Summary
액체 상 전자 현미경 실험 중 온도 제어는 형성 또는 응용 매체를 모방하는 액체 환경에서 나노 입자의 역학을 연구하는 새로운 관점을 열어줍니다. 최근에 개발된 가열 액체 세포를 사용하여, 우리는 직접 물에서 금 나노 입자의 핵형성 및 성장 과정에 온도의 영향을 관찰.
Abstract
온도 조절은 액체 세포 투과 전자 현미경 검사법에 의한 나노화학을 연구할 수 있는 추가적인 정도의 자유를 제공하는 최근의 개발이다. 이 논문에서는, 우리는 물에서 무선 용해에 의해 구동 되는 금 나노 입자의 형성에 온도의 효과 연구 하기 위한 시투 가열 실험을 준비 하는 방법을 설명 합니다. 실험의 프로토콜은 최대 100°C의 균일한 가열 기능을 갖춘 특수 액체 셀, 유동 기능을 갖춘 액체 셀 TEM 홀더 및 온도를 제어하기위한 통합 인터페이스를 포함하는 매우 간단합니다. 우리는 금 나노 입자의 핵 형성 및 성장 메커니즘이 액체 세포의 온도에 의해 크게 영향을 받는 것을 보여줍니다. STEM 이미징 및 나노절절을 사용하여 성장하는 나노 입자의 밀도, 크기, 형상 및 원자 구조의 진화가 실시간으로 드러난다. 자동화된 이미지 처리 알고리즘은 나노입자의 핵형성 및 성장속도와 같은 비디오 서열으로부터 유용한 정량적 데이터를 추출하기 위해 활용된다. 이 접근법은 나노 물질의 액체 상 합성 중에 재생에서 복잡한 물리 화학 공정을 이해하기위한 새로운 입력을 제공합니다.
Introduction
금속 나노 입자 (NPs)는 광학 감지1,약2 또는 에너지3과같은 다양한 영역에서 사용될 수있는 유망한 물리 화학 적 특성을 갖는다. 습식 화학 합성은 잘 정의 된 크기와 모양으로 금속 NP를 제조하는 매우 다양한 방법입니다. 지난 수십 년 동안, 많은 전략이 NPs 합성을 제어하기 위해 개발되었습니다 : 종자 매개 성장4,얼굴 차단 방법5,kinetically 대조 합성6,선택적 에칭7 또는 온도 제어 합성8. 그러나, 합성을 유도하는 화학 반응은 상당히 간단하지만, 많은 파라미터가 형성 공정에 역할을 하고 그들의 개별적인 영향은 합성의 주어진 시점 시점에서 그들의 형성 매체로부터 추출된 결과 나노 물질의 전 시투 스냅샷으로부터 회수하기 어렵기 때문에 핵형성 및 성장 메커니즘은 아니다. 핵 형성 및 성장 과정을 진정으로 이해하고 이를 제어하는 방법을 수립하려면 미세하게 제어된 액체 환경에서 실시간 관찰을 허용하는 시투 도구를 사용해야 합니다.
그 와 관련하여, 액체 세포 투과 전자 현미경 검사법(LCTEM)은 금속 나노 입자9,10,11,12,13의합성에 새로운 빛을 흘리기 위한 매우 강력한 방법이되었다. 액체 형성 매체에서 개별 나노 구조의 역학을 직접 이미징함으로써, 이 기술은 핵형성 및 성장 메커니즘, 특히 방향 성장 또는 에칭 공정을 구동하고 특정 형상(나노로드, 나노스타, 나노플레이트, 나노껍질)10,11,12,13,14,15, 16,18,18, 18, 18, 18, 18, 18, 189의결정 적 결함, 종자 형태 및 유기 리간드의 역할에 대한 심층적인 이해를 제공했습니다. TEM의 전자 빔이 액체와 상호 작용할 때, 방사선 분해 공정은 조사 된 영역에서 용액 화학을 수정하고 성장 또는 에칭 공정을 구동하는 데 사용할 수있는 강력한 감소 및 산화 종을 생성합니다. 흥미롭게도, 무선 분해 제품의 농도는 전자 용량율, 전자현미경(20)에서미세하게 조정할 수 있는 파라미터로 증가하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 이러한 투여속도 의존성은 반응 속도를 조절하고나노구조체 11,15,20의형성 과정 및 최종 형태에 대한 운동 효과를 드러내기 위해 이용되고있다.
온도는 나노 물질 합성에 있는 결정적인 매개변수이지만, 그 효력은 지금까지 LCTEM에 의해 주의 깊게 조사되지 않았습니다, 믿을 수 있는 온도 통제를 가진 상업적인 액체 세포는 최근에 개발되었기 때문에. 그러나, 이러한 시상 연구에서는 온도 변화에 의해 유도되는 복잡한 운동과 열역학 효과를 해명하는 데 필수적입니다. 실제로, 온도를 높이는 한편으로는 성장 하는 동안 얼굴 처리에 급격한 영향을 미칠, 액체에 원자 및 분자 확산 속도 및 반응 속도 수정. 한편, 나노구조의 나노위상 다이어그램도 온도에 매우 민감하다. 이 기사에서는 최근 개발된 가열 액체 세포를 활용하여 실온과 100°C 사이의 온도 조절을 통해 물 속에서 금 나노 입자의 무선 성장을 따릅니다. 실제 합성 조건에 점점 더 가까워지고 있는 환경에서 STEM 이미징과 회절을 결합한 이 방법론은 Situ TEM 관측과 벤치 스케일 신디사이저 사이의 격차를 줄입니다.
