Summary
液体相電子顕微鏡実験における温度制御は、その形成または応用媒体を模倣した液体環境におけるナノ粒子の動的な研究の新たな視点を開く。最近開発された加熱液細胞を用いて、水中の金ナノ粒子の核生成および成長過程における温度の影響を直接観測した。
Abstract
温度制御は、液体細胞透過電子顕微鏡によるナノ化学の研究にさらなる自由度を提供する最近の開発である。本論文では、水中の放射線による金ナノ粒子の形成に対する温度の影響を研究するためのin at citu加熱実験を準備する方法を説明する。実験の議定書は100 °Cまでの均一な暖房機能を持つ特別な液体セル、流れ能力および温度を制御するための統合されたインターフェイスを備えた液体電池TEMのホールダーを含むかなり簡単である。金ナノ粒子の核生成・成長機構は、液体細胞の温度に大きく影響することを示す。STEMイメージングとナノディフ分を用いて、成長するナノ粒子の密度、大きさ、形状、原子構造の進化がリアルタイムで明らかになる。自動画像処理アルゴリズムを利用して、ナノ粒子の核生成や成長速度などのビデオシーケンスから有用な定量データを抽出します。このアプローチは、ナノ材料の液相合成中に遊ぶ複雑な物理化学的プロセスを理解するための新しいインプットを提供します。
Introduction
金属ナノ粒子(NPs)は、光学センシング1、医薬2、 エネルギー3などの様々な領域で使用できる有望な物理化学的特性を有する。ウェット化学合成は、明確に定義されたサイズと形状を持つ金属のNPsを製造するための非常に汎用性の高い方法です。過去数十年にわたり、多くの戦略が開発されたNPs合成の制御を得るために:種子介在成長4、顔遮断法5、キネチカル制御合成6、選択的エッチング7 または温度制御合成8。しかし、合成を駆動する化学反応はかなり単純であるが、核生成および成長メカニズムは、多くのパラメータが形成プロセスにおいて役割を果たし、その個々の影響が合成の所定の時点でそれらの形成媒体から抽出された元の現場のスナップショットから取り出すのが難しいため、そうではない。核生成と成長過程を真に理解し、それらを制御する方法を確立するためには、細かく制御された液体環境でリアルタイムの観察を可能にする場で使用する必要があります。
その点、液体細胞透過型電子顕微鏡(LCTEM)は、金属ナノ粒子9、10、11、12、13の合成に新たな光を当てる非常に強力な方法であった。個々のナノ構造体のダイナミクスを液体形成媒体に直接イメージングすることにより、 この技術は、結晶欠陥、種子形態および有機リガンドの役割を深く理解し、方向性成長またはエッチングプロセスを駆動し、特定の形状(ナノロッド、ナノスター、ナノプレート、ナノシェル)10、11、12、13、14、15、16、17、18を提供する。TEMの電子ビームが液体と相互作用すると、放射線溶解プロセスは、照射領域の溶液化学を変更し、成長またはエッチングプロセスを駆動するために使用することができる強力な還元および酸化種を生成します。興味深いことに、放射線分解物の濃度は電子線量率とともに増加することが知られており、電子顕微鏡20で細かく調整できるパラメータである。従って、この放射線分解の用量速度依存性は、反応速度を制御し、ナノ構造11、15、20の形成過程および最終形態に対する運動学的影響を明らかにするために利用されてきた。
温度はナノ材料合成の重要なパラメータですが、温度制御が確実な市販の液体細胞が最近開発されたばかりであるため、LCTEMではこれまでのところその効果を慎重に調査していません。しかし、このような研究では、温度変化によって引き起こす複雑な運動学や熱力学的効果を解明するために不可欠です。確かに、温度を上げると、成長中のファセットプロセスに大きな影響を与え、液体中の原子および分子拡散をスピードアップし、反応速度を変更します。一方、ナノ構造のナノ相図も温度に対して非常に敏感である。本稿では、最近開発された加熱液体細胞を利用して、室温と100°Cの間の温度制御を伴う水中の金ナノ粒子の放射線増殖に従う。 この方法論は、実際の合成条件に近づいている環境におけるSTEMイメージングと回折を組み合わせることで、Situ TEM観測とベンチスケールの合成のギャップを減少させます。
Protocol
1. STEM HAADFイメージング用の透過型電子顕微鏡の位置合わせ
- 顕微鏡の位置合わせについては、メーカーの指示に従ってください。
- 顕微鏡を整列させるために、従来の乾燥サンプルを使用してください。液体サンプルは使用しないでください。
