Summary
Temperatuurregeling tijdens vloeistoffase-elektronenmicroscopie-experimenten opent nieuwe perspectieven voor het bestuderen van de dynamiek van nanodeeltjes in vloeibare omgevingen die hun vormings- of toepassingsmedia nabootsen. Met behulp van recent ontwikkelde verwarmingsvloeistofcellen hebben we direct de invloed van temperatuur op de nucleatie- en groeiprocessen van gouden nanodeeltjes in water waargenomen.
Abstract
Temperatuurregeling is een recente ontwikkeling die een extra mate van vrijheid biedt om nanochemie te bestuderen door elektronenmicroscopie van vloeibare celtransmissie. In dit artikel beschrijven we hoe we een in situ verwarmingsexperiment kunnen voorbereiden voor het bestuderen van het effect van temperatuur op de vorming van gouden nanodeeltjes aangedreven door radiolyse in water. Het protocol van het experiment is vrij eenvoudig met een speciale vloeistofcel met uniforme verwarmingscapaciteiten tot 100 °C, een TEM-houder met vloeistofcel met stroommogelijkheden en een geïntegreerde interface voor het regelen van de temperatuur. We laten zien dat de nucleatie- en groeimechanismen van gouden nanodeeltjes drastisch worden beïnvloed door de temperatuur in vloeibare cellen. Met behulp van STEM-beeldvorming en nanodiffractie worden de evolutie van de dichtheid, grootte, vorm en atoomstructuur van de groeiende nanodeeltjes in realtime onthuld. Geautomatiseerde beeldverwerkingsalgoritmen worden gebruikt om nuttige kwantitatieve gegevens uit videosequenties te extraheren, zoals de nucleatie- en groeisnelheden van nanodeeltjes. Deze aanpak biedt nieuwe input voor het begrijpen van de complexe fysisch-chemische processen die spelen tijdens de vloeistoffasesynthese van nanomaterialen.
Introduction
Metalen nanodeeltjes (NPs) hebben veelbelovende fysisch-chemische eigenschappen die kunnen worden gebruikt in verschillende domeinen zoals optische detectie1, geneeskunde2 of energie3. Nat-chemische synthese is een zeer veelzijdige methode om metalen NPs te fabriceren met een goed gedefinieerde grootte en vorm. In de afgelopen decennia zijn veel strategieën ontwikkeld om controle te krijgen over de synthese van NPs: zaadgemedieerde groei4, gezichtsblokkeermethode5, kinetisch gecontroleerdesynthese 6, selectieve ets7 of temperatuurgecontroleerdesynthese 8. Hoewel de chemische reacties die de synthese aansturen vrij eenvoudig zijn, zijn de nucleatie- en groeimechanismen dat niet, omdat veel parameters een rol spelen in de vormingsprocessen en hun individuele invloed moeilijk te achterhalen is uit ex situ snapshots van de resulterende nanomaterialen die op bepaalde tijdstippen van de synthese uit hun vormingsmedium zijn geëxtraheerd. Om de nucleatie- en groeiprocessen echt te begrijpen en manieren te vinden om ze te beheersen, moeten we in situ tools gebruiken die hun realtime observatie in een fijn gecontroleerde vloeibare omgeving mogelijk maken.
In dat opzichten is liquid-cell transmission electron microscopie (LCTEM) een zeer krachtige methode geweest om nieuw licht te werpen op de synthese van metalen nanodeeltjes9,10,11,12,13. Door de dynamiek van individuele nanostructuren direct in hun vloeibare vormingsmedia in beeld te brengen, heeft deze techniek een dieper begrip gegeven van nucleatie- en groeimechanismen, met name de rol van kristaldefecten, zaadmorfologie en organische liganden die rijrichtingsgroei- of etsprocessen mogelijk maken en nanomaterialen met specifieke vormen (nanorods, nanosterren,nanoplaten,nanoschalen)10,11,12,13, 14,15,16. Wanneer de elektronenbundel van een TEM interageert met vloeistoffen, produceren radiolyseprocessen sterk reducerende en oxiderende soorten die de oplossingschemie in het bestraalde gebied wijzigen en kunnen worden gebruikt om groei- of etsprocessen te stimuleren. Interessant is dat het bekend is dat de concentratie van radiolytische producten toeneemt met de elektronendosissnelheid, een parameter die nauwkeurig kan worden afgestemd in een elektronenmicroscoop20. Daarom is deze dosis-rate afhankelijkheid van radiolyse benut om de reactiesnelheid te beheersen en kinetische effecten op de vormingsprocessen en de uiteindelijke morfologie van nanostructuren11,15,20te onthullen .
Hoewel de temperatuur een cruciale parameter is in de synthese van nanomaterialen, zijn de effecten ervan tot nu toe niet zorgvuldig onderzocht door LCTEM, omdat commerciële vloeistofcellen met betrouwbare temperatuurregeling pas onlangs zijn ontwikkeld. Toch zijn dergelijke in situ studies onmisbaar om de complexe kinetiek en thermodynamische effecten te ontrafelen die worden veroorzaakt door temperatuurveranderingen. Aan de ene kant heeft het verhogen van de temperatuur drastische gevolgen voor de facetprocessen tijdens de groei, versnelt het de atoom- en moleculaire diffusie in vloeistof en wijzigt het de reactiesnelheden. Aan de andere kant is het nanofasediagram van nanostructuren ook erg gevoelig voor temperatuur. In dit artikel maken we gebruik van recent ontwikkelde verwarmingsvloeistofcellen om de radiolytische groei van gouden nanodeeltjes in water te volgen met een temperatuurregeling tussen kamertemperatuur en 100 °C. Deze methodologie die STEM-beeldvorming en diffractie combineert in een omgeving die steeds dichter bij de echte syntheseomstandigheden komt, verkleint de kloof tussen TEM-observaties in situ en syntheses op bankschaal.