Protocol
1. STEM HAADF 이미징을 위한 투과 전자 현미경 정렬
- 현미경 정렬에 대한 제조업체 지침을 따르십시오.
- 현미경을 정렬하기 위해 기존의 건조 된 샘플을 사용합니다. 액체 샘플을 사용하지 마십시오.
- 성장 속도를 최소화하기 위해, 작은 응축기 조리개와 작은 점 크기를 사용하여 빔 전류를 줄이는 것을 의미하는 전자 용량 속도(토론 섹션 참조)를 최소화합니다.
2. 전자 칩 처리
참고: 상업용 액체 홀더는 거의 모든 TEM에 적합하지만 현미경 브랜드 및 극 조각을 위해 특별히 디자인된 홀더를 사용합니다. 액체 셀은 전자 칩이라는 두 개의 MEMS 기반 실리콘 칩으로 만들어지며, 둘 다 전자투명한50 nm 두께의 무정형 실리콘 질산화물 (SiN) 필름으로 덮인 500 x 50 μm 창의 실리콘 기판입니다. 이 두 전자 칩의 크기는 다릅니다. 작은 하나는 두 E 칩 (여기에 150 nm)과 액체 두께 사이의 거리를 고정 골드 스페이서 와 2 x 2mm입니다. 큰 것은 4 x 6mm이며 액체 샘플(도 1B)의균일 한 가열을 허용하는 실리콘 기판 내부에 내장 된 저항성을 갖는다. 그들은 깨끗한 방에서 조작되는 방식 때문에, E 칩은 두 개의 서로 다른 측면을 가지고 있습니다 : 창이 작게 보이는 하나 (여기에 전면이라고 한 후) 창이 싱크 모양이 큰 다른 (여기에 후면이라고 한 후).
- E-칩을 처리할 때는 핀셋으로 창을 만지지 말고 칩을 측면으로 잡습니다. 실리콘 기판의 표면을 긁는 것을 피하려면 탄소 팁 핀셋을 사용하십시오.
- 표면에 E 칩을 배치하는 경우 SiN 필름이 깨지기 쉽고 전면에 증착되므로 뒷면이 표면과 접촉하고 있는지 확인하십시오.
3. 액체 세포 홀더의 청소 (실험 전)
- 홀더의 끝을 덮는 뚜껑을 제거합니다. 핀셋을 사용하여 더미 액체 세포를 제거합니다. 더미 액체 세포와 함께 사용되는 개스킷을 제거합니다.
참고 : 더미 액체 세포는 SiN 창과 실리콘이없는 액체 세포입니다. 그들은 진공 펌프에 액체 셀 홀더를 저장하는 데 사용됩니다. 시간이 지남에 따라 쉽게 무너지기 때문에 황동 나사의 상태에주의를 기울이라. 특히 나사 헤드가 손상된 경우 나사를 변경해야 합니다. 그렇지 않으면 실험 후 나사를 풀기 어려울 수 있으며 작은 파편이 시료 하중을 방해할 수도 있습니다. - 홀더 뒤쪽에 연결하기 위해 주사기와 외부 PEEK 튜브를 사용하여 홀더 내부에 증류수 2mL를 수동으로 주입합니다.
참고: 홀더 내부에는 3개의 미세 유체 터널이 있습니다. 세 가지 모두 물로 청소해야 합니다. 홀더 앞에서 나오는 물에주의를 기울이세요: 이전 실험으로 인해 물이 착색되면 액체가 변색될 때까지 홀더 내부에 물을 계속 넣습니다. - 실험 중 액체 셀에 용액을 주입하는 경우(당사의 경우 물에 HAuCl4의 1mMM) 샘플 홀더의 튜브를 이 솔루션으로 채웁니다.
- 공기 권총을 사용하여 액체 셀 홀더의 끝을 건조.
4. 액체 셀의 준비 (E 칩)
- 액체 세포의 청소.
- 유리 페트리 접시에 아세톤으로 채웁니다.
- 페트리 유리 접시에 메탄올을 채웁니다.
주의: 메탄올의 독성으로 인해 메탄올이 있는 페트리 접시를 연기 후드 아래에 두어야 합니다. 메탄올은 적절한 보호 장비 (장갑)로 처리해야합니다. - 페트리 접시에 아세톤이 있는 작은 E칩 1개를 넣고 2분간 기다립니다.
참고: E-칩은 실험 전에 제거해야 하는 보호 층으로 코팅됩니다. 아세톤은 포토레지스트를 제거하고 이물질의 E 칩을 청소합니다. 청소를 향상시키기 위해 용액을 부드럽게 교반 할 수 있습니다. - 페트리 접시에 메탄올을 넣고 2분간 기다립니다. 메탄올은 아세톤과 나머지 잔해에서 E 칩을 청소합니다.
주의: E-칩이 공중에서 건조시키지 않도록 가능한 한 빨리 아세톤과 메탄올 사이의 E 칩 을 전송해야 합니다. - 공기 권총을 사용하여 액체 세포를 건조. 에어 권총을 사용하는 동안 핀셋을 사용하여 E 칩을 잡으라. 그렇지 않으면 E 칩이 핀셋에서 떨어질 수 있습니다 공기 권총 트리거에 너무 많이 누르지 않도록주의하십시오. 중퇴하면 아세톤과 메탄올로 청소를 다시 시작하십시오.
- 쌍안경 돋보기 또는 광학현미경(도 2)을사용하여 실리콘 진타창의 무결성을 검증한다.
참고: 두 E-칩의 창이 깨끗하고 파손되지 않았는지 확인합니다. E-칩이 깨끗해 보이지 않으면 아세톤과 메탄올에 다시 넣으세요. 먼지가 여전히 창에 있거나 창이 깨진 경우 E-칩을 새 칩으로 변경해야 합니다. - 플라즈마는 아르곤과 산소 가스를 혼합하여 2분 동안 E 칩을 청소합니다. 플라즈마 청소 전자 칩은 친수 성 수 있습니다. 여기에 플라즈마 세척 설정의 세부 사항은 다음과 같습니다 아르곤 가스 흐름 = 35 sccm, 산소 가스 흐름 = 11.5 sccm, 가스 흐름 시간 = 20 s, 전방 RF 대상 = 50 W, 전방 RF 범위 = 5 W, 최대 반사 RF = 5 W.
- 액체 세포를 TEM 홀더에적재(도 3).
- 액체 셀홀더(도 3B)에개스킷 O 링을 적재합니다. 사용된 개스킷이 깨끗한지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 증류수로 빠르게 청소하십시오. 깨끗한 필터 용지를 사용하여 건조하십시오. 개스킷의 파편과 섬유를 제거하려면 두 장의 파라필름 사이에 여러 번 누릅니다.
- 액체 셀홀더(그림 3C)에작은 E칩을 넣습니다. 현미경의 진공을 향해 SiN 필름의 절을 줄이기 위해, 교차 구성에 액체 셀의 창을 배치. 따라서 작은 E-칩의 창은 홀더의 길이와 앞면위로 평행해야 합니다. 작은 E 칩이 개스킷 내부에 잘 삽입되어 있는지 확인합니다.
- 액체 샘플을 준비하십시오 (여기, 물에 HAuCl4의 1 mM).
- 마이크로피펫(도3D)을사용하여 작은 E칩상의 액체 샘플의 ≈2 μL을 떨어뜨립니다. 작은 E-칩이 제대로 플라즈마 를 세척한 경우 수성 액체 샘플이 칩 표면전체에 고르게 퍼집니다.
- 필터 용지로 여분의 액체를 제거합니다. 필터 용지의 급격하게 잘라 낸 조각으로, 평평한 돔을 형성 할 때까지 작은 E 칩에 액체 층의 두께를 줄일 수 있습니다.
- 액체 셀 홀더 내부에 큰 E 칩을 넣습니다(도 3E). 큰 E-칩을 앞면에 아래로 놓습니다(두 칩의 전면은 서로 직면해야 합니다). 대형 E-칩의 전극은 홀더의 전극 패드와 접촉해야 합니다.
- 액체 셀 홀더에 뚜껑을 다시 밀어. 각 나사(그림3F)를점진적으로 조입니다.
- 작은 컷아웃 필터 용지를 사용하여 E 칩에서 나오는 최종 액체를 건조시다. 액체 세포 홀더를 축 주위로 회전시켜 액체 세포의 양쪽에 액체가 나오지 않는지 확인하십시오.
- 펌핑 스테이션에서 액체 셀의 진공 밀봉을 테스트합니다. 펌프의 진공 레벨이 5 x10-2 Pa에 도달하면 프로토콜을 계속합니다. 그렇지 않은 경우 창의 무결성을 확인하고(대부분 파손될 가능성이 있음) 새로운 E-칩 세트로 처음부터 프로토콜을 시작합니다.
- 쌍안경 돋보기 또는 광학 현미경을 사용하여 실리콘 진타창의 무결성을 마지막으로 확인합니다. 때로는 액체 셀이 창이 부러져도 펌핑 스테이션의 진공 상태를 유지할 수 있습니다. 창이 깨지고 액체가 흘러나올 때 창의 깨진 부분에 소금의 집합체가 형성되어 구멍을 덮을 수 있기 때문입니다. 이 경우 새로운 E-칩 세트를 준비합니다.
- 액체 셀 홀더를 TEM에 적재하고 진공 레벨을 확인합니다. 액체 셀이 펌핑 스테이션의 진공을 지속하고 창에 눈에 보이는 문제가 없더라도 액체 셀의 미세 누출은 TEM을 작동하는 데 필요한 진공 수준에 도달하는 것을 방지 할 수 있습니다. 현미경이 작동하도록 필요한 진공 레벨(2-5 x 10-5 Pa)에 도달하지 못하면 샘플 홀더를 제거하고 새로운 E-칩 세트를 준비합니다.