- 成長速度を最小にするために、ビーム電流を低減するために小さな凝縮器絞りと小さなスポットサイズを使用することを意味する電子線量速度(説明セクションを参照)を最小限に抑えます。
2. Eチップ処理
注:市販の液体ホルダーは、ほぼすべてのTEMに適合しますが、顕微鏡ブランドとポールピースのために特別に設計されているホルダーを使用しています。液体セルは、Eチップと呼ばれる2つのMEMSベースのシリコンチップで作られており、どちらも500 x 50 μmの窓を持つシリコン基板で、50nmの厚いアモルファスシリコン窒化ケイ素(SiN)フィルムで覆われており、電子透過性である(図1A)。これら2つのeチップはサイズが異なります。小さい1つは2つのEチップ(ここで150 nm)と液体の厚さの間の間隔を固定する金のスペーサーと2 x 2のmmである。大きい方は4 x 6mmで、シリコン基板内部に埋め込まれた抵抗を有し、液体サンプルの均一な加熱が可能である(図1B)。クリーンルームで製造される方法のために、Eチップには2つの異なる側面があります:1つは窓が小さく見える(ここでは前側と呼ばれる)、もう1つは窓がシンク形状で大きい(ここでは裏側と呼ばれる)。
- Eチップを扱うときは、ピンセットで窓に触れないようにし、チップを横につかまないでください。シリコン基板の表面を傷つけないように、カーボンチップピンセットを使用してください。
- 表面にEチップを配置する場合は、SiNフィルムが壊れやすく、前面に堆積しているため、裏面が表面に接触していることを確認してください。
3. 液体セルホルダーの洗浄(実験前)
- ホルダーの先端を覆う蓋を取り外します。ピンセットを使用してダミーの液体セルを取り除きます。ダミーの液体セルで使用するガスケットを取り除きます。
注:ダミー液体セルは、SiNウィンドウのない液体セルであり、シリコンのみである。それらは真空ポンプの液体細胞のホールダーを貯えるため使用される。ブラスねじは時間の経過とともに簡単に崩れてしまうので、注意してください。特に、ねじ頭が破損している場合は、ねじを交換する必要があります。それ以外の場合は、実験後にそれらを緩めるのが難しい場合があり、小さな破片もサンプルのロードを中断する可能性があります。 - 手動でホルダーの背面に接続するために、注射器と外部PEEKチューブを使用してホルダーの内側に蒸留水の2 mLを注入します。
注:ホルダーの内部に3つのマイクロ流体トンネルがあります。3つとも水できれいにしなければならない。ホルダーの前から出てくる水に注意してください:水が以前の実験のために着色されている場合は、液体が着色されるまでホルダーの中に水を入れ続けます。 - 実験中に液体細胞に溶液を注入する場合(我々の場合は水中のHAuCl4 の1 mM)、この溶液でサンプルホルダーのチューブを充填して下さい。
- エアピストルを使用して液体電池ホルダーの先端を乾かします。
4. 液体セル(Eチップ)の調製
- 液体細胞の洗浄。
- ガラスペトリ皿にアセトンを入れます。
- ガラスペトリ皿にメタノールを入れます。
注意:メタノールの毒性のために、メタノールとペトリ皿は、フュームフードの下に置く必要があります。メタノールは、適切な保護具(手袋)で取り扱う必要があります。 - ペトリ皿に小さくて大きなEチップを1つアセトンで入れ、2分間待ちます。
メモ:Eチップは、実験の前に取り外す必要がある保護層でコーティングされています。アセトンはフォトレジストを取り除き、破片のEチップをクリーンアップします。洗浄を強化するために、溶液を穏やかに攪拌することができる。 - メタノールとペトリ皿に両方のEチップを入れ、2分間待ちます。メタノールは、アセトンと残りの破片からEチップをクリーンアップします。
注意: アセトンとメタノール間のEチップの移動は、Eチップが空気中で乾燥しないように、できるだけ速く行う必要があります。 - 空気ピストルを使用して液体細胞を乾燥させます。エアピストルを使用しながらピンセットを使用してEチップを保持します。それ以外の場合、Eチップはピンセットから脱落することができます空気ピストルトリガーにあまりにも多くを押しないように注意してください。それらが脱落した場合は、アセトンとメタノールで洗浄を再開します。
- 双眼鏡または光学顕微鏡を使用して窒化シリコンウィンドウの完全性を確認する(図2)。
