Summary
Этот протокол описывает количественную оценку объемных церебральных гемодинамических вариаций в мозге мыши с использованием функционального ультразвука (fUS). Процедуры для 3D-карты функциональной активации после сенсорной стимуляции, а также функциональной связности состояния покоя приведены в качестве иллюстративных примеров у анестезирующих и бодрствующих мышей.
Abstract
Функциональная ультразвуковая визуализация (fUS) - это новый метод визуализации мозга, который опирается на высокочувствительную меру объема мозговой крови, достигаемую с помощью сверхбыстрой допплерографии. Поскольку перфузия мозга тесно связана с локальной нейронной активностью, этот метод позволяет 3D-картировать весь мозг региональной активации, вызванной задачей, а также функциональную связь в состоянии покоя, неинвазивно, с непревзойденным пространственно-временным разрешением и простотой работы. По сравнению с фМРТ (функциональная магнитно-резонансная томография), основное преимущество fUS-визуализации заключается в обеспечении полной совместимости с экспериментами на животных. Кроме того, картирование мозга фМРТ у мышей, наиболее используемая доклиническая модель в неврологии, остается технически сложной из-за небольшого размера мозга и трудности поддержания стабильных физиологических условий. Здесь мы представляем простой, надежный и надежный протокол для визуализации fUS всего мозга у анестезированных и бодрствующих мышей с использованием готовой коммерческой системы fUS с моторизованным линейным преобразователем, что дает значительную кортикальную активацию после сенсорной стимуляции, а также воспроизводимую 3D-функциональную схему подключения для идентификации сети.
Introduction
За последние два десятилетия нейровизуализация стала важным инструментом для изучения функции и организации мозга, что позволяет исследователям делать важные открытия в области нейробиологии. Сегодня функциональная магнитно-резонансная томография (фМРТ) стала золотым стандартом клинической нейровизуализации для оценки активации мозга, вызванной вызовом или лекарственными средствами, и для отображения функциональной связности в состоянии покоя. В то время как фМРТ человека обладает высокой надежностью и чувствительностью, фМРТ мыши остается технически сложной по многим причинам1. Во-первых, фМРТ имеет плохое пространственное и временное разрешение. Небольшой размер мозга мыши требует использования сильных магнитных полей с использованием дорогостоящих сканеров для достижения разумного пространственного разрешения. Во-вторых, поддержание стабильных физиологических параметров в узком диапазоне, позволяющем эффективную нейроваскулярную связь, очень сложно у анестезирующих мышей. Наконец, сигнал, зависящий от уровня кислорода в крови (BOLD), на который опираются исследования фМРТ, имеет относительно низкую чувствительность, что приводит к низкому соотношению сигнал/шум при применении к мышам и часто требует повторного представления стимула в течение длительного сбора для обнаружения небольших вариаций. Поскольку мышь является наиболее широко используемой моделью на животных в биомедицинских доклинических исследованиях, эти ограничения частично ответственны за трансляционный разрыв в нейропсихиатрии, препятствуя переносу новых перспективных терапевтических целей на стенде в эффективные методы лечения у постели.
Функциональное ультразвуковое исследование (fUS) - это недавно разработанная техника нейровизуализации, основанная на сверхбыстрой допплере2. Непосредственно отбирая объем мозговой крови, этот метод позволяет профилактически прощать активность мозга в режиме реального времени через нейрососудистую связь. По сравнению с другими методами нейровизуализации, fUS дает пространственное разрешение 100 мкм и временное разрешение в десятки миллисекунд. Этот метод позволяет визуализирование всего мозга полных коронарных участков мозга мыши, полностью неинвазивно. Кроме того, он полностью совместим с сознательными и веющими себя животными3,4,5. Одним из основных ограничений тока fUS является его 2D-функция, позволяющая одновременно записывать одну корональный плоскость. В то время как объемный 3D-fUS с использованием 2D-матрицы датчиков уже был успешно продемонстрирован на крысах6 и подтвержден на мышах7,его текущее отсутствие чувствительности требует полной треканиотомии, а также усреднения важного числа испытаний для обнаружения небольшого изменения активности. Альтернативно, линейные преобразователи могут быть шагнули через несколько положений и выполнять функциональную визуализацию плоскость за плоскостью, чтобы охватить весь мозг. Однако этот метод требует многочисленных экспериментальных повторений парадигм и как такового длительного времени приобретения (3-4 часа для мозга мыши)8,9.