Protocol
1. Lijn de transmissie-elektronenmicroscoop uit voor STEM HAADF-beeldvorming
- Volg de instructies van de fabrikant voor het uitlijnen van de microscoop.
- Gebruik een conventioneel gedroogd monster om de microscoop uit te lijnen. Gebruik geen vloeibaar monster.
- Om de groeisnelheid te minimaliseren, minimaliseert u de elektronendosissnelheid (zie discussiesectie), wat inhoudt dat u een kleine condensatoropening en een kleine vlekgrootte gebruikt om de bundelstroom te verminderen.
2. E-chip behandeling
OPMERKING: Commerciële vloeistofhouders passen op bijna alle TEM, maar gebruik de houder die specifiek is ontworpen voor het microscoopmerk en het poolstuk. Een vloeibare cel bestaat uit twee op MEMS gebaseerde siliciumchips, E-chips genaamd, die beide siliciumsubstraten zijn met een venster van 500 x 50 μm bedekt met een 50 nm dikke amorfe siliciumnitride (SiN) film die elektron transparant is (Figuur 1A). Deze twee e-chips hebben verschillende afmetingen. De kleine is 2 x 2 mm met gouden afstandhouders die de afstand tussen de twee E-chips (150 nm hier) en de vloeibare dikte bevestigen. De grote is 4 x 6 mm en heeft een weerstand ingebed in het siliciumsubstraat die een uniforme verwarming van het vloeibare monster mogelijk maakt (figuur 1B). Vanwege de manier waarop ze in schone kamers zijn vervaardigd, hebben de E-chips twee verschillende kanten: een waar het raam er klein uitziet (hier na de voorkant genoemd) en de andere waar het raam groot is met een gootsteenvorm (hier na de achterkant genoemd).
- Raak bij het hanteren van de E-chips nooit het raam aan met een pincet en pak de chips aan de zijkanten vast. Gebruik een pincet met koolstofpennen om krassen op het oppervlak van het siliciumsubstraat te voorkomen.
- Als u een E-chip op een oppervlak plaatst, zorg er dan voor dat de achterkant in contact komt met het oppervlak, omdat de SiN-film kwetsbaar is en aan de voorkant wordt afgezet.
3. Reiniging van de vloeistofcelhouder (vóór het experiment)
- Verwijder het deksel dat de punt van de houder bedekt. Verwijder de dummy vloeibare cellen met een pincet. Verwijder de pakking die wordt gebruikt met de dummy vloeistofcellen.
OPMERKING: Dummy vloeibare cellen zijn vloeibare cellen zonder het SiN-venster en alleen silicium. Ze worden gebruikt voor het opslaan van de vloeistofcelhouder in de vacuümpomp. Let op de staat van messing schroeven omdat ze na verloop van tijd gemakkelijk afbrokkelen. In het bijzonder, als de schroefkoppen beschadigd zijn, moeten de schroeven worden vervangen. Anders kan het moeilijk zijn om ze na het experiment los te schroefen en kleine brokstukken kunnen ook de monsterbelasting verstoren. - Injecteer handmatig 2 ml gedestilleerd water in de houder met behulp van spuiten en de externe PEEK-slang om verbinding te maken met de achterkant van de houder.
OPMERKING: Er zijn 3 microfluïdische tunnels in de houder. Alle drie moeten ze worden schoongemaakt met water. Let op het water dat uit de voorkant van de houder komt: als het water gekleurd is vanwege een eerder experiment, blijf dan water in de houder steken totdat de vloeistof ongekleurd is. - Als u tijdens het experiment een oplossing in de vloeibare cel injecteert (in ons geval 1 mM HAuCl4 in water), vult u de slang van de monsterhouder met deze oplossing.
- Droog de punt van de vloeistofcelhouder op met een luchtpistool.
4. Bereiding van de vloeibare cel (E-chips)
- Reiniging van de vloeibare cellen.
- Vul een glazen Petrischaal met aceton.
- Vul een glazen Petrischaal met methanol.
LET OP: Vanwege de toxiciteit van methanol moet de Petrischaal met methanol onder een zuurkast worden geplaatst. Methanol moet worden behandeld met de juiste beschermende uitrusting (handschoenen). - Doe een kleine en een grote E-chip in de Petrischaal met aceton en wacht 2 minuten.
OPMERKING: De E-chips zijn bedekt met een beschermlaag die vóór het experiment moet worden verwijderd. Aceton verwijdert de fotoresist en ruimt de E-chips van puin op. Om de reiniging te verbeteren, kan de oplossing voorzichtig worden geagiteerd. - Doe beide E-chips in de Petrischaal met methanol en wacht 2 minuten. De methanol ruimt de E-chips op van de aceton en de rest van het puin.
LET OP: De overdracht van de E-chips tussen de aceton en de methanol moet zo snel mogelijk gebeuren om de E-chips niet in de lucht te laten opdrogen. - Droog de vloeibare cellen op met een luchtpistool. Houd de E-chip vast met een pincet terwijl u het luchtpistool gebruikt. Zorg ervoor dat u niet te veel op de trekker van het luchtpistool drukt, anders kan de E-chip uit het pincet vallen. Als ze afhaken, start u de reiniging opnieuw met aceton en methanol.
- Controleer de integriteit van het siliciumnitridevenster met behulp van een verrekijker of een optische microscoop (figuur 2).
OPMERKING: Zorg ervoor dat de ramen van beide E-chips schoon en niet kapot zijn. Als de E-chips er niet schoon uit zien, probeer ze dan weer in aceton en methanol te doen. Als het vuil zich nog op het raam bevindt of als het raam kapot is, moeten de E-chips worden vervangen door nieuwe. - Reinig de E-chips gedurende 2 minuten met een mengsel van argon en zuurstofgas. Plasmareiniging van de E-chips maakt het mogelijk om ze hydrofiel te maken. Hier zijn de details van plasmareiniging ingesteld: argon gas flow = 35 sccm, zuurstof gas flow = 11,5 sccm, gas flow timeout = 20 s, Forward RF target = 50 W, Forward RF Range = 5 W, Maximum reflected RF = 5 W.
