Summary
Burada, ortam çevre koşulları altında kelebeklerin soğuk şok geri kazanımını değerlendirmek için düşük maliyetli, erişilebilir bir protokol açıklanmaktadır.
Abstract
Ekolojik fizyoloji, özellikle ektotermler, bu değişen dünyada, hayatta kalmalarını ve zindeliklerini daha iyi anlamak için organizmalar ve çevreleri arasındaki etkileşimleri keşfetmek için türlerin ve çevresel özelliklerin önlemlerini kullandığı için giderek daha önemlidir. Geleneksel termal tahliller zaman, para ve ekipman açısından maliyetlidir ve bu nedenle genellikle küçük örnek boyutları ve az sayıda türle sınırlıdır. Burada sunulan, kelebek örneğini kullanarak büyük, hacimli, karasal böceklerin bireysel davranışları ve fizyolojisi hakkında ayrıntılı veriler üreten yeni bir protokoldür. Bu makalede, sahada ortam çevre koşulları altında yapılabilen ve maliyetli laboratuvar ekipmanı gerektirmeyen bir soğuk şok geri kazanım tahlili yöntemleri açıklanmaktadır. Bu yöntem, tropikal kelebeklerin soğuk şokuna yanıt ve iyileşme stratejisini anlamak ve tüm kelebek topluluklarında bireysel düzeyde veriler oluşturmak için kullanılmıştır. Bu yöntemler hem uzak alan ortamlarında hem de sınıflarda kullanılabilir ve ekolojik olarak ilgili fizyolojik veriler oluşturmak ve bir öğretim aracı olarak kullanılabilir.
Introduction
1970'lerin sonu ve 1980'lerin başında termal fizyoloji ve ekolojinin entegrasyonu1,2 ekolojik fizyoloji alanını başlattı. Ektotermler üzerinde yapılan kapsamlı termal çalışmalar, çeşitli eko-evrimsel bağlamlarda ekolojik-fizyolojik sinerjileri vurgulamaktadır3,4,5. Ektotermik organizmaların termal fizyolojisi üzerine yapılan araştırmalar, son zamanlarda iklim değişikliği ve dünya genelinde değişen termal manzaralar karşısında yeniden ilgi gördü6,7. Ekolojik fizyoloji akademik alanındaki çalışmaların bilgilendirilmesinin yanı sıra, termal fizyoloji tahlilleri araştırmacılar tarafından geniş ölçüde erişilebilir ve her seviye için uygulamalı bir öğretim yaklaşımı olarak hizmet edebilir. Termal sınırlar ve sıcaklık şoklarının etkileri de dahil olmak üzere termal performansın bileşenleri, hayvanların ekolojisi, davranışı ve yaşam öyküsü için temeldir8,9.
Özellikle, ekototermler fizyoloji sorularını ele almak için kullanılır, çünkü endotermi ortam ve organizma sıcaklığı arasında ayrılmaz bir bağlantı belirler. Organizmaların dayanabileceği sıcaklık aralığı (kritik termal minimum ila maksimum termal aralıkları) ve davranışlarının ve zindeliklerinin en üst düzeye çıkarıldıkları sıcaklıklar (termal optima) genellikle ekolojik ve evrimsel süreçlere dayanır. Bu fizyolojik özellikler, hem araçlar hem de aşırı sıcaklıklar arttıkça artan öneme sahiptir10. Örneğin, habitat tahribatına ve parçalanmaya eşlik eden sıcaklık artışları da dahil olmak üzere abiyotik değişiklikler, anuranlar da dahil olmak üzere ektoterm topluluklarını etkilemiş, fizyolojik olarak kırılgan türleri (dar termal toleranslı) küçük kalıntı habitat yamalarıyla sınırlamıştır11,12.
Termal performansın temel bileşenlerini değerlendirmek hem zaman hem de kaynak açısından pahalı olabilir ve geleneksel olarak laboratuvar ekipmanı ve standart koşullar gerektirir. Ayrıca, geleneksel tahliller genellikle belirli bir hayvan13 tarafından doğada yaşanan ortam koşullarının genişliğini yansıtmaz, çünkü benzer fizyoloji deneylerindeki sıcaklık dikkatlice kontrol edilir ve genellikle bir hayvanın yaşadığı ortam koşullarıyla ilgisizdir. Bu sıcaklık kontrolü, bireysel yanıtlardaki varyasyonun anlaşılmasını azaltabilir2,14. Fizyologlar, termal performans eğrilerini bilgilendirmek için bir hayvanın ortamını sürekli ısıtmak veya soğutmak için programlanabilir su banyolarını kullanarak laboratuvar tabanlı ısıtma ve soğutma deneylerine güvenmiştir15.
