Summary
כאן מתואר פרוטוקול זול ונגיש להערכת התאוששות הלם קר של פרפרים בתנאי סביבה.
Abstract
פיזיולוגיה אקולוגית, במיוחד של ectotherms, חשוב יותר ויותר בעולם המשתנה הזה כפי שהוא משתמש במדדים של מינים ותכונות סביבתיות כדי לחקור את האינטראקציות בין אורגניזמים וסביבתם כדי להבין טוב יותר את הישרדותם ואת הכושר שלהם. מבחנים תרמיים מסורתיים הם יקרים במונחים של זמן, כסף, וציוד ולכן מוגבלים לעתים קרובות לגדלים מדגם קטן ומינים מעטים. מוצג כאן פרוטוקול חדשני המייצר נתונים מפורטים על התנהגות הפרט ופיזיולוגיה של חרקים גדולים, וולנטיים, יבשתיים, באמצעות הדוגמה של פרפרים. מאמר זה מתאר את השיטות של בדיקה התאוששות הלם קר שניתן לבצע בשטח בתנאים סביבתיים סביבתיים ואינו דורש ציוד מעבדה יקר. שיטה זו שימשה להבנת אסטרטגיית התגובה וההתאוששות להלם קר של פרפרים טרופיים, תוך יצירת נתונים ברמה האישית על פני קהילות פרפרים שלמות. ניתן להשתמש בשיטות אלה הן במסגרות שדה מרוחק והן בכיתות לימוד וניתן להשתמש בהן כדי ליצור נתונים פיזיולוגיים רלוונטיים מבחינה אקולוגית ככלי הוראה.
Introduction
השילוב של פיזיולוגיה תרמית ואקולוגיה בסוף שנות השבעים ובתחילת שנות השמונים1,2 השיק את תחום הפיזיולוגיה האקולוגית. מחקרים תרמיים נרחבים שנערכו על ectotherms להדגיש סינרגיות אקולוגיות-פיזיולוגיות על פני הקשרים אקולוגיים-אבולוציוניים מגוונים3,4,5. מחקר על פיזיולוגיה תרמית של אורגניזמים אקותרמיים החזיר את תשומת הלב לאחרונה לנוכח שינוי האקלים ושינה נופים תרמיים ברחבי העולם6,7. בנוסף ללימודים בתחום האקדמי של פיזיולוגיה אקולוגית, מבחני פיזיולוגיה תרמית יכולים להיות נגישים באופן נרחב לחוקרים ויכולים לשמש כגישה מעשית להוראה לכל הרמות. רכיבים של ביצועים תרמיים, כולל גבולות תרמיים והשפעות של זעזועי טמפרטורה, הם היסוד לאקולוגיה, להתנהגות ולתולדות החיים של בעליחיים 8,9.
באופן ספציפי, ecototherms משמשים כדי לענות על שאלות של פיזיולוגיה, כמו אנדותרמיה מכתיב קשר בלתי ניתן לניתק בין טמפרטורת הסביבה והאורגניזם. טווח הטמפרטורות שאורגניזמים יכולים לעמוד בו (המינימום התרמי הקריטי שלהם לטווח תרמי מרבי) והטמפרטורות שבהן התנהגויותיהם וכושרם מוגדלים (אופטימה תרמית) מושרשת לעתים קרובות בתהליכים אקולוגיים ואבולוציוניים. תכונות פיזיולוגיות אלה הן בעלי חשיבות גוברת כמו טמפרטורות, הן אמצעים וקיצוניות, גדלים10. לדוגמה, השינויים האביוטיים, כולל עליית הטמפרטורה, המלווים הרס בתי גידול ופיצול השפיעו על קהילות של ectotherms, כולל anurans, הגבלת מינים שבריריים מבחינה פיזיולוגית (עם סובלנות תרמית צרה) לשרידים קטנים של בתי גידול11,12.
הערכת מרכיבים מרכזיים של ביצועים תרמיים יכולה להיות יקרה הן מבחינת זמן והן מבחינת משאבים ובאופן מסורתי דורשת ציוד מעבדה ותנאים מתוקננים. יתר על כן, מבחנים קונבנציונליים לעתים קרובות אינם משקפים את רוחבם של תנאי הסביבה מנוסים בטבע על ידי בעל חיים נתון13 כמו טמפרטורה בניסויים פיזיולוגיים דומים נשלט בקפידה ולעתים קרובות אינו קשור לתנאי הסביבה מנוסים על ידי בעל חיים. בקרת טמפרטורה זו יכולה להפחית את ההבנה של וריאציה בתגובות בודדות2,14. פיזיולוגים הסתמכו על ניסויי חימום וקירור מבוססי מעבדה, תוך שימוש באמבטיות מים ניתנות לתכנות כדי לחמם או לקרר בהתמדה את סביבת החיה כדי ליידע את עקומות הביצועים התרמיים15.