5. 유동 모드에서 액체 홀더사용
- 주입할 용액의 몇 밀리리터로 2개의 주사기를 채우십시오(HAuCl4의 1mM의 물).
- 외부 PEEK 튜브 2개를 주사기에 연결합니다. 주사기 펌프에 주사기 2개대 액체 셀 홀더의 2개의 항목에 외부 PEEK 튜브를 삽입합니다. 액체 셀 홀더의 출력을 위해 하나의 외부 PEEK 튜브를 추가로 삽입합니다.
- 각 입구에 5 μL/min의 유량으로 솔루션을 주입합니다.
6. 액체 환경의 가열
- 전원 공급 장치를 홀더에 연결합니다. 전원 공급 장치를 가열 소프트웨어가 설치된 컴퓨터에 연결합니다.
- 컴퓨터를 전원을 공급하고 난방 소프트웨어를 엽니다. 전원 공급 장치.
- 장치 확인 버튼을 클릭합니다. 소프트웨어가 "통과"를 나타내는 경우 실험을 계속할 수 있습니다. 그렇지 않으면 대형 E 칩에 문제가 있을 수 있습니다(E 칩의 잘못된 로딩, 깨진 전극...).
- 실험 탭을 클릭합니다. 수동을 클릭하여 수동 가열 모드를 활성화합니다.
- 대상 온도를 선택하고 그에 따라 온도 속도를 변경합니다. 프레스는 E 칩을 표적 온도(그림4)로가열하기 위해 적용됩니다.
참고: E-칩은 최대 100°C까지 가열할 수 있습니다. 수성 용액이 실험에 사용되는 경우 (우리의 경우와 같이), 90 ° C 이상의 전자 칩을 가열하지 마십시오. 그렇지 않으면 액체 샘플이 건조 될 수 있습니다. 액체를 가열할 때 온도가 일시적으로 목표 온도 이상으로 상승한 다음 원하는 온도로 떨어질 수 있습니다. 이러한 오버슈트를 최소화하기 위해 낮은 가열 속도를 사용합니다 (1 ° C / s는 괜찮습니다). - 주변 온도를 클릭하십시오 (25 °C). 갑자기 난방을 중지 중지를 클릭합니다. 가열 실험을 종료하려면 끝 세션 탭을 클릭합니다.
7. 나노 입자 성장의 STEM 이미징
- HAADF 검출기를 사용하여 STEM 모드에서 현미경을 사용하십시오. 액체 두께가 최소화된 관측 창의 모서리 근처에 있는 시료의 깨끗한 영역으로 이동합니다. 액체의 다른 온도에 대한 나노 입자 성장의 비디오를 취득(그림 5).
참고: 금 나노 입자즉시 나타나고 스캔 된 영역에서 자랍니다. 초당 하나의 이미지의 프레임 속도로 비디오 녹화는 좋은 신호 대 잡음 비율과 좋은 시간 해상도로 성장 과정을 관찰하는 좋은 타협이다.
8. 단일 나노 입자의 STEM 나노 디프침해
- 여러 나노 물체의 STEM HAADF 이미지를 획득합니다. STEMx소프트웨어(도 6)를이용하여 이미지상에서 선택된 개별 나노입자의 회절 패턴을 획득한다.
참고: STEM 나노 절전은 성장실험(22)에서액체에서 단일 나노 입자의 회절 패턴을 획득할 수 있는 기술이다. - STEM HAADF 이미지를 획득한 후, 이미지상에 있는 여러 나노 물체를 선택하고 STEMx 소프트웨어는 프로브와 CCD 카메라의 위치를 자동으로 동기화하여 프로브의 각 위치에서 회절 패턴을 획득한다. 회절 반점의 중복을 방지하려면 작은 응축기 조리개 (당사의 경우 10 μm)를 사용하여 STEM 프로브 (당사의 경우 7.4 mrad)의 작은 수렴 각도를 사용합니다.
9. 액체 세포 홀더의 세척 (실험 후)
참고: 여기에서는 액체 셀 홀더에 대한 표준 세척 절차를 설명합니다. 이 세척이 충분히 효율적이지 않은 경우 희석 된 질산과 메탄올을 사용하여 액체 세포 홀더에서 최종 나노 입자 응집체를 플러시 할 수 있습니다. 액체 세포 홀더의 화학 적 호환성 문서는 이전에 상담해야합니다. 어쨌든 증류수의 주입으로 항상 청소를 마칩니다.
- 뚜껑을 제거합니다. 사용된 E 칩을 제거합니다. 내부 개스킷을 제거합니다.
참고: 사용된 전자 칩을 적응된 상자에 저장할 수 있습니다. 그런 다음 액체셀(15)을봉인해제한 후 SiN 창에 부착된 나노 물체의 전 시트 TEM 또는 SEM 분석을 수행할 수 있다. E-칩을 다른 시투 실험을 재사용하는 것은 바람직하지 않지만, 액체 세포의 밀봉 해제 중에 SiN 필름이 파손되지 않은 경우에도 가능합니다. 그런 다음 다른 용매의 자라기 실험을 수행할 수 있습니다. 23 - 액체 셀 홀더의 입구 및 콘센트 튜브에 증류수 5mL을 주입하십시오.