- Laden van de vloeibare cellen in de TEM-houder (figuur 3).
- Plaats de pakking O-ringen in de vloeistofcelhouder (afbeelding 3B). Controleer of de gebruikte pakking schoon is. Zo niet, reinig het dan snel met gedestilleerd water. Droog het op met een schoon filterpapier. Om vuil en vezels op de pakking te verwijderen, drukt u deze meerdere keren tussen twee vellen parafilm.
- Plaats de kleine E-chip in de vloeistofcelhouder(afbeelding 3C). Om het buigen van de SiN-films naar het vacuüm van de microscoop te verminderen, plaatst u de ramen van de vloeibare cel in een gekruiste configuratie. Daarom moet het venster van de kleine E-chip evenwijdig zijn aan de lengte van de houder en de voorkant naar boven. Zorg ervoor dat de kleine E-chip goed in de pakking is geplaatst.
- Bereid het vloeibare monster voor (hier 1 mM HAuCl4 in water).
- Druppel ≈ 2 μL van het vloeibare monster op de kleine E-chip met behulp van een micropipet (figuur 3D). Als de kleine E-chip goed is gereinigd, zal het waterige vloeistofmonster zich gelijkmatig over het oppervlak van de chip verspreiden.
- Verwijder de extra vloeistof met een filterpapier. Met een scherp gesneden stuk filterpapier vermindert u de dikte van de vloeibare laag op de kleine E-chip totdat deze een platte koepel vormt.
- Plaats de grote E-chip in de vloeistofcelhouder(afbeelding 3E). Plaats de grote E-chip op de kleine met de voorkant naar beneden (de voorkanten van de twee chips moeten tegenover elkaar staan). De elektroden op de grote E-chip moeten in contact komen met de elektrodepad op de houder.
- Schuif het deksel terug op de vloeistofcelhouder. Draai elke schroef geleidelijk vast (figuur 3F).
- Droog de uiteindelijke vloeistof die uit de E-chips komt op met klein uitgesneden filterpapier. Controleer of er geen vloeistof aan beide zijden van de vloeistofcellen uitkomt door de vloeistofcelhouder om de as te draaien.
- Test de vacuümafdichting van de vloeistofcel in een pompstation. Als het vacuümniveau van de pomp 5 x 10-2 Pa bereikt, gaat u verder met het protocol. Zo niet, controleer dan de integriteit van het venster (het is hoogstwaarschijnlijk gebroken) en start het protocol vanaf het begin met een nieuwe set E-chips.
- Controleer nog een laatste keer de integriteit van het siliciumnitridevenster met behulp van een verrekijker of een optische microscoop. Soms kan de vloeistofcel het vacuüm van het gemaal in stand houden, zelfs als het raam kapot is. Dit komt omdat wanneer het raam breekt en de vloeistof eruit morst, het aggregaten zout kan vormen op het gebroken deel van het raam en zo het gat bedekt. Als het gebeurt, bereid dan een nieuwe set E-chips voor.
- Plaats de vloeistofcelhouder in de TEM en controleer het vacuümniveau. Zelfs als de vloeistofcel het vacuüm van het pompstation heeft volgehouden en er geen zichtbaar probleem met het raam is, kan microlekken van de vloeistofcel voorkomen dat het vacuümniveau wordt bereikt dat nodig is om de TEM te bedienen. Als de microscoop het vereiste vacuümniveau niet kan bereiken om te werken (2-5 x 10-5 Pa), verwijdert u de monsterhouder en maakt u een nieuwe set E-chips klaar.
5. Gebruik de vloeistofhouder in de stromingsmodus
- Vul 2 spuiten met een paar milliliter van de te injecteren oplossing (1 mM HAuCl4 in water in ons geval).
- Sluit 2 externe PEEK-buizen aan op de spuiten. Plaats de 2 spuiten op de spuitpompen. Plaats de externe PEEK-buizen in de 2 ingangen van de vloeistofcelhouder. Plaats een extra externe PEEK-buis voor de uitgang van de vloeistofcelhouder.
- Injecteer de oplossing met een debiet van 5 μL/min in elke inlaat.
6. Verwarming van de vloeibare omgeving
- Sluit de voeding aan op de houder. Sluit de voeding aan op de computer waarop de verwarmingssoftware is geïnstalleerd.
- Schakel de computer in en open de verwarmingssoftware. Schakel de voeding in.
- Klik op de knop Apparaatcontrole. Als de software aangeeft "geslaagd" dan kan het experiment doorgaan. Anders kan de grote E-chip een probleem hebben (onjuiste belasting van de E-chip, kapotte elektroden...).
- Klik op het tabblad Experiment. Klik op Handmatig om de handmatige verwarmingsmodus te activeren.
- Selecteer de beoogde temperatuur en verander dienovereenkomstig de temperatuursnelheid. Druk op toepassen om de E-chips op te warmen tot de beoogde temperatuur (Figuur 4).
OPMERKING: De E-chips kunnen tot 100 °C worden verwarmd. Als voor het experiment een waterige oplossing wordt gebruikt (zoals in ons geval), vermijd dan het verwarmen van de E-chips boven 90 °C. Anders kan het vloeibare monster opdrogen. Bij het opwarmen van de vloeistof kan de temperatuur tijdelijk boven de beoogde temperatuur stijgen en vervolgens terugvallen naar de gewenste temperatuur. Gebruik een lage verwarmingssnelheid om dergelijke overschrijdingen te minimaliseren (1 °C/s is prima). - Klik op Ambient om terug te gaan naar de omgevingstemperatuur (25 °C). Klik op Stop om de verwarming abrupt te stoppen. Klik op het tabblad Sessie beëindigen om het verwarmingsexperiment te beëindigen.