Tipik olarak, hayvanlar bir termokupl ile şişelere yerleştirilir ve ortam sıcaklıkları çevredeki su banyosunun sıcaklığını kontrol ederek sürekli olarak değiştirilir. Araştırmacılar, değiştirilmiş bir fizyolojik duruma (örneğin, soğuk komaya, nakavta) ulaşmak için gereken süreyi ve durum değişikliğinin gerçekleştiği sıcaklığı16,17. En az 500 USD'den başlayan fiyatlarla, bu araçlar büyük, ağırdır ve ek teknik ekipman (örneğin, bilgisayar, termokuples) gerektirir. Sonuç olarak, termal performansı değerlendirmek için klasik yöntemleri yürütmek için temel araçlar 1) herkes için ekonomik olarak erişilebilir değildir, 2) küçük dipteranlar için kullanılan geleneksel şişelerde yer alamayacak kadar büyük hayvanları test etmek için uygun değildir ve 3) uzak alan ayarlarında kullanılmak üzere taşınabilir değildir. Ortak uygulamaya bağlılık, taksonomi ve deneysel koşullar genelinde sınırlı temsile neden olmuştur18,19,20.
Tam termal performans eğrileri tür dağılımını, yaşam öyküsü özelliklerini ve davranışlarını bilgilendirebilirken, diğer özelliklerin yanı sıra, daha az ve daha basit termal ölçümlerin nicelemesi daha verimli ve hala son derece bilgilendirici olabilir. Soğuk koma başlangıcını ve ardından soğuk şok iyileşmesini, soğuk sertleştirmeyi ve sağalama davranışını ölçen fizyolojik tahliller, bir organizmanın kritik termal minimum için etkili ve yürütülebilirproxy'lerdir 8. Burada açıklanan, büyük karasal ektotermik böceklerden fizyolojik veriler elde etmek için yararlı bir soğuk şok tahlildir. Test uygun fiyatlı, erişilebilir ve saha koşullarında veya sınıfta yürütülmesi kolaydır. Bu protokol tarafından oluşturulan soğuk şok kurtarma verileri, ekolojik fizyoloji ile ilgili soruları takip etmek için türler veya bireysel düzeyde özellik verileri ile birleştirilmiş ve / veya öğrencilere fizyolojik ilkeleri öğretmek için kullanılabilir.
Protocol
1. İlgi gören türlerin tanımlanması
- Soğuk şok iyileşme süresini belirlemek için ilgi çekici türleri tanımlayın. Her grubun soğuk komaya neden olmak için gereken sürede farklılık göstereceğini unutmayın (yani, böceğin hala hayatta olduğu, ancak hareket etmediğini ve yanıt vermediğini). Aynı şekilde, organizmaya ve verilerin kullanımına dayanarak, odak bireyleri uçmazsa denemenin durdurulacağı farklı kesme noktaları seçin (bkz. bölüm 4).
NOT: Bu protokol Lepidoptera'da kullanılmak üzere tasarlanmış ve geliştirilmiştir. Bununla birlikte, özellikle hareketi ve hasarı kısıtlayan cam zarflarda düz olarak saklanabilen büyük, hacimli, karasal böcekler için geçerlidir (örneğin, kelebekler ve yusufçuklar / damselflies).
2. Ön duruşmanın yürütülmesi
- Anahtar parametreleri belirlemek için küçük bir birey örneği üzerinde bir ön yargılama gerçekleştirin. Bir ön duruşma için aşağıdaki protokolün 3 ile 5 arasında olan bölümlerini 5-10 kişi ile takip edin.
- Soğuk komaya neden olmak için buzda gereken süreyi test edin (hareket etmiyor), ancak 30 dk, 60 dk ve 90 dakikalık tedaviler kullanarak 5.1 adımını izleyerek odak türlerini öldürmeyin.
NOT: Soğuk komaya neden olmak için gereken süre, bireylerin büyüklüğüne, konumuna ve doğal geçmişine/ davranışına bağlı olacaktır. - 4.1-4.4 adımlarından elde edilen sonuçlara dayanarak ve odak böceklerinin ekolojisi hakkındaki bilgileri kullanarak, belirli bir birey tam bir iyileşme yapmazsa denemeyi sonuçlandırmak için bir zaman seçin. Bu kez türlerin ekolojisine de dayandırın, uçuştan kaçamaktan birkaç dakika sonra birçok böceğin önlendiğini unutmayın.
NOT: Örneğin, çoğu ön deneme 15 dakika sonra uçuşla sona ererse, aykırılıkların bile tamamen iyileşme (yani uçma) şansına sahip olmasını sağlamak için denemeleri 25 dakika sonra sonlandırmaya karar verilebilir. Bu protokol, 30 dakikalık bir kesme süresine (adım 5.4) dayanır.
- Soğuk komaya neden olmak için buzda gereken süreyi test edin (hareket etmiyor), ancak 30 dk, 60 dk ve 90 dakikalık tedaviler kullanarak 5.1 adımını izleyerek odak türlerini öldürmeyin.
- Denemeler için veri toplamayı bilgilendirmek için duruşma öncesi verilerden parametreleri kullanın. Aşağıda açıklanan protokolü, buz bulamacındaki zaman, denemelerin sona erdiği zaman ve veri sayfasında belgelenen davranışlar da dahil olmak üzere odak organizmalarının ihtiyaçlarına göre değiştirin (örneğin, titreme, tercih edilen böcek için uygunsuz bir davranış olabilir).
- Parametreleri iyileştirirken bu verilerle yanıtlanacak belirli araştırma sorularını tanımlayın.