בדרך כלל, בעלי חיים ממוקמים בקבוקונים עם thermocouple, ואת טמפרטורת הסביבה שלהם משתנה בהתמדה על ידי שליטה על הטמפרטורה של אמבט המים שמסביב. החוקרים מודדים את הזמן שלוקח להשיג מצב פיזיולוגי שונה (למשל, תרדמת צוננת, הפלה) ואת הטמפרטורה שבה התרחש שינוי הסטטוס16,17. החל ממינימום של $500, כלים אלה הם גדולים, כבדים, ודורשים ציוד טכני נוסף (למשל, מחשב, thermocouples). כתוצאה מכך, הכלים הבסיסיים לביצוע שיטות קלאסיות להערכת ביצועים תרמיים הם 1) לא נגישים כלכלית לכולם, 2) לא מתאימים לחיות גדולות מכדי להיכלל בבקבוקונים מקובלים המשמשים לדיפטרנים קטנים, ו -3) לא ניידים לשימוש בהגדרות שדה מרוחק. דבקות בפרקטיקה המקובלת הביאה לייצוג מוגבל על פני טקסונומיה ותנאים ניסיוניים18,19,20.
בעוד עקומות ביצועים תרמיים מלאים יכולים ליידע את הפצת המינים, תכונות היסטוריית החיים, והתנהגות, בין תכונות אחרות, כימות של מדדים תרמיים פחות ופשוטים יכול להיות יעיל יותר ועדיין אינפורמטיבי מאוד. מבחנים פיזיולוגיים, מדידת התפרצות תרדמת צמרמורת והתאוששות הלם קר לאחר מכן, התקשות קרה, והתנהגות תיקון, הם פרוקסי יעילים ותשיקים למינימום התרמי הקריטי של אורגניזם8. המתואר כאן הוא הלם קר assay שימושי עבור לעורר נתונים פיזיולוגיים מחרקים אקותרמיים יבשתיים גדולים. ההסתעפות היא סבירה, נגישה וקלה לביצוע בתנאי שדה או בכיתה. נתונים על התאוששות הלם קר שנוצר על ידי פרוטוקול זה ניתן לשלב עם מינים או נתוני תכונה ברמה האישית כדי להמשיך שאלות לגבי פיזיולוגיה אקולוגית ו / או משמש ללמד את התלמידים על עקרונות פיזיולוגיים.
Protocol
1. זיהוי מינים של עניין
- לזהות מינים של עניין כדי לקבוע זמן התאוששות הלם קר. זכור כי כל קבוצה תהיה שונה בזמן שלוקח לגרום לתרדמת צוננת (כלומר, הנקודה שבה החרק עדיין בחיים, אך אינו זז ואינו מגיב). כמו כן, בהתבסס על האורגניזם והשימוש בנתונים, בחר נקודות ניתוק שונות שבהן ניתן לעצור את הניסוי אם המוקדים אינם טסים (ראה סעיף 4).
הערה: פרוטוקול זה תוכנן ופותח לשימוש בלפידופטרה. עם זאת, הוא חל על חרקים גדולים, וולנטיים, יבשתיים, בפרט, אלה שניתן לאחסן שטוח במעטפות glassine הגבלת תנועה ונזק (למשל, פרפרים שפיריות / עלמות).
2. עריכת קדם משפט
- בצע קדם משפט במדגם קטן של אנשים כדי לקבוע את הפרמטרים העיקריים. עקוב אחר סעיפים 3 עד 5 של הפרוטוקול שלהלן עם 5-10 אנשים עבור קדם משפט.
- בדוק את הזמן הנדרש על הקרח כדי לגרום לתרדמת צוננת (לא זז), אבל לא להרוג את המינים המוקד על ידי ביצוע שלב 5.1 באמצעות טיפולים של 30 דקות, 60 דקות, ו 90 דקות.
הערה: הזמן הנדרש כדי לגרום לתרדמת צמרמורת יהיה תלוי בגודל, מיקום, ואת ההיסטוריה הטבעית / התנהגות של הפרטים. - בהתבסס על תוצאות שלבים 4.1-4.4 ושימוש בידע על האקולוגיה של חרקי המוקד, לבחור זמן שבו לסיים את הניסוי אם אדם נתון אינו עושה החלמה מלאה. לבסס הפעם ניתוק על האקולוגיה של המין גם כן, תוך התחשבות כי לאחר דקות רבות של חוסר היכולת לעוף, חרקים רבים קדמו.
הערה: לדוגמה, אם רוב הניסויים הראשוניים מסתיימים בטיסה לאחר 15 דקות, אפשר להחליט לסיים את הניסויים לאחר 25 דקות כדי להבטיח שגם לחריגים יש סיכוי להתאושש לחלוטין (כלומר, לעוף). פרוטוקול זה מבוסס על זמן ניתוק של 30 דקות (שלב 5.4).
- בדוק את הזמן הנדרש על הקרח כדי לגרום לתרדמת צוננת (לא זז), אבל לא להרוג את המינים המוקד על ידי ביצוע שלב 5.1 באמצעות טיפולים של 30 דקות, 60 דקות, ו 90 דקות.
- השתמש בפרמטרים מנתונים לפני משפט כדי ליידע את איסוף הנתונים עבור הניסויים. לשנות את הפרוטוקול המתואר להלן בהתבסס על הצרכים של האורגניזמים המוקד, כולל זמן תרחיף הקרח, זמן לקרוא ניסויים לסיום, והתנהגויות המתועדות על גיליון הנתונים (למשל, צמרמורת עשויה להיות התנהגות בלתי הולמת עבור החרק של בחירה).