7. STEM-beeldvorming van de groei van nanodeeltjes
- Gebruik de microscoop in de STEM-modus met behulp van de HAADF-detector. Ga naar een ongerept deel van het monster, in de buurt van een hoek van het observatievenster waar de vloeistofdikte minimaal is. Verkrijg video's van nanodeeltjesgroei voor verschillende temperaturen van de vloeistof (Figuur 5).
OPMERKING: Gouden nanodeeltjes verschijnen onmiddellijk en groeien in het gescande gebied. Video-opname met een framesnelheid van één beeld per seconde is een goed compromis om de groeiprocessen te observeren met een goede signaal-ruisverhouding en een goede tijdresolutie.
8. STEM nanodiffractie van enkele nanodeeltjes
- Verkrijg een STEM HAADF-afbeelding van verschillende nano-objecten. Verkrijg het diffractiepatroon van individuele nanodeeltjes die op de afbeelding zijn geselecteerd met behulp van de STEMx-software (figuur 6).
OPMERKING: STEM nanodiffractie is een techniek die het mogelijk maakt om het diffractiepatroon van enkele nanodeeltjes in vloeistof te verkrijgen tijdens groeiexperimenten22. - Selecteer na het verkrijgen van een STEM HAADF-afbeelding verschillende nanoobjecten op de afbeelding en de STEMx-software synchroniseert automatisch de positie van de sonde en de CCD-camera om het diffractiepatroon op elke positie van de sonde te verkrijgen. Om overlapping van de diffractiepunten te voorkomen, gebruikt u een kleine convergentiehoek van de STEM-sonde (7,4 mrad in ons geval) met behulp van een kleine condensatoropening (10 μm in ons geval).
9. Reiniging van de vloeistofcelhouder (na het experiment)
OPMERKING: Hier beschrijven we een standaard reinigingsprocedure voor de vloeistofcelhouder. Als deze reiniging niet efficiënt genoeg is, is het mogelijk om verdund salpeterzuur en methanol te gebruiken om de uiteindelijke nanodeeltjesaggregaten in de vloeistofcelhouder weg te spoelen. De chemische compatibiliteitsdocumentatie van de houder van de vloeibare cel moet vooraf worden geraadpleegd. Maak de reiniging in ieder geval altijd af met de injectie van gedestilleerd water.
- Verwijder het deksel. Verwijder de gebruikte E-chips. Verwijder de interne pakking.
OPMERKING: De gebruikte E-chips kunnen in een aangepaste doos worden bewaard. Het is dan mogelijk om ex situ TEM- of SEM-analyses uit te voeren van de nano-objecten die aan de SiN-vensters zijn bevestigd na het loszetten van de vloeistofcel15. Het is niet aan te raden om de E-chips te hergebruiken voor een ander in situ experiment, maar het is nog steeds mogelijk als de SiN-folie niet is gebroken tijdens het loszetten van de vloeistofcel. Overgroeiexperimenten in een ander oplosmiddel kunnen dan worden uitgevoerd. 23 - Injecteer 5 ml gedestilleerd water in de inlaat- en uitlaatslang van de vloeistofcelhouder.
- Reinig de punt van de vloeistofcelhouder met behulp van een ultrasoon bad gedurende 20 minuten. Het contactpad kan in het bad worden ondergedompeld. Dompel alleen het deel onder dat bedekt is met het deksel. Dompel de ontluchtingsgaten niet onder in vloeistof.
- Droog de vloeistofcelhouder op met een luchtpistool.
- Zet de pakking terug die wordt gebruikt met de dummy vloeibare cellen. Zet de dummy vloeibare cellen en het deksel terug.
- Bewaar de monsterhouder in een vacuümstation.
10. Analyse na het experiment met Fiji (ImageJ)
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om elk frame van de video die is gemaakt in afzonderlijke afbeeldingen te splitsen. Het doel van deze analysestap na het experiment is om de originele video's van de nanodeeltjes om te zetten in binaire video's die door Fiji kunnen worden geanalyseerd. Een mediaanfilter wordt gebruikt om het contrast van de nanodeeltjes op de achtergrond te verbeteren (figuren 7B & 7E). Dit is essentieel om de binarisatie van de video te vergemakkelijken.
- Open de bestandsmap met de afbeeldingen van de video op Fiji door te klikken op Bestand | Import | Afbeeldingsvolgorde. Het venster met sequentieopties verschijnt. Selecteer de juiste startafbeelding (als het begin van de video moet worden verwijderd). Voer het toenamenummer voor de afbeeldingsreeks in (dit komt overeen met het aantal frames dat nodig is om de STEM-scan de onderkant van de afbeelding te laten bereiken). Schakel het selectievakje Converteren naar 8-bits grijswaarden in. Sla de afbeeldingsvolgorde op in tiff-indeling.
- Snijd alle ongewenste artefacten uit de video uit (bijvoorbeeld de schaalbalk of de rand van het venster met vloeibare cellen).
- Klik op Proces | Filters | Mediaan om een mediaanfilter op alle afbeeldingen toe te passen. Sla de verwerkte afbeeldingsvolgorde op in tiff-indeling.
OPMERKING: Er verschijnt een venster waarin wordt gevraagd naar de straal die wordt gebruikt voor het mediaanfilter. We gebruikten een straal van 2 pixels, maar voel je vrij om verschillende parameters te gebruiken. Andere filters zijn ook beschikbaar in Fiji die kunnen worden gebruikt om de beeldverwerking te verbeteren. Met name het aftrekkende achtergrondalgoritme kan worden gebruikt om de achtergrondintensiteit vlak te maken als deze niet-uniform is. Klik hiervoor op Proces | Substract achtergrond. In ons geval creëert dit proces kleine witte vlekken op de achtergrond van de eerste afbeeldingen die kunnen worden geïnterpreteerd als valse nanodeeltjes. We hebben dit proces dus niet gebruikt, maar het moet worden geprobeerd op andere datasets, omdat de toenemende vloeistofdikte van de hoek tot het midden van de vloeibare cel meestal een niet-uniforme achtergrondintensiteit induceert bij LCTEM-afbeeldingen met een lage vergroting. - Klik op Afbeelding | | aanpassen Drempel. Beweeg handmatig voor een betere precisie van de drempel van de binarisatie totdat alleen de nanodeeltjes rood gekleurd zijn. Druk op de solliciteerknop. De stapel converteren naar binair venster verschijnt. Schakel Drempel berekenen voor elke afbeelding uit. Sla de binaire afbeeldingsvolgorde op in tiff-indeling (Figuren 7C & 7F).