メモ:両方のEチップの窓がきれいで壊れていないことを確認してください。Eチップがきれいでない場合は、アセトンとメタノールに戻してみてください。汚れがウィンドウに残っている場合、またはウィンドウが壊れている場合は、Eチップを新しいもので交換する必要があります。 - プラズマは、アルゴンと酸素ガスの混合物でEチップを2分間洗浄します。Eチップを洗浄するプラズマは親水性を可能にします。ここでは、プラズマ洗浄の設定の詳細です:アルゴンガス流量=35sccm、酸素ガス流量=11.5sccm、ガス流タイムアウト=20s、前方RFターゲット=50W、フォワードRFレンジ= 5W、最大反射RF= 5W。
- TEM ホルダに液体セルをロードする (図 3)。
- 液体セルホルダーの内側にガスケットOリングを積み込みます(図3B)。使用するガスケットがきれいであることを確認します。そうでなければ、蒸留水で速くきれいにしてください。きれいなフィルターペーパーを使用して乾燥させます。ガスケットの破片や繊維を取り除くために、2枚のパラフィルムの間で複数回押します。
- 小さなEチップを液体セルホルダーの中に入れてください(図3C)。顕微鏡の真空に向かってSiNフィルムの弓を減らすには、液体セルの窓を交差した構成に置きます。したがって、小さなEチップの窓は、ホルダーと前面の長さに平行でなければなりません。小さなEチップがガスケットの中に十分に挿入されていることを確認してください。
- 液体サンプルを準備します(ここでは、水のHAuCl4 の1 mM)。
- マイクロピペットを使用して、液体サンプルの≈2μLを小さなEチップにドロップします(図3D)。小さなEチップが適切にプラズマ洗浄されている場合、水性液体サンプルはチップの表面全体に均等に広がります。
- 余分な液体を濾紙で取り除きます。フィルターペーパーを鋭く切り取った部分で、平らなドームを形成するまで、小さなEチップの液体層の厚さを減らします。
- 大きなEチップを液体セルホルダーの内側に入れます(図3E)。大きなEチップを前面を下にして小さなEチップを置きます(2つのチップの前面は互いに向き合う必要があります)。大きいEチップの電極は、ホルダーの電極パッドに接触している必要があります。
- 蓋を液体セルホルダーに戻します。各ネジを徐々に締めます(図3F)。
- 小さな切り抜きフィルターペーパーを使用して、Eチップから出てくる最終的な液体を乾燥させます。液体セルホルダーを軸に回して、液体セルの両側に液体が出てこないか確認します。
- ポンプ場で液体セルの真空シーリングをテストします。ポンプの真空レベルが5 x 10-2 Paに達した場合は、プロトコルを続行します。ない場合は、ウィンドウの整合性を確認し (ほとんどの場合、壊れています)、新しい E チップのセットで最初からプロトコルを開始します。
- 双眼鏡または光学顕微鏡を使用して、最後に窒化シリコンの窓の完全性を確認します。時には、液体セルは、窓が壊れていてもポンプ場の真空を維持することができる。これは、窓が壊れて液体がこぼれると、窓の壊れた部分に塩の凝集体を形成し、穴を覆うからです。その場合は、新しい E チップセットを準備します。
- 液体セルホルダーをTEMに積み込み、真空レベルを確認します。液体電池がポンプ場の真空を持続し、窓に目に見える問題がない場合でも、液体電池の微漏は、TEMを動作させるために必要な真空レベルに達するのを防ぐことができます。顕微鏡が作動するのに必要な真空レベル(2-5 x10-5 Pa)に達できない場合は、サンプルホルダーを取り外し、新しいEチップセットを用意します。
5. フローモードで液体ホルダーを使用する
- 注射液を数ミリリットルの溶液で2本充填します(当社の場合は水中HAuCl4 の1mM)。
- 2つの外部PEEKチューブを注射器に接続します。2つの注射器をスポイトポンプに置きます。液体セルホルダーの2エントリに外部PEEKチューブを挿入します。液体セルホルダーの出力用に、外部PEEKチューブを1つ追加挿入します。
- 各入口に5μL/minの流量で溶液を注入します。
6. 液体環境の加熱
- 電源装置をホルダーに接続します。加熱ソフトウェアがインストールされているコンピュータに電源を接続します。
- コンピュータの電源を入れ、暖房ソフトウェアを開きます。電源を入れる。
- デバイスのチェック ボタンをクリックします。ソフトウェアが「合格」と示す場合、実験を続行できます。それ以外の場合、大きなEチップに問題がある可能性があります(Eチップの誤った負荷、壊れた電極.