В настоящей работе мы описываем надежную экспериментальную платформу, включавшую коммерчески доступный функциональный ультразвуковой сканер и линейный преобразователь с быстрым плоским переключением с процедурами получения 3D-данных fUS у анестезированных и бодрствующих мышей, что позволяет осуществлять объемное и транскраниальное функциональное картирование мозга мыши, неинвазивно, без контрастного агента и в течение короткого времени сбора. Мы иллюстрируем эту особенность, отображая активацию соматосенсорной коры после стимуляции усов, а также функциональную связность состояния покоя. Помимо подготовки животных и сбора данных, мы также описываем процедуру визуализации, регистрации атласа и анализа сигналов fUS в режиме реального времени.
Protocol
Все процедуры, представленные здесь, были выполнены в соответствии с Директивой Совета Европейского сообщества от 22 сентября 2010 года (010/63/UE) и нашим местным комитетом по этике (Comité d'éthique en matière d'expérimentation animale No 59, «Paris Centre et Sud», проект No 2017-23). Взрослые мыши (самцы C57BL/6 Rj, возраст 2-3 месяца, 20-30 г, из Janvier Labs, Франция) размещались по 4 в клетке с 12-часовым циклом света/темноты, постоянной температурой при 22 °C и пищей и водой ad libitum. Перед началом экспериментов животным дается недельный минимальный период акклиматизации к условиям содержания.
1. Подготовка животных к анестезированной визуализации fUS
- Анестезия
- Взвесьте мышь.
- Приготовьте смесь кетамина и ксилазина в 10 мг/мл и 2 мг/мл соответственно в стерильном физиологическом растворе. Вводят 0,2 мл раствора кетамина/ксилазина внутрибрюшинно с помощью иглы 26 калибра и 1 мл одноразового шприца. Через несколько минут поместите животное на стереотаксическую рамку, убедившись, что голова плоская.
- Вводят второй объем анестетиков для достижения общей дозы 100 мг/кг кетамина и 20 мг/кг ксилазина (с учетом начальной дозы).
ПРИМЕЧАНИЕ: Анестезия должна длиться в течение 1 ч. Для поддержания устойчивой сакдации в течение более длительного времени вводят 0,05 мл смеси кетамин/ксилазин каждые 30 мин внутрибрюшинно.
-
Подготовка животных к сеансу анестезированной визуализации
- Нанесите немного глазной мази (например, Ocry-Gel) на глаза мыши, чтобы избежать образования катаракты во время сеанса визуализации. Побрейте головку мыши с помощью триммера. Нанесите крем для депиляции и смойте через пару минут. Повторяйте до тех пор, пока волосы не будут полностью удалены.
- Вставьте подкожные штифты в конечности для записи электрокардиограммы (ЭКГ). Поместите центрифугированный ультразвуковой гель (1500 об/мин, 5 мин) на голову.
- Контролировать глубину анестезии в течение всей продолжительности экспериментов (включая индукцию анестезии). Поддерживайте температуру животных на уровне 37 °C с помощью нагревательного одеяла, подключенного к ректальному зонду.
- Контролируют следующие физиологические параметры, есть косвенные показатели глубины анестезии: Частота сердечных сокращений (220-250 ударов в минуту - контролируется через электрокардиограмму тонкими электродами, имплантируемыми подкожно), и частота дыхания (130-140 вдохов в минуту - контролируется с помощью спирометра, подключенного к системе сбора ЭКГ).