- 초음파 목욕을 사용하여 액체 세포 홀더의 끝을 20 분 동안 청소하십시오. 접지 패드는 욕조에 담그수 있습니다. 뚜껑으로 덮인 부분만 침지합니다. 통풍구 구멍을 액체에 담그지 마십시오.
- 공기 권총을 사용하여 액체 셀 홀더를 건조시십시오.
- 더미 액체 세포와 함께 사용되는 개스킷을 다시 넣습니다. 더미 액체 세포와 뚜껑을 다시 넣습니다.
- 샘플 홀더를 진공 스테이션에 보관합니다.
10. 피지를 이용한 실험 후 분석(ImageJ)
참고: 촬영한 비디오의 각 프레임을 단일 이미지로 나누는 것이 좋습니다. 이 실험 후 분석 단계의 목적은 피지에 의해 분석 될 수있는 바이너리 비디오로 나노 입자의 원래 비디오를 변환하는 것입니다. 중앙값 필터는 배경에 나노 입자의 대비를 향상시키기 위해 사용된다(그림 7B 및 7E). 이것은 비디오의 바이비어화를 용이하게하는 데 필수적입니다.
- 파일 | 클릭하여 피지에 비디오의 이미지가 포함 된 파일 디렉토리를 엽니 다 가져오기 | 이미지 시퀀스. 시퀀스 옵션 창이 팝업됩니다. 적절한 시작 이미지를 선택합니다(비디오의 시작 부분을 삭제하는 경우). 이미지 시퀀스에 대한 증분 번호를 입력합니다(STEM 스캔이 이미지의 맨 아래에 도달하는 데 걸리는 프레임 수에 해당). 8비트 그레이스케일로 변환하려면 확인란을 선택합니다. 이미지 시퀀스를 티프 형식으로 저장합니다.
- 비디오에서 원하지 않는 모든 아티팩트(예: 축척 막대 또는 액체 셀 창가장자리)를 자르십시오.
- 프로세스 | 클릭하십시오. 필터 | 중앙값은 모든 이미지에 중앙값 필터를 적용합니다. 처리된 이미지 시퀀스를 티프 형식으로 저장합니다.
참고: 중앙값 필터에 사용되는 반경을 묻는 창이 팝업됩니다. 반경 2픽셀을 사용했지만 다양한 매개 변수를 자유롭게 사용할 수 있습니다. 다른 필터는 이미지 처리를 향상시키는 데 사용할 수있는 피지에서도 사용할 수 있습니다. 특히, 배경 알고리즘을 빼는 것은 균일하지 않은 경우 배경 강도를 평평하게 만드는 데 사용될 수 있다. 이를 위해 프로세스 | 클릭하십시오. 배경을 뺍니다. 우리의 경우,이 프로세스는 거짓 나노 입자로 해석 될 수있는 첫 번째 이미지의 배경에 작은 흰색 패치를 만듭니다. 따라서, 우리는 이 과정을 사용하지 않았지만 다른 데이터 세트에서 시도되어야 하는데, 이는 액체 세포의 중심으로 모서리에서 액체 두께가 증가하여 일반적으로 낮은 배율 LCTEM 이미지에 대한 비균일한 배경 강도를 유도하기 때문이다. - 이미지 | 클릭 조정 | 임계값. 나노 입자만 빨간색으로 칠해질 때까지 바이나화 임계값의 더 나은 정밀도를 위해 수동으로 이동합니다. 적용 버튼을 누릅니다. 변환 스택에서 바이너리 창으로 이동합니다. 각 이미지에 대한 계산 임계값을 선택 취소합니다. 티프 형식으로 바이너리 이미지 시퀀스를 저장합니다(그림7C 및 7F).
참고: 비디오의 각 프레임에서 임계값이 충족하는지 확인하는 것이 좋습니다. - 비디오 중에 나노 입자의 대비 반전이 있는 경우에만 이 단계를 수행합니다. 프로세스 | 클릭하십시오. 바이너리 | 디레이트. 필요한 경우 한 번 더 수행하십시오. 프로세스 | 클릭하십시오. 바이너리 | 채우기 구멍 (그림 7G,토론 섹션을 참조하십시오).
- | 분석하려면 클릭하십시오. 입자를 분석합니다. 실험 중에 관찰된 분석된 나노입자의 크기 범위를 정의한다. 요약을 확인합니다.
참고: 관찰된 나노입자의 최소 크기를 최소한정의하는 것이 매우 중요합니다. 그것 없이, 이진 이미지 서열에 나타나는 작은 검정점(noise)은 나노입자로 간주됩니다. 첫 번째 시도로, 눈으로 식별 된 가장 작은 나노 입자의 크기를 선택하지만,이 매개 변수의 효과를 이해하고 자동화 된 데이터 분석을 최적화하기 위해 시행 착오 과정이 필요합니다 (토론 섹션 참조). 이 단계 전에 나노 입자의 영역을 검색하려면 분석 | 클릭하십시오. 측정을 설정하고 영역을확인합니다. 다른 측정을 사용할 수 있습니다. - 결과 및 요약 창을 저장합니다. 각 프레임의 나노 입자 수는 요약 데이터 창에 있습니다.