- [ 実験 ] タブをクリックします。手動加熱モードを有効にするには、[ 手動 ]をクリックします。
- 目標温度を選択し、それに応じて温度レートを変更します。[Apply]を押してEチップを目標温度まで加熱します(図4)。
メモ:Eチップは100°Cまで加熱することができます。 水溶液を使用して実験を行う場合(当社の場合のように)、Eチップを90°C以上に加熱することは避けてください。 それ以外の場合は、液体サンプルが乾燥する可能性があります。液体を加熱すると、温度が目標温度を一時的に上回り、希望の温度に戻ることができます。このようなオーバーシュートを最小限に抑えるために低い加熱速度を使用してください(1°C/sは問題ありません)。 - 周囲温度(25 °C)に戻るアン ビエント をクリックします。突然加熱を 停止するには、[停止] をクリックします。[セッションの 終了 ] タブをクリックして、加熱実験を終了します。
7. ナノ粒子の増殖のSTEMイメージング
- HAADF検出器を使用して、STEMモードで顕微鏡を使用してください。液体の厚さが最小である観察窓の隅近くのサンプルの手付かずの領域に移動します。液体の異なる温度に対するナノ粒子成長の動画を取得する(図5)。
注: 金ナノ粒子は、スキャンした領域にすぐに現れ、成長します。1秒あたり1つの画像のフレームレートでビデオ録画は、良好な信号対ノイズ比と良好な時間分解能で成長プロセスを観察するための良い妥協点です。
8. 単一ナノ粒子のSTEMナノ回折
- いくつかのナノオブジェクトのSTEM HAADF画像を取得します。STEMxソフトウェアを用いて画像上で選択した個々のナノ粒子の回折パターンを取得する(図6)。
注:STEMナノディフフラクションは、成長実験22の間に液体中の単一ナノ粒子の回折パターンを取得することを可能にする技術である。 - STEM HAADF画像の取得後、画像上の複数のナノオブジェクトを選択し、STEMxソフトウェアは自動的にプローブとCCDカメラの位置を同期させて、プローブの各位置で回折パターンを取得します。回折スポットの重なりを避けるために、小さな凝縮器絞り(私たちの場合は10 μm)を使用して、STEMプローブの小さな収束角度(私たちの場合は7.4 mrad)を使用してください。
9. 液体セルホルダーの洗浄(実験後)
注: ここでは、液体セルホルダーの標準的な洗浄手順について説明します。この洗浄が十分に効率的でない場合、希釈硝酸およびメタノールを使用して、最終的なナノ粒子凝集体を液体細胞ホルダに洗い流すことができます。液体セルホルダーの化学的適合性文書は、事前に相談する必要があります。いずれの場合も、常に蒸留水の注入で洗浄を終了します。
- 蓋を取り外します。使用しているEチップを取り外します。内部ガスケットを取り外します。
注意:使用されたEチップは、適合した箱に保存することができます。その後、液体セル15を開封した後にSiN窓に付着したままのナノオブジェクトのexsitu TEMまたはSEM分析を行うことが可能である。Sit実験ではEチップを別のチップに再利用することはお勧めできませんが、液体細胞の封止中にSiNフィルムが壊れていない場合でも可能です。次いで、異なる溶媒での過増殖実験を行うことができる。23 - 液体セルホルダーの入口と出口管に蒸留水5mLを注入します。
- 超音波浴を使って液体セルホルダーの先端を20分間洗浄します。接触パッドは、浴中に浸漬することができる。蓋で覆われた部分だけを浸します。ベント穴を液体に浸かないでください。
- エアピストルを使用して液体セルホルダーを乾かします。
- ダミーの液体セルで使用されるガスケットを元に戻します。ダミーの液体細胞と蓋を戻します。
- サンプルホルダーを真空ステーションに保管してください。
フィジーを用いた実験後の分析(ImageJ)
注:撮影したビデオの各フレームを1つの画像に分割することをお勧めします。実験後の分析ステップの目的は、フィジーが分析できるバイナリビデオにナノ粒子の元のビデオを変換することです。背景上のナノ粒子のコントラストを高めるために、中央分離帯フィルタが使用される(図7B及び7E)。これは、ビデオの二項化を容易にするために不可欠です。
- ファイル|をクリックして、フィジーのビデオの画像を含むファイルディレクトリを開きます インポート |画像シーケンス。シーケンスオプションウィンドウがポップアップ表示されます。適切な開始イメージを選択します (ビデオの先頭を破棄する場合)。イメージ シーケンスの増分数を入力します(STEM スキャンがイメージの下部に到達するまでに必要なフレーム数に対応)。[8 ビットグレースケールに変換] チェック ボックスをオンにします。tiff 形式でイメージ シーケンスを保存します。
- ビデオからすべての不要なアーティファクト(例えば、スケールバーや液体セルウィンドウの端)を切り取ります。
- [ プロセス]をクリック|フィルター|[中央値] をクリックして、すべての画像に中央値フィルターを適用します。処理されたイメージ シーケンスを tiff 形式で保存します。
注: 中央分離帯フィルタに使用されている半径を尋ねるウィンドウがポップアップ表示されます。半径は2ピクセルですが、自由に異なるパラメータを使用しました。他のフィルタは、画像処理を強化するために使用することができるフィジーでも利用可能です。特に、減算バックグラウンド アルゴリズムを使用して、背景の輝度が不均一な場合にフラットにすることができます。この場合は、[プロセス] |背景をサブトラクトします。我々の場合、このプロセスは、偽ナノ粒子として解釈することができる最初の画像の背景に小さな白いパッチを作成します。したがって、このプロセスを使用しませんでしたが、コーナーから液体セルの中心までの液体厚みが増加すると、通常、低倍率LCTEM画像上で不均一な背景強度が誘発されるため、他のデータセットで試す必要があります。 - 画像|をクリックします。|を調整するしきい値:ナノ粒子だけが赤で着色されるまで、二項化の閾値をより正確に行う手作業で移動します。適用ボタンを押します。[スタックをバイナリに変換]ウィンドウがポップアップ表示されます。[各イメージのしきい値を計算する] チェック ボックスをオフにします。tiff 形式のバイナリ イメージ シーケンスを保存します (図 7C と 7F)。
注: ビデオの各フレームでしきい値が満たされているかどうかを確認することをお勧めします。 - この手順は、ビデオ中にナノ粒子のコントラスト反転がある場合にのみ行います。[ プロセス]をクリック|バイナリ|拡張.必要に応じてもう一度実行してください。[ プロセス]をクリック|バイナリ|穴を埋める (図 7G) の説明のセクションを参照してください。
- [分析] |をクリックします 。パーティクルを分析 します。実験中に観察された分析ナノ粒子のサイズ範囲を定義します。 [要約]をオンにします。
注: 少なくとも、観察されるナノ粒子の最小サイズを定義することは非常に重要です。それがなければ、バイナリ画像シーケンスに現れる小さな黒い点(ノイズ)はナノ粒子とみなされます。最初の試みとして、目で識別される最小のナノ粒子のサイズを選択しますが、このパラメータの効果を理解し、自動化されたデータ分析を最適化するために試行錯誤プロセスが必要です(説明セクションを参照)。このステップの前に、ナノ粒子の領域を取り出すために、分析をクリック|測定を設定し、[面積] をオンにします。他の測定は利用できる。 - [結果] ウィンドウと[概要]ウィンドウを保存します。各フレームのナノ粒子の数は、サマリーデータウィンドウにあります。
Representative Results
図5は、25°Cおよび85°Cで80秒間にわたって獲得した金ナノ粒子形成の2つのSTEM HAADF画像系列を示す。 これらの実験では、ナノ粒子の核形成と成長は、水の放射線による駆動されます。この電子ビーム誘導現象によって生成される化学種の中でも、強力な還元剤(すなわち、水性電子および水素ラジカル)は、SiN窓と液体との界面で金ナノ結晶の形成につながるテトラクロロウ酸を減少させることができる。この2つの場で同じ電子線量速度で行われた観測は、本手法が液体媒体中のナノ粒子の形成に対する温度の劇的な影響を可視化することを確認する。低温では、小さなナノ粒子の非常に密な組み立ての成長を観察し、一方、高温ではいくつかの大きく、よくファセットされたナノ構造が得られます。STEM HAADF画像のコントラストは金ナノ粒子の厚さに比例するため、これらの成長実験では、高コントラストの3Dナノ粒子と、三角形または六角形の形状と低いコントラストを持つ大きな2Dナノ構造( 図5の赤い矢印で示される)の2つの集団が形成されていることがわかります。
このプロトコルで説明するビデオ解析法は、観察領域におけるナノ粒子の数とその平均表面積を経て測定することによって、核生成および成長プロセスを定量化することを可能にする。 図8に示すように、低温では、800個を超えるナノ粒子が数十秒以内に形成され、高温で30ナノ粒子しか形成されていない。2つの三角形および六角形のナノプレートを除いて、すべてのナノ粒子は、すでに高温フォローアップの最初の画像に存在しています。 図9 は、ナノ粒子の平均表面積が25°Cよりも85°Cで40倍速く増加することを示す。
