Summary
בקרת טמפרטורה במהלך ניסויים מיקרוסקופיים אלקטרונים שלב נוזלי פותח פרספקטיבות חדשות של לימוד הדינמיקה של חלקיקים בסביבות נוזליות מחקה היווצרותם או מדיה יישום. באמצעות תאים נוזליים חימום שפותחו לאחרונה, ראינו ישירות את ההשפעה של טמפרטורה על תהליכי הגרעין והצמיחה של חלקיקי זהב במים.
Abstract
בקרת טמפרטורה היא התפתחות האחרונה המספקת מידה נוספת של חופש ללמוד ננוכימיה על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים העברת תא נוזלי. במאמר זה, אנו מתארים כיצד להכין ניסוי חימום באתרו לחקר השפעת הטמפרטורה על היווצרות חלקיקי זהב המונעים על ידי רדיוליזה במים. הפרוטוקול של הניסוי הוא פשוט למדי מעורב תא נוזלי מיוחד עם יכולות חימום אחיד עד 100 °C (60 °F), מחזיק TEM תא נוזלי עם יכולות זרימה ממשק משולב לשליטה בטמפרטורה. אנו מראים כי מנגנוני הגרעין והצמיחה של חלקיקי זהב מושפעים באופן דרסטי מהטמפרטורה בתא הנוזלי. באמצעות הדמיית STEM וננו-עקיפה, האבולוציה של הצפיפות, הגודל, הצורה והמבנה האטומי של הננו-חלקיקים הגדלים מתגלים בזמן אמת. אלגוריתמים אוטומטיים לעיבוד תמונה מנוצלים כדי לחלץ נתונים כמותיים שימושיים מרצפי וידאו, כגון הגרעין וקצבי הצמיחה של חלקיקים. גישה זו מספקת תשומות חדשות להבנת התהליכים הפיזיו-כימיים המורכבים במשחק במהלך סינתזת השלב הנוזלי של ננו- חומרים.
Introduction
חלקיקי מתכת (NPs) יש תכונות מבטיחות physico-כימי שניתן להשתמש בהם בתחומים שונים כגון חישה אופטית1,רפואה 2 אואנרגיה 3. סינתזה רטובה-כימית היא שיטה רב-תכליתית מאוד לפברק NPs מתכת עם גודל וצורה מוגדרים היטב. במהלך העשורים האחרונים, אסטרטגיות רבות פותחו כדי להשיג שליטה על סינתזת NPs: צמיחה בתיווךזרעים 4, שיטת חסימתפנים 5, סינתזה מבוקרת קינטית6, תחריט סלקטיבי7 או סינתזה מבוקרת טמפרטורה8. עם זאת, בעוד התגובות הכימיות המניעות את הסינתזה הן פשוטות למדי, מנגנוני הגרעין והצמיחה אינם, מכיוון שפרמטרים רבים ממלאים תפקיד בתהליכי היווצרות והשפעתם האישית קשה לאחזר מתמונות ex situ של הננו-חומרים הנובעים מכך שחולצו מאמצע היווצרותם בנקודות זמן נתונות של הסינתזה. כדי להבין באמת את תהליכי הגרעין והצמיחה ולבסס דרכים לשלוט בהם, עלינו להשתמש בכלים המאפשרים התבוננות בזמן אמת בסביבה נוזלית מבוקרת היטב.
בהקשר זה, מיקרוסקופ אלקטרונים העברת תא נוזלי (LCTEM) כבר שיטה חזקה מאוד לשפוך אור חדש על הסינתזה של חלקיקים מתכתיים9,10,11,12,13. על ידי הדמיית הדינמיקה של ננו-מבנים בודדים ישירות במדיית היווצרות הנוזלים שלהם, טכניקה זו סיפקה הבנה עמוקה יותר של מנגנוני התגרענות והצמיחה, במיוחד את התפקיד של פגמים גביש, מורפולוגיה זרעים ליגנדים אורגניים המאפשרים נהיגה צמיחה כיוונית או תחריט תהליכים והשגת ננו עם צורות ספציפיות (nanorods, nanostars, nanoplates, nanoshells)10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. כאשר קרן האלקטרונים של TEM מקיימת אינטראקציה עם נוזלים, תהליכי רדיוליזה מייצרים מינים חזקים של צמצום וחמצון המשנים את הכימיה של הפתרון באזור המוקרן וניתן להשתמש בהם כדי להניע תהליכי צמיחה או תחריט. מעניין, הריכוז של מוצרים רדיוליטיים ידוע להגדיל עם קצב מינון אלקטרונים, פרמטר זה יכול להיות מכוון דק מיקרוסקופ אלקטרונים20. לכן, תלות זו בקצב המינון של רדיוליזה נוצלה כדי לשלוט במהירות התגובה ולחשוף השפעות קינטיות על תהליכי היווצרות ומורפולוגיה סופית של ננו11,15,20.
למרות הטמפרטורה היא פרמטר חיוני סינתזה ננו, השפעותיו עד כה לא נחקרו בקפידה על ידי LCTEM, כי תאים נוזליים מסחריים עם בקרת טמפרטורה אמינה פותחו רק לאחרונה. עם זאת, מחקרים כאלה הם הכרחיים כדי לפענח את קינטיקה מורכבת ואפקטים תרמודינמיים לגרום על ידי שינויי טמפרטורה. ואכן, מצד אחד להעלאת הטמפרטורה יש השפעות דרסטיות על תהליכי ההתמודדות במהלך הצמיחה, מאיצה את הדיפוזיה האטומית והמולקולרית בנוזל ומשנה את שיעורי התגובה. מצד שני, תרשים ננו פאזה של nanostructures הוא גם רגיש מאוד לטמפרטורה. במאמר זה, אנו מנצלים תאים נוזליים חימום שפותחו לאחרונה כדי לעקוב אחר הצמיחה הרדיוליטית של חלקיקי זהב במים עם בקרת טמפרטורה בין טמפרטורת החדר 100 °C (60 °F). מתודולוגיה זו המשלבת הדמיית STEM ועקיפה בסביבה שמתקרבת יותר ויותר לתנאי הסינתזה האמיתיים מצמצמת את הפער בין תצפיות situ TEM לבין סינתיסייזרים בקנה מידה של ספסל.
Protocol
1. ליישר את מיקרוסקופ אלקטרונים ההולכה עבור הדמיית STEM HAADF
- בצע את הוראות היצרן ליישור מיקרוסקופ.
- השתמש במדגם מיובש קונבנציונלי כדי ליישר את המיקרוסקופ. אין להשתמש בדגימה נוזלית.
- כדי למזער את מהירות הצמיחה, למזער את קצב מינון האלקטרונים (ראה סעיף דיון) אשר מרמז באמצעות צמצם מרוכב קטן וגודל נקודה קטנה כדי להפחית את זרם הקרן.
2. טיפול בשבב אלקטרוני
הערה: מחזיקי נוזלים מסחריים מתאימים כמעט לכל TEM אך משתמשים במחזיק המיועד במיוחד למותג המיקרוסקופ ולפיסת המוט. תא נוזלי עשוי משני שבבי סיליקון מבוססי MEMS הנקראים שבבי E, שניהם מצעי סיליקון עם חלון של 500 x 50 מיקרומטר המכוסה בסרט סיליקון ניטריד (SiN) בעובי 50 ננומטר שהוא שקוף אלקטרונים(איור 1A). לשני השבבים האלקטרוניים האלה יש גדלים שונים. הקטן הוא 2 x 2 מ"מ עם מרווחי זהב לתקן את המרחק בין שני E-שבבים (150 ננומטר כאן) ואת עובי הנוזל. הגדול הוא 4 x 6 מ"מ ויש לו התנגדות מוטבעת בתוך מצע הסיליקון המאפשר חימום אחיד של המדגם הנוזלי (איור 1B). בגלל האופן שבו הם מפוברקים בחדרים נקיים, שבבי E יש שני צדדים שונים: אחד שבו החלון נראה קטן (כאן אחרי שנקרא הצד הקדמי) והשני שבו החלון גדול עם צורת כיור (כאן אחרי שנקרא הצד האחורי).
- בעת טיפול בשבבי E, לעולם אל תיגע בחלון בפינצטה ותאחוז בשבבים בצדדים. כדי למנוע גירוד פני השטח של מצע הסיליקון להשתמש פינצטה פחמן הטה.
- אם מניחים שבב E על משטח, ודא כי הצד האחורי נמצא במגע עם פני השטח כי הסרט SiN הוא שביר והוא מופקד בצד הקדמי.
3. ניקוי מחזיק התא הנוזלי (לפני הניסוי)
- הסר את המכסה המכסה את קצה המחזיק. הסר את התאים הנוזליים הבובה באמצעות פינצטה. הסר את האטם המשמש עם תאים נוזליים דמה.
הערה: תאים נוזליים דמה הם תאים נוזליים ללא חלון SiN ורק סיליקון. הם משמשים לאחסון מחזיק התא הנוזלי במשאבת הוואקום. שים לב למצב של ברגים פליז כי הם מתפוררים בקלות לאורך זמן. במיוחד אם ראשי הברגים פגומים, יש להחליף את הברגים. אחרת, ייתכן שיהיה קשה לפתוח אותם לאחר הניסוי ופסולת קטנה עלולה גם לשבש את טעינת הדגימה. - באופן ידני להזריק 2 מ"ל של מים מזוקקים בתוך המחזיק באמצעות מזרקים ואת צינורות PEEK החיצוניים כדי להתחבר לחלק האחורי של המחזיק.
הערה: יש 3 מנהרות מיקרופלואידיות בתוך המחזיק. יש לנקות את כל השלושה במים. שימו לב למים שיוצאים מהחזית של המחזיק: אם המים נצבעים בגלל ניסוי קודם, המשיכו לשים מים בתוך המחזיק עד שהנוזל לא יתפרק. - אם הזרקת פתרון בתא הנוזלי במהלך הניסוי (1 מ"מ של HAuCl4 במים במקרה שלנו), למלא את הצינור של מחזיק המדגם עם פתרון זה.
- יבש את קצה מחזיק התא הנוזלי באמצעות אקדח אוויר.
4. הכנת התא הנוזלי (שבבי E)
- ניקוי התאים הנוזליים.
- מלאו צלחת פטרי מזכוכית באצטון.
- מלאו צלחת פטרי מזכוכית במתנול.
זהירות: בשל הרעילות של מתנול, צלחת פטרי עם מתנול חייב להיות לשים מתחת למכסה המנוע אדים. יש לטפל במתנול עם ציוד מגן הולם (כפפות). - שים אחד קטן אחד גדול E-שבב בצלחת פטרי עם אצטון ולחכות 2 דקות.
הערה: השבבים האלקטרוניים מצופים בשכבת מגן שיש להסיר לפני הניסוי. אצטון יסיר את הפוטורסיסט וינקה את שבבי הפסולת. כדי לשפר את הניקוי, הפתרון יכול להיות נסער בעדינות. - שים את שני E-צ'יפס בצלחת פטרי עם מתנול ולחכות 2 דקות. המתנול ינקה את הצ'יפס מהאצטון ושאר ההריסות.
התראה: העברת שבבי E בין האצטון למתנול חייבת להיעשות מהר ככל האפשר על מנת לא לתת לשבבי E להתייבש באוויר. - לייבש את התאים הנוזליים באמצעות אקדח אוויר. החזק את השבב האלקטרוני באמצעות פינצטה בעת שימוש באקדח האוויר. היזהר לא ללחוץ יותר מדי על ההדק אקדח האוויר אחרת E-שבב יכול לנשור פינצטה. אם הם נושר, להפעיל מחדש את הניקוי עם אצטון ומתנול.
- אמת את תקינות חלון הסיליקון nitride באמצעות זכוכית מגדלת משקפת או מיקרוסקופ אופטי (איור 2).
הערה: ודא כי החלונות של שני שבבי E נקיים ולא שבורים. אם השבבים האלקטרוניים לא נראים נקיים, נסו להחזיר אותם לאצטון ומתנול שוב. אם הלכלוך עדיין על החלון או אם החלון שבור, יש להחליף את השבבים האלקטרוניים בשבבים חדשים. - פלזמה לנקות את שבבי E עם תערובת של ארגון וגז חמצן במשך 2 דקות. ניקוי פלזמה E-שבבים מאפשר להם להיות הידרופילי. להלן הפרטים של ניקוי פלזמה להגדיר: זרימת גז ארגון = 35 sccm, זרימת גז חמצן = 11.5 sccm, זמן קצוב זרימת גז = 20 s, יעד RF קדימה = 50 W, טווח RF קדימה = 5 W, RF משתקף מרבי = 5 W.
- טעינת התאים הנוזליים במחזיק TEM (איור 3).
- טען את אטם ה-O-rings בתוך מחזיק התא הנוזלי(איור 3B). ודא שהאטם שבו נעשה שימוש נקי. אם לא, לנקות אותו במהירות עם מים מזוקקים. ייבש אותו באמצעות נייר סינון נקי. כדי להסיר פסולת וסיבים על האטם, לחץ עליו בין שני גיליונות של parafilm מספר פעמים.
- שים את השבב האלקטרוני הקטן בתוך מחזיק התא הנוזלי (איור 3C). כדי להפחית את השתחוות של סרטי SiN לכיוון הוואקום של המיקרוסקופ, למקם את החלונות של התא הנוזלי בתצורה מוצלבת. לכן, החלון של שבב E קטן חייב להיות מקביל לאורך המחזיק ואת הפנים הקדמיות כלפי מעלה. ודא כי שבב E קטן מוכנס היטב בתוך האטם.
- הכינו את דגימת הנוזל (כאן, 1 מ"מ של HAuCl4 במים).
- זרוק ≈2 μL של דגימת הנוזל על שבב E קטן באמצעות micropipette (איור 3D). אם השבב האלקטרוני הקטן נוקה כראוי בפלזמה, דגימת הנוזל המים תתפשט באופן שווה על פני השטח של השבב.
- הסר את הנוזל הנוסף באמצעות נייר סינון. עם פיסת נייר סינון חתוכה בחדות, להפחית את עובי השכבה הנוזלית על שבב E קטן עד שהוא יוצר כיפה שטוחה.
- שים את השבב האלקטרוני הגדול בתוך מחזיק התא הנוזלי (איור 3E). מניחים את השבב האלקטרוני הגדול על השבב הקטן עם הפנים הקדמיות כלפי מטה (הצדדים הקדמיים של שני השבבים חייבים להתמודד זה מול זה). האלקטרודות על שבב E הגדול חייב להיות במגע עם כרית האלקטרודה על המחזיק.
- החלק את המכסה בחזרה על מחזיק התא הנוזלי. הדקו בהדרגה כל בורג (איור 3F).
- ייבשו את הנוזל הסופי שיוצא משבבי ה-E באמצעות נייר סינון קטן וגזור. ודא כי אין נוזל יוצא משני צידי התאים הנוזליים על ידי סיבוב מחזיק התא הנוזלי סביב צירו.
- בדוק את איטום ואקום של התא הנוזלי בתחנת שאיבה. אם רמת הוואקום של המשאבה מגיעה 5 x 10-2 Pa ואז להמשיך את הפרוטוקול. אם לא, בדוק את תקינות החלון (קרוב לוודאי שהוא שבור) והתחל את הפרוטוקול מההתחלה עם ערכה חדשה של שבבי E.
- ודא בפעם האחרונה את תקינות חלון הסיליקון הניטריד באמצעות זכוכית מגדלת דו-עינית או מיקרוסקופ אופטי. לפעמים, התא הנוזלי יוכל לקיים את הוואקום של תחנת השאיבה גם אם החלון שבור. הסיבה לכך היא שכאשר החלון נשבר והנוזל נשפך החוצה, הוא יכול ליצור אגרגטים של מלח על החלק השבור של החלון ובכך לכסות את החור. אם זה יקרה, הכינו סט חדש של שבבי אי.
- טען את מחזיק התא הנוזלי ב- TEM ובדוק את רמת הוואקום. גם אם התא הנוזלי ספג את הוואקום של תחנת השאיבה ואין בעיה נראית לעין עם החלון, מיקרו דליפה של התא הנוזלי יכולה למנוע להגיע לרמת הוואקום הנדרשת להפעלת TEM. אם המיקרוסקופ אינו יכול להגיע לרמת הוואקום הנדרשת לתפעול (2-5 x 10-5 Pa), הסר את מחזיק הדגימה והכן ערכה חדשה של שבבי E.
5. השתמש במחזיק הנוזל במצב זרימה
- למלא 2 מזרקים עם כמה מיליליטר של הפתרון להיות מוזרק (1 מ"מ של HAuCl4 במים במקרה שלנו).
- חבר 2 צינורות PEEK חיצוניים למזרקים. מניחים את 2 המזרקים על משאבות המזרק. הכנס את צינורות PEEK החיצוניים ב-2 הערכים של מחזיק התא הנוזלי. הכנס צינור PEEK חיצוני נוסף עבור הפלט של מחזיק התא הנוזלי.
- להזריק את הפתרון עם קצב זרימה של 5 μL / min בכל מפרצון.
6. חימום הסביבה הנוזלית
- חבר את ספק הכוח למחזיק. חבר את ספק הכוח למחשב שבו מותקנת תוכנת החימום.
- תפעיל את המחשב ופתח את תוכנת החימום. תפעיל את ספק הכוח.
- לחץ על כפתור בדיקת המכשיר. אם התוכנה מציינת "עבר" אז הניסוי יכול להמשיך. אחרת, ייתכן שלשבב האלקטרוני הגדול תהיה בעיה (טעינה שגויה של השבב האלקטרוני, אלקטרודות שבורות...).
- לחץ על הכרטיסיה ניסוי. לחץ על ידני כדי להפעיל את מצב ידני של חימום.
- בחר את הטמפרטורה הייעודית ושנה בהתאם את קצב הטמפרטורה. לחץ כדי לחמם את השבבים האלקטרוניים לטמפרטורה הייעודית (איור 4).
הערה: ניתן לחמם את השבבים האלקטרוניים עד 100 °C (60 °F). אם נעשה שימוש בתמיסה מימית לניסוי (כמו במקרה שלנו), הימנעו מחימום שבבי E מעל 90 °C (60 °F). אחרת, הדגימה הנוזלית יכולה להתייבש. בעת חימום הנוזל, הטמפרטורה יכולה לעלות באופן זמני מעל הטמפרטורה הממוקדת ולאחר מכן ליפול בחזרה לטמפרטורה הרצויה. השתמש בקצב חימום נמוך כדי למזער overshoots כזה (1 °C /s זה בסדר). - לחץ על הסביבה כדי לחזור לטמפרטורת הסביבה (25 מעלות צלזיוס). לחץ על עצור כדי לעצור את החימום בפתאומיות. לחץ על הכרטיסיה סיום הפעלה כדי לסיים את ניסוי החימום.
7. הדמיית STEM של צמיחת חלקיקים
- השתמש במיקרוסקופ במצב STEM באמצעות גלאי HAADF. עבור לאזור בתולי של המדגם, ליד פינה של חלון התצפית שבו עובי הנוזל הוא מינימלי. לרכוש קטעי וידאו של צמיחת חלקיקים עבור טמפרטורות שונות של הנוזל (איור 5).
הערה: חלקיקי זהב מופיעים מיד וגדלים באזור הסרוק. הקלטת וידאו עם קצב מסגרות של תמונה אחת לשנייה היא פשרה טובה להתבונן בתהליכי הצמיחה עם יחס אות טוב לרעש ורזולוציית זמן טובה.
8. ננו-עקיפת STEM של חלקיקים בודדים
- לרכוש תמונת STEM HAADF של מספר ננו-אובייקטים. רכוש את תבנית עקיפת הננו-חלקיקים הבודדים שנבחרו בתמונה באמצעות תוכנת STEMx (איור 6).
הערה: ננו-עקיפת STEM היא טכניקה המאפשרת רכישת דפוס עקיפה של חלקיקים בודדים בנוזל במהלך ניסויי צמיחה22. - לאחר רכישת תמונת STEM HAADF, בחר מספר ננו-אובייקטים בתמונה ותוכנת STEMx מסנכרנת באופן אוטומטי את מיקום הגשוש ואת מצלמת ה- CCD כדי לרכוש את תבנית עקיפה בכל מיקום של הגשוש. כדי למנוע את החפיפה של כתמי עקיפה, להשתמש בזווית התכנסות קטנה של החללית STEM (7.4 mrad במקרה שלנו) באמצעות צמצם מרוכב קטן (10 מיקרומטר במקרה שלנו).
9. ניקוי מחזיק התא הנוזלי (לאחר הניסוי)
הערה: כאן אנו מתארים הליך ניקוי סטנדרטי עבור מחזיק התא הנוזלי. אם ניקוי זה אינו יעיל מספיק, ניתן להשתמש בחומצה חנקתית מדוללת ומתנול כדי לשטוף את אגרגטים חלקיקים בסופו של דבר במחזיק התא הנוזלי. יש להתייעץ עם תיעוד התאימות הכימית של מחזיק התא הנוזלי לפני כן. בכל מקרה, תמיד לסיים את הניקוי עם הזרקת מים מזוקקים.
- הסר את המכסה. הסר את השבבים האלקטרוניים המשומשים. הסר את האטם הפנימי.
הערה: ניתן לאחסן את השבבים האלקטרוניים המשומשים בקופסה מותאמת. לאחר מכן ניתן לבצע ניתוחים לשעבר של TEM או SEM של הננו-אובייקטים שנותרו מחוברים לחלונות SiN לאחר הסרת חתך התא הנוזלי15. לא מומלץ לעשות שימוש חוזר בשבבי E לניסוי אחר באתרו, אך עדיין ייתכן אם הסרט של SiN לא נשבר במהלך הסרת הקליטה של התא הנוזלי. לאחר מכן ניתן לבצע ניסויים בצמחי יתר בממס אחר. 23 , 23 - להזריק 5 מ"ל של מים מזוקקים במפרצון צינורות שקע של מחזיק התא הנוזלי.
- נקה את קצה מחזיק התא הנוזלי באמצעות אמבטיה קולית במשך 20 דקות. ניתן לטבול את משטח המגע באמבטיה. רק לטבול את החלק המכוסה במכסה. אין לטבול את חורי האוורור בנוזל.
- לייבש את מחזיק התא הנוזלי באמצעות אקדח אוויר.
- מחזירים את האטם המשמש עם התאים הנוזליים הבובה. מחזירים את התאים הנוזליים הבובה ואת המכסה.
- אחסן את מחזיק הדגימה בתחנת ואקום.
10. ניתוח שלאחר הניסוי באמצעות פיג'י (ImageJ)
הערה: מומלץ לפצל כל מסגרת של הסרטון שצולמה לתמונות בודדות. מטרת שלב ניתוח שלאחר הניסוי היא להפוך את הסרטונים המקוריים של הננו-חלקיקים לסרטונים בינאריים שניתן לנתח על ידי פיג'י. מסנן חציוני משמש כדי לשפר את הניגודיות של חלקיקים על הרקע (איורים 7B & 7E). זה חיוני כדי להקל על binarization של הווידאו.
- פתח את ספריית הקבצים המכילה את התמונות של הווידאו על פיג'י על ידי לחיצה על קובץ | יבא | רצף תמונות. חלון אפשרויות הרצף יהיה מוקפץ. בחר את תמונת ההתחלה המתאימה (אם יש למחוק את תחילת הסרטון). הזן את מספר ההפרש הקבוע עבור רצף התמונה (הוא תואם למספר המסגרות שנדרש כדי שסריקת STEM תגיע לתחתית התמונה). סמן את התיבה עבור המר לגווני אפור של 8 סיביות. שמור את רצף התמונות בתבנית tiff.
- חתוך את כל הממצאים הלא רצויים מהסרטון (לדוגמה, סרגל קנה המידה או קצה חלון התא הנוזלי).
- לחץ על | תהליך מסננים | חציון להחלת מסנן חציוני על כל התמונות. שמרו את רצף התמונות המעובדות בתבנית tiff.
