Summary
Здесь описан недорогой, доступный протокол для оценки восстановления бабочек от холодового шока в условиях окружающей среды.
Abstract
Экологическая физиология, особенно эктотерм, становится все более важной в этом меняющемся мире, поскольку она использует измерения видов и признаков окружающей среды для изучения взаимодействий между организмами и их окружением, чтобы лучше понять их выживание и приспособленность. Традиционные термические анализы являются дорогостоящими с точки зрения времени, денег и оборудования и поэтому часто ограничиваются небольшими размерами выборки и небольшим количеством видов. Здесь представлен новый протокол, который генерирует подробные данные об индивидуальном поведении и физиологии крупных, волантовых, наземных насекомых, на примере бабочек. В данной работе описаны методы анализа восстановления от холодового удара, которые могут быть выполнены в полевых условиях в условиях окружающей среды и не требуют дорогостоящего лабораторного оборудования. Этот метод был использован для понимания реакции и стратегии восстановления на холодный шок тропических бабочек, генерируя данные индивидуального уровня по целым сообществам бабочек. Эти методы могут использоваться как в отдаленных полевых условиях, так и в классных комнатах и могут использоваться для получения экологически значимых физиологических данных и в качестве учебного пособия.
Introduction
Интеграция тепловой физиологии и экологии в конце 1970-х и начале 1980-х годов1,2 запустила область экологической физиологии. Обширные тепловые исследования, проведенные на эктотермах, подчеркивают эколого-физиологические синергии в различных эко-эволюционных контекстах3,4,5. Исследования по тепловой физиологии эктотермических организмов вновь обрели внимание в последнее время в условиях изменения климата и изменения тепловых ландшафтов во всем мире6,7. В дополнение к информированию исследований в академической области экологической физиологии, анализы тепловой физиологии могут быть широко доступны для исследователей и могут служить практическим подходом к обучению для всех уровней. Компоненты тепловых характеристик, включая тепловые пределы и последствия температурных шоков, имеют основополагающее значение для экологии, поведения и истории жизни животных8,9.
В частности, экототермы используются для решения вопросов физиологии, поскольку эндотермия диктует неразрывную связь между температурой окружающей среды и организма. Температурный диапазон, который могут выдержать организмы (от их критического теплового минимума до максимального теплового диапазона), и температуры, при которых их поведение и приспособленность максимизируются (тепловая оптима), часто коренятся в экологических и эволюционных процессах. Эти физиологические черты имеют все большее значение, поскольку температуры, как средние, так и экстремальные, увеличиваютсяна 10. Например, абиотические изменения, включая повышение температуры, которые сопровождают разрушение среды обитания и фрагментацию, затронули сообщества эктотерм, включая ануранов, ограничив физиологически хрупкие виды (с узкой тепловой толерантностью) небольшими остаточными участками средыобитания 11,12.
Оценка ключевых компонентов тепловых характеристик может быть дорогостоящей как с точки зрения времени, так и ресурсов и традиционно требует лабораторного оборудования и стандартизированных условий. Более того, обычные анализы часто не отражают широту условий окружающей среды, испытываемых в природе данным животным13, поскольку температура в аналогичных физиологических экспериментах тщательно контролируется и часто не связана с условиями окружающей среды, испытываемыми животным. Этот контроль температуры может уменьшить понимание вариаций в отдельных реакциях2,14. Физиологи полагались на лабораторные эксперименты по нагреванию и охлаждению, используя программируемые водяные бани для устойчивого нагрева или охлаждения окружающей среды животного для информирования кривых тепловых характеристик15.
Как правило, животных помещают во флаконы с термопарой, и температура их окружающей среды постоянно изменяется путем контроля температуры окружающей водяной бани. Исследователи измеряют время, необходимое для достижения измененного физиологического состояния (например, холодная кома, нокдаун) и температуру, при которой произошло изменение статуса16,17. Начиная с минимума в 500 долларов США, эти инструменты являются большими, тяжелыми и требуют дополнительного технического оборудования (например, компьютер, термопары). Следовательно, основными инструментами для проведения классических методов оценки тепловых характеристик являются: 1) экономически недоступные для всех, 2) не пригодные для анализа животных, слишком большие, чтобы содержаться в обычных флаконах, используемых для небольших диптеранов, и 3) не портативные для использования в отдаленных полевых условиях. Следование общепринятой практике привело к ограниченному представительству в таксономии и экспериментальных условиях18,19,20.
В то время как полные кривые тепловых характеристик могут информировать о распределении видов, признаках истории жизни и поведении, среди других признаков, количественная оценка меньшего количества и более простых тепловых показателей может быть более эффективной и все же чрезвычайно информативной. Физиологические анализы, измеряющие начало холодовой комы и последующее восстановление холодового шока, холодостойку и выпрямляющее поведение, являются эффективными и исполняемыми прокси для критического теплового минимума организма8. Здесь описан анализ холодного шока, полезный для получения физиологических данных от крупных наземных эктотермических насекомых. Анализ является недорогим, доступным и простым в выполнении в полевых условиях или в классе. Данные о восстановлении после холодового шока, генерируемые этим протоколом, могут быть объединены с данными о видах или признаках индивидуального уровня для изучения вопросов, касающихся экологической физиологии, и / или использоваться для обучения студентов физиологическим принципам.
Protocol
1. Идентификация видов, представляющих интерес
- Определите виды, представляющие интерес, чтобы определить время восстановления после холодового шока. Имейте в виду, что каждая группа будет отличаться временем, которое требуется, чтобы вызвать холодную кому (то есть точку, в которой насекомое все еще живо, но не движется и не реагирует). Аналогичным образом, исходя из организма и использования данных, выбирайте различные точки отсечения, в которых можно остановить эксперимент, если фокусное лицо (лица) не летает (см. раздел 4).
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол был разработан и разработан для использования на чешуекрылых. Тем не менее, он применим к крупным, волюнтным, наземным насекомым, в частности, к тем, которые могут храниться в стеклянных оболочках, ограничивающих движение и повреждение (например, бабочки и стрекозы / стрекозы).
2. Проведение досудебного
- Проведите досудебное дело на небольшой выборке лиц для определения ключевых параметров. Следуйте разделам с 3 по 5 протокола ниже с 5-10 лицами для досудебного лечения.
- Проверьте время, необходимое на льду, чтобы вызвать холодную кому (не двигаясь), но не убивайте очаговые виды, следуя шагу 5.1, используя процедуры продолжительность 30 минут, 60 минут и 90 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время, необходимое для того, чтобы вызвать холодную кому, будет зависеть от размера, местоположения и естественной истории / поведения людей. - Основываясь на результатах шагов 4.1-4.4 и используя знания об экологии очаговых насекомых, выберите время, в которое следует завершить испытание, если данный человек не выздоравливает полностью. Основывайте это время отсечения на экологии вида, имея в виду, что после многих минут неспособности к полету многие насекомые предшествуют.
ПРИМЕЧАНИЕ: Например, если большинство предварительных испытаний заканчиваются в полете через 15 минут, можно принять решение о прекращении испытаний через 25 минут, чтобы гарантировать, что даже выбросы имеют шанс полностью восстановиться (т.е. летать). Этот протокол основан на 30-минутном времени отсечения (шаг 5.4).
- Проверьте время, необходимое на льду, чтобы вызвать холодную кому (не двигаясь), но не убивайте очаговые виды, следуя шагу 5.1, используя процедуры продолжительность 30 минут, 60 минут и 90 минут.
- Используйте параметры из досудебных данных для сбора данных для экспериментов. Изменить протокол, описанный ниже, на основе потребностей очаговых организмов, включая время пребывания в ледяной суспензии, время, в которое можно назвать испытания до конца, и поведение, задокументированное в паспорте данных (например, дрожь может быть неподходящим поведением для насекомого по выбору).
- Определите конкретные вопросы исследования, на которые необходимо ответить с помощью этих данных, уточняя параметры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Например, если исследователь заинтересован в влиянии длительного воздействия на восстановление, время во льду является ключевой переменной для изменения. Если исследователи заинтересованы в различиях в физиологии между светлыми и темными видами, они могут выбрать либо два отчетливо окрашенных вида, либо изменить цвет крыльев насекомого, чтобы измерить влияние цвета крыльев на время восстановления. Важно отметить, что этот метод легко настраивается в соответствии с потребностями и поставленными исследовательскими вопросами (см. раздел обсуждения).
- Определите конкретные вопросы исследования, на которые необходимо ответить с помощью этих данных, уточняя параметры.
3. Сбор насекомых
- Собирайте насекомых с помощью соответствующих методов, таких как ловушки с приманкой и энтомологические сети(Дополнительный рисунок 1). После сбора поместите каждого человека в отдельный стеклянный конверт с уникальным идентификатором.
- Храните животных в затененном прохладном месте после отлова и до воздействия эксперимента с холодным шоком. Всегда подвергайте животное экспериментальному лечению в течение 24 часов после отлова и стандартизируйте это время как можно больше во всех испытаниях.
- Хотя условия хранения могут варьироваться, держите насекомых подальше от прямых солнечных лучей. Если возможно, поместите их в помещение в прохладное, темное помещение.
- В полевых условиях убедитесь, что они будут затенены во время хранения и защищены от ветра (сдувания) и других насекомых-хищников, которые могут войти в конверты.
4. Настройте эксперимент с холодным ударом
- Наполните кулер льдом и водой. Убедитесь, что льда достаточно для поддержания в течение по крайней мере одного часа, и периодически добавляйте лед по мере необходимости с целью поддержания окружающей среды в воде при 0 ° C.
- Выберите между 1 и 4 фокусными лицами для раунда экспериментов, убедившись, что каждый человек идентифицируется.
- Если используется несколько видов, используйте только один из них, чтобы избежать путаницы в техническом описании. Если вы экспериментируете только с одним видом, используйте только особей, которые можно легко отличить, например, по сломанному крылу или отчетливой маркировке.
- Если цель эксперимента не связана с окраской крыльев, пометьте крылья уникальными идентификаторами (например, цифрами) с помощью тонкого маркера с войлочного наконечника, чтобы различать людей.
- Если эксперименты не соответствуют ни одному из вышеперечисленных критериев, проводите эксперимент на одном человеке за раз.
- Заполните строки технического описания информацией, относящейся к каждому анализируемому насекомому, включая их уникальный идентификатор и полезный идентификатор в примечаниях, таких как название вида или отличительный характер(Дополнительная таблица 1).
- Поместите всех фокусных лиц (все еще в их индивидуально маркированных конвертах) в запечатанный пластиковый пакет с весом(Таблица материалов)и поместите пакет в ледяную воду на 60 минут (или до тех пор, пока не будет вызвана холодная кома; см. обсуждение)(Дополнительный рисунок 2).
- Убедитесь, что вес тяжелый (например, большие монеты, большие шайбы или гладкие камни) и достаточно большой, чтобы мешок насекомых был погружен в ледяную воду и перпендикулярен поверхности воды. Используйте вес, который не вызывает утечек в герметичном полиэтиленовом пакете.
ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как насекомые все еще могут восстанавливаться, если они подвергаются непосредственному воздействию воды во время погружения, влажные оболочки затрудняют удаление каждой особи. Лучше всего поддерживать насекомых сухими в их сумке.
- Убедитесь, что вес тяжелый (например, большие монеты, большие шайбы или гладкие камни) и достаточно большой, чтобы мешок насекомых был погружен в ледяную воду и перпендикулярен поверхности воды. Используйте вес, который не вызывает утечек в герметичном полиэтиленовом пакете.
- Запись данных о температуре и освещенности.
- Используйте регистратор данных (см. Таблицу материалов)для записи данных о температуре окружающей среды и освещенности с помощью шага 5.1 или 5.2.
- Запрограммируйте регистратор данных на сбор данных о температуре и освещении с интервалом в 10 с, начиная с момента выпуска насекомых.
- Основывайте время начала регистратора данных на том, когда насекомые были помещены в ледяную воду. Обеспечить синхронизацию информации регистратора данных (дата, время) таким образом, чтобы данные об условиях окружающей среды впоследствии могли быть сопоставлены с каждым отдельным очаговым насекомым.
- Используйте простой термометр для записи данных о температуре и освещении через короткие промежутки времени вручную (вторым исследователем).
- Определитесь с экспериментальными параметрами, которые следует связать со временем восстановления, которое можно измерить без регистратора данных. Используйте различные методы лечения: тень/солнце; сумерки/середина дня.
- Используйте регистратор данных (см. Таблицу материалов)для записи данных о температуре окружающей среды и освещенности с помощью шага 5.1 или 5.2.
- Поместите сетчатую клетку для насекомых в соответствующее место, чтобы температура и световая среда были как можно более однородными в клетке, а также чтобы основание клетки было приподнятым и можно было постукивать наблюдателем.
- Поместите регистратор данных прямо за пределы клетки или внутри клетки, чтобы он не был опрокинут или иным образом затронут небольшими движениями внутри клетки. Если не используется регистратор данных, расположите термометр соответствующим образом и/или установите клетки в соответствующей конфигурации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Регистратор данных должен быть размещен таким образом, чтобы регистрируемые условия окружающей среды были как можно ближе к тем, которые испытывает насекомое.
5. Запустите эксперимент с холодным шоком
- Удалите животных из ледяной водяной бани через 60 мин (или время, определенное соответствующим образом; см. выше). Немедленно извлеките насекомых из пластикового пакета и извлеките каждую особь из его конверта как можно быстрее, минимизируя обработку(Дополнительный рисунок 3).
- Запустите секундомер, как только животные постанут в сетчатые клетки (см. пример данных, Дополнительная таблица 1).
- Постучите карандашом по основанию клетки, чтобы перемешать выздоравливающих насекомых.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предоставление стимулов во время выздоровления гарантирует, что очаговые насекомые демонстрируют состояние восстановления и поведение, как только они будут физиологически способны(Дополнительное видео).- Нажимайте часто и достаточно сильно, чтобы гарантировать, что животное будет реагировать, если это возможно, но не вызовет ответа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Например, при постукивании по клетке, если животное катапультируется в воздух и приземляется вертикально, но не двигается, чтобы стоять самостоятельно, это не считается «стоячем» поведением, так как организм действительно не стоял сам по себе.
- Нажимайте часто и достаточно сильно, чтобы гарантировать, что животное будет реагировать, если это возможно, но не вызовет ответа.
- Отметьте испытание как завершенное после того, как человек прилетел (т.е. показал полное выздоровление). Закончите испытание и считайте, что насекомое достигло полного выздоровления, если оно не двигается через 30 минут.
- Извлеките насекомых из клетки сетки и поместите особей обратно в их помеченные стеклянные конверты. Освободите животных или сохраните их для дальнейшего сбора данных (например, индивидуальные признаки размера, веса).
- При использовании регистратора данных остановите сбор данных регистратора данных и сохраните файл данных о температуре и освещенности во время эксперимента с соответствующей информацией о дате и времени.
6. Обработка данных
- Введите данные, представленные из таблицы, в электронную таблицу (например, MS Excel).
- При использовании регистратора данных добавьте данные о температуре и освещенности для каждого ответа каждого отдельного анализируемого.
- Рассчитайте среднее и стандартное отклонение температуры и света для каждого поведения каждого человека.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку регистратор данных регистрирует данные каждые 10 с, если поведение стенда для одного животного заняло 48 с, используйте первые 5 записей из регистратора данных для этого испытания. - Свяжите каждое поведение каждого человека при восстановлении с абиотическими данными, записанными регистратором данных, округляя интервалы вверх или вниз по мере необходимости.
- Рассчитайте среднее и стандартное отклонение температуры и света для каждого поведения каждого человека.
- Построение и анализ данных. Например, на рисунке 1визуализируется влияние температуры и света на время восстановления после холодового шока. Соберите другие соответствующие данные (видовые признаки, региональные характеристики среды обитания) для изучения экологических и эволюционных закономерностей в физиологических признаках тестируемых групп.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рисунок 1 был построен с использованием пакета ggplot2 в R. Уровень детализации данных об условиях окружающей среды будет различаться в зависимости от приборов, используемых для измерения условий окружающей среды. Если используется регистратор данных, можно сгенерировать рисунки с детализацией, сравнимой с рисунком 2. Если использовать термометр, исследователь не сможет создать график, информированный окружающим светом. Аналогичным образом, если исследователи используют категории света или температуры, эти диаграммы рассеяния могут быть изменены в квадратные графики или другой соответствующий шаблон для иллюстрации этих явлений.