図6は、画像上で直接選択された2つの金ナノ粒子の典型的なSTEM画像と回折パターンを表す(図6Aの赤い矢印で示される)。ここでは、[001]と[図6B](図6C)のゾーン軸に沿って配向した金の面中心の立方体(FCC)構造を特定することができます。
図1:Eチップと液体セルホルダーの先端の概略 (A) 液体セル(上)と小さなEチップ(底)を加熱するために使用される抵抗を有する大きなeチップ。 (B) 両方のEチップが液体セルホルダーに積載されています。大きいEチップの電極は液体電池のホールダーの電極パッドと接触している。大きいEチップの抵抗は液体の細胞を熱することができる。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:Eチップの光学顕微鏡写真を示す:(A) 実験に必要な無傷のSiNウィンドウ。 (B)E チップの端にシリコンウエハが破損している。このタイプのEチップは、液体セルが密封されると、損傷領域が濡れた領域の外側にある場合(すなわち、損傷がOリングによって定義された領域の外にある場合)に使用できます。 (C)E チップ表面上の残基。洗浄処理を繰り返した後に残存する場合(4.1項参照)、Eチップを使用しないでください。 (D から F) SiN ウィンドウが破損しました (使用できない E チップ)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:TEMホルダ内の液体セルのローディングのステップバイステップのプロセスの写真。(A) サンプルホルダーのみ。 (B) ガスケットOリングをキャビティに入れます。 (C) 小さなEチップをガスケットOリングに挿入します。 (D) 小さなEチップに溶液を一滴入れる。 (E) 大きいEチップを小さいチップの上に置きます。 (F) 蓋をねじ込んで液電池全体をシールします。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:液体セルの温度を制御する加熱ソフトウェアのスクリーンショット。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:金ナノ粒子の成長の低倍率STEM HAADF画像系列(A)25°C(B)で85°C。 対応する時間は、各画像の左下隅に示されています。2Dナノ構造体は赤い矢印で示されます。すべての画像は、同じ電子線量率3.4電子量速度で取得されます。·s-1·nm-2.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:単一ナノ粒子のSTEMナノ回折(A) 回折ナノ粒子の選択に使用されるSTEM画像(回折獲得時のプローブの位置は赤い矢印で示される)。 (B,C) 2つの選択されたナノ粒子の回折パターン。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7: フィジーを用いたSTEM HAADF画像のデータ処理と解析画像は、成長の開始40秒後に取得されました。(A~C)画像は、85°C(A,D)生STEM画像で取得した25°C(D〜G)画像で取得した画像です。 (B,E)処理された画像(中央値フィルタ)。(C,F)バイナリ イメージ。(G)ピクセルの拡張が 2 回適用され、「穴を埋める」プロセスが適用されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図8:金ナノ粒子の数を25°C及び85°Cでの時間の関数として表すグラフ。 25°C の 2 つの曲線は、最小検出サイズ (Smin)が 20 (赤) と 50 (青) ピクセル2で自動的に測定されます。取得後の12秒と60秒後に測定された緑色の点は、25°Cで撮影したビデオで手動で計数されたナノ粒子 の数を表し、この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図9:金ナノ粒子の平均表面積を25°Cおよび85°Cの時間の関数として表すグラフ。緑色のドットは、85°Cで取得したビデオの所定の時点でのナノ粒子の平均面積の手動測定を表 します。