ПРИМЕЧАНИЕ: Описание экспериментальной установки показано на рисунке 1.
Рисунок 1:Экспериментальная установка для экспериментов с анестезированными fUS. Описание экспериментальной установки, показывающей все научное оборудование, необходимое во время анестезированного эксперимента. 1. Физиологический мониторинг: живое отображение как дыхательных, так и сердечных частот. 2. Четырехосевой двигательный модуль (три трансляции и один поворот), контролируемый системой Iconeus One(9)и позволяющий выполнять транскраниальные 3D томографические сканирования или 4D-захваты. 3а. Серводвигатель, приводящий в движение стимулятор усов (3b.) Серводвигатель управляется картой arduino uno, которая сопряжена с системой Iconeus One(9)для синхронизации паттернов стимуляции с последовательностями изображений. 4.а. Контроллер шприцевого насоса. 4.b. Держатель шприца. 5.а. Монитор температуры пластины, контролирующий нагревательную пластину. 5.b. Нагревательная пластина и ректальный термометр сопряжены с температурной пластиноймонитора (5.a.). 6. Ультразвуковой гель помещается между головой животного и ультразвуковым зондом, обеспечивая акустическую связь между ними. 7. Ультразвуковой зонд 15 МГц. 8. Держатель зонда, связывающий зонд(7)с модулем двигателя(2). 9. Оборудование и программное обеспечение Iconeus One, позволяющее программировать различные последовательности визуализации и управлять модулями двигателей(2),приводящими в движение зонд(7). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
2. Подготовка животных к экспериментам с бодрствующими фиксированной головой мышей
- Хирургия головной пластины
- Поместите обезболенное животное (шаги 1.1-1.2) в стереотаксическую рамку на грелку (37 °C). Нанесите защитный гель для глаз и вводят лидокаин s.c. (0,2 мл, 2 %) под кожу головы с помощью иглы 26-го калибра и подождите несколько минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Контролируйте уровень анестезии каждые 10-30 мин по реакции (отсутствию) на твердое защемление носа. - Выполните разрез после сагиттального шва от затылочной кости до начала носовой кости. Используя хирургические ножницы, иссежируйте кожу над обоими полушариями.
- Очистите череп 1% раствором йода и удалите оставшуюся часть подеозгов. Используя головную панель в качестве шаблона, просверлите два отверстия (диаметром 1 мм) в черепе, чтобы расположить анкерные винты.
ВНИМАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не просверлить полностью череп, чтобы избежать каких-либо повреждений мозга или воспаления твердой мозговой оболочки - Расположите головную панель с помощью винтов. Используйте зубной цемент для фиксации винтов и головной пластины спереди и сзади рамы, чтобы сохранить хорошее сцепление имплантата.
ВНИМАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не наносить цемент внутри окна рамы, так как это значительно снижает качество сигнала. Накройте череп тонким слоем хирургического клея, чтобы защитить кость и запечатать раны на боковой стороне окна визуализации. - Удалите животное из стереотаксического каркаса после высыхания цемента и отмените анестезию путем подкожной инъекции атипамезола в 1 мг / кг. Профилактическое введение мелоксикама (5 мг/кг/сут, с.c.) проводится при послеоперационных болях.
- Поместите животное в клетку восстановления на грелку (37 °C). Мышь может вернуть свою домашнюю клетку с однопометниками в течение нескольких часов. Поместите магнитный 3D-печатный колпачок (материал полиактовой кислоты с магнитными вставками) над головной панелью для защиты(рисунок 2A). Оставьте мышь восстанавливаться за 4-6 дней до начала привыкания к подвижной домашней клетке (MHC).
ПРИМЕЧАНИЕ: Общий вес колпачка и головной панели составляет 2,8 г.
- Поместите обезболенное животное (шаги 1.1-1.2) в стереотаксическую рