات الصغيرة داخل القفص. إذا لم يكن استخدام مسجل بيانات، ضع ميزان الحرارة بشكل مناسب و/أو قم بإعداد الأقفاص في التكوين المناسب.
ملاحظة: يجب وضع مسجل البيانات بحيث تكون الظروف المحيطة المسجلة أقرب ما يمكن إلى تلك التي تعاني منها الحشرة.
5. بدء تجربة الصدمة الباردة
- إزالة الحيوانات من حمام الماء المثلج بعد 60 دقيقة (أو الوقت المحدد المناسب؛ انظر أعلاه). إزالة الحشرات فورا من كيس من البلاستيك، وإزالة كل فرد من المغلف في أسرع وقت ممكن مع التقليل من التعامل مع (الشكل التكميلي 3).
- بدء ساعة توقيت بمجرد الحيوانات في أقفاص شبكة (انظر المثال البيانات، الجدول التكميلي 1).
- اضغط على قاعدة القفص بقلم رصاص لإثارة الحشرات المتعافيه.
ملاحظة: توفير المحفزات أثناء التعافي يضمن أن الحشرات البؤرية تثبت حالة التعافي والسلوكيات بمجرد أن تكون قادرة من الناحيةالفسيولوجية (فيديو تكميلي).- اضغط بشكل متكرر وقوي بما يكفي لضمان استجابة الحيوان إذا أمكن، ولكن دون التسبب في استجابة.
ملاحظة: على سبيل المثال، عند النقر على القفص، إذا تم قذف في الهواء والأراضي تستقيم، ولكن لا تتحرك للوقوف من تلقاء نفسها، وهذا لا يعتبر سلوك الوقوف، كما الكائن الحي لم يقف في الواقع من تلقاء نفسها.
- اضغط بشكل متكرر وقوي بما يكفي لضمان استجابة الحيوان إذا أمكن، ولكن دون التسبب في استجابة.
- ضع علامة على التجربة على أنها كاملة بمجرد أن يطير الفرد (أي يظهر استردادا كاملا). إنهاء التجربة والنظر في الحشرة قد حققت الشفاء التام إذا لم تتحرك بعد 30 دقيقة.
- إزالة الحشرات من قفص شبكة، ووضع الأفراد مرة أخرى إلى مغلفات زجاجي المسمى بهم. تحرير الحيوانات أو الاحتفاظ بها لمزيد من جمع البيانات (على سبيل المثال، الصفات الفردية للحجم والوزن).
- إذا كنت تستخدم مسجل بيانات، أوقف تجميع بيانات مسجل البيانات، واحفظ ملف بيانات درجة الحرارة والضوء أثناء التجربة بمعلومات مناسبة عن التاريخ/الوقت.
6. معالجة البيانات
- أدخل البيانات المقدمة من ورقة البيانات في جدول بيانات (على سبيل المثال، MS Excel).
- إذا كنت تستخدم مسجل بيانات، أضف بيانات درجة الحرارة والضوء لكل استجابة لكل فرد تم فحصه.
- حساب متوسط الانحراف المعياري لدرجة الحرارة والضوء لكل سلوك كل فرد.
ملاحظة: كما تسجيل البيانات تسجيل البيانات كل 10 s، إذا استغرق سلوك الحامل الحيوان واحد 48 s تحدث، استخدم الإدخالات 5 الأولى من مسجل البيانات لتلك التجربة. - إقران كل سلوك استرداد كل فرد مع البيانات اللاأحيائية المسجلة من قبل datalogger، تقريب صعودا أو أسفل إلى فترات 10 ق حسب الضرورة.
- حساب متوسط الانحراف المعياري لدرجة الحرارة والضوء لكل سلوك كل فرد.
- رسم وتحليل البيانات. الشكل 1، على سبيل المثال ، تصور تأثير درجة الحرارة والضوء على وقت التعافي من الصدمة الباردة. تجميع بيانات أخرى ذات صلة (سمات الأنواع، خصائص الموائل الإقليمية) لدراسة الأنماط الإيكولوجية والتطورية في الصفات الفسيولوجية للمجموعات التي تم اختبارها.