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om te controleren of de drempel op elk frame van de video voldoet. - Doe deze stap alleen als er een contrastomkering van de nanodeeltjes is tijdens de video. Klik op Proces | Binaire | Verwijden. Doe het nog een keer als het nodig is. Klik op Proces | Binaire | Vulgaten (Figuur 7G, zie de discussiesectie).
- Klik op Analyseren | Analyseer deeltjes. Definieer het groottebereik van de geanalyseerde nanodeeltjes die tijdens het experiment zijn waargenomen. Vink Samenvatten aan.
OPMERKING: Het is erg belangrijk om op zijn minst de minimale grootte van de waargenomen nanodeeltjes te definiëren. Zonder dit worden de kleine zwarte stippen (ruis) die in de binaire afbeeldingssequentie verschijnen, beschouwd als nanodeeltjes. Kies bij de eerste poging de grootte van de kleinste nanodeeltjes die door het oog worden geïdentificeerd, maar vervolgens is een trial and error-proces nodig om het effect van deze parameter te begrijpen en de geautomatiseerde gegevensanalyse te optimaliseren (zie discussiesectie). Klik voor deze stap op Analyseren | Stel metingen in en controleer Gebied. Andere metingen zijn beschikbaar. - Sla de vensters Resultaten en Overzicht op. Het aantal nanodeeltjes voor elk frame bevindt zich in het venster Overzichtsgegevens.
Representative Results
Figuur 5 toont twee STEM HAADF-beeldreeksen van gouden nanodeeltjesvorming die gedurende 80 seconden bij 25 °C en 85 °C zijn verworven. In al deze experimenten wordt de nucleatie en groei van nanodeeltjes aangedreven door de radiolyse van water. Onder de chemische soorten die door deze door elektronenbundel geïnduceerde verschijnselen worden gegenereerd, kunnen sterke reducerende middelen (d.w.z. waterige elektronen en waterstofradicalen) het tetrachlooretrische zuur verminderen, wat leidt tot de vorming van gouden nanokristal op het raakvlak tussen de SiN-ramen en de vloeistof. Deze twee in situ observaties uitgevoerd met dezelfde elektronendosissnelheid bevestigen dat de huidige methode het mogelijk maakt om de drastische impact van temperatuur op de vorming van nanodeeltjes in vloeibare media te visualiseren. Bij lage temperatuur observeren we de groei van een zeer dichte assemblage van kleine nanodeeltjes, terwijl bij hoge temperatuur een paar grote en goed gefacetteerde nanostructuren worden verkregen. Aangezien het contrast van STEM HAADF-beelden evenredig is met de dikte van de gouden nanodeeltjes, kunnen we zien dat tijdens deze groei-experimenten twee populaties objecten worden gevormd: sterk contrasterende 3D-nanodeeltjes en grote 2D-nanostructuren met driehoekige of zeshoekige vorm en een lager contrast (aangegeven door rode pijlen in figuur 5).
De video-analysemethode die in dit protocol wordt beschreven, maakt het mogelijk om de nucleatie- en groeiprocessen te kwantificeren door in de loop van de tijd het aantal nanodeeltjes en hun gemiddelde oppervlak in het waargenomen gebied te meten. Zoals te zien is in figuur 8, worden bij lage temperatuur meer dan 800 nanodeeltjes gevormd binnen enkele tientallen seconden na observatie, terwijl slechts 30 nanodeeltjes worden gevormd bij hoge temperatuur. Afgezien van twee driehoekige en zeshoekige nanoplaten, zijn alle nanodeeltjes al aanwezig op het allereerste beeld van de follow-up bij hoge temperaturen. Figuur 9 laat zien dat het gemiddelde oppervlak van nanodeeltjes bij 85 °C 40 keer sneller toeneemt dan bij 25 °C.
Figuur 6 vertegenwoordigt een typische STEM-afbeelding en het diffractiepatroon van twee gouden nanodeeltjes die direct op de afbeelding zijn geselecteerd (aangegeven met rode pijlen op figuur 6A). Hier kunnen we de face-centered cubic (FCC) structuur van goud georiënteerd langs de [001] (Figuur 6B) en [112] (Figuur 6C) zone assen identificeren.