NOT: Örneğin, araştırmacı uzun süreli maruziyetin iyileşme üzerindeki etkisiyle ilgileniyorsa, buzdaki süre değiştirilmesi gereken önemli bir değişkendir. Araştırmacılar açık ve koyu renkli türler arasındaki fizyoloji farklılıklarıyla ilgileniyorlarsa, iki belirgin renkli tür seçebilir veya kanat renginin iyileşme süresi üzerindeki etkisini ölçmek için böceğin kanat rengini değiştirebilirler. Daha da önemlisi, bu yöntem ortaya çıkan ihtiyaçlara ve araştırma sorularına göre son derece özelleştirilebilir (tartışma bölümüne bakın).
- Parametreleri iyileştirirken bu verilerle yanıtlanacak belirli araştırma sorularını tanımlayın.
3. Böceklerin toplanması
- Yemlenmiş tuzaklar ve entomolojik ağlar gibi uygun yöntemleri kullanarak böcekleri toplayın,(Ek Şekil 1). Koleksiyon üzerine, her bireyi benzersiz bir kimlik içeren ayrı bir cam zarfa yerleştirin.
- Hayvanları yakalandıktan sonra ve soğuk şok deneyine maruz kalmadan önce gölgeli, serin bir yerde saklayın. Hayvanı her zaman yakalandıktan sonraki 24 saat içinde deneysel tedaviye maruz bırak ve bu zamanı denemeler boyunca mümkün olduğunca standartlaştırın.
- Depolama koşulları değişse de, böcekleri doğrudan güneşten uzak tutun. Mümkünse, iç mekanlara serin ve karanlık bir odaya yerleştirin.
- Alanda, saklanırken gölgelendirileceğinden ve rüzgardan (üfleme) ve zarflara girebilecek diğer böcek avcılarından korunduğundan emin olun.
4. Soğuk şok deneyini kurun
- Bir soğutucuyu buz ve suyla doldurun. En az bir saat devam etmek için yeterli buz olduğundan emin olun ve sudaki ortamı 0 °C'de tutmak amacıyla periyodik olarak buz ekleyin.
- Her bireyin tanımlanabilir olduğundan emin olmak için bir deney turu için 1 ila 4 odak birey arasında seçim yapın.
- Birden fazla tür kullanıyorsanız, veri sayfasındaki bireylerin kafasını karıştırmamak için her birinden yalnızca birini kullanın. Sadece bir türle deneme yapıyorsanız, örneğin kırık bir kanat veya farklı bir işaretle kolayca ayırt edilebilen bireyleri kullanın.
- Deneyin amacı kanat renklendirmesi ile ilgisizse, kanatları bireyleri ayırt etmek için ince bir keçe uçlu işaretleyici ile benzersiz kimliklerle (örneğin sayılar) işaretleyin.
- Deneyler yukarıdaki kriterlerin hiçbirini karşılamazsa, deneyi aynı anda bir kişi üzerinde gerçekleştirin.
- Veri sayfasının satırlarını, benzersiz kimlikleri ve tür adı veya ayırt edici karakter (Tamamlayıcı Tablo 1)gibi notlarda yararlı bir tanımlayıcı da dahil olmak üzere test edilen her böcekle ilgili bilgilerle doldurun.
- Tüm odak bireylerini (hala ayrı ayrı işaretlenmiş zarflarında) bir ağırlıkla(Malzeme Masası)kapalı bir plastik torbaya yerleştirin ve torbayı 60 dakika boyunca buzlu suya yerleştirin (veya soğuk komaya girene kadar; tartışmaya bakın) (Ek Şekil 2).
- Ağırlığın ağır olduğundan (örneğin, büyük paralar, büyük pullar veya pürüzsüz kayalar) ve böcek torbasını buzlu suya batıracak ve su yüzeyine dik tutacak kadar büyük olduğundan emin olun. Kapalı plastik torbada sızıntıya neden olmayan bir ağırlık kullanın.
NOT: Böcekler su altındayken doğrudan suya maruz kalırlarsa hala iyileşebilirler, ancak ıslak zarflar her bireyin çıkarılmasını zorlaştırır. Böcekleri çantalarında kuru tutmak en iyisidir.
- Ağırlığın ağır olduğundan (örneğin, büyük paralar, büyük pullar veya pürüzsüz kayalar) ve böcek torbasını buzlu suya batıracak ve su yüzeyine dik tutacak kadar büyük olduğundan emin olun. Kapalı plastik torbada sızıntıya neden olmayan bir ağırlık kullanın.
- Sıcaklık ve ışık verilerini kaydedin.
- 5.1 veya 5.2 adımlarını kullanarak ortam sıcaklığını ve ışık verilerini kaydetmek için bir veri kaydedici (Bkz. Malzeme Tablosu)kullanın.
- Böceklerin serbest bırakılacağı andan başlayarak, sıcaklık ve ışık verilerini 10 s aralıklarla toplamak için veri kaydediciyi programlayın.
- Böceklerin buzlu suya yerleştirildiğinde veri kaydedicinin başlangıç zamanını temel edin. Ortam koşullarındaki verilerin daha sonra her bir odak böceğiyle eşleştirilebilmesi için veri kaydedici bilgilerinin (tarih, saat) eşitlendiğinden emin olun.
- Sıcaklık ve ışık verilerini kısa aralıklarla elle kaydetmek için basit bir termometre kullanın (ikinci bir araştırmacı tarafından).
- Veri kaydedici olmadan ölçülebilen kurtarma süresiyle ilişkilendirilecek deneysel parametrelere karar verin. Farklı tedaviler kullanın: gölge / güneş; alacakaranlık/gün ortası.
- 5.1 veya 5.2 adımlarını kullanarak ortam sıcaklığını ve ışık verilerini kaydetmek için bir veri kaydedici (Bkz. Malzeme Tablosu)kullanın.
- Böcekler için uygun bir yere bir kafes kafesi yerleştirin, böylece sıcaklık ve ışık ortamları kafes içinde mümkün olduğunca homojen olur ve böylece kafesin tabanı yükseltilir ve gözlemci tarafından dokunabilir.
- Veri kaydediciyi kafesin hemen dışına veya kafesin içine yerleştirin, böylece kafesin içindeki küçük hareketlerden etkilenmez veya başka bir şekilde etkilenmez. Veri kaydedici kullanmıyorsanız, bir termometreyi uygun şekilde konumlandırın ve/veya kafesleri uygun konfigürasyonda ayarlayın.
NOT: Veri kaydedici, kaydedilen ortam koşullarının böceğin yaşadığı ortam koşullarına mümkün olduğunca yakın olması için yerleştirilmelidir.
5. Soğuk şok deneyine başlayın
- Hayvanları 60 dakika sonra buzlu su banyosundan çıkarın (veya uygun belirlenen süre; yukarıya bakın). Böcekleri plastik torbadan hemen çıkarın ve elleçleme en aza indirirken her bireyi mümkün olduğunca çabuk zarfından çıkarın (Tamamlayıcı Şekil 3).
- Hayvanlar kafes kafeslerine girer girmez kronometreyi başlatın (örnek verilere bakın, Tamamlayıcı Tablo 1).
- İyileşen böcekleri kışkırtmak için kafesin tabanına bir kalemle dokunun.
NOT: İyileşme sırasında uyaranların sağlanması, odak böceklerinin fizyolojik olarak yetenekli oldukları anda iyileşme durumunu ve davranışlarını göstermelerini sağlar (Ek Video).- Bir hayvanın mümkünse yanıt vereceğine emin olmak için sık ve güçlü bir şekilde dokunun, ancak yanıta neden olmayın.
NOT: Örneğin, kafese dokunurken, bir hayvan havaya mancınıkla atılırsa ve dik bir yere inerse, ancak kendi başına durmak için hareket etmiyorsa, organizma gerçekten kendi başına durmadığı için bu bir "stand" davranışı olarak kabul edilir.
- Bir hayvanın mümkünse yanıt vereceğine emin olmak için sık ve güçlü bir şekilde dokunun, ancak yanıta neden olmayın.
- Bir kişi uçtuktan sonra denemeyi tamamlandı olarak işaretleyin (yani, tam bir iyileşme gösterdi). Denemeyi sonlandırın ve 30 dakika sonra hareket etmiyorsa böceğin tam bir iyileşme elde ettiğini düşünün.
- Böcekleri kafes kafesinden çıkarın ve bireyleri etiketli cam zarflarına geri yerleştirin. Hayvanları özgürleştirmek veya daha fazla veri toplama için tutmak (örneğin, boyut, ağırlık gibi bireysel özellikler).
- Bir veri kaydedici kullanıyorsanız, veri kaydedici veri toplamayı durdurun ve deneme sırasında sıcaklık ve ışık verilerinin dosyasını uygun tarih/saat bilgileriyle kaydedin.
6. Veri işleme
- Veri sayfasıyla birlikte sunulan verileri bir elektronik tabloya (ör. MS Excel) girin.
- Bir veri kaydedici kullanıyorsanız, test edilen her bir kişinin her yanıtı için sıcaklık ve ışık verileri ekleyin.
- Her bireyin her davranışı için sıcaklık ve ışığın ortalama ve standart sapması hesaplayın.
NOT: Veri kaydedici her 10 s'de bir veri kaydederken, bir hayvanın stand davranışının gerçekleşmesi 48 s sürdüyse, bu deneme için veri kaydediciden ilk 5 girişi kullanın. - Her bireyin her kurtarma davranışını, gerektiğinde 10 s aralıklara yuvarlayarak veya aşağı yuvarlayarak veri kaydedici tarafından kaydedilen abiyotik verilerle ilişkilendirin.
- Her bireyin her davranışı için sıcaklık ve ışığın ortalama ve standart sapması hesaplayın.
- Verileri çizin ve analiz edin. Şekil 1, örneğin, sıcaklık ve ışığın soğuk şok geri kazanım süresi üzerindeki etkisini görselleştirir. Test edilen grupların fizyolojik özelliklerindeki ekolojik ve evrimsel kalıpları incelemek için diğer ilgili verileri (tür özellikleri, bölgesel habitat özellikleri) derleyin.
NOT: Şekil 1, R'deki ggplot2 paketi kullanılarak çizilmiş. Ortam koşullarındaki verilerin ayrıntı düzeyi, ortam koşullarını ölçmek için kullanılan araçlara göre farklılık gösterecektir. Bir veri kaydedici kullanılırsa, Şekil 2 ile karşılaştırılabilir ayrıntıya sahip şekiller oluşturulabilir. Bir termometre kullanılırsa, araştırmacı ortam ışığı tarafından bilgilendirilmiş bir arsa oluşturamaz. Aynı şekilde, araştırmacılar ışık veya sıcaklık kategorilerini kullanırlarsa, bu dağılımlar bu fenomenleri göstermek için boxplots veya başka bir uygun şablon olarak değiştirilebilir.
Representative Results
Bu protokolde toplanan veriler organizma fizyolojisi için önemli olan değişkenlerin incelenmesine ve bölümlemesine olanak tanır. Örneğin, hem sıcaklık hem de ışık koşulları kelebeklerin soğuk şoktan kurtarılmasına katkıda bulunur (Şekil 1). Arsa ortam koşulları ve soğuk şok kurtarma arasındaki etkileşimi keşfetmek için tasarlanmıştır. Hem tuzaklardan hem de ağlardan vahşice yakalanan kelebekler kullanan 181 kelebek türü, soğuk şokun neden olduğu soğuk komadan belirgin bir iyileşme göstermiştir (Şekil 2). Şekil 2'de sunulan veriler, Kolombiya AndEs'te yaklaşık beş ay boyunca (Ocak, Şubat, Mayıs-Temmuz 2020) üç gözlemci tarafından toplanmıştır. Kelebek koleksiyonundan sonraki sabah her zaman deneyler yapılırdı. Maksimum verimlilikte, iki gözlemcinin aynı anda her biri yedi kez (en az 7,37 saat) tekrarlanan dört kelebeği gözlemlemesi mümkündü ve bu da tek bir sabah 56 kişinin testine neden oldu. Bu, bireysel varyasyonla ilgili verileri dahil ederken ve göz önünde bulundurarak tüm kelebek topluluklarında çok fazla veri toplanmasına izin verdi. Tahlillerin ortam çevre koşulları altında ortaya çıkabileceği gibi, geri kazanım koşulları yaşam alanlarını temsil eder ve organizmaların doğada yaşadığı doğal varyasyonu yansıtır. Şekil 3, soğuk şok geri kazanım deneyinin sıcaklık ve ışık koşulları ile test edilmiş bazı kelebeklerin toplandığı bir meradaki koşullar arasındaki çakışmayı göstermektedir.
Şekil 1: Soğuk şoktan sonra kelebeklerin iyileşme süresi (saniyeler içinde) scatterplots. (A) Ortalama sıcaklık ve (B) iyileşmeleri sırasında LUX (ışık yoğunluğu) anlamına gelir. Türler Aile tarafından organize edilir ve renklendirilir. Genel olarak, ışık ve sıcaklık arttıkça, soğuk şok iyileşme süresi azalır ve takson genelinde değişkenlik gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kolombiya AndEs'ten 181 kelebek türü üzerinde soğuk şok kurtarma tahlilinden elde edilen sonuçlara örnektir. Veriler, kelebeğin soğuktan çıkarılmasından geçen ve ne zaman uçabildiğini gösteren saniye sayısını temsil eder. Türler Aile tarafından organize edilir ve renklendirilir. Bu rakam, bu deneyin başarıyla uygulanabileceği taksonomik genişliği ve türler arasında soğuk şok geri kazanım tepkilerinin çeşitliliğini göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Soğuk şok geri kazanım denemeleri sırasında ortam sıcaklığı ve LUX. Kelebek toplamanın gerçekleştiği meralara yerleştirilen veri kayıtörleri tarafından kaydedilen ortam sıcaklığının (mavi) ve LUX'ın (ışık yoğunluğu, kırmızı) grafiği (açık renkler, koşullar tüm güne yayılır) ve soğuk şok kurtarma denemeleri sırasındaki koşullar (koyu renkler, sadece sabah saatleri). Çizilen ortam alanı koşulları ve deneysel koşullar, kelebeklerin bir haftalık alan örneklemesi ve deneyleri boyunca yaşadıkları çeşitli ve ortalama koşulları göstermektedir. Deneyler sadece erken saatlerde (07:00-13:00 saat) yapılırken, dataloggerlar bir hafta boyunca sahada konuşlandırıldı (gündüz saatleri, 06:00-18:00 saatleri gösterildi). Burada gösterilen, deneysel koşullar ile kelebeklerin yaşadığı ortam koşulları arasındaki örtüşme, ortam koşulları altında fizyoloji testlerinin yapılmasının ekolojik alakasını gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: Odak böceklerini toplama prosedürü-budurumda kelebekler-yemlenmiş Van-Someren tuzakları ve aktif ağ kullanarak. Tuzaklar hem çürüyen balıklarla hem de çürüyen meyve yemleriyle yemlendi. Arka planda tuzak (yemsiz), ön planda mavi bir plastik toplama kutusuna karşı benzersiz zarfında bir örnek vardır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 2: Bir soğutucuda buzlu suya batırılmış dört ayrı kelebeğe sahip torbalar. Plastik torbalar buzlu suya