Representative Results
도 5는 25°C 및 85°C에서 80초 이상 획득한 두 개의 STEM HAADF 이미지 시리즈를 나타낸다. 이러한 모든 실험에서 나노 입자의 핵 형성 및 성장은 물의 무선 Lysis에 의해 구동된다. 이러한 전자빔 유도 현상에 의해 생성된 화학종 중, 강력한 환원제(즉, 수성 전자 및 수소 라디칼)는 SiN 창과 액체 사이의 계면에서 금 나노결정의 형성으로 이어지는 테트라클로로우리산을 감소시킬 수 있다. 이 두 가지는 동일한 전자 투여량 비율로 수행된 시상 관측에서 현재 의 방법으로 액체 매체의 나노 입자 형성에 대한 온도의 급격한 영향을 시각화할 수 있음을 확인합니다. 저온에서, 우리는 작은 나노 입자의 매우 조밀 한 조립의 성장을 관찰, 고온에서 몇 크고 잘 면화 나노 구조를 얻을 수 있는 동안. STEM HAADF 이미지의 대비는 금 나노입자 두께에 비례하기 때문에, 이러한 성장 실험 중에 물체의 두 집단이 형성되는 것을 볼 수 있습니다: 삼각형 또는 육각형 모양과 낮은 대비(도 5에서적색 화살표로 표시).
이 프로토콜에 기재된 비디오 분석 방법은 관찰된 영역에서 나노입자의 수와 평균 표면적을 시간이 지남에 따라 측정하여 핵형성 및 성장 공정을 정량화할 수 있게 한다. 도 8에서볼 수 있듯이, 800나노이상의 나노입자는 관측의 수십 초 이내에 형성되며 30나노입자만이 고온에서 형성된다. 두 개의 삼각형 및 육각형 나노 플레이트를 제외하고, 모든 나노 입자는 이미 고온 후속의 첫 번째 이미지에 존재한다. 도 9는 나노입자의 평균 표면적이 25°C보다 85°C에서 40배 빠르게 증가한다는 것을 보여준다.
도 6은 영상상에서 직접 선택된 두 개의 금 나노입자의 일반적인 STEM 영상 및 회절 패턴을 나타낸다(도 6A상에적색 화살표로 표시됨). 여기서, 우리는 [001](도 6B)및 [도6C]영역 축을 따라 중심의 금의 얼굴 중심 입방 (FCC) 구조를 식별할 수 있습니다.
그림 1: E 칩의 회로도 및 액체 셀 홀더의 끝. (A) 액체 셀(위)과 소형 E칩(아래쪽)을 가열하는 데 사용되는 저항성을 가진 대형 전자 칩. (B) 두 E 칩이 액체 셀 홀더에 로드됩니다. 대형 E-칩의 전극은 액체 셀 홀더의 전극 패드와 접촉한다. 대형 E 칩의 저항은 액체 셀을 가열 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: E 칩의 광학 현미경 사진 설명 : (A) 실험에 필요한 그대로 SiN 창. (B) E-칩 의 가장자리에 손상된 실리콘 웨이퍼. 이러한 유형의 E-칩은 액체 셀이 밀봉되면 손상된 영역이 젖은 영역 외부에 있는 경우 사용할 수 있습니다(즉, 손상이 O-링에 의해 정의된 영역 외부에 있는 경우). (C) E-칩 표면의 잔류물. 이러한 잔류물이 세척 과정을 반복한 후 방치되지 않는 경우(섹션 4.1 참조), E 칩을 사용하지 마십시오. (D ~ F) 손상된 SiN 창 (사용할 수없는 전자 칩). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: TEM 홀더내의 액체 셀의 적재의 단계별 공정사진. (A) 샘플 홀더만. (B) 개스킷 O 링을 캐비티에 넣습니다. (C) 개스킷 O 링에 작은 전자 칩을 삽입합니다. (D) 작은 E 칩에 한 방울의 용액을 넣습니다. (E) 큰 E 칩을 작은 전자 칩 위에 놓습니다. (F) 뚜껑을 나사로 밀봉하여 전체 액체 셀을 밀봉합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 액체 셀의 온도를 제어하는 가열 소프트웨어의 스크린 샷. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 금 나노 입자의 성장의 낮은 배율 STEM HAADF 이미지 시리즈. (A) 85°C에서 25°C(B)에서. 해당 시간은 각 이미지의 왼쪽 하단 모서리에 표시됩니다. 2D 나노 구조는 빨간색 화살표로 표시됩니다. 모든 이미지는 동일한 전자 용량 율3.4전자·-1·nm-2로 획득된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 단일 나노 입자의 STEM 나노 절전. (A) 확산 나노 입자를 선택하는 데 사용되는 STEM 이미지(회절 획득 시 프로브의 위치는 빨간색 화살표로 표시됩니다). (B,C) 선택된 두 나노입자의 회절 패턴. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 피지를 사용하여 STEM HAADF 이미지의 데이터 처리 및 분석. 이미지는 성장 시작 후 40초 후에 수집되었습니다. (A ~ C) 85°C에서 획득한 이미지(D ~G) 이미지(A,D) 원시 STEM 이미지. (B,E) 처리된 이미지(중앙값 필터). (C,F) 바이너리 이미지입니다. (G) 픽셀의 확장이 두 번 적용되고 "채우기 구멍" 프로세스가 적용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 8: 25°C 및 85°C에서 시간의 함수로서 금 나노 입자의 수를 나타내는 그래프. 25°C의 두 곡선은 20(빨간색) 및 50(파란색) 픽셀2의최소 감지 크기(Smin)로자동으로 측정됩니다. 12초 60초 후에 측정된 녹색 점은 25°C에서 획득한 비디오에 수동으로 계산된 나노입자의 수를 나타냅니다.
도 9: 25°C 및 85°C의 시간 함수로서 금 나노입자의 평균 표면적을 나타내는 그래프. 녹색 점은 85 ° C에서 획득 한 비디오의 주어진 시간 지점에서 나노 입자의 평균 면적의 수동 측정을 나타냅니다.이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 10: 85°C에서 단일 금 나노큐브의 성장의 고배율 STEM HAADF 이미지 시리즈. 이 이미지 시리즈는 전자 투여량률 83.6-1.nm-2로인수되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
설명된 프로토콜은 온도 조절 액체 매체에서 무선 Lysis에 의해 구동되는 금 나노 입자의 핵 형성 및 성장을 가능하게 한다. 자동화된 비디오 처리와 결합하여 나노입자의 밀도, 크기, 형상 및 원자구조와 같은 나노입자 합성의 주요 파라미터에 대한 온도의 효과를 측정할 수 있습니다. 이러한 귀중한 입력을 통해 온도가 핵 형성 및 성장 속도에 미치는 영향을 평가하고 가능한 상 전환을 감지하고 콜로이드 솔루션의 최종 결과를 결정하는 패싯 공정을 시각화할 수 있습니다. 반응성 미디어의 조성을 제어할 수 있는 가능성과 함께, 온도 조절액 세포 TEM은 현실적인 합성 조건에서 다양한 나노구조의 핵형성 및 성장 과정의 직접적인 관찰을 향한 또 다른 단계이다. 이 문서에서 제시된 결과의 해석과 핵 형성 및 성장 모델과의 비교는 다른 곳에서 논의될 것입니다. 여기서는 Situ TEM 실험에서 관련성을 수행하기 위해 고려해야 하는 몇 가지 방법론적 측면을 강조하고자 합니다.
우선, 실험 결과에 큰 영향을 미칠 수 있기 때문에 반응 매체에서 전자 빔 효과를 식별하는 것이 중요하다. 여기서, 수중 방사선분해가 나노입자 형성의 원동력이기 때문에, 나노물체의 최종 형상에 영향을 미치는 전자투여량율(11,15)으로성장 속도가 급격히 증가한다. 따라서 나노입자의 핵형성 및 성장에 대한 온도의 효과를 연구하기 위해서는 동일한 전자 용량비율로 획득한 성장 실험을 비교할 필요가 있다. STEM 모드에서, 전자 투여량은 영상 크기(nm2)로나눈 빔 전류(초당 전자)에 해당한다. 따라서, 일정한 전자 투여량은 동일한 빔 전류(즉, 동일한 응축기 조리개 및 동일한 현물 크기)와 각 실험에 대해 동일한 배율을 유지하는 것을 의미한다. CCD 카메라 또는 패러데이 컵을 사용하여 이미징 조건의 빔 전류를 정량화하는 것은 데이터를 해석하고 재현하는 것이 중요합니다. 상기 배율 및 결과 투여량율은 나노입자 표면상의 우대 흡착 부위를 식별하기 위해 단일 나노입자 스케일에서 통계적으로 관련 결과를 추출하기 위해 나노입자의 대형 조립체의 성장을 시각화하고자 하는지(도10)에따라 선택되어야 한다. 핵 형성 및 성장 과정이 너무 빠르면, 특히 높은 배율에서, 작은 응축기 조리개와 작은 반점 크기는 복용량 속도를 최소화하기 위해 선택되어야 한다. 나노입자의 핵형성 및 성장은 분석된 용액에서 금속 전구체의 농도를 감소시킴으로써 속도가 느려질 수 있지만, 온도에 따라 무선 분해 제품의 농도가 증가할 것이라는 점에 유의한다. 일반적인 방식으로, 전체 샘플의 전자 조사 내역을 고려하는 것도 중요합니다. 여기서, 예를 들어, 여러 성장 실험이 서로 가까운 지역에서 급속히 수행되는 경우, 연구된 지역에서 금 전구체의 농도가 감소하기 때문에 시간이 지남에 따라 나노 입자의 밀도가 감소할 것이다. 이러한 효과는 공간과 시간 모두에서 성장 실험을 분리하고 유동 모드에서 액체 홀더를 사용하여 최소화될 수 있다.