Figuur 1: Schematisch van de E-chips en de punt van de vloeistofcelhouder. (A) De grote e-chip met de weerstand die wordt gebruikt om de vloeistofcel (boven) en de kleine E-chip (onder) te verwarmen. (B) Beide E-chips worden in de vloeistofcelhouder geladen. De elektroden van de grote E-chip staan in contact met elektrodenkussens van de vloeistofcelhouder. De weerstand van de grote E-chip kan de vloeibare cel opwarmen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Optische microscoopfoto's van E-chips ter illustratie van: (A) Een intact SiN-venster dat nodig is voor het experiment. (B) Een beschadigde siliconen wafer aan de rand van de E-Chip. Dit type E-chips kan worden gebruikt als het beschadigde gebied zich buiten het natte gebied bevindt zodra de vloeistofcel is verzegeld (d.w.z. als de schade zich buiten het door de O-ringen gedefinieerde gebied bevindt). C) Residuen op het E-chipoppervlak. Als dergelijke residuen na het herhalen van de reinigingsprocessen niet achterlaat (zie punt 4.1), gebruik dan de E-chip niet. (D tot F) Beschadigde SiN-ramen (onbruikbaar E-chips). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Foto's van het stapsgewijze proces van het laden van de vloeistofcel in de TEM-houder. a) Alleen monsterhouder. (B) Plaats de pakking O-ring in de holte. (C) Steek de kleine E-chip in pakking O-ringen. (D) Doe een druppel oplossing op de kleine E-chips. (E) Plaats de grote E-chip over de kleine. (F) Verzegel de hele vloeistofcel door het deksel te schroeven. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Screenshot van de verwarmingssoftware die de temperatuur van de vloeistofcel regelt. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Lage vergroting STEM HAADF beeldreeks van de groei van gouden nanodeeltjes. a) bij 25 °C. b) bij 85 °C. De overeenkomstige tijd wordt in de linkerbenedenhoek van elke afbeelding aangegeven. De 2D nanostructuren worden aangegeven met rode pijlen. Alle beelden worden verkregen met dezelfde elektronendosissnelheid van 3,4 elektron·s-1·nm-2. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6: STEM nanodiffractie van enkelvoudige nanodeeltjes. (A) STEM-afbeelding die wordt gebruikt om de diffrerende nanodeeltjes te selecteren (de posities van de sonde tijdens diffractie-acquisities worden aangegeven met rode pijlen). (B, C) Diffractiepatroon van de twee geselecteerde nanodeeltjes. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 7: Gegevensverwerking en analyse van STEM HAADF-afbeeldingen met Fiji. De beelden werden 40 seconden na het begin van de groei verkregen. (A tot C) Afbeelding verkregen bij 25 °C. (D tot G) Afbeelding verkregen bij 85 °C. (A,D) Raw STEM-afbeelding. (B,E) Verwerkte afbeelding (mediaanfilter). (C,F) Binaire afbeelding. (G) Een verwijding van de pixels wordt twee keer toegepast en vervolgens wordt het proces "Vulgaten" toegepast. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 8: Grafiek die het aantal gouden nanodeeltjes weergeeft als functie van de tijd bij 25 °C en 85 °C. De twee curven bij 25°C worden automatisch gemeten met een minimale detectiegrootte (Smin) van 20 (rood) en 50 (blauw) pixels2. De groene stippen gemeten na 12 en 60 seconden acquisitie vertegenwoordigen het aantal nanodeeltjes dat handmatig wordt geteld op de video die is verkregen bij 25 °C. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 9: Grafieken die het gemiddelde oppervlak van gouden nanodeeltjes weergeven als functie van de tijd voor 25 °C en 85 °C. De groene stippen vertegenwoordigen handmatige metingen van het gemiddelde oppervlak van nanodeeltjes op bepaalde tijdstippen van de video die is verkregen bij 85 ° C. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 10: Hoge vergroting STEM HAADF beeldreeks van de groei van enkele gouden nanokubus bij 85 °C. Deze beeldreeks werd verworven met een elektronendosis van 83,6 electron.s-1.nm-2. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Discussion
Het beschreven protocol maakt het mogelijk om de nucleatie en groei van gouden nanodeeltjes aangedreven door radiolyse in een temperatuurgeregeld vloeibaar medium te volgen. In combinatie met geautomatiseerde videoverwerking maakt het het mogelijk om het effect van de temperatuur te meten op belangrijke parameters van nanodeeltjessynthese, zoals de dichtheid, de grootte, de vorm en de atoomstructuur van nanodeeltjes. Deze waardevolle inputs maken het mogelijk om het effect van de temperatuur op de nucleatie- en groeisnelheden te evalueren, mogelijke faseovergangen te detecteren en de facetprocessen te visualiseren die het eindresultaat van colloïdale oplossingen bepalen. Samen met de mogelijkheid om de samenstelling van de reactieve media te controleren, is temperatuurgecontroleerde vloeibare cel TEM een volgende stap in de richting van de directe observatie van de nucleatie- en groeiprocessen van verschillende nanostructuren in realistische syntheseomstandigheden. De interpretatie van de resultaten in dit artikel en hun vergelijking met nucleatie- en groeimodellen zullen elders worden besproken. Hier willen we verschillende methodologische aspecten benadrukken die moeten worden overwogen om relevante TEM-experimenten in situ uit te voeren.
Allereerst is het cruciaal om de elektronenbundeleffecten in de reactiemedia te identificeren, omdat ze de resultaten van het experiment drastisch kunnen beïnvloeden. Hier, aangezien waterradiolyse de drijvende kracht is van nanodeeltjesvorming, neemt de groeisnelheid snel toe met de elektronendosissnelheid die de uiteindelijke vorm van nanoobjecten11,15zal beïnvloedt. Daarom is het noodzakelijk om groeiexperimenten die zijn verkregen met dezelfde elektronendosissnelheid te vergelijken om de effecten van de temperatuur op de nucleatie en groei van nanodeeltjes te bestuderen. In stemmodus komt de elektronendosissnelheid overeen met de bundelstroom (in elektron per seconde) gedeeld door de beeldgrootte (in nm2). Daarom impliceert een constante elektronendosissnelheid dat dezelfde bundelstroom (d.w.z. dezelfde condensatoropening en dezelfde vlekgrootte) en dezelfde vergroting voor elk experiment behouden blijft. Het kwantificeren van de stralingsstroom van de beeldomstandigheden met behulp van een CCD-camera of een Faraday-beker is belangrijk om de gegevens te interpreteren en te reproduceren. De vergroting en de daaruit voortvloeiende dosissnelheid moeten worden geselecteerd op basis van de vraag of men de groei van een grote verzameling nanodeeltjes wil visualiseren om statistisch relevante resultaten op de groeikinetiek te extraheren (figuur 5) of de groeimechanismen op de schaal van één nanodeeltjes om de voorkeursadvertentieplaatsen op de nanodeeltjesoppervlakken te identificeren (figuur 10). Als de nucleatie- en groeiprocessen te snel zijn, met name bij hoge vergroting, moeten kleine condensoropening en kleine spotgrootte worden geselecteerd om de dosissnelheid te minimaliseren. De nucleatie en groei van nanodeeltjes kan ook vertragen door de concentratie van metaalprecursor in de geanalyseerde oplossing te verminderen, maar merk op dat de concentratie van radiolytische producten zal toenemen met de temperatuur. In het algemeen is het ook belangrijk om rekening te houden met de elektronenbestralingsgeschiedenis van het hele monster. Hier, bijvoorbeeld, als verschillende groeiexperimenten snel worden uitgevoerd in gebieden dicht bij elkaar, zal de dichtheid van nanodeeltjes in de loop van de tijd afnemen omdat de concentratie van gouden precursoren in het bestudeerde gebied afneemt. Dit effect kan worden geminimaliseerd door de groeiexperimenten zowel in ruimte als tijd te scheiden en door de vloeistofhouder in stroommodus te gebruiken.