Representative Results
Данные, собранные в этом протоколе, позволяют и анализировать переменные, важные для физиологии организма. Например, как температурные, так и световые условия способствуют восстановлению бабочек от холодовогошока (рисунок 1). Сюжет предназначен для изучения взаимодействия между условиями окружающей среды и восстановлением холодового шока. Используя пойманных в дикой природе бабочек как из ловушек, так и из сетей, 181 вид бабочек продемонстрировал отчетливое восстановление от холодной комы, вызванной холодным шоком(рисунок 2). Данные, представленные на рисунке 2, были собраны тремя наблюдателями в течение примерно пяти месяцев (январь, февраль, май-июль 2020 года) в колумбийских Андах. Эксперименты всегда проводились на следующее утро после сбора бабочек. При максимальной эффективности два наблюдателя смогли одновременно наблюдать за четырьмя бабочками каждая, повторенные семь раз (минимум 7,37 часа), в результате чего тестирование 56 особей за одно утро. Это позволило пролить большой объем данных по целым сообществам бабочек, включая и рассматривая данные об отдельных вариациях. Поскольку анализы могут происходить в условиях окружающей среды, условия восстановления являются репрезентативными для их среды обитания и отражают естественную изменчивость, испытываемую организмами в природе. Рисунок 3 иллюстрирует перекрытие между температурными и световыми условиями эксперимента по восстановлению после холодного удара и условиями на пастбище, с которого были собраны некоторые испытанные бабочки.
Рисунок 1:Графики рассеяния времени восстановления (в секундах) бабочек после холодового шока. (A)Средняя температура и(B)средняя LUX (интенсивность света) во время их восстановления. Виды организованы и окрашены по семействам. В целом, по мере увеличения света и температуры время восстановления холодового шока уменьшается, показывая изменчивость по таксонам. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Пример результатов анализа восстановления после холодового шока на 181 вид бабочки из колумбийских Анд. Данные представляют собой количество секунд, прошедших с момента извлечения бабочки из холода и когда она смогла летать. Виды организованы и окрашены по семействам. Этот рисунок демонстрирует таксономическую широту, в которой этот эксперимент может быть успешно применен, и разнообразие реакций восстановления холодного шока у разных видов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Температура окружающей среды и LUX во время испытаний на восстановление после холодового удара. График температуры окружающей среды (синий) и LUX (интенсивность света, красный), записанный регистраторами данных, размещенными на пастбищах, где происходил сбор бабочек (светлые цвета, условия охватывают весь день) и условия во время испытаний по восстановлению после холодного шока (темные цвета, только утренние часы). Построение полевых условий окружающей среды и экспериментальных условий показывает диапазон и средние условия, с которыми сталкиваются бабочки в течение одной недели полевого отбора проб и экспериментов. Эксперименты проводились только в ранние часы (07:00-13:00 ч), в то время как регистраторы данных были развернуты в полевых условиях в течение одной недели (световое время, 06:00-18:00 ч показано). Здесь показано перекрытие между экспериментальными условиями и условиями окружающей среды, испытываемыми бабочками, демонстрируя экологическую значимость проведения физиологических анализов в условиях окружающей среды. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1: Порядок сбора очаговых насекомых-в данном случаебабочек-сиспользованием приманочных ловушек Ван-Сомерена и активных сетей. Ловушки были приманенными как гниющей рыбой, так и гниющими фруктовыми приманками. Ловушка (без приманки) на заднем плане, на переднем плане изображен экземпляр в своем уникальном конверте на фоне синей пластиковой коробки для сбора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 2:Мешки с четырьмя отдельными бабочками, погруженными в ледяную воду в охладитель. Пластиковые пакеты были отмечены временем, когда они были помещены в ледяную воду, так что эксперименты с холодным шоком можно было проводить в шахматном порядке в течение утра. Пластиковые пакеты должны быть запечатаны, чтобы предотвратить намоканию образцов; однако затопление мешков и конвертов в этом случае не оказало измеримого влияния на восстановление бабочек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 3:Два наблюдателя собирают данные на местах. Каждая сетчатая клетка содержит четырех уникальных бабочек, восстанавливающихся после холодового шока. Т-соединение поливинилхлорида в клетке содержит регистратор данных для предотвращения прямого воздействия солнца или дождя. У каждого наблюдателя есть секундомер, который запускался сразу после выпуска бабочки в клетку. Клетки приподняты скамейками, что позволяет наблюдателям агитировать основание клетки, чтобы бабочки реагировали поведенчески как можно быстрее. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительная таблица 1: Пример технического описания. На листе отображается уникальный идентификатор каждой бабочки, назначенный в поле, и отличительные символы (название вида, ключевые цвета) в примечаниях. Также зафиксировано доминирующее положение бабочки (т.е. какая сторона крыла подвергалась воздействию солнца) в период восстановления, отмеченное как D (дорсальный) или V (вентральный). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Дополнительное видео 1: Постукивание клетки для восстановления после холодового шока. Когда бабочки выздоравливают, наблюдатель осторожно постукивает по основанию клетки, чтобы вызвать поведение, как только бабочки будут способны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Discussion
Изучение тепловой физиологии включает в себя измерения видов и признаков окружающей среды, чтобы лучше понять взаимодействия между организмами и их окружением, которые являются ключом к выживанию и приспособленности. Хотя тепловые черты всегда являются неотъемлемой частью понимания естественной истории и экологии растений и животных, они имеют все большее значение перед лицом ландшафта и изменения климата11,21. Несколько групп эктотермических наземных насекомых, в частности, чешуекрылых и одонатанов, относительно велики и многочисленны, демонстрируют различное поведение и поддаются манипуляциям. Здесь описан эффективный и недорогой анализ для эффективного измерения физиологических реакций таких насекомых. Этот протокол требует источника здоровых организмов для анализа, время обработки которых до эксперимента ограничено. Несмотря на гибкость в отношении числа организмов, анализируемых за один раз, число фокусных особей в одном эксперименте будет варьироваться в зависимости от цели сбора данных и/или числа наблюдателей.
Например, этот протокол был разработан для сбора подробных индивидуальных данных о бабочах в целых сообществах. Таким образом, репрезентативные результаты иллюстрируют усилия по максимальному сбору данных по отдельным особям как можно большего количества видов и при различных условиях, имеющих отношение к местной окружающей среде. Независимо от количества очаговых видов, для наблюдателя крайне важно иметь возможность идентифицировать каждую особь в клетке, переживающую выздоровление. Если цель состоит в том, чтобы собрать данные только от одного вида, то только одна или две особи (если они идентифицируются на основе разного износа крыльев или если они индивидуально отмечены) должны быть сразу же анализированы. Предметы исследования должны быть выбраны в соответствии с конкретным исследовательским вопросом или планом обучения. В зависимости от поставленного вопроса и цели сбора данных (например, исследования или классной комнаты), размер выборки и сбор других признаков будут различаться.
Чтобы проиллюстрировать фундаментальные компоненты физиологии, проясняемые этим протоколом (индукция холодовой комы, этапы восстановления, роль условий окружающей среды), преподаватель в классе может выбрать два различных вида или морфы одного вида. Если очаговые особи отличаются только одним ключевым признаком (например, цветом), потребуется меньший размер выборки, и студенты могут внимательно изучить взаимосвязь этого признака и физиологии организма. Исследователи, интересующиеся экологической физиологией, могут использовать свои экспериментальные данные для изучения сложных экологических и эволюционных вопросов. Исследователи должны быть уверены, что тщательно выбирают очаговых насекомых, которые непосредственно решают их вопросы (например, на основе стадии жизни, возраста, пола, местоположения), и, основываясь на количестве вовлеченных переменных, определяют соответствующий размер выборки. Размеры выборки для сложных моделей будут больше, чем описанные выше.
При сборе данных о поведенческом восстановлении важно, чтобы клетка лежала над землей, потому что наблюдатель должен быть в состоянии постучать по дну клетки, чтобы вызвать поведение восстановления. Это гарантирует, что организм реагирует (стоит, летает), как только он физиологически способен это сделать, и поведение терминального восстановления (полет) документируется. Регистрация условий окружающей среды во время восстановления после холодового шока является неотъемлемой частью изучения физиологии тепла, поскольку этот протокол предназначен для изучения и распутывать роль окружающей среды в физиологии организма. Регистраторы данных (см. Таблицу материалов)полезны для записи стандартизированных показателей соответствующих условий (например, температуры, света и даже влажности). Однако, если эти инструменты недоступны, соответствующие условия могут быть измерены другими способами, такими как цифровой термометр или путем упрощения переменной условий окружающей среды и использования различных сред, таких как тень и солнце. Этот протокол дает исследователю возможность измерить условия во время восстановления после холодного шока на основе цели и объема исследования.