yerleştirildikleri saatle işaretlenmişti, böylece soğuk şok deneyleri sabah boyunca sendeleyebiliyordu. Numunelerin ıslanmasını önlemek için plastik torbalar kapatılmalıdır; ancak, bu durumda torbaların ve zarfın taşması kelebeklerin iyileşmesi üzerinde ölçülebilir bir etkiye sahip değildi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 3: İki gözlemci sahada veri toplar. Her kafes, soğuk şoktan kurtulan dört benzersiz kelebek içerir. Kafesteki polivinil klorür T-eklemi, doğrudan güneşe veya yağmura maruz kalmayı önlemek için veri kaydediciyi barındırır. Her gözlemcinin, kelebek kafese salındıktan hemen sonra başlatılan bir kronometresi vardır. Kafesler banklar tarafından yükseltilir ve gözlemcilerin kelebeklerin fizyolojik olarak mümkün olduğunca hızlı bir şekilde davranışsal olarak yanıt vermelerini sağlamak için kafesin tabanını kışkırtmalarına izin verir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Tamamlayıcı Tablo 1: Örnek veri sayfası. Sayfa, alanda atanan her kelebeğin benzersiz kimliği ve notlardaki karakterleri (tür adı, anahtar renkler) gösterir. Ayrıca, D (dorsal) veya V (ventral) olarak belirtilen iyileşme döneminde kelebeğin baskın konumu (yani kanadın hangi tarafı güneşe maruz kaldı) da kaydedilmiştir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Video 1: Soğuk şok iyileşmesi için kafese dokunma. Kelebekler iyileştikçe, gözlemci kelebekler yetenekli olur olmaz davranışları teşvik etmek için kafesin tabanına hafifçe dokunur. Bu Videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Discussion
Termal fizyoloji çalışması, hayatta kalma ve zindelik için anahtar olan organizmalar ve çevreleri arasındaki etkileşimleri daha iyi anlamak için türlerin ve çevresel özelliklerin önlemlerini içerir. Bitki ve hayvanların doğal tarihini ve ekolojisini anlamanın ayrılmaz bir parçası olmakla birlikte, termal özellikler peyzaj ve iklim değişikliği karşısında giderek artan öneme sahiptir11,21. Çeşitli ektotermik karasal böcek grupları, özellikle lepidoptera ve odonatan, nispeten büyük ve boldur, farklı davranışlar sergiler ve manipülasyona elverişlidir. Burada özetlenen, bu tür böceklerin fizyolojik yanıtlarını etkili bir şekilde ölçmek için verimli ve düşük maliyetli bir testtir. Bu protokol, deneyden önceki kullanım süresi sınırlı olan sağlıklı organizmaların test etmesini gerektirir. Bir kerede test edilen organizma sayısında esnek olmakla birlikte, deney başına odak birey sayısı veri toplama amacına ve/veya gözlemci sayısına bağlı olarak değişecektir.
Örneğin, bu protokol tüm topluluklardaki kelebekler hakkında ayrıntılı bireysel veriler toplamak için geliştirilmiştir. Bu nedenle, temsili sonuçlar, mümkün olduğunca çok türdeki bireyler için ve yerel çevreyle ilgili çeşitli koşullar altında veri toplamayı en üst düzeye çıkarma çabasını göstermektedir. Odak türlerinin sayısından bağımsız olarak, gözlemcinin iyileşmeyi yaşayan kafesteki her bireyi tanımlayabilmesi çok önemlidir. Amaç sadece bir türden veri toplamaksa, aynı anda yalnızca bir veya iki kişi (farklı kanat aşınmasına dayanarak tanımlanabilirse veya ayrı ayrı işaretlenmişse) test edilmelidir. Çalışma konuları belirli bir araştırma sorusuna veya çalışma planına uygun olarak seçilmelidir. Ortaya çıkan soruya ve veri toplama amacına (örneğin araştırma veya sınıf) dayanarak, örnek boyutu ve diğer özelliklerin toplanması farklılık gösterecektir.
Bu protokolle ortaya çıkan fizyolojinin temel bileşenlerini göstermek için (soğuk komaya indüksiyon, iyileşme adımları, ortam koşullarının rolü), bir sınıf eğitmeni tek bir türün iki farklı türünü veya morflarını seçebilir. Odak bireyleri yalnızca bir temel özellikte (örneğin, renk) farklılık gösterirse, daha küçük bir örnek boyutu gerekli olacaktır ve öğrenciler bu özelliğin ve organizma fizyolojisinin ilişkisini yakından inceleyebilirler. Ekolojik fizyoloji ile ilgilenen araştırmacılar deneysel verilerini karmaşık ekolojik ve evrimsel soruları araştırmak için kullanabilirler. Araştırmacılar, sorularını doğrudan ele alan odak böceklerini (örneğin, yaşam evresine, yaşa, cinsiyete, konuma göre) dikkatlice seçtiklerinden ve ilgili değişkenlerin sayısına göre uygun örnek boyutunu belirlediklerinden emin olmalıdır. Karmaşık modeller için örnek boyutları yukarıda açıklananlardan daha büyük olacaktır.
Davranışsal kurtarma verilerini toplarken, kafesin zeminin üzerinde dinlenmesi önemlidir, çünkü gözlemci kurtarma davranışlarını ortaya çıkarmak için kafesin altına dokunabilmelidir. Bu, organizmanın fizyolojik olarak bunu yapabildiği anda yanıt vermesini (ayakta durmasını, uçmasını) sağlar ve terminal kurtarma davranışı (uçuş) belgelenmiştir. Soğuk şok geri kazanımı sırasında ortam koşullarının kaydedilmeleri termal fizyoloji çalışmasının ayrılmaz bir parçası, çünkü bu protokol organizma fizyolojisinde çevrenin rolünü incelemek ve dağıtmak için tasarlanmıştır. Veri kayıt cihazı (Bkz. Malzeme Tablosu),ilgili koşulların standartlaştırılmış önlemlerini (örneğin sıcaklık, ışık ve hatta nem) kaydetmek için yararlıdır. Ancak, bu araçlar kullanılamıyorsa, ilgili koşullar dijital termometre gibi başka şekillerde veya çevresel koşulların değişkenini basitleştirerek ve gölge ve güneş gibi farklı ortamlar kullanılarak ölçülebilir. Bu protokol, araştırmacıya çalışmanın amacına ve kapsamına göre soğuk şok iyileşmesi sırasındaki koşulları ölçme seçenekleri sunar.
Bu yöntem belirli taksonomik gruplara daha iyi uyacak şekilde değiştirilebilmesine rağmen, büyük, hacimli böceklerin kullanılması önerilir. Bağımsız olarak uçma yeteneklerini geri kazanan uçan böceklerin tam bir iyileşme başardığı düşünülebilir. Yöntem, açıklandığı gibi, tropik ve subtropiklerdeki kelebeklerde başarıyla kullanılmıştır. Belirli bir alanın termal eğilimlerine (yani, bir bölgede yaşanan sıcaklık aralığı değişebilir, böylece yükseklik, enlem, gölgelik örtüsüne dayalı beklentileri etkileyen), bir organizmanın soğuk komaya girmek için buzlu su banyosunda bir saatten fazla veya daha az bir süre gerektirebilir. Organizmanın büyüklüğü, soğuk komaya girmek için gerekli zamanı da etkileyebilir. Soğuk komaya neden olmak için gerekli soğuk maruz kalma zamanını bulmak (hareket etmemek), ancak odak türlerini öldürmemek önemlidir. Soğuk komaya neden olmak için gereken süre, bireylerin büyüklüğüne, konumuna ve doğal geçmişine / davranışına bağlı olacaktır. Burada açıklanan soğuk şok deneyinden elde edilen sonuçlara dayanarak ve odak böceklerinin ekolojisi bilgisini kullanarak, belirli bir birey tam bir iyileşme yapmazsa denemeyi sonuçlandırmak için bir zaman seçin.
Araştırmacının özel sorularına dayanarak, bu yöntem, sırasıyla hem doğal çevresel varyasyona hem de önemli değişkenler için kontrole izin vermek için sahada veya laboratuvarda kullanılabilir. Bu test basit ve ucuzdur ve termal fizyoloji alanındaki mevcut boşlukları doldurmaya yardımcı olur. Bu protokolün kolaylığı, alanı laboratuvar dostu organizmalardan daha fazlasına açarak çeşitli bir takson dizisi için istihdam etmeyi erişilebilir hale getirir. Standartlaştırılmış ancak ortam termal tahlili yapmanın yeniliği laboratuvar ve saha sonuçları arasındaki boşluğu doldurur22. Organizma iyileşmesi için ortam koşullarından yararlanmak, araştırmacıların fizyoloji14,22'deçevresel ve tür faktörlerinin rolünü bölümlemelerine yardımcı olacaktır. Son olarak, düşük maliyeti ve gerekli materyallerin eksikliği nedeniyle, bu protokol, birçok alan biyoloğu için ideal olan az ekipmanla ve küçük öğrencilere uygulamalı bir öğrenme deneyimi sağlamak için sınıflarda alanın uzak yerlerinde kullanılabilir.
Disclosures
Yazarın rakip finansal çıkarları veya diğer çıkar çatışmaları yoktur.
Acknowledgments
Jaret Daniels, Isabella Plummer, Brett Scheffers ve Dan Hahn'a protokole ilk gelişinde girdiler için teşekkürler. Jaime Haggard, Sebastián Durán ve Indiana Cristóbal Róis-Málaver'e bu protokolün birkaç tekrarını uyguladıklarından ve önemli bileşenlere girdilerinden dolayı ek şükranlar. Ayrıca, bir bütün olarak makale hakkında geri bildirim için anonim bir hakeme teşekkür edin. McGuire Lepidoptera Merkezi ve Biyoçeşitlilik yayın fonu, Tarım ve Yaşam Bilimleri Koleji, Doğal Kaynaklar ve Çevre Okulu ve UF'deki Yaban Hayatı Ekolojisi ve Koruma bölümü tarafından destek sağlandı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 x 24 x 36" Popup Rearing & Observation Cage | Bioquip | 1466PB | Ensure that the cage is slightly elevated from the ground to be able to tap the floor of the cage during experiments. |
| Cooler | Any | NA | |
| Glassine envelopes | Bioquip | 1130B | |
| HOBO Pendant Temperature/Light 8K Data Logger | Onset | UA-002-08 | If a datalogger is not accessible, researchers may choose to use a digital thermometer to record ambient temperatures at regular intervals. See protocol step 4.5 for additional information. |
| HOBO Optic USB Base Station | Onset | Base-U-1 | |
| Ice water | NA | NA | |
| Insects (focal taxa) | NA | Any | Collect sufficient samples to test, ensuring replication of experimental groups (e.g. species, sampling location) |
| PVC T-joint | Any | Any | |
| Sealable plastic bag | Any | NA | |
| Stopwatch/timer | Any | NA | |
| Weight | Any | NA | Large coins or small rocks to weigh down the plastic bags will ensure that specimens are submerged in ice water. A standardized weight is ideal. |
References
- Huey, B., Stevenson, R. D. Integrating thermal physiology and ecology of ectotherms a discussion of approaches. American Zoologist. 19 (1), 357-366 (1979).