Interface-tracking algoritmen zijn uiterst nuttig om de analyse van video's te automatiseren en kwantitatieve resultaten te extraheren op de nucleatie en groei van grote nanodeeltjesassemblages. Het is echter vermeldensgezegd dat de stap voor beeld binarisatie altijd gegevensspecifiek is, wat betekent dat de filters en de gegevensverwerking die op afbeeldingen moeten worden toegepast om de detectie van de nanodeeltjes / vloeibare interface te optimaliseren, van een experiment tot een ander zullen variëren. Bovendien is het essentieel om de resultaten van deze geautomatiseerde analyses te vergelijken met handmatige metingen die op een paar afbeeldingen worden uitgevoerd om de workflow voor beeldverwerking te optimaliseren en de beperkingen ervan te kennen. Hier veroorzaken bijvoorbeeld meerdere verstrooiingsgebeurtenissen in de steeds dikker wordende 3D-nanodeeltjes gevormd bij hoge temperatuur een contrastomkering van hun kern na 30 seconden observatie omdat de hoekverbreding van verspreide elektronen resulteert in een afname van het verzamelde signaal in het hoekbereik van de ringvormige detector. Om het ware oppervlak van deze nanodeeltjes te blijven meten, gebruikten we een "vulgaten" dataproces na de binarisatie van de afbeelding die de binnenste cirkel van ringvormcontrast vult(figuur 7F, G). We moesten echter een kleine verwijding van de objecten gebruiken om ervoor te zorgen dat deze ringvormcontrasts altijd volledig met elkaar verbonden zijn. Deze laatste stap leidt tot een lichte overwaardering van het gemiddelde oppervlak van nanodeeltjes in de geautomatiseerde metingen (figuur 9). Evenzo moeten we voor de detectie van nanodeeltjes een minimale grootte van gedetecteerde objecten (Smim) definiëren om te voorkomen dat het geluid wordt gedetecteerd, maar deze parameter beïnvloedt de gemeten nucleatiesnelheid. Zoals te zien is in figuur 8,neemt het aantal gedetecteerde nanodeeltjes aan het begin van het experiment toe om een plateau te bereiken. Wanneer Smin groot is (50 pixels2 overeenkomend met 1543 nm2),worden automatische en handmatige metingen overeengekomen op het niveau van dit plateau (835 nanodeeltjes na 60 seconden), maar de detectie van nanodeeltjes wordt vertraagd in de automatische analyse, omdat 835 nanodeeltjes handmatig worden geteld na slechts 12 s, maar pas later automatisch worden gedetecteerd. Deze langere detectietijd leidt tot een onderwaardering van de nucleatiesnelheid. Het verminderen van Smin tot 20 pixel2 (d.w.z. 617 nm2) vermindert de fout op de nucleatietijd van de nanodeeltjesassemblage, maar het leidt tot een overwaardering van de nanodeeltjesdichtheid, vooral in het vroege stadium van de experimenten (figuur 8) die ook de nucleatiesnelheid beïnvloedt. De detectie en de grootte- en vormmetingen van nanoobjecten met een zeer dynamisch gedrag en een lage signaal-ruisverhouding is een veel voorkomende uitdaging in vloeibare fase TEM die verder kan worden verbeterd met behulp van andere segmentatie- en denoisingmethoden24 of machine learning-benaderingen25.
Last but not least moeten de bereiding van de vloeibare cel en het reinigen van de vloeistofhouder zeer zorgvuldig worden uitgevoerd om verontreinigingen van de reactiemedia te voorkomen.
Over het algemeen biedt het regelen van de temperatuur van het monster tijdens LCTEM-analyses de mogelijkheid om thermische effecten op chemische reacties te onderzoeken die optreden op het raakvlak tussen vaste stoffen en vloeistoffen. Daarom hopen we dat de huidige methode de weg vrijmaakt voor andere TEM-experimenten in situ die zijn ontworpen om de dynamiek van harde, zachte of biologische materialen in temperatuurgecontroleerde vloeibare media te onthullen.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
Wij erkennen dankbaar de financiële steun van de regio Ile-de-France (conventie SESAME E1845 voor de JEOL ARM 200 F elektronenmicroscoop geïnstalleerd aan de Universiteit van Parijs), het Labex SEAM (GLOIRE Project) en het CNRS (Defi Nano Program). We danken Madeline Dukes en Daniel Franck voor het delen van de schema's en de optische foto's van de vloeibare cellen in figuur 1 en 2.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Plus electron microscope | Jeol | ||
| Acetone | Merck | ||
| Air pistol | |||
| ARM 200F electron microscope | Jeol | ||
| Binoculars or optical microscope | |||
| Carbon tipped tweezers | |||
| Computer with heating software | Software by Protochips | ||
| Distlilled water | |||
| Dummy e-chips | Protochips | ||
| Gasket/O-rings | Protochips | ||
| Gold aqueous solution | Merck | 1 mM of HAuCl4 - Prepared beforehand | |
| Large liquid heating E-chip | Protochips | ||
| Methanol | Merck | ||
| One View camera | Gatan | ||
| Petri dish | Number : 2 | ||
| Plasma cleaner | Gatan | ||
| Poseidon Select | Protochips | Liquid cell holder | |
| Power supply Keithley 2450 | |||
| Protective gloves | |||
| Red PEEK tubing | Number : 3 | ||
| Screwdriver with torque | |||
| Small liquid E-chip | Protochips | 150 nm spacers | |
| STEM HAADF detector | Jeol | ||
| STEMx software | Gatan | ||
| Syringe | Number : 2 | ||
| Syringe pump | Harvard apparatus | Number : 2 | |
| Vacuum pump | Gatan |
References
- Willets, K. A., Van Duyne, R. P. Localized surface plasmon resonance spectroscopy and sensing. Annual Review of Physical Chemistry. 58 (1), 267-297 (2007).