Хотя этот метод может быть модифицирован, чтобы лучше соответствовать конкретным таксономическим группам, рекомендуется использовать крупных, волюновых насекомых. Летающие насекомые, которые восстанавливают свою способность летать самостоятельно, можно считать достигающими полного выздоровления. Метод, как описано, успешно применялся на бабочках в тропиках и субтропиках. Основываясь на тепловых тенденциях данной области (т.е. диапазоне температур, испытываемых на участке, который будет варьироваться, тем самым влияя на ожидания, основанные на высоте, широте, покрытии полога), организму может потребоваться более или менее одного часа на ледяной водяной бане, чтобы войти в холодную кому. Размер организма также может влиять на время, необходимое для вступления в холодную кому. Это ключ к тому, чтобы найти время воздействия холода, необходимое для того, чтобы вызвать холодную кому (не двигаясь), но не убить очаговые виды. Время, необходимое для того, чтобы вызвать холодную кому, будет зависеть от размера, местоположения и естественной истории / поведения людей. Основываясь на результатах эксперимента с холодным шоком, описанного в настоящем документе, и используя знания об экологии очаговых насекомых, выберите время, в которое следует завершить испытание, если данный человек не выздоровеет полностью.
Основываясь на конкретных вопросах исследователя, этот метод может быть использован либо в полевых условиях, либо в лаборатории, чтобы обеспечить как естественную изменчивость окружающей среды, так и контроль важных переменных, соответственно. Этот анализ прост и недорог и помогает заполнить существующие пробелы в области физиологии тепла. Простота этого протокола делает его доступным для использования для разнообразного массива таксонов, открывая поле для большего, чем лабораторные организмы. Новизна выполнения стандартизированного, но окружающего теплового анализа заполняет пробел между лабораторными и полевыми результатами22. Использование условий окружающей среды для восстановления организма поможет исследователям разделить роль факторов окружающей среды и вида в физиологии14,22. Наконец, из-за его низкой стоимости и отсутствия необходимых материалов, этот протокол может использоваться в отдаленных местах в полевых условиях с небольшим количеством оборудования - идеально подходит для многих полевых биологов - а также в классах, чтобы позволить молодым студентам получить практический опыт обучения.
Disclosures
У автора нет конкурирующих финансовых интересов или других конфликтов интересов.
Acknowledgments
Спасибо Джарету Дэниелсу, Изабелле Пламмер, Бретту Шефферу и Дэну Хану за вклад в протокол, когда он был впервые разработан. Дополнительная благодарность Хайме Хаггарду, Себастьяну Дюрану и Индиане Кристобалю Ройсу-Малаверу за реализацию нескольких итераций этого протокола и за вклад в ключевые компоненты. Спасибо также анонимному рецензенту за отзыв о рукописи в целом. Поддержка была оказана издательским фондом Центра Чешуекрылых и биоразнообразия Макгуайра, Колледжем сельскохозяйственных и биологических наук, Школой природных ресурсов и окружающей среды и отделом экологии и сохранения дикой природы в UF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 x 24 x 36" Popup Rearing & Observation Cage | Bioquip | 1466PB | Ensure that the cage is slightly elevated from the ground to be able to tap the floor of the cage during experiments. |
| Cooler | Any | NA | |
| Glassine envelopes | Bioquip | 1130B | |
| HOBO Pendant Temperature/Light 8K Data Logger | Onset | UA-002-08 | If a datalogger is not accessible, researchers may choose to use a digital thermometer to record ambient temperatures at regular intervals. See protocol step 4.5 for additional information. |
| HOBO Optic USB Base Station | Onset | Base-U-1 | |
| Ice water | NA | NA | |
| Insects (focal taxa) | NA | Any | Collect sufficient samples to test, ensuring replication of experimental groups (e.g. species, sampling location) |
| PVC T-joint | Any | Any | |
| Sealable plastic bag | Any | NA | |
| Stopwatch/timer | Any | NA | |
| Weight | Any | NA | Large coins or small rocks to weigh down the plastic bags will ensure that specimens are submerged in ice water. A standardized weight is ideal. |
References
- Huey, B., Stevenson, R. D. Integrating thermal physiology and ecology of ectotherms a discussion of approaches. American Zoologist. 19 (1), 357-366 (1979).