- Huey, R. B., Slatkin, M. Cost and benefits of lizard thermoregulation. The Quarterly Review of Biology. 51 (3), 363-384 (1976).
- Kingsolver, J. G. Butterfly thermoregulario: Organismic mechanisms and population consequences. Journal of Research on the Lepidoptera. 24, 1-20 (1985).
- Kingsolver, J. G. Evolution and coadaptation of thermoregulatory behavior and wing pigmentation pattern in pierid butterflies. Evolution. 41 (3), 472-490 (1987).
- Kingsolver, J. G., Huey, R. B. Evolutionary analyses of morphological and physiological plasticity in thermally variable environments. American Zoologist. 38, 545-560 (1998).
- Malhi, Y., Wright, J. Spatial patterns and recent trends in the climate of tropical rainforest regions. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 359 (1443), 311-329 (2004).
- Sears, M. W., et al. Configuration of the thermal landscape determines thermoregulatory performance of ectotherms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (38), 10595-10600 (2016).
- Sinclair, B. J., Coello Alvarado, L. E., Ferguson, L. V. An invitation to measure insect cold tolerance: Methods, approaches, and workflow. Journal of Thermal Biology. 53, 180-197 (2015).
- Angilletta, M. Thermal adaptation: a theoretical and empirical synthesis. , Oxford University Press. (2009).
- Perkins-Kirkpatrick, S. E., Gibson, P. B. Changes in regional heatwave characteristics as a function of increasing global temperature. Scientific Reports. 7, 12256 (2017).
- Frishkoff, L. O., Hadly, E. A., Daily, G. C. Thermal niche predicts tolerance to habitat conversion in tropical amphibians and reptiles. Global Change Biology. 21 (11), 3901-3916 (2015).
- Nowakowski, A. J., Otero Jiménez, B., Allen, M., Diaz-Escobar, M., Donnelly, M. Landscape resistance to movement of the poison frog, Oophaga pumilio, in the lowlands of northeastern Costa Rica. Animal Conservation. 16 (2), 188-197 (2013).
- Kingsolver, J. G., Buckley, L. B. Quantifying thermal extremes and biological variation to predict evolutionary responses to changing climate. Philosophical Transactions of the Royal Society B. Biological Sciences. 372 (1723), 20160147 (2017).
- Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals. Journal of Experimental Biology. 218, 1956-1967 (2015).
- Sinclair, B. J., Williams, C. M., Terblanche, J. S. Variation in thermal performance among insect populations. Physiological and Biochemical Zoology. 85 (6), 594-606 (2012).
- Gotcha, N., Terblanche, J. S., Nyamukondiwa, C. Plasticity and cross-tolerance to heterogeneous environments: divergent stress responses co-evolved in an African fruit fly. Journal of Evolutionary Biology. 31 (1), 98-110 (2018).
- Mutamiswa, R., Chidawanyika, F., Nyamukondiwa, C. Superior basal and plastic thermal responses to environmental heterogeneity in invasive exotic stemborer Chilo partellus Swinhoe over indigenous Busseola fusca (Fuller) and Sesamia calamistis Hampson. Physiological Entomology. 43 (2), 108-119 (2018).
- de Jong, M. A., Saastamoinen, M. Environmental and genetic control of cold tolerance in the Glanville fritillary butterfly. Journal of Evolutionary Biology. 31 (5), 636-645 (2018).
- DeVries, Z. C., Kells, S. A., Appel, A. G. Estimating the critical thermal maximum (CTmax) of bed bugs, Cimex lectularius: Comparing thermolimit respirometry with traditional visual methods. Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Molecular & Integrative Physiology. 197, 52-57 (2016).
- De Keyser, R., Breuker, C. J., Hails, R. S., Dennis, R. L. H., Shreeve, T. G. Why small is beautiful: Wing colour is free from thermoregulatory constraint in the small lycaenid butterfly, Polyommatus icarus. PLoS One. 10 (4), 0122623 (2015).
- Nowakowski, A. J., et al. Tropical amphibians in shifting thermal landscapes under land-use and climate change. Conservation Biology. 31 (1), 96-105 (2017).
- Niehaus, A. C., Angilletta, M. J., Sears, M. W., Franklin, C. E., Wilson, R. S. Predicting the physiological performance of ectotherms in fluctuating thermal environments. Journal of Experimental Biology. 215, 694-701 (2012).