ملاحظة: تم رسم الشكل 1 باستخدام حزمة ggplot2 في R. ويختلف مستوى تفاصيل البيانات المتعلقة بالظروف المحيطة استنادا إلى الأدوات المستخدمة لقياس الظروف المحيطة. إذا تم استخدام مسجل بيانات، يمكن إنشاء أرقام مع تفاصيل قابلة للمقارنة مع الشكل 2. إذا تم استخدام ميزان الحرارة ، فإن الباحث لن يكون قادرا على إنشاء مؤامرة مستنيرة بالضوء المحيط. وبالمثل، إذا استخدم الباحثون فئات من الضوء أو درجة الحرارة، يمكن تعديل هذه التشتتات إلى مؤامرات مربعة أو قالب مناسب آخر لتوضيح هذه الظواهر.
Representative Results
تسمح البيانات التي تم جمعها في هذا البروتوكول بفحص وتقسيم المتغيرات المهمة لعلم وظائف الأعضاء الكائنية. على سبيل المثال ، تساهم كل من درجة الحرارة وظروف الضوء في تعافي الفراشات من الصدمة الباردة(الشكل 1). وتهدف المؤامرة لاستكشاف التفاعل بين الظروف المحيطة واستعادة الصدمة الباردة. باستخدام الفراشات البرية اشتعلت من كل من الفخاخ والمعاوضة، أظهرت 181 نوعا من الفراشات انتعاش متميز من غيبوبة البرد الناجمة عن صدمة البرد(الشكل 2). جمع ثلاثة مراقبين البيانات المقدمة في الشكل 2 على مدى خمسة أشهر تقريبا (كانون الثاني/يناير وشباط/فبراير و أيار/مايو - تموز/يوليه 2020) في أنديس الكولومبية. كانت التجارب تجرى دائما في الصباح التالي لجمع الفراشات. وبأقصى قدر من الكفاءة، كان من الممكن لاثنين من المراقبين مراقبة أربع فراشات في وقت واحد لكل منهما، تتكرر سبع مرات (7.37 ساعات كحد أدنى)، مما أدى إلى اختبار 56 فردا في صباح واحد. وقد سمح ذلك بقدر كبير من جمع البيانات عبر مجتمعات الفراشات بأكملها مع تضمين والنظر في البيانات المتعلقة بالتنوع الفردي. وبما أن عمليات الفحص يمكن أن تحدث في ظل الظروف البيئية المحيطة، فإن ظروف الانتعاش تمثل موائلها وتعكس الاختلاف الطبيعي الذي تعاني منه الكائنات الحية في طبيعتها. يوضح الشكل 3 التداخل بين درجة الحرارة وظروف الضوء لتجربة استعادة الصدمة الباردة والظروف في مرعى تم جمع بعض الفراشات المختبرة منه.
الشكل 1: Scatterplots من وقت الانتعاش (في ثوان) من الفراشات بعد الصدمة الباردة. (أ) متوسط درجة الحرارة و (ب) يعني لوكس (كثافة الضوء) خلال شفائهم. يتم تنظيم الأنواع والملونة من قبل الأسرة. بشكل عام ، مع زيادة الضوء ودرجة الحرارة ، ينخفض وقت استرداد الصدمة الباردة ، مما يظهر التباين عبر التصنيف. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مثال على نتائج من الصدمة الباردة الانتعاش المقايسة على 181 نوعا من الفراشة من أنديس الكولومبية. تمثل البيانات عدد الثواني التي انقضت من إزالة الفراشة من البرد وعندما كانت قادرة على الطيران. يتم تنظيم الأنواع والملونة من قبل الأسرة. ويبين هذا الرقم اتساع التصنيف الذي يمكن عبره تطبيق هذه التجربة بنجاح، وتنوع استجابات استعادة الصدمة الباردة عبر الأنواع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3:درجة الحرارة المحيطة ولوكس خلال التجارب استعادة الصدمة الباردة. قطعة من درجة الحرارة المحيطة (الأزرق) و LUX (شدة الضوء والأحمر) كما سجلت من قبل قاطعي البيانات وضعت في المراعي حيث وقعت جمع الفراشات (ألوان فاتحة، وظروف تمتد يوم كامل) والظروف خلال التجارب استعادة الصدمة الباردة (الألوان الداكنة، ساعات الصباح فقط). تظهر ظروف الحقل المحيط والظروف التجريبية المرسومة نطاق ومتوسط الظروف التي تعاني منها الفراشات على مدى أسبوع واحد من أخذ العينات الميدانية والتجريب. أجريت التجارب في الساعات الأولى فقط (07:00-13:00 ساعة)، في حين تم نشر خبراء تسجيل البيانات في الميدان لمدة أسبوع واحد (ساعات النهار، 06:00-18:00 ساعة هو مبين). يظهر هنا التداخل بين الظروف التجريبية والظروف المحيطة التي تعاني منها الفراشات ، مما يدل على الأهمية الإيكولوجية لإجراء فحوصات علم وظائف الأعضاء في ظل الظروف المحيطة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: إجراء لجمع الحشرات البؤرية-في هذه الحالة، الفراشات-باستخدام مصائدفان سومرين الطعم والمعاوضة النشطة. تم اصطياد الفخاخ مع كل من الأسماك المتعفنة وطعم الفاكهة المتعفنة. فخ (دون طعم) في الخلفية، في المقدمة هو عينة في مغلف فريد من نوعه ضد مربع جمع البلاستيك الأزرق. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الشكل التكميلي 2:أكياس مع ما يصل إلى أربعة فراشات فردية مغمورة في الماء المثلج في مبرد. تم وضع علامة على الأكياس البلاستيكية مع الوقت الذي وضعت في الماء المثلج، بحيث يمكن أن تكون تجارب الصدمة الباردة متداخلة حتى الصباح. يجب إغلاق الأكياس البلاستيكية لمنع العينات من الحصول على الرطب. ومع ذلك ، فإن فيضان الأكياس والمغلف في هذه الحالة لم يكن له تأثير قابل للقياس على استعادة الفراشات. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الشكل التكميلي 3:مراقبان يجمعان البيانات في الميدان. كل قفص شبكة يحتوي على أربع فراشات فريدة من نوعها يتعافى من صدمة البرد. كلوريد البولي فينيل تي مشتركة في القفص يضم مسجل البيانات لمنع التعرض المباشر لأشعة الشمس أو المطر. كل مراقب لديه ساعة توقيت التي بدأت على الفور عند إطلاق الفراشة في القفص. يتم رفع الأقفاص بواسطة المقاعد ، مما يسمح للمراقبين بإثارة قاعدة القفص لضمان استجابة الفراشات سلوكيا في أسرع وقت ممكن من الناحية الفسيولوجية. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الجدول التكميلي 1: ورقة بيانات نموذجية. تظهر الورقة معرف كل فراشة الفريد المعين في الحقل والأحرف المميزة (اسم النوع، ألوان المفاتيح) في الملاحظات. كما سجلت هو المركز المهيمن للفراشة (أي، أي جانب من الجناح تعرض لأشعة الشمس) خلال فترة الانتعاش، وأشار إلى D (الظهرية) أو V (البطني). الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.
فيديو تكميلي 1: التنصت على القفص لاستعادة الصدمة الباردة. مع تعافي الفراشات ، ينقر المراقب على قاعدة القفص بلطف للحث على السلوكيات بمجرد قدرة الفراشات. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.
Discussion
تتضمن دراسة علم وظائف الأعضاء الحرارية مقاييس للأنواع والصفات البيئية لفهم أفضل للتفاعلات بين الكائنات الحية والمناطق المحيطة بها التي هي مفتاح البقاء واللياقة البدنية. في حين أن دائما جزءا لا يتجزأ من فهم التاريخ الطبيعي والبيئة من النباتات والحيوانات، والصفات الحرارية ذات أهمية متزايدة في مواجهة المناظر الطبيعية وتغير المناخ11،21. العديد من مجموعات الحشرات الأرضية الكثيرة ، على وجه الخصوص ، lepidoptera و odonatan ، كبيرة نسبيا وفيرة ، وتظهر سلوكيات متميزة ، وقابلة للتلاعب. المبين هنا هو إجراء فحص فعال ومنخفض التكلفة لقياس الاستجابات الفسيولوجية لمثل هذه الحشرات بشكل فعال. يتطلب هذا البروتوكول مصدرا للكائنات الحية السليمة للتشتياز ، والتي يكون وقت معالجتها قبل التجربة محدودا. وفي حين أن عدد الكائنات الحية التي يتم فحصها في وقت واحد مرن، فإن عدد الأفراد المحوريين في كل تجربة سيختلف استنادا إلى الغرض من جمع البيانات و/أو عدد المراقبين.