인터페이스 추적 알고리즘은 비디오 분석을 자동화하고 대형 나노 입자 어셈블리의 핵 형성 및 성장에 대한 정량적 결과를 추출하는 데 매우 유용합니다. 그러나 이미지 비나화 단계는 항상 데이터에 특정하므로 나노입자/액체 인터페이스의 검출을 최적화하기 위해 이미지에 적용해야 하는 필터 및 데이터 처리가 실험에서 다른 실험에 따라 달라질 수 있음을 의미합니다. 또한 이러한 자동화된 분석 결과를 몇 가지 이미지에서 수행된 수동 측정과 비교하여 이미지 처리 워크플로우를 최적화하고 그 한계를 아는 것이 필수적입니다. 여기서, 예를 들어, 고온에서 형성되는 점점 더 두꺼운 3D 나노입자에서 다중 산란 이벤트는 산란된 전자의 각도 확대가 환상 검출기의 각도 범위에서 수집된 신호의 감소를 초래하기 때문에 관찰 30초 후에 그들의 코어의 대비 반전을 유도한다. 이러한 나노입자의 실제 표면적을 계속 측정하기 위해, 우리는 링 형상 대비의 내부 원을 채우는 이미지의 바이너화 후 "채우기 구멍" 데이터 프로세스를 사용하였다(도7F,G). 그러나 이러한 링 셰이프 대비가 항상 완전히 연결되어 있는지 확인하기 위해 개체의 작은 확장체를 사용해야 했습니다. 이 후자단계는 자동화된측정(도 9)에서나노입자의 평균 표면적의 약간의 과대 평가로 이어집니다. 마찬가지로, 나노입자의 검출을 위해서는 노이즈를 감지하지 않으려면 검출된 물체(Smim)의최소한의 크기를 정의해야 하지만, 이 파라미터는 측정된 핵형성 속도에 영향을 미칩니다. 도 8에서볼 수 있듯이, 검출된 나노입자의 수는 실험 초기에 증가하여 고원에 도달한다. Smin이 큰 경우(50픽셀2 1543 nm2),자동 및 수동 측정은 이 고원(60초 후 835나노입자)의 수준에 합의되었지만, 835나노입자는 12초 후에만 수동으로 계산되지만, 나중에까지 는 자동으로 검출되지 않기 때문에 나노입자의 검출이 지연되기 때문에 자동 분석에서 나노입자의 검출이 지연된다. 이 연장된 검출 시간은 핵화 속도의 과소 평가로 이끌어 냅니다. Smin을 20픽셀2(즉, 617 nm2)로감소시켜 나노입자 어셈블리의 핵화 시간에 대한 오차를 감소시킵니다만, 특히 실험의 초기단계에서 나노입자 밀도의 과대 평가로 이어져 핵형성율에도 영향을 미친다. 매우 역동적인 동작과 낮은 신호 대 노이즈 비율을 가진 나노 물체의 검출 및 크기 및 형상 측정은 다른 세분화 및 디노이징방법(24) 또는 기계 학습접근법(25)을사용하여 더욱 개선될 수 있는 액체 위상 TEM에서 일반적인 과제이다.
마지막으로, 액체 세포의 준비와 액체 홀더의 세척은 반응 매체의 오염을 피하기 위해 매우 신중하게 수행해야합니다.
일반적으로 LCTEM 분석 중에 샘플의 온도를 제어하면 고체와 액체 사이의 인터페이스에서 발생하는 화학 반응에 대한 열 효과를 조사할 수 있습니다. 따라서, 우리는 본 방법이 온도 조절 액체 매체에서 단단, 연약하거나 생물학적 물질의 역학을 드러내도록 설계된 시투 TEM 실험에서 다른 쪽으로 길을 열어 줄 수 있기를 바랍니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 감사하게 지역 일 드 프랑스 (파리 대학에 설치된 JEOL ARM 200 F 전자 현미경에 대한 협약 SESAME E1845), 라텍스 SEAM (GLOIRE 프로젝트) 및 CNRS (Defi Nano 프로그램)의 재정 지원을 인정합니다. 우리는 마들린 듀크와 다니엘 프랑크가 그림 1과 2에서 볼 수있는 액체 세포의 회로도와 광학 사진을 공유해 주셔서 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Plus electron microscope | Jeol | ||
| Acetone | Merck | ||
| Air pistol | |||
| ARM 200F electron microscope | Jeol | ||
| Binoculars or optical microscope | |||
| Carbon tipped tweezers | |||
| Computer with heating software | Software by Protochips | ||
| Distlilled water | |||
| Dummy e-chips | Protochips | ||
| Gasket/O-rings | Protochips | ||
| Gold aqueous solution | Merck | 1 mM of HAuCl4 - Prepared beforehand | |
| Large liquid heating E-chip | Protochips | ||
| Methanol | Merck | ||
| One View camera | Gatan | ||
| Petri dish | Number : 2 | ||
| Plasma cleaner | Gatan | ||
| Poseidon Select | Protochips | Liquid cell holder | |
| Power supply Keithley 2450 | |||
| Protective gloves | |||
| Red PEEK tubing | Number : 3 | ||
| Screwdriver with torque | |||
| Small liquid E-chip | Protochips | 150 nm spacers | |
| STEM HAADF detector | Jeol | ||
| STEMx software | Gatan | ||
| Syringe | Number : 2 | ||
| Syringe pump | Harvard apparatus | Number : 2 | |
| Vacuum pump | Gatan |
References
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