- הגדר שאלות מחקר ספציפיות שיש לענות עליהן באמצעות נתונים אלה תוך זיקוק הפרמטרים.
הערה: לדוגמה, אם החוקר מעוניין בהשפעה של חשיפה ממושכת על התאוששות, הזמן בקרח הוא משתנה מפתח לשינוי. אם החוקרים מעוניינים בהבדלים בפיזיולוגיה בין מינים בהירים וכהים, הם יכולים לבחור שני מינים בצבעים מובהקים או לשנות את צבע הכנף של החרק כדי למדוד את ההשפעה של צבע הכנף על זמן ההחלמה. חשוב לציין כי שיטה זו ניתנת להתאמה אישית רבה לצרכים ולשאלות המחקר המוצגות (ראו סעיף הדיון).
- הגדר שאלות מחקר ספציפיות שיש לענות עליהן באמצעות נתונים אלה תוך זיקוק הפרמטרים.
3. אוסף חרקים
- לאסוף חרקים בשיטות מתאימות כגון מלכודות פיתיון ורשתות אנטומולוגיות,(איור משלים 1). לאחר האיסוף, הניחו כל אדם במעטפת זכוכית נפרדת עם תעודה מזהה ייחודית.
- יש לאחסן בעלי חיים במקום מוצל וקריר לאחר שנלכדו ולפני החשיפה לניסוי ההלם הקר. תמיד לחשוף את החיה לטיפול ניסיוני בתוך 24 שעות של לכידה, ולתקנן הפעם ככל האפשר על פני ניסויים.
- למרות שתנאי האחסון עשויים להשתנות, יש להרחיק את החרקים מהשמש הישירה. במידת האפשר, הניחו אותם בבית בחדר קריר וחשוך.
- בשטח, ודאו שהם יוצללו בזמן האחסון והם מוגנים מפני רוח (נושבת) וטורפי חרקים אחרים שעשויים להיכנס למעטפות.
4. הגדר את ניסוי ההלם הקר
- מלאו צידנית בקרח ובמים. ודא כי יש מספיק קרח כדי להתמיד לפחות שעה אחת, ולהוסיף קרח מעת לעת לפי הצורך במטרה לשמור על הסביבה במים ב 0 מעלות צלזיוס.
- בחר בין 1 ל -4 אנשים מוקדיים לסיבוב של ניסויים, מוודא שכל אדם ניתן לזיהוי.
- אם אתה משתמש במינים מרובים, השתמש רק באחד מכל אחד מהם כדי להימנע מבלבול בין אנשים בגליון הנתונים. אם מתנסים עם מין אחד בלבד, יש להשתמש רק באנשים שניתן להבחין ביניהם בקלות, למשל על ידי כנף שבורה או סימון ברור.
- אם מטרת הניסוי אינה קשורה לצבע כנף, סמנו את הכנפיים בתעודות זהות ייחודיות (למשל, מספרים) עם סמן עדין עם קצה לבד כדי להבחין בין אנשים.
- אם הניסויים אינם עומדים באף אחד מהקריטריונים לעיל, ערכו את הניסוי על אדם אחד בכל פעם.
- אכלס את השורות של גליון הנתונים במידע הרלוונטי לכל חרק הנבחן, כולל המזהה הייחודי שלו ומזהה שימושי בהערות כגון שם המין או התו המבדיל(טבלה משלימה 1).
- מניחים את כל המוקדים (עדיין במעטפות המסומנות בנפרד) בשקית ניילון אטומה עם משקל(שולחן החומרים), ומניחיםאת השקית במי קרח במשך 60 דקות (או עד שהתרדמת הצוננת נגרמה; ראודיון) (איור משלים 2).
- ודא שהמשקל כבד (למשל, מטבעות גדולים, מכונות כביסה גדולות או סלעים חלקים) וגדול מספיק כדי לשמור על שקית החרקים שקועה במי הקרח וניצבת אל פני המים. השתמש במשקל שאינו גורם לדליפות בשקית הפלסטיק האטומה.
הערה: בעוד חרקים עדיין מסוגלים להתאושש אם הם נחשפים ישירות למים בזמן שקוע, מעטפות רטובות לסבך את ההסרה של כל אדם. עדיף לשמור על החרקים יבשים בתיק שלהם.
- ודא שהמשקל כבד (למשל, מטבעות גדולים, מכונות כביסה גדולות או סלעים חלקים) וגדול מספיק כדי לשמור על שקית החרקים שקועה במי הקרח וניצבת אל פני המים. השתמש במשקל שאינו גורם לדליפות בשקית הפלסטיק האטומה.
- רשום טמפרטורה ונתוני תאורה.
- השתמש ביומן נתונים (עיין בטבלת החומרים)כדי לתעד את טמפרטורת הסביבה ואת נתוני האור באמצעות שלב 5.1 או 5.2.
- תכנן את אוגר הנתונים כדי לאסוף נתוני טמפרטורה ואור במרווחים של 10 שניות, החל ממרווחי הזמן שבהם החרקים ישוחררו.
- לבסס את שעת ההתחלה של חוטב הנתונים על כאשר החרקים הונחו במי הקרח. ודא שפרוטת אוגר הנתונים (תאריך, שעה) מסונכרנת כך שמאוחר יותר ניתן יהיה להתאים נתונים בתנאי סביבה לכל חרק מוקד בודד.