הערה: חלון יופיע בחלון ויבקש את הרדיוס המשמש עבור המסנן החציוני. השתמשנו ברדיוס של 2 פיקסלים אבל אל תהסס להשתמש בפרמטרים שונים. מסננים אחרים זמינים גם פיג'י שיכול לשמש כדי לשפר את עיבוד התמונה. במיוחד, אלגוריתם רקע חיסור יכול לשמש כדי להפוך את עוצמת הרקע שטוח אם הוא לא אחיד. בשביל זה, לחץ על תהליך | רקע מחרוזת משנה. במקרה שלנו, תהליך זה יוצר כתמים לבנים קטנים ברקע של התמונות הראשונות שניתן לפרש כננו-חלקיקים כוזבים. לכן, לא השתמשנו בתהליך זה אבל זה צריך להיות ניסה על datasets אחרים, כי עובי נוזלי הגדלת מהפינה למרכז התא הנוזלי בדרך כלל גורם עוצמת רקע לא אחידה על תמונות LCTEM הגדלה נמוכה. - לחץ על תמונה | כוונון | סף סף. העבר ידנית לדיוק טוב יותר של סף הבינאריזציה עד שרק הננו-חלקיקים ייצבעו באדום. לחץ על לחצן החל. החלון המוקפץ המר מחסנית לחלון בינארי. בטל את הסימון של סף חישוב עבור כל תמונה. שמור את רצף התמונה הבינארי בתבנית tiff (איורים 7C & 7F).
הערה: מומלץ לבדוק אם הסף מספק בכל מסגרת של הסרטון. - בצע שלב זה רק אם יש היפוך ניגודיות של הננו-חלקיקים במהלך הווידאו. לחץ על | תהליך | בינארי ת מורחבת. תעשה את זה עוד פעם אחת במידת הצורך. לחץ על | תהליך | בינארי חורי מילוי (איור 7G, עיין בסעיף הדיון).
- לחץ על נתח | לנתח חלקיקים. הגדר את טווח הגודל של הננו-חלקיקים המנותחים שנצפו במהלך הניסוי. בדוק את סכם.
הערה: חשוב מאוד לפחות להגדיר את הגודל המינימלי של חלקיקים שנצפו. בלעדיו, הנקודות השחורות הקטנות (רעש) המופיעות ברצף התמונה הבינארית ייחשבו כננו-חלקיקים. נסיון ראשון, בחר את גודל הננו-חלקיקים הקטנים ביותר שזוהו על-ידי העין, אך לאחר מכן יש צורך בתהליך ניסוי וטעייה כדי להבין את ההשפעה של פרמטר זה ולמטב את ניתוח הנתונים האוטומטי (ראה סעיף דיון). לפני שלב זה, כדי לאחזר את האזור של חלקיקים, לחץ על לנתח | קבעו מידות ובדקו את Area. מדידות אחרות זמינות. - שמור את חלונות התוצאות והסיכום. מספר הננו-חלקיקים עבור כל מסגרת נמצא בחלון נתוני הסיכום.
Representative Results
איור 5 מציג שתי סדרות תמונות STEM HAADF של היווצרות חלקיקי זהב שנרכשו במשך 80 שניות ב-25°C ו-85 °C (69 °F). בכל הניסויים האלה הגרעין והצמיחה של חלקיקים מונע על ידי רדיוליזה של מים. בין המינים הכימיים הנוצרים על ידי תופעות אלו הנגרמות על ידי קרן אלקטרונים, סוכני צמצום חזקים (כלומר, אלקטרונים מימיים ורדיקלים מימן) יכולים להפחית את החומצה הטטרכלורואורית המובילה להיווצרות ננו-קריסטל זהב בממשק בין חלונות ה- SiN לנוזל. שני אלה בתצפיות situ שבוצעו עם אותו שיעור מינון אלקטרונים לאשר כי השיטה הנוכחית מאפשרת לדמיין את ההשפעה הדרסטית של הטמפרטורה על היווצרות של חלקיקים במדיה נוזלית. בטמפרטורה נמוכה, אנו רואים את הצמיחה של הרכבה צפופה מאוד של חלקיקים קטנים, בעוד בטמפרטורה גבוהה כמה ננו גדולים היטב facetted מתקבלים. מכיוון שהניגודיות של תמונות STEM HAADF היא פרופורציונלית לעובי חלקיקי הזהב, אנו יכולים לראות ששתי אוכלוסיות של עצמים נוצרות במהלך ניסויי צמיחה אלה: חלקיקי תלת-ממד מנוגדים מאוד וננו-מבנים דו-ממדיים גדולים עם צורה משולשת או משושה וניגודיות נמוכה יותר (המצוינת על ידי חצים אדומים באיור 5).
שיטת ניתוח הווידאו המתוארת בפרוטוקול זה מאפשרת לכמת את תהליכי הגרעין והצמיחה על ידי מדידת לאורך זמן את מספר הננו-חלקיקים ואת שטח הפנים הממוצע שלהם באזור הנצפה. כפי שניתן לראות באיור 8, בטמפרטורה נמוכה יותר מ 800 חלקיקים נוצרים בתוך כמה עשרות שניות של תצפית בעוד רק 30 חלקיקים נוצרים בטמפרטורה גבוהה. מלבד שני nanoplates משולש משושה, כל חלקיקים כבר נוכחים על התמונה הראשונה של מעקב טמפרטורה גבוהה. איור 9 מראה כי שטח הפנים הממוצע של חלקיקים גדל פי 40 מהר יותר ב- 85 °C (69 °F) מאשר ב 25 °C (69 °F).
איור 6 מייצג תמונת STEM טיפוסית ותבנית עקיפה של שני חלקיקי זהב שנבחרו ישירות בתמונה (מסומנים על ידי חצים אדומים באיור 6A). כאן, אנו יכולים לזהות את מבנה הזהב המעוקב (FCC) המרוכז בפנים לאורך צירי האזור [001](איור 6B)ו- [112] (איור 6C).