図10:85°Cでのシングルゴールドナノキューブの成長の高倍率STEM HAADF画像シリーズこの画像シリーズは電子線量率83.6電子-1 .nm-2で取得した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
このプロトコルは、温度制御された液体媒体における放射線による金ナノ粒子の核形成および成長を可能にする。自動ビデオ処理と組み合わせることで、ナノ粒子の密度、サイズ、形状、原子構造などのナノ粒子合成の主要パラメータに対する温度の影響を測定できます。これらの貴重な入力は、核生成および成長速度に対する温度の影響を評価し、可能な相転移を検出し、コロイド溶液の最終的な結果を決定するファセットプロセスを視覚化することを可能にする。反応性媒体の組成を制御する可能性と共に、温度制御液体細胞TEMは、現実的な合成条件における様々なナノ構造の核生成および成長過程の直接観察に向けたもう一つのステップである。本稿で提示された結果の解釈と核生成および成長モデルとの比較は、他の場所で議論される。ここでは、Situ TEM実験に関連する必要があるいくつかの方法論的側面を強調したいと考えています。
まず、実験結果に大きな影響を与える可能性があるため、反応媒体における電子線の効果を特定することが重要です。ここで、水のラジオリシスがナノ粒子形成の原動力であるほど、ナノオブジェクト11,15の最終形状に影響を与える電子線量速度とともに成長速度が急速に上昇する。したがって、ナノ粒子の核生成及び成長に対する温度の影響を研究するために、同じ電子線量率で得られた成長実験を比較する必要がある。STEMモードでは、電子線量速度は、ビーム電流(電子/秒)を画像サイズで割った値(nm2)で割った値に対応する。したがって、一定の電子線量率は、同じビーム電流(すなわち、同じ凝縮器開口と同じスポットサイズ)を維持することを意味し、各実験に対して同じ倍率を維持する。CCDカメラやファラデーカップを使用して、撮像条件のビーム電流を定量化することは、データを解釈して再現するために重要です。倍率および結果として得られる線量率は、ナノ粒子の大規模な集合体の成長を可視化して、成長動態(図5)または単一ナノ粒子スケールでの成長メカニズムを抽出して、ナノ粒子表面上の優先吸着部位を同定することを望むかどうかに応じて選択すべきである(図10)。核生成および成長過程が速すぎる場合、特に高倍率では、小さな凝縮器絞りと小さなスポットサイズを選択して、線量を最小限に抑える必要があります。ナノ粒子の核化と成長はまた、分析された溶液中の金属前駆体の濃度を低下させることによって減速することができるが、放射線分解物の濃度は温度とともに増加することに注意してください。一般的に、試料全体の電子照射履歴を考慮することも重要である。ここで、例えば、複数の成長実験が互いに近い領域で迅速に行われる場合、研究領域における金前駆体の濃度が低下するため、ナノ粒子の密度は時間の経過とともに減少する。この効果は、空間と時間の両方で成長実験を分離し、フローモードで液体ホルダーを使用することによって最小限に抑えることができます。
インターフェース追跡アルゴリズムは、ビデオの解析を自動化し、大規模なナノ粒子アセンブリの核生成と成長に関する定量的な結果を抽出するのに非常に有用です。ただし、画像二値化ステップは常にデータ固有であり、ナノ粒子/液体界面の検出を最適化するために画像に適用する必要のあるフィルタとデータ処理は実験によって異なることを意味します。さらに、画像処理ワークフローを最適化し、その限界を知るためには、これらの自動分析の結果をいくつかの画像で実行された手動測定と比較することが不可欠です。ここで、例えば、高温で形成される増え強い厚さの3Dナノ粒子における複数の散乱事象は、散乱電子の角広がりを環状検出器の角範囲で収集された信号の減少をもたらすため、30秒間の観察後にコアのコントラスト反転を誘導する。これらのナノ粒子の真の表面積を測定し続けるために、リング形状のコントラストの内側の円を埋める画像の二値化後の「フィルホール」データプロセスを用いた(図7F,G)。しかし、これらのリング形状のコントラストが常に完全に接続されていることを確認するために、オブジェクトの小さな拡張を使用する必要がありました。この後者のステップは、自動測定におけるナノ粒子の平均表面積のわずかな過大評価をもたらす(図9)。同様に、ナノ粒子の検出のために、ノイズの検出を避けるために検出された物体の最小サイズ(Smim)を定義する必要がありますが、このパラメータは測定された核生成速度に影響を与えます。