على سبيل المثال، تم تطوير هذا البروتوكول لجمع بيانات فردية مفصلة عن الفراشات عبر مجتمعات بأكملها. وعلى هذا النحو، توضح النتائج التمثيلية الجهود المبذولة لزيادة جمع البيانات إلى أقصى حد ممكن للأفراد من أكبر عدد ممكن من الأنواع وفي ظل مجموعة متنوعة من الظروف ذات الصلة بالبيئة المحلية. وبغض النظر عن عدد الأنواع المحورية، من الأهمية بمكان أن يتمكن المراقب من تحديد هوية كل فرد في القفص يعاني من الانتعاش. إذا كان الهدف هو جمع البيانات من نوع واحد فقط، ثم واحد فقط أو اثنين من الأفراد (إذا كان يمكن التعرف عليها على أساس ارتداء جناح مختلفة أو إذا وضعت علامة فردية) ينبغي أن يتم فحصها في وقت واحد. يجب اختيار مواضيع الدراسة وفقا لمسألة بحثية محددة أو خطة دراسة. واستنادا إلى السؤال المطروح والغرض من جمع البيانات (البحوث أو الفصول الدراسية، على سبيل المثال)، سيختلف حجم العينة وجمع الصفات الأخرى.
لتوضيح المكونات الأساسية لعلم وظائف الأعضاء التي أوضحها هذا البروتوكول (تحريض غيبوبة البرد ، وخطوات التعافي ، ودور الظروف المحيطة) ، يمكن لمدرب الفصل الدراسي اختيار نوعين متميزين أو مورفات من نوع واحد. إذا اختلف الأفراد البؤريين فقط في سمة رئيسية واحدة (مثل اللون) ، فسيكون من الضروري وجود حجم عينة أصغر ، ويمكن للطلاب دراسة العلاقة بين هذه الصفة وعلم وظائف الأعضاء الحية عن كثب. قد يستخدم الباحثون المهتمون في علم وظائف الأعضاء الإيكولوجية بياناتهم التجريبية لاستكشاف الأسئلة الإيكولوجية والتطورية المعقدة. يجب على الباحثين التأكد من اختيار الحشرات البؤرية بعناية التي تعالج أسئلتهم مباشرة (على سبيل المثال ، استنادا إلى مرحلة الحياة والعمر والجنس والموقع) ، وبناء على عدد المتغيرات المعنية ، حدد حجم العينة المناسب. أحجام العينة للنماذج المعقدة ستكون أكبر من تلك الموضحة أعلاه.
أثناء جمع بيانات الاسترداد السلوكي ، من المهم أن يستريح القفص فوق الأرض لأن المراقب يجب أن يكون قادرا على الاستفادة من الجزء السفلي من القفص لإثارة سلوكيات التعافي. وهذا يضمن استجابة الكائن الحي (المدرجات والذباب) بمجرد أن يكون قادرا من الناحية الفسيولوجية على القيام بذلك ، ويتم توثيق سلوك التعافي النهائي (الطيران). تسجيل الظروف المحيطة أثناء استعادة الصدمة الباردة هو جزء لا يتجزأ من دراسة علم وظائف الأعضاء الحرارية، كما تم تصميم هذا البروتوكول لدراسة وتفكيك دور البيئة في فسيولوجيا الكائنات الحية. 10- إن قاطعي البيانات (انظر جدول المواد)مفيدون في تسجيل مقاييس موحدة للظروف ذات الصلة (مثل درجة الحرارة والضوء وحتى الرطوبة). ومع ذلك، إذا كانت هذه الأدوات غير متوفرة، يمكن قياس الظروف ذات الصلة بطرق أخرى مثل ميزان الحرارة الرقمي أو عن طريق تبسيط متغير الظروف البيئية واستخدام بيئات متميزة مثل الظل والشمس. يمنح هذا البروتوكول الباحث خيارات لقياس الظروف أثناء التعافي من الصدمة الباردة استنادا إلى الغرض ونطاق الدراسة.