איור 1: סכמטי של שבבי E וקצה מחזיק התא הנוזלי. (א) השבב האלקטרוני הגדול עם ההתנגדות המשמשת לחימום התא הנוזלי (למעלה) והשבב האלקטרוני הקטן (למטה). (ב) שני השבבים האלקטרוניים טעונים במחזיק התא הנוזלי. האלקטרודות של שבב ה-E הגדול נמצאות במגע עם רפידות אלקטרודה של מחזיק התא הנוזלי. ההתנגדות של שבב E גדול יכול לחמם את התא הנוזלי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תמונות מיקרוסקופ אופטי של שבבי E הממחישים: (A) חלון SiN שלם הנחוץ לניסוי. (ב) רקיק סיליקון פגום בקצה ה-E-Chip. ניתן להשתמש בסוג זה של שבבי E אם האזור הפגוע נמצא מחוץ לאזור הרטוב ברגע שהתא הנוזלי אטום (כלומר, אם הנזק נמצא מחוץ לאזור שהוגדר על ידי O-rings). (ג) שאריות על משטח השבב האלקטרוני. אם שאריות כאלה אינן עוזבות לאחר חזרה על תהליכי הניקוי (ראה סעיף 4.1), אין להשתמש בשבב האלקטרוני. (D עד F) חלונות SiN פגומים (שבבי E שאינם שמיש). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תמונות של תהליך שלב אחר שלב של טעינת התא הנוזלי במחזיק TEM. (א) מחזיק דגימה בלבד. (ב) שים את אטם O-טבעת בחלל. (ג) הכנס את השבב האלקטרוני הקטן לאוטוקט O-טבעות. (ד) שים טיפת פתרון על שבבי E קטנים. (ה) שים את השבב האלקטרוני הגדול על השבב הקטן. (ו) לאטום את כל התא הנוזלי על ידי את המכסה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: צילום מסך של תוכנת החימום השולטת בטמפרטורת התא הנוזלי.
איור 5: סדרת תמונות STEM HAADF בהגדלה נמוכה של צמיחת חלקיקי זהב. (A) ב 25 °C (B) ב 85 °C (60 °F). השעה המתאימה מצוינת בפינה השמאלית התחתונה של כל תמונה. הננו-מבנים הדו-מימדיים מסומנים על-ידי חצים אדומים. כל התמונות נרכשות עם אותו קצב מינון אלקטרונים של 3.4 אלקטרונים·1·nm-2. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: ננו-עקיפת STEM של חלקיקים בודדים. (א) תמונת STEM המשמשת לבחירת הננו-חלקיקים המפזרים (מיקומי הגשוש במהלך רכישות עקיפה מסומנים על-ידי חצים אדומים). (B, C) תבנית עקיפה של שני הננו-חלקיקים שנבחרו. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: עיבוד וניתוח נתונים של תמונות STEM HAADF באמצעות פיג'י. התמונות נרכשו 40 שניות לאחר תחילת הצמיחה. (A עד C) תמונה שנרכשה ב 25 °C (D עד G) תמונה שנרכשה ב 85 °C (A,D) תמונת STEM גולמי. (B, ה) תמונה מעובדת (מסנן חציוני). (C, F) תמונה בינארית. (G) חלוקה של הפיקסלים מוחלת פעמיים ולאחר מכן מוחל תהליך "מילוי חורים". לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: גרף המייצג את מספר חלקיקי הזהב כפונקציה של זמן ב 25 °C (69 °F) ו 85 °C (69 °F). שתי העקומות ב- 25°C נמדדות באופן אוטומטי עם גודל זיהוי מינימלי (Smin)של 20 (אדום) ו- 50 (כחול) פיקסלים2. הנקודות הירוקות שנמדדו לאחר 12 ו 60 שניות של רכישה מייצגות את מספר הננו-חלקיקים שנספרו ידנית על הסרטון שנרכש ב 25 °C (60 °F).
איור 9: גרפים המייצגים את שטח הפנים הממוצע של חלקיקי זהב כפונקציה של זמן עבור 25 °C (70 °F) ו 85 °C (69 °F). הנקודות הירוקות מייצגות מדידות ידניות של השטח הממוצע של חלקיקים בנקודות זמן נתונות של הסרטון שנרכש ב 85° C. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 10: סדרת תמונות STEM HAADF בהגדלה גבוהה של צמיחת ננו-קוב זהב יחיד ב-85 °C (69 °F). סדרת תמונות זו נרכשה עם קצב מינון אלקטרונים של 83.6 אלקטרון.s-1.nm-2. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
הפרוטוקול המתואר מאפשר לעקוב אחר התגרענות וצמיחה של חלקיקי זהב המונעים על ידי רדיוליזה במדיה נוזלית מבוקרת טמפרטורה. בשילוב עם עיבוד וידאו אוטומטי, זה מאפשר למדוד את ההשפעה של הטמפרטורה על הפרמטרים העיקריים של סינתזת חלקיקים כגון הצפיפות, הגודל, הצורה ואת המבנה האטומי של חלקיקים. תשומות יקרות ערך אלה מאפשרות להעריך את השפעת הטמפרטורה על שיעורי הגרעין והצמיחה, לזהות מעברי פאזה אפשריים ולהמחיש את תהליכי ההיבט המכתיבים את התוצאה הסופית של פתרונות קולואידיים. יחד עם האפשרות לשלוט בהרכב של התקשורת תגובתי, TEM תא נוזלי מבוקר טמפרטורה הוא צעד נוסף לקראת תצפית ישירה של תהליכי הגרעין והצמיחה של ננו מבנים שונים בתנאי סינתזה מציאותיים. הפרשנות של התוצאות המוצגות במאמר זה והשוואתן למודלים של התגרענות וצמיחה יידונו במקומות אחרים. כאן, אנחנו רוצים להדגיש כמה היבטים מתודולוגיים שיש לשקול לבצע רלוונטי בניסויים situ TEM.