- השתמש במדחום פשוט כדי לתעד נתוני טמפרטורה ואור במרווחי זמן קצרים ביד (על ידי חוקר שני).
- החלט על הפרמטרים הניסיוניים שיש לשייך לזמן שחזור שניתן למדוד ללא אוגר נתונים. השתמש בטיפולים נפרדים: צל / שמש; דמדומים / אמצע היום.
- השתמש ביומן נתונים (עיין בטבלת החומרים)כדי לתעד את טמפרטורת הסביבה ואת נתוני האור באמצעות שלב 5.1 או 5.2.
- מניחים כלוב רשת לחרקים במקום מתאים, כך שסביבות הטמפרטורה והאור הן הומוגניות ככל האפשר בתוך הכלוב, כך שבסיס הכלוב מוגבה וניתן להקיש עליו על ידי הצופה.
- מניחים את חוטב הנתונים ממש מחוץ לכלוב, או בתוך הכלוב, כך שהוא לא יופל או יושפע בדרך אחרת על ידי תנועות קטנות בתוך הכלוב. אם אינך משתמש ביומן נתונים, מקם מדחום כראוי ו/או הגדר את הכלובים בתצורה המתאימה.
הערה: יש למקם את אוגר הנתונים כך שתנאי הסביבה המתועדים יהיו קרובים ככל האפשר לאלה שחרק חווה.
5. התחל ניסוי הלם קר
- הסר את בעלי החיים מאמבט מי הקרח לאחר 60 דקות (או זמן שנקבע מתאים; ראה לעיל). מוציאים מיד את החרקים משקית הניילון, ומסירים כל אדם מהמעטפה מהר ככל האפשר תוך מזעור הטיפול (איור 3 משלים).
- התחל את שעון העצר ברגע שבעלי החיים נמצאים בכלובי הרשת (ראה נתונים לדוגמה, טבלה משלימה 1).
- הקש על בסיס הכלוב בעיפרון כדי להתסיס את החרקים המתאוששים.
הערה: מתן גירויים במהלך ההחלמה מבטיח כי חרקים המוקד להפגין מצב התאוששות והתנהגויות ברגע שהם מסוגלים מבחינה פיזיולוגית (וידאו משלים).- הקש לעתים קרובות וחזק מספיק כדי להבטיח כי בעל חיים יגיב במידת האפשר, אך לא לגרום לתגובה.
הערה: לדוגמה, בעת הקשה על הכלוב, אם בעל חיים הוא מעוט לאוויר ונוחת זקוף, אבל לא זז לעמוד בכוחות עצמו, זה לא נחשב התנהגות "לעמוד", כמו האורגניזם אכן לא לעמוד בכוחות עצמו.
- הקש לעתים קרובות וחזק מספיק כדי להבטיח כי בעל חיים יגיב במידת האפשר, אך לא לגרום לתגובה.
- סמן את גירסת הניסיון כשלמה לאחר שאדם טס (כלומר, הראה התאוששות מלאה). לסיים את הניסוי ולשקול את החרק כדי להשיג התאוששות מלאה אם זה לא זז לאחר 30 דקות.
- מוציאים את החרקים מכלוב הרשת, ומחזירים את הפרטים למעטפות הזכוכית המסומנים שלהם. לשחרר את בעלי החיים או לשמור אותם לאיסוף נתונים נוסף (למשל, תכונות בודדות של גודל, משקל).
- אם אתה משתמש ביומן נתונים, הפסק את איסוף הנתונים של אוגר הנתונים ושמור את קובץ הטמפרטורה ונתוני האור במהלך הניסוי עם מידע התאריך/שעה המתאים.
6. עיבוד נתונים
- הזן את הנתונים המוצגים מגליון הנתונים לגיליון אלקטרוני (למשל, MS Excel).
- אם אתה משתמש ביומן נתונים, הוסף נתוני טמפרטורה ואור עבור כל תגובה של כל אדם.
- חשב את הממוצע ואת סטיית התקן של הטמפרטורה והאור עבור כל התנהגות של כל אדם.
הערה: כאשר אוגר הנתונים רושם נתונים כל 10 שניות, אם התנהגות המעמד של בעל חיים אחד ארכה 48 שניות, השתמש ב- 5 הערכים הראשונים של אוגר הנתונים עבור גירסת ניסיון זו. - שייך כל התנהגות שחזור של כל אדם לנתונים אביוטיים שנרשמו על-ידי datalogger, תוך עיגול למעלה או למטה למרווחי זמן של 10 שניות לפי הצורך.
- חשב את הממוצע ואת סטיית התקן של הטמפרטורה והאור עבור כל התנהגות של כל אדם.
- התווה ונתח נתונים. איור 1, לדוגמה, מדמיין את השפעת הטמפרטורה והאור על זמן התאוששות ההלם הקר. אסוף נתונים רלוונטיים אחרים (תכונות מינים, מאפייני בית גידול אזוריים) כדי לבחון את הדפוסים האקולוגיים והאבולוציוניים בתכונות הפיזיולוגיות של הקבוצות שנבדקו.
הערה: איור 1 הותווה באמצעות חבילת ggplot2 ב- R. רמת הפירוט של נתונים על תנאי הסביבה תהיה שונה בהתבסס על המכשירים המשמשים למדידת תנאי הסביבה. אם נעשה שימוש ביומן נתונים, ניתן ליצור נתונים עם פרטים דומים לאיור 2. אם נעשה שימוש במדחום, החוקר לא יוכל ליצור עלילה המודעת על ידי אור הסביבה. כמו כן, אם החוקרים משתמשים בקטגוריות של אור או טמפרטורה, פיזור אלה ניתן לשנות לתוך boxplots או תבנית מתאימה אחרת כדי להמחיש תופעות אלה.
Representative Results
הנתונים הנאספים בפרוטוקול זה מאפשרים בדיקה וחלוקה של משתנים החשובים לפיזיולוגיה אורגנית. לדוגמה, הן טמפרטורה והן תנאי תאורה תורמים להתאוששות הפרפרים מהלם קר (איור 1). העלילה נועדה לחקור את האינטראקציה בין תנאי הסביבה לבין הלם קר להתאושש. באמצעות פרפרים שנתפסו בטבע הן ממלכודות והן מרשתות, 181 מינים של פרפרים הפגינו התאוששות ברורה מתרדמת צוננת הנגרמת על ידי הלם קר(איור 2). נתונים שהוצגו באיור 2 נאספו על ידי שלושה משקיפים במשך כחמישה חודשים (ינואר, פברואר, מאי-יולי 2020) באדמות הקולומביאניות. ניסויים נערכו תמיד בבוקר שלאחר איסוף הפרפרים. ביעילות מרבית, שני משקיפים התבוננו בו זמנית בארבעה פרפרים כל אחד, שחזרו על עצמם שבע פעמים (מינימום 7.37 שעות), וכתוצאה מכך נבדקו 56 אנשים בבוקר אחד. הדבר איפשר איסוף נתונים רב בקהילות פרפרים שלמות תוך הכללה ובחינה של נתונים על שונות אישית. כמו מבחנים יכולים להתרחש בתנאים סביבתיים סביבתיים, תנאי ההתאוששות מייצגים את בתי הגידול שלהם ומשקפים את הווריאציה הטבעית שחווים אורגניזמים בטבע. איור 3 ממחיש את החפיפה בין הטמפרטורה לבין תנאי האור של ניסוי התאוששות ההלם הקר לבין התנאים במרעה שממנו נאספו כמה פרפרים שנבדקו.
איור 1: פיזור זמן התאוששות (בשניות) של פרפרים לאחר הלם קר. (A) טמפרטורה ממוצעת ו -( B) ממוצע LUX (עוצמת אור) במהלך ההתאוששות שלהם. מינים מאורגנים וצבועים על ידי משפחה. בסך הכל, ככל שהאור והטמפרטורה עולים, זמן התאוששות ההלם הקר פוחת, מה שמראה שונות על פני מסה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: דוגמה לתוצאות מהתאוששות ההלם הקר על 181 מינים של פרפרים מההרים הקולומביאנים. הנתונים מייצגים את מספר השניות שחלפו מהסרת הפרפר מקור ומתי הוא הצליח לעוף. מינים מאורגנים וצבועים על ידי משפחה. נתון זה מדגים את רוחב הטקסונומי שלאורך כל הניסוי ניתן ליישם בהצלחה, ואת מגוון התגובות להתאוששות הלם קר על פני מינים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: טמפרטורת הסביבה ו- LUX במהלך ניסויים התאוששות הלם קר. עלילה של טמפרטורת הסביבה (כחול) ו LUX (עוצמת אור, אדום) כפי שנרשם על ידי אוגרי נתונים להציב במרעה שבו איסוף פרפר התקיים (צבעים בהירים, תנאים משתרעים על פני כל היום) ותנאים במהלך ניסויים התאוששות הלם קר (צבעים כהים, רק שעות הבוקר). תנאי שדה הסביבה והתנאים הניסיוניים שהותוו מראים את טווח התנאים הממוצעים שחווים פרפרים במשך שבוע של דגימת שדה וניסויים. הניסויים נערכו רק בשעות המוקדמות (07:00-13:00 שעות), ואילו הנתונים נפרסו בשטח במשך שבוע (שעות אור, 06:00-18:00 שעות). המוצג כאן הוא החפיפה בין תנאים ניסיוניים ותנאי הסביבה מנוסים על ידי פרפרים, המדגים את הרלוונטיות האקולוגית של ביצוע מבחני פיזיולוגיה בתנאי סביבה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים 1: נוהל לאיסוף חרקים מוקדיים-במקרהזה, פרפרים-באמצעותמלכודות ואן-סומרן פיתיון ורשתות פעילות. מלכודות היו פיתיון עם דגים נרקבים ופיתיונות פירות נרקבים. מלכודת (ללא פיתיון) ברקע, בחזית היא דגימה במעטפה הייחודית שלה על קופסת איסוף פלסטיק כחולה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים 2: שקיות עם עד ארבעה פרפרים בודדים שקועים במי קרח בצידנית. שקיות ניילון סומנו בזמן שהן הונחו במי הקרח, כך שניתן היה לטלטל את ניסויי ההלם הקר במהלך הבוקר. שקיות ניילון צריך להיות אטום כדי למנוע דגימות מלהירטב; עם זאת, להצפת השקיות והמעטפה במקרה זה לא הייתה השפעה מדידה על התאוששות הפרפרים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים 3: שני משקיפים אוספים נתונים בשטח. כלוב רשת מכיל ארבעה פרפרים ייחודיים המחלימים מהלם קר. פוליוויניל כלוריד T-joint בכלוב בתים חוטב הנתונים כדי למנוע חשיפה ישירה לשמש או גשם. לכל צופה יש סטופר שהתחיל מיד עם שחרור הפרפר לתוך הכלוב. הכלובים מורמים על ידי ספסלים, ומאפשרים לצופים להתסיס את בסיס הכלוב כדי להבטיח שהפרפרים הגיבו בצורה התנהגותית במהירות האפשרית מבחינה פיזיולוגית. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
טבלה משלימה 1: גליון נתונים לדוגמה. הגיליון מציג את המזהה הייחודי של כל פרפר כפי שהוקצה בשדה ותווים ייחודיים (שם מין, צבעי מפתח) בהערות. כמו כן נרשם המיקום הדומיננטי של הפרפר (כלומר, איזה צד של הכנף נחשף לשמש) במהלך תקופת ההחלמה, ציין כמו D (הגב) או V (גחון). לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
וידאו משלים 1: הקשה על הכלוב להתאוששות הלם קר. כאשר הפרפרים מתאוששים, הצופה מקיש בעדינות על בסיס הכלוב כדי לגרום להתנהגויות ברגע שהפרפרים מסוגלים. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
Discussion
המחקר של פיזיולוגיה תרמית משלב מדדים של מינים ותכונות סביבתיות כדי להבין טוב יותר את האינטראקציות בין אורגניזמים וסביבתם כי הם המפתח להישרדות וכושר. בעוד תמיד חלק בלתי נפרד להבנת ההיסטוריה הטבעית והאקולוגיה של צמחים ובעלי חיים, תכונות תרמיות הן בעלי חשיבות גוברת לנוכח הנוף ושינוי האקלים11,21. מספר קבוצות של חרקים יבשתיים אקותרמיים, בפרט לפידופטרה ואודונאטן, הן גדולות ושופע יחסית, מפגינות התנהגויות שונות, והן מסוגלות למניפולציה. מתואר כאן היא חקירה יעילה וזולה כדי למדוד ביעילות תגובות פיזיולוגיות של חרקים כאלה. פרוטוקול זה דורש מקור של אורגניזמים בריאים כדי לבצע מבחנים, שזמן הטיפול בהם לפני הניסוי מוגבל. בעוד גמיש במספר האורגניזמים הנבדקים בבת אחת, מספר המוקדים לכל ניסוי ישתנה בהתאם למטרת איסוף הנתונים ו/או מספר הצופים.
לדוגמה, פרוטוקול זה פותח כדי לאסוף נתונים פרטניים מפורטים על פרפרים על פני קהילות שלמות. לפיכך, התוצאות הייצוגיות ממחישות מאמץ למקסם את איסוף הנתונים עבור אנשים ממין רב ככל האפשר ובמגוון תנאים הרלוונטיים לסביבה המקומית. ללא קשר למספר המינים המוקדיים, זה חיוני עבור הצופה להיות מסוגל לזהות כל אדם בכלוב חווה את ההתאוששות. אם המטרה היא לאסוף נתונים ממין אחד בלבד, אז רק אדם אחד או שניים (אם ניתן לזיהוי על בסיס ללבוש כנף שונים או אם מסומן בנפרד) צריך להיות מחויב בבת אחת. יש לבחור את נושאי המחקר בהתאם לשאלת מחקר או תוכנית לימודים ספציפית. בהתבסס על השאלה שהוצגה ומטרת איסוף הנתונים (מחקר או כיתה, למשל), גודל המדגם ואיסוף תכונות אחרות יהיו שונים.
כדי להמחיש את המרכיבים הבסיסיים של הפיזיולוגיה המובהקים על ידי פרוטוקול זה (אינדוקציה של תרדמת צמרמורת, צעדי התאוששות, תפקיד של תנאי הסביבה), מדריך בכיתה יכול לבחור שני מינים או מורפים שונים של מין אחד. אם המוקד שונה רק בתכונה מרכזית אחת (למשל, צבע), יהיה צורך בגודל מדגם קטן יותר, והתלמידים יכולים ללמוד מקרוב את הקשר של תכונה זו ופיזיולוגיה אורגניזמית. חוקרים המעוניינים בפיזיולוגיה אקולוגית עשויים להשתמש בנתונים הניסיוניים שלהם כדי לחקור שאלות אקולוגיות ואבולוציוניות מורכבות. החוקרים חייבים להיות בטוחים לבחור בקפידה חרקים מוקדיים כי ישירות לענות על השאלות שלהם (למשל, בהתבסס על שלב החיים, גיל, מין, מיקום), ו, בהתבסס על מספר המשתנים המעורבים, לקבוע את גודל המדגם המתאים. גדלים לדוגמה עבור דגמים מורכבים יהיו גדולים יותר מאלה שתוארו לעיל.
בעת איסוף נתוני התאוששות התנהגותית, זה המפתח כי הכלוב לנוח מעל הקרקע כי הצופה חייב להיות מסוגל להקיש על החלק התחתון של הכלוב כדי לעורר התנהגויות התאוששות. זה מבטיח שהאורגניזם יגיב (עומד, עף) ברגע שהוא מסוגל מבחינה פיזיולוגית לעשות זאת, והתנהגות ההחלמה הסופית (טיסה) מתועדת. רישום תנאי הסביבה במהלך התאוששות ההלם הקר הוא חלק בלתי נפרד מחקר הפיזיולוגיה התרמית, שכן פרוטוקול זה נועד לחקור ולהתיר את תפקיד הסביבה בפיזיולוגיה האורגנית. אוגרי נתונים (ראה טבלת החומרים)שימושיים לתיעוד מדדים מתוקננים של תנאים רלוונטיים (למשל, טמפרטורה, אור ואפילו לחות). עם זאת, אם כלים אלה אינם זמינים, ניתן למדוד את התנאים הרלוונטיים בדרכים אחרות כמו עם מדחום דיגיטלי או על ידי פישוט המשתנה של תנאי הסביבה ושימוש בסביבות נפרדות כגון צל ושמש. פרוטוקול זה נותן לחוקר אפשרויות למדוד את התנאים במהלך התאוששות הלם קר בהתבסס על המטרה וההיקף של המחקר.
למרות שניתן לשנות שיטה זו כך שתתאים יותר לקבוצות טקסונומיות ספציפיות, מומלץ להשתמש בחרקים גדולים ווולנטיים. חרקים מעופפים המחזירים לעצמם את יכולתם לעוף באופן עצמאי עשויים להיחשב כמי שהשיגו החלמה מלאה. השיטה, כמתואר, שימשה בהצלחה על פרפרים באזורים הטרופיים והסובטרופיים. בהתבסס על המגמות התרמיות של אזור נתון (כלומר, טווח הטמפרטורות שחוו באתר שישתנה, ובכך להשפיע על הציפיות המבוססות על גובה, קו רוחב, כיסוי חופה), אורגניזם עשוי לדרוש פחות או יותר משעה באמבט מי קרח כדי להיכנס לתרדמת צוננת. גודל האורגניזם עשוי להשפיע גם על הזמן הדרוש כדי להיכנס לתרדמת צמרמורת. זה המפתח למצוא את הזמן של חשיפה קרה הכרחי כדי לגרום לתרדמת צמרמורת (לא זז), אבל לא להרוג מינים מוקדיים. הזמן הנדרש כדי לגרום לתרדמת צמרמורת יהיה תלוי בגודל, מיקום, ואת ההיסטוריה הטבעית / התנהגות של הפרטים. בהתבסס על תוצאות ניסוי ההלם הקר המתואר בזאת ושימוש בידע על האקולוגיה של החרקים המוקדיים, בחר זמן לסיים את הניסוי אם אדם נתון אינו מחלים לחלוטין.
בהתבסס על השאלות הספציפיות של החוקר, שיטה זו יכולה להיות מועסקת או בתחום או במעבדה כדי לאפשר הן וריאציה סביבתית טבעית ושליטה עבור משתנים חשובים, בהתאמה. בדיקה זו היא פשוטה וזולה ומסייעת למלא פערים קיימים בתחום הפיזיולוגיה התרמית. הקלות של פרוטוקול זה הופכת אותו לנגיש להעסיק עבור מגוון רחב של taxa, פתיחת השדה יותר אורגניזמים ידידותיים למעבדה. החידוש בביצוע בדיקה תרמית סטנדרטית אך סביבתית ממלא את הפער בין תוצאות המעבדה לשדה22. מינוף תנאי הסביבה להתאוששות האורגניזם יסייע לחוקרים לחלק את תפקידם של גורמים סביבתיים ומינים בפיזיולוגיה14,22. לבסוף, בשל עלותו הנמוכה והיעדר החומרים הנדרשים, ניתן להשתמש בפרוטוקול זה במקומות מרוחקים בשטח עם מעט ציוד אידיאלי לביולוגים רבים בתחום - כמו גם בכיתות כדי לאפשר לתלמידים צעירים חווית למידה מעשית.
Disclosures
למחבר אין אינטרסים כלכליים מתחרים או ניגודי אינטרסים אחרים.
Acknowledgments
תודה לג'ארט דניאלס, איזבלה פלאמר, ברט שיברס ודן האן על הקלט על הפרוטוקול כפי שהוא פותח לראשונה. הכרת תודה נוספת לחיימה הגארד, סבסטיאן דוראן ואינדיאנה כריסטובל רויס-מלאבר על יישום מספר איטרציות של פרוטוקול זה ועל קלט על מרכיבי מפתח. תודה גם לסוקר אנונימי על משוב על כתב היד בכללותו. התמיכה ניתנה על ידי מרכז מקגווייר לקרן הפרסום של לפידופטרה והמגוון הביולוגי, המכללה למדעי החקלאות והחיים, בית הספר למשאבי טבע וסביבה, והמחלקה לאקולוגיה ושימור חיות בר ב- UF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 x 24 x 36" Popup Rearing & Observation Cage | Bioquip | 1466PB | Ensure that the cage is slightly elevated from the ground to be able to tap the floor of the cage during experiments. |
| Cooler | Any | NA | |
| Glassine envelopes | Bioquip | 1130B | |
| HOBO Pendant Temperature/Light 8K Data Logger | Onset | UA-002-08 | If a datalogger is not accessible, researchers may choose to use a digital thermometer to record ambient temperatures at regular intervals. See protocol step 4.5 for additional information. |
| HOBO Optic USB Base Station | Onset | Base-U-1 | |
| Ice water | NA | NA | |
| Insects (focal taxa) | NA | Any | Collect sufficient samples to test, ensuring replication of experimental groups (e.g. species, sampling location) |
| PVC T-joint | Any | Any | |
| Sealable plastic bag | Any | NA | |
| Stopwatch/timer | Any | NA | |
| Weight | Any | NA | Large coins or small rocks to weigh down the plastic bags will ensure that specimens are submerged in ice water. A standardized weight is ideal. |
References
- Huey, B., Stevenson, R. D. Integrating thermal physiology and ecology of ectotherms a discussion of approaches. American Zoologist. 19 (1), 357-366 (1979).