على الرغم من أنه يمكن تعديل هذه الطريقة لتناسب مجموعات تصنيف محددة بشكل أفضل ، فمن المستحسن استخدام الحشرات الكبيرة والفولانت. يمكن اعتبار الحشرات الطائرة التي تستعيد قدرتها على الطيران بشكل مستقل أنها حققت الشفاء التام. تم استخدام هذه الطريقة ، كما هو موضح ، بنجاح على الفراشات في المناطق المدارية وشبه المدارية. واستنادا إلى الاتجاهات الحرارية لمنطقة معينة (أي نطاق درجات الحرارة التي تشهدها المواقع التي ستختلف، مما يؤثر على التوقعات على أساس الارتفاع، والعرض، وغطاء المظلة)، قد يحتاج الكائن الحي إلى أكثر أو أقل من ساعة واحدة في حمام الماء المثلج للدخول في غيبوبة البرد. قد يؤثر حجم الكائن الحي أيضا على الوقت اللازم للدخول في غيبوبة البرد. من المهم العثور على وقت التعرض البارد اللازم للحث على غيبوبة البرد (عدم التحرك) ، ولكن ليس قتل الأنواع المحورية. الوقت اللازم للحث على غيبوبة البرد سيعتمد على حجم وموقع وتاريخ طبيعي / سلوك الأفراد. استنادا إلى نتائج تجربة الصدمة الباردة الموصوفة هنا واستخدام المعرفة بإيكولوجيا الحشرات البؤرية ، اختر الوقت الذي تنتهي فيه التجربة إذا لم يتعافى فرد معين تماما.
واستنادا إلى الأسئلة المحددة للباحث، يمكن استخدام هذه الطريقة إما في الميدان أو المختبر للسماح بالتنوع البيئي الطبيعي والتحكم في المتغيرات الهامة على التوالي. هذا المقايسة بسيطة وغير مكلفة ويساعد على سد الثغرات الموجودة في مجال علم وظائف الأعضاء الحرارية. سهولة هذا البروتوكول يجعل من السهل استخدام لمجموعة متنوعة من الضرائب، وفتح المجال لأكثر من الكائنات الصديقة للمختبر. إن حداثة إجراء فحص حراري موحد ولكن محيط تسد الفجوة بين النتائج المختبرية والميدانية22. الاستفادة من الظروف المحيطة لاستعادة الكائن الحي سوف تساعد الباحثين تقسيم دور العوامل البيئية والأنواع في علم وظائف الأعضاء14،22. وأخيرا، ونظرا لانخفاض تكلفته وعدم وجود المواد المطلوبة، يمكن استخدام هذا البروتوكول في مواقع نائية في الميدان مع معدات قليلة مثالية لكثير من علماء الأحياء الميدانيين، وكذلك في الفصول الدراسية للسماح للطلاب الصغار بتجربة تعليمية عملية.
Disclosures
ولا توجد لدى صاحب البلاغ مصالح مالية متنافسة أو أي تضارب آخر في المصالح.
Acknowledgments
بفضل جاريت دانيلز، إيزابيلا بلومر، بريت شيفرز، ودان هان لإدخال على البروتوكول كما تم تطويره لأول مرة. امتنان إضافي لخايمي هاغارد وسيباستيان دوران وإنديانا كريستوبال رويس-مالافر لتنفيذهم عدة تكرارات لهذا البروتوكول وللمدخلات المتعلقة بالمكونات الرئيسية. شكرا أيضا لمراجع مجهول للحصول على تعليقات حول المخطوطة ككل. وقدم الدعم مركز ماكغواير لليبيدوباتيرا وصندوق النشر التابع للتنوع البيولوجي، وكلية العلوم الزراعية والحياتية، وكلية الموارد الطبيعية والبيئة، وقسم إيكولوجيا الحياة البرية والحفاظ عليها في الجبهة المتحدة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 x 24 x 36" Popup Rearing & Observation Cage | Bioquip | 1466PB | Ensure that the cage is slightly elevated from the ground to be able to tap the floor of the cage during experiments. |
| Cooler | Any | NA | |
| Glassine envelopes | Bioquip | 1130B | |
| HOBO Pendant Temperature/Light 8K Data Logger | Onset | UA-002-08 | If a datalogger is not accessible, researchers may choose to use a digital thermometer to record ambient temperatures at regular intervals. See protocol step 4.5 for additional information. |
| HOBO Optic USB Base Station | Onset | Base-U-1 | |
| Ice water | NA | NA | |
| Insects (focal taxa) | NA | Any | Collect sufficient samples to test, ensuring replication of experimental groups (e.g. species, sampling location) |
| PVC T-joint | Any | Any | |
| Sealable plastic bag | Any | NA | |
| Stopwatch/timer | Any | NA | |
| Weight | Any | NA | Large coins or small rocks to weigh down the plastic bags will ensure that specimens are submerged in ice water. A standardized weight is ideal. |
References
- Huey, B., Stevenson, R. D. Integrating thermal physiology and ecology of ectotherms a discussion of approaches. American Zoologist. 19 (1), 357-366 (1979).