図8に示すように、実験開始時に検出されたナノ粒子の数が増加し、高原に到達する。Sminが大きい場合(1543nm2に対応する50ピクセル2)、自動および手動測定はこの高原(60秒後の835ナノ粒子)のレベルで合意したが、835ナノ粒子は12秒後に手動で数えられるので、ナノ粒子の検出は遅れるが、後で自動的に検出されない。この検出時間の延長は、核生成率の過小評価につながります。Sminを20ピクセル2(すなわち、617nm2)に減らすことは、ナノ粒子アセンブリの核生成時間の誤差を減少させるが、特に実験の初期段階におけるナノ粒子密度の過大評価につながる(図8)また、核生成速度に影響を与える。極めて動的な挙動と低い信号対雑音比を有するナノ物体の検出およびサイズおよび形状測定は、他のセグメンテーションおよび脱ノイジング法24または機械学習アプローチ25を用いてさらに改善することができる液相TEMにおける一般的な課題である。
最後になりましたが、液体セルの調製と液体ホルダーの洗浄は、反応媒体の汚染を避けるために非常に慎重に行う必要があります。
一般に、LCTEM 分析中にサンプルの温度を制御することで、固体と液体の界面で発生する化学反応に対する熱的影響を調査する機会が得られます。したがって、温度制御された液体媒体における硬、軟質、または生物学的物質のダイナミクスを明らかにするために設計されたsitu TEM実験において、本方法が他の方法への道を開くことを期待しています。
Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
我々は、地域Ile-de-France(パリ大学に設置されたJEOL ARM 200 F電子顕微鏡のための大会SESAME E1845)、ラレックスシーム(GLOIREプロジェクト)およびCNRS(デフィナノプログラム)の財政的支援を感謝しています。マデリーン・デュークスとダニエル・フランクは、図1と2に示す液体細胞の回路図と光学写真を共有してくれたことに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Plus electron microscope | Jeol | ||
| Acetone | Merck | ||
| Air pistol | |||
| ARM 200F electron microscope | Jeol | ||
| Binoculars or optical microscope | |||
| Carbon tipped tweezers | |||
| Computer with heating software | Software by Protochips | ||
| Distlilled water | |||
| Dummy e-chips | Protochips | ||
| Gasket/O-rings | Protochips | ||
| Gold aqueous solution | Merck | 1 mM of HAuCl4 - Prepared beforehand | |
| Large liquid heating E-chip | Protochips | ||
| Methanol | Merck | ||
| One View camera | Gatan | ||
| Petri dish | Number : 2 | ||
| Plasma cleaner | Gatan | ||
| Poseidon Select | Protochips | Liquid cell holder | |
| Power supply Keithley 2450 | |||
| Protective gloves | |||
| Red PEEK tubing | Number : 3 | ||
| Screwdriver with torque | |||
| Small liquid E-chip | Protochips | 150 nm spacers | |
| STEM HAADF detector | Jeol | ||
| STEMx software | Gatan | ||
| Syringe | Number : 2 | ||
| Syringe pump | Harvard apparatus | Number : 2 | |
| Vacuum pump | Gatan |
References
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