- Dreaden, E. C., Alkilany, A. M., Huang, X., Murphy, C. J., El-Sayed, M. A. The golden age: gold nanoparticles for biomedicine. Chemical Society Review. 41, 2740-2779 (2012).
- You, H., Yang, S., Ding, B., Yang, H. Synthesis of colloidal metal and metal alloy nanoparticles for electrochemical energy applications. Chemical Society Review. 42, 2880-2904 (2013).
- Nikoobakht, B., El-Sayed, M. A. Preparation and growth mechanism of gold nanorods using seed-mediated growth method. Chemistry of Materials. 15, 1957-1962 (2003).
- Hubert, F., Testard, F., Spalla, O. Cetyltrimethylammonium bromid silver bromide complex as the capping agent of gold nanorods. Langmuir. 24, 9219-9222 (2008).
- Xia, Y., Xiong, Y., Lim, B., Skrabalak, S. E. Shape-controlled synthesis of metal nanocrystals: Simple chemistry meets complex physics. Angewandte Chemie International Edition. 48, 60-103 (2009).
- Zheng, Y., Zeng, J., Ruditskiy, A., Liu, M., Xia, Y. Oxidative etching and its role in manipulating the nucleation and growth of noble-metal nanocrystals. Chemistry of Materials. 26, 22-33 (2014).
- Xin, H. L., Zheng, H. In situ observation of oscillatory growth of bismuth nanoparticles. Nano Letters. 12 (3), 1470-1474 (2012).
- Wu, J., et al. Growth of Auau on Pt icosahedral nanoparticles revealed by low-dose in situ TEM. Nano letters. 15, 2711-2715 (2015).
- Ahmad, N., Wang, G., Nelayah, J., Ricolleau, C., Alloyeau, D. Exploring the formation of symmetric gold nanostars by liquid-cell transmission electron microscopy. Nano letters. 17, 4194-4201 (2017).
- Woehl, T. J., Evans, J. E., Arslan, I., Ristenpart, W. D., Browning, N. D. Direct in situ determination of the mechanisms controlling nanoparticle nucleation and growth. ACS Nano. 6, 8599-8610 (2012).
- Tan, S. F., et al. Intermediate structures of pt-ni nanoparticles during selective chemical and electrochemical etching. The Journal of Physical Chemistry Letters. 10, 6090-6096 (2019).
- Xin, H. L., Zheng, H. In situ observation of oscillatory growth of bismuth nanoparticles. Nano Letters. 12, 1470-1474 (2012).
- Aliyah, K., et al. Real-time in situ observations reveal a double role for ascorbic acid in the anisotropic growth of silver on gold. The Journal of Physical Chemistry Letters. 11 (8), 2830-2837 (2020).
- Alloyeau, D., et al. Unravelling kinetic and thermodynamic effects on the growth of gold nanoplates by liquid transmission microscopy. Nano Letters. 15 (4), 2574-2581 (2015).
- Gao, W., et al. Direct in situ observation and analysis of the formation of palladium nanocrystals with high-index facets. Nano Letters. 18 (11), 7004-7013 (2018).
- Liao, H. -G., et al. Facet development during platinum nanocube growth. Science. 345, 916-919 (2014).
- Tan, S. F., et al. Real-time imaging of the formation of Au-Ag core-shell nanoparticles. Journal of the American Chemical Society. 138 (16), 5190-5193 (2016).
- Khelfa, A. Selective shortening of gold nanorods: when surface functionalization dictates the reactivity of nanostructures. Nanoscale. 12, 22658-22667 (2020).
- Schneider, N. M., et al. Electron-water interactions and implications for liquid cell electron microscopy. Journal of Physical Chemistry C. 118, 22373-22382 (2014).
- Ahmad, N., Le Bouar, Y., Ricolleau, C., Alloyeau, D. Growth of dendritic nanostructures by liquid-cell transmission electron microscopy: a reflection of the electron-irradiation history. Advanced Structural and Chemical Imaging. 2, 9 (2016).
- Khelfa, A., et al. Structural analysis of single nanoparticles in liquid by low-dose STEM nanodiffraction. Micron. 116, 30-35 (2019).
- Ahmad, N., Wang, G., Nelayah, J., Ricolleau, C., Alloyeau, D. Driving Reversible Redox Reactions at Solid/Liquid Interfaces with the Electron Beam of a Transmission Electron Microscope. Journal of Microscopy. 269, 127-133 (2018).
- Schneider, N. M., Park, J. H., Norton, M. M., Ross, F. M., Bau, H. H. Automated analysis of evolving interfaces during in situ electron microscopy. Advanced Structural and Chemical Imaging. 2, (2016).
- Yao, L., Ou, Z., Luo, B., Xu, C., Chen, Q. Machine learning to reaveal nanoparticle dynamics from liquid-phase TEM videos. ACS Central Science. 6, 1421-1430 (2020).