- Huey, R. B., Slatkin, M. Cost and benefits of lizard thermoregulation. The Quarterly Review of Biology. 51 (3), 363-384 (1976).
- Kingsolver, J. G. Butterfly thermoregulario: Organismic mechanisms and population consequences. Journal of Research on the Lepidoptera. 24, 1-20 (1985).
- Kingsolver, J. G. Evolution and coadaptation of thermoregulatory behavior and wing pigmentation pattern in pierid butterflies. Evolution. 41 (3), 472-490 (1987).
- Kingsolver, J. G., Huey, R. B. Evolutionary analyses of morphological and physiological plasticity in thermally variable environments. American Zoologist. 38, 545-560 (1998).
- Malhi, Y., Wright, J. Spatial patterns and recent trends in the climate of tropical rainforest regions. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 359 (1443), 311-329 (2004).
- Sears, M. W., et al. Configuration of the thermal landscape determines thermoregulatory performance of ectotherms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (38), 10595-10600 (2016).
- Sinclair, B. J., Coello Alvarado, L. E., Ferguson, L. V. An invitation to measure insect cold tolerance: Methods, approaches, and workflow. Journal of Thermal Biology. 53, 180-197 (2015).
- Angilletta, M. Thermal adaptation: a theoretical and empirical synthesis. , Oxford University Press. (2009).
- Perkins-Kirkpatrick, S. E., Gibson, P. B. Changes in regional heatwave characteristics as a function of increasing global temperature. Scientific Reports. 7, 12256 (2017).
- Frishkoff, L. O., Hadly, E. A., Daily, G. C. Thermal niche predicts tolerance to habitat conversion in tropical amphibians and reptiles. Global Change Biology. 21 (11), 3901-3916 (2015).
- Nowakowski, A. J., Otero Jiménez, B., Allen, M., Diaz-Escobar, M., Donnelly, M. Landscape resistance to movement of the poison frog, Oophaga pumilio, in the lowlands of northeastern Costa Rica. Animal Conservation. 16 (2), 188-197 (2013).
- Kingsolver, J. G., Buckley, L. B. Quantifying thermal extremes and biological variation to predict evolutionary responses to changing climate. Philosophical Transactions of the Royal Society B. Biological Sciences. 372 (1723), 20160147 (2017).
- Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals. Journal of Experimental Biology. 218, 1956-1967 (2015).
- Sinclair, B. J., Williams, C. M., Terblanche, J. S. Variation in thermal performance among insect populations. Physiological and Biochemical Zoology. 85 (6), 594-606 (2012).
- Gotcha, N., Terblanche, J. S., Nyamukondiwa, C. Plasticity and cross-tolerance to heterogeneous environments: divergent stress responses co-evolved in an African fruit fly. Journal of Evolutionary Biology. 31 (1), 98-110 (2018).
- Mutamiswa, R., Chidawanyika, F., Nyamukondiwa, C. Superior basal and plastic thermal responses to environmental heterogeneity in invasive exotic stemborer Chilo partellus Swinhoe over indigenous Busseola fusca (Fuller) and Sesamia calamistis Hampson. Physiological Entomology. 43 (2), 108-119 (2018).
- de Jong, M. A., Saastamoinen, M. Environmental and genetic control of cold tolerance in the Glanville fritillary butterfly. Journal of Evolutionary Biology. 31 (5), 636-645 (2018).
- DeVries, Z. C., Kells, S. A., Appel, A. G. Estimating the critical thermal maximum (CTmax) of bed bugs, Cimex lectularius: Comparing thermolimit respirometry with traditional visual methods. Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Molecular & Integrative Physiology. 197, 52-57 (2016).
- De Keyser, R., Breuker, C. J., Hails, R. S., Dennis, R. L. H., Shreeve, T. G. Why small is beautiful: Wing colour is free from thermoregulatory constraint in the small lycaenid butterfly, Polyommatus icarus. PLoS One. 10 (4), 0122623 (2015).
- Nowakowski, A. J., et al. Tropical amphibians in shifting thermal landscapes under land-use and climate change. Conservation Biology. 31 (1), 96-105 (2017).
- Niehaus, A. C., Angilletta, M. J., Sears, M. W., Franklin, C. E., Wilson, R. S. Predicting the physiological performance of ectotherms in fluctuating thermal environments. Journal of Experimental Biology. 215, 694-701 (2012).