- Huey, R. B., Slatkin, M. Cost and benefits of lizard thermoregulation. The Quarterly Review of Biology. 51 (3), 363-384 (1976).
- Kingsolver, J. G. Butterfly thermoregulario: Organismic mechanisms and population consequences. Journal of Research on the Lepidoptera. 24, 1-20 (1985).
- Kingsolver, J. G. Evolution and coadaptation of thermoregulatory behavior and wing pigmentation pattern in pierid butterflies. Evolution. 41 (3), 472-490 (1987).
- Kingsolver, J. G., Huey, R. B. Evolutionary analyses of morphological and physiological plasticity in thermally variable environments. American Zoologist. 38, 545-560 (1998).
- Malhi, Y., Wright, J. Spatial patterns and recent trends in the climate of tropical rainforest regions. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 359 (1443), 311-329 (2004).
- Sears, M. W., et al. Configuration of the thermal landscape determines thermoregulatory performance of ectotherms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (38), 10595-10600 (2016).
- Sinclair, B. J., Coello Alvarado, L. E., Ferguson, L. V. An invitation to measure insect cold tolerance: Methods, approaches, and workflow. Journal of Thermal Biology. 53, 180-197 (2015).
- Angilletta, M. Thermal adaptation: a theoretical and empirical synthesis. , Oxford University Press. (2009).
- Perkins-Kirkpatrick, S. E., Gibson, P. B. Changes in regional heatwave characteristics as a function of increasing global temperature. Scientific Reports. 7, 12256 (2017).
- Frishkoff, L. O., Hadly, E. A., Daily, G. C. Thermal niche predicts tolerance to habitat conversion in tropical amphibians and reptiles. Global Change Biology. 21 (11), 3901-3916 (2015).
- Nowakowski, A. J., Otero Jiménez, B., Allen, M., Diaz-Escobar, M., Donnelly, M. Landscape resistance to movement of the poison frog, Oophaga pumilio, in the lowlands of northeastern Costa Rica. Animal Conservation. 16 (2), 188-197 (2013).
- Kingsolver, J. G., Buckley, L. B. Quantifying thermal extremes and biological variation to predict evolutionary responses to changing climate. Philosophical Transactions of the Royal Society B. Biological Sciences. 372 (1723), 20160147 (2017).
- Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals. Journal of Experimental Biology. 218, 1956-1967 (2015).
- Sinclair, B. J., Williams, C. M., Terblanche, J. S. Variation in thermal performance among insect populations. Physiological and Biochemical Zoology. 85 (6), 594-606 (2012).
- Gotcha, N., Terblanche, J. S., Nyamukondiwa, C. Plasticity and cross-tolerance to heterogeneous environments: divergent stress responses co-evolved in an African fruit fly. Journal of Evolutionary Biology. 31 (1), 98-110 (2018).
- Mutamiswa, R., Chidawanyika, F., Nyamukondiwa, C. Superior basal and plastic thermal responses to environmental heterogeneity in invasive exotic stemborer Chilo partellus Swinhoe over indigenous Busseola fusca (Fuller) and Sesamia calamistis Hampson. Physiological Entomology. 43 (2), 108-119 (2018).
- de Jong, M. A., Saastamoinen, M. Environmental and genetic control of cold tolerance in the Glanville fritillary butterfly. Journal of Evolutionary Biology. 31 (5), 636-645 (2018).
- DeVries, Z. C., Kells, S. A., Appel, A. G. Estimating the critical thermal maximum (CTmax) of bed bugs, Cimex lectularius: Comparing thermolimit respirometry with traditional visual methods. Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Molecular & Integrative Physiology. 197, 52-57 (2016).
- De Keyser, R., Breuker, C. J., Hails, R. S., Dennis, R. L. H., Shreeve, T. G. Why small is beautiful: Wing colour is free from thermoregulatory constraint in the small lycaenid butterfly, Polyommatus icarus. PLoS One. 10 (4), 0122623 (2015).
- Nowakowski, A. J., et al. Tropical amphibians in shifting thermal landscapes under land-use and climate change. Conservation Biology. 31 (1), 96-105 (2017).
- Niehaus, A. C., Angilletta, M. J., Sears, M. W., Franklin, C. E., Wilson, R. S. Predicting the physiological performance of ectotherms in fluctuating thermal environments. Journal of Experimental Biology. 215, 694-701 (2012).