קודם כל, זה חיוני כדי לזהות את ההשפעות קרן אלקטרונים בתקשורת התגובה כי הם יכולים להשפיע באופן דרסטי על תוצאות הניסוי. כאן, כמו רדיוליזה מים הוא הכוח המניע של היווצרות חלקיקים, מהירות הצמיחה עולה במהירות עם קצב מינון האלקטרונים אשר ישפיע על הצורה הסופית של ננו אובייקטים11,15. לכן, כדי ללמוד את ההשפעות של הטמפרטורה על הגרעין והצמיחה של חלקיקים, יש צורך להשוות ניסויי צמיחה שנרכשו עם אותו שיעור מינון אלקטרונים. במצב STEM, קצב מינון האלקטרונים מתאים לזרם הקרן (באלקטרון לשנייה) חלקי גודל התמונה (ב nm2). לכן, קצב מינון אלקטרונים קבוע מרמז לשמור על אותו זרם קרן (כלומר, אותו צמצם מרוכב ואותו גודל ספוט) ועל אותה הגדלה עבור כל ניסוי. חשוב לכמת את זרם הקרן של תנאי ההדמיה באמצעות מצלמת CCD או פאראדיי כדי לפרש ולשכפל את הנתונים. יש לבחור את ההגדלה ואת קצב המינון הנובע מכך בהתאם לשאלה האם ברצוננו לדמיין את צמיחתה של הרכבה גדולה של חלקיקים כדי לחלץ תוצאות רלוונטיות סטטיסטית על קינטיקה הצמיחה (איור 5) או על מנגנוני הגדילה בסולם הננו-חלקיקים הבודד כדי לזהות את אתרי הספיחת המועדפים על משטחי הננו-חלקיקים (איור 10). אם תהליכי הגרעין והצמיחה מהירים מדי, במיוחד בהגדלה גבוהה, יש לבחור פתח מעין קטן וגודל ספוט קטן כדי למזער את קצב המינון. התגרענות וצמיחה של חלקיקים יכול גם להאט על ידי הפחתת הריכוז של מבשר מתכת בתמיסה מנותחת אבל לציין כי הריכוז של מוצרים רדיוליטיים יגדל עם הטמפרטורה. באופן כללי, חשוב גם לקחת בחשבון את ההיסטוריה הקרנת אלקטרונים של המדגם כולו. כאן, למשל, אם מספר ניסויי צמיחה מבוצעים במהירות באזורים הקרובים זה לזה, צפיפות הננו-חלקיקים תקטן עם הזמן מכיוון שריכוז מבשרי הזהב באזור הנחקר פוחת. אפקט זה ניתן למזער על ידי הפרדת ניסויי הצמיחה הן בחלל ובזמן והן על ידי שימוש במחזיק הנוזל במצב זרימה.
אלגוריתמים למעקב אחר ממשק עוזרים מאוד להפוך את הניתוח של קטעי וידאו לאוטומציה ולחלץ תוצאות כמותיות על הגרעין והצמיחה של מכלולי חלקיקים גדולים. עם זאת, ראוי לציין כי שלב בינאריזציה תמונה הוא תמיד נתונים ספציפיים, כלומר המסננים ועיבוד הנתונים שיש להחיל על תמונות כדי לייעל את הזיהוי של ממשק ננו חלקיקים / נוזלים ישתנה מניסוי למשנהו. יתר על כן, חיוני להשוות את התוצאות של ניתוחים אוטומטיים אלה עם מדידות ידניות שבוצעו על כמה תמונות כדי לייעל את זרימת העבודה של עיבוד תמונה ולדעת את המגבלות שלה. כאן, למשל, אירועי פיזור מרובים בננו-חלקיקים תלת-ממדיים העבים יותר ויותר הנוצרים בטמפרטורה גבוהה גורמים להיפוך ניגודיות של הליבה שלהם לאחר 30 שניות של תצפית מכיוון שהרחבת האלקטרונים המפוזרים גורמת לירידה של האות שנאסף בטווח הזוויתי של הגלאי הזוויתי. כדי להמשיך למדוד את שטח הפנים האמיתי של חלקיקים אלה, השתמשנו בתהליך נתונים של "חורי מילוי" לאחר הבינאריזציה של התמונה הממלאת את המעגל הפנימי של ניגודי צורת הטבעת(איור 7F, G). עם זאת, היינו צריכים להשתמש בחלוקה קטנה של האובייקטים כדי לוודא כי ניגודים צורת טבעת אלה מחוברים תמיד באופן מלא. צעד זה מוביל להערכת יתר קלה של שטח הפנים הממוצע של חלקיקים במדידות האוטומטיות (איור 9). באופן דומה, לגילוי חלקיקים, עלינו להגדיר גודל מינימלי של עצמים שזוהו (Smim)כדי למנוע זיהוי הרעש, אך פרמטר זה משפיע על קצב הגרעין הנמדד. כפי שניתן לראות באיור 8, מספר הננו-חלקיקים שזוהו גדל בתחילת הניסוי כדי להגיע לרמה. כאשר Smin גדול (50 פיקסלים2 המתאים 1543 ננומטר2), מדידות אוטומטיות וידניות הסכימו על רמת רמה זו (835 חלקיקים לאחר 60 שניות) אבל זיהוי של חלקיקים מתעכב בניתוח האוטומטי מאז 835 חלקיקים נספרים באופן ידני לאחר רק 12 s, אבל לא זוהה באופן אוטומטי עד מאוחר יותר. זמן זיהוי ממושך זה מוביל להערכת חסר של קצב התגרען. הפחתת Smin עד 20 פיקסל2 (כלומר, 617 ננומטר2)מפחיתה את השגיאה בזמן הגרעין של הרכבת הננו-חלקיקים, אך היא מובילה להערכת יתר של צפיפות הננו-חלקיקים במיוחד בשלב מוקדם של הניסויים (איור 8) המשפיע גם על קצב הגרעין. הזיהוי ומדידות הגודל והצורה של ננו-עצמים עם התנהגות דינמית מאוד ויחס אות לרעש נמוך הוא אתגר נפוץ ב- TEM שלב נוזלי שניתן לשפר עוד יותר באמצעות סגמנטציה ושיטות גינוי אחרות24 או למידת מכונהמתקרבת 25.
אחרון חביב, הכנת התא הנוזלי וניקוי מחזיק הנוזל חייב להתבצע בזהירות רבה כדי למנוע זיהומים של התקשורת התגובה.
באופן כללי, שליטה בטמפרטורת המדגם במהלך ניתוחי LCTEM מספקת את ההזדמנות לחקור השפעות תרמיות על תגובות כימיות המתרחשות בממשק בין מוצקים לנוזלים. לכן, אנו מקווים שהשיטה הנוכחית תסלול את הדרך לאחרים בניסויי situ TEM שנועדו לחשוף את הדינמיקה של חומרים קשים, רכים או ביולוגיים במדיה נוזלית מבוקרת טמפרטורה.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו מכירים בהכרת תודה על התמיכה הכספית של אזור איל דה פראנס (כנס SESAME E1845 עבור מיקרוסקופ אלקטרונים JEOL ARM 200 F מותקן באוניברסיטת פריז), תפר Labex (פרויקט GLOIRE) ו CNRS (תוכנית Defi Nano). אנו מודים למדלן דיוקס ודניאל פרנק על שיתוף השרטוטים והתמונות האופטיות של התאים הנוזליים שנראו באיורים 1 ו -2.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Plus electron microscope | Jeol | ||
| Acetone | Merck | ||
| Air pistol | |||
| ARM 200F electron microscope | Jeol | ||
| Binoculars or optical microscope | |||
| Carbon tipped tweezers | |||
| Computer with heating software | Software by Protochips | ||
| Distlilled water | |||
| Dummy e-chips | Protochips | ||
| Gasket/O-rings | Protochips | ||
| Gold aqueous solution | Merck | 1 mM of HAuCl4 - Prepared beforehand | |
| Large liquid heating E-chip | Protochips | ||
| Methanol | Merck | ||
| One View camera | Gatan | ||
| Petri dish | Number : 2 | ||
| Plasma cleaner | Gatan | ||
| Poseidon Select | Protochips | Liquid cell holder | |
| Power supply Keithley 2450 | |||
| Protective gloves | |||
| Red PEEK tubing | Number : 3 | ||
| Screwdriver with torque | |||
| Small liquid E-chip | Protochips | 150 nm spacers | |
| STEM HAADF detector | Jeol | ||
| STEMx software | Gatan | ||
| Syringe | Number : 2 | ||
| Syringe pump | Harvard apparatus | Number : 2 | |
| Vacuum pump | Gatan |
References
- Willets, K. A., Van Duyne, R. P. Localized surface plasmon resonance spectroscopy and sensing. Annual Review of Physical Chemistry. 58 (1), 267-297 (2007).
- Dreaden, E. C., Alkilany, A. M., Huang, X., Murphy, C. J., El-Sayed, M. A. The golden age: gold nanoparticles for biomedicine. Chemical Society Review. 41, 2740-2779 (2012).
- You, H., Yang, S., Ding, B., Yang, H. Synthesis of colloidal metal and metal alloy nanoparticles for electrochemical energy applications. Chemical Society Review. 42, 2880-2904 (2013).
- Nikoobakht, B., El-Sayed, M. A. Preparation and growth mechanism of gold nanorods using seed-mediated growth method. Chemistry of Materials. 15, 1957-1962 (2003).
- Hubert, F., Testard, F., Spalla, O. Cetyltrimethylammonium bromid silver bromide complex as the capping agent of gold nanorods. Langmuir. 24, 9219-9222 (2008).
- Xia, Y., Xiong, Y., Lim, B., Skrabalak, S. E. Shape-controlled synthesis of metal nanocrystals: Simple chemistry meets complex physics. Angewandte Chemie International Edition. 48, 60-103 (2009).
- Zheng, Y., Zeng, J., Ruditskiy, A., Liu, M., Xia, Y. Oxidative etching and its role in manipulating the nucleation and growth of noble-metal nanocrystals. Chemistry of Materials. 26, 22-33 (2014).
- Xin, H. L., Zheng, H. In situ observation of oscillatory growth of bismuth nanoparticles. Nano Letters. 12 (3), 1470-1474 (2012).
- Wu, J., et al. Growth of Auau on Pt icosahedral nanoparticles revealed by low-dose in situ TEM. Nano letters. 15, 2711-2715 (2015).
- Ahmad, N., Wang, G., Nelayah, J., Ricolleau, C., Alloyeau, D. Exploring the formation of symmetric gold nanostars by liquid-cell transmission electron microscopy. Nano letters. 17, 4194-4201 (2017).
- Woehl, T. J., Evans, J. E., Arslan, I., Ristenpart, W. D., Browning, N. D. Direct in situ determination of the mechanisms controlling nanoparticle nucleation and growth. ACS Nano. 6, 8599-8610 (2012).
- Tan, S. F., et al. Intermediate structures of pt-ni nanoparticles during selective chemical and electrochemical etching. The Journal of Physical Chemistry Letters. 10, 6090-6096 (2019).
- Xin, H. L., Zheng, H. In situ observation of oscillatory growth of bismuth nanoparticles. Nano Letters. 12, 1470-1474 (2012).
- Aliyah, K., et al. Real-time in situ observations reveal a double role for ascorbic acid in the anisotropic growth of silver on gold. The Journal of Physical Chemistry Letters. 11 (8), 2830-2837 (2020).
- Alloyeau, D., et al. Unravelling kinetic and thermodynamic effects on the growth of gold nanoplates by liquid transmission microscopy. Nano Letters. 15 (4), 2574-2581 (2015).
- Gao, W., et al. Direct in situ observation and analysis of the formation of palladium nanocrystals with high-index facets. Nano Letters. 18 (11), 7004-7013 (2018).
- Liao, H. -G., et al. Facet development during platinum nanocube growth. Science. 345, 916-919 (2014).
- Tan, S. F., et al. Real-time imaging of the formation of Au-Ag core-shell nanoparticles. Journal of the American Chemical Society. 138 (16), 5190-5193 (2016).
- Khelfa, A. Selective shortening of gold nanorods: when surface functionalization dictates the reactivity of nanostructures. Nanoscale. 12, 22658-22667 (2020).
- Schneider, N. M., et al. Electron-water interactions and implications for liquid cell electron microscopy. Journal of Physical Chemistry C. 118, 22373-22382 (2014).
- Ahmad, N., Le Bouar, Y., Ricolleau, C., Alloyeau, D. Growth of dendritic nanostructures by liquid-cell transmission electron microscopy: a reflection of the electron-irradiation history. Advanced Structural and Chemical Imaging. 2, 9 (2016).
- Khelfa, A., et al. Structural analysis of single nanoparticles in liquid by low-dose STEM nanodiffraction. Micron. 116, 30-35 (2019).
- Ahmad, N., Wang, G., Nelayah, J., Ricolleau, C., Alloyeau, D. Driving Reversible Redox Reactions at Solid/Liquid Interfaces with the Electron Beam of a Transmission Electron Microscope. Journal of Microscopy. 269, 127-133 (2018).
- Schneider, N. M., Park, J. H., Norton, M. M., Ross, F. M., Bau, H. H. Automated analysis of evolving interfaces during in situ electron microscopy. Advanced Structural and Chemical Imaging. 2, (2016).
- Yao, L., Ou, Z., Luo, B., Xu, C., Chen, Q. Machine learning to reaveal nanoparticle dynamics from liquid-phase TEM videos. ACS Central Science. 6, 1421-1430 (2020).