- Huey, R. B., Slatkin, M. Cost and benefits of lizard thermoregulation. The Quarterly Review of Biology. 51 (3), 363-384 (1976).
- Kingsolver, J. G. Butterfly thermoregulario: Organismic mechanisms and population consequences. Journal of Research on the Lepidoptera. 24, 1-20 (1985).
- Kingsolver, J. G. Evolution and coadaptation of thermoregulatory behavior and wing pigmentation pattern in pierid butterflies. Evolution. 41 (3), 472-490 (1987).
- Kingsolver, J. G., Huey, R. B. Evolutionary analyses of morphological and physiological plasticity in thermally variable environments. American Zoologist. 38, 545-560 (1998).
- Malhi, Y., Wright, J. Spatial patterns and recent trends in the climate of tropical rainforest regions. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 359 (1443), 311-329 (2004).
- Sears, M. W., et al. Configuration of the thermal landscape determines thermoregulatory performance of ectotherms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (38), 10595-10600 (2016).
- Sinclair, B. J., Coello Alvarado, L. E., Ferguson, L. V. An invitation to measure insect cold tolerance: Methods, approaches, and workflow. Journal of Thermal Biology. 53, 180-197 (2015).
- Angilletta, M. Thermal adaptation: a theoretical and empirical synthesis. , Oxford University Press. (2009).
- Perkins-Kirkpatrick, S. E., Gibson, P. B. Changes in regional heatwave characteristics as a function of increasing global temperature. Scientific Reports. 7, 12256 (2017).
- Frishkoff, L. O., Hadly, E. A., Daily, G. C. Thermal niche predicts tolerance to habitat conversion in tropical amphibians and reptiles. Global Change Biology. 21 (11), 3901-3916 (2015).
- Nowakowski, A. J., Otero Jiménez, B., Allen, M., Diaz-Escobar, M., Donnelly, M. Landscape resistance to movement of the poison frog, Oophaga pumilio, in the lowlands of northeastern Costa Rica. Animal Conservation. 16 (2), 188-197 (2013).
- Kingsolver, J. G., Buckley, L. B. Quantifying thermal extremes and biological variation to predict evolutionary responses to changing climate. Philosophical Transactions of the Royal Society B. Biological Sciences. 372 (1723), 20160147 (2017).
- Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals. Journal of Experimental Biology. 218, 1956-1967 (2015).
- Sinclair, B. J., Williams, C. M., Terblanche, J. S. Variation in thermal performance among insect populations. Physiological and Biochemical Zoology. 85 (6), 594-606 (2012).
- Gotcha, N., Terblanche, J. S., Nyamukondiwa, C. Plasticity and cross-tolerance to heterogeneous environments: divergent stress responses co-evolved in an African fruit fly. Journal of Evolutionary Biology. 31 (1), 98-110 (2018).
- Mutamiswa, R., Chidawanyika, F., Nyamukondiwa, C. Superior basal and plastic thermal responses to environmental heterogeneity in invasive exotic stemborer Chilo partellus Swinhoe over indigenous Busseola fusca (Fuller) and Sesamia calamistis Hampson. Physiological Entomology. 43 (2), 108-119 (2018).
- de Jong, M. A., Saastamoinen, M. Environmental and genetic control of cold tolerance in the Glanville fritillary butterfly. Journal of Evolutionary Biology. 31 (5), 636-645 (2018).
- DeVries, Z. C., Kells, S. A., Appel, A. G. Estimating the critical thermal maximum (CTmax) of bed bugs, Cimex lectularius: Comparing thermolimit respirometry with traditional visual methods. Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Molecular & Integrative Physiology. 197, 52-57 (2016).
- De Keyser, R., Breuker, C. J., Hails, R. S., Dennis, R. L. H., Shreeve, T. G. Why small is beautiful: Wing colour is free from thermoregulatory constraint in the small lycaenid butterfly, Polyommatus icarus. PLoS One. 10 (4), 0122623 (2015).
- Nowakowski, A. J., et al. Tropical amphibians in shifting thermal landscapes under land-use and climate change. Conservation Biology. 31 (1), 96-105 (2017).
- Niehaus, A. C., Angilletta, M. J., Sears, M. W., Franklin, C. E., Wilson, R. S. Predicting the physiological performance of ectotherms in fluctuating thermal environments. Journal of Experimental Biology. 215, 694-701 (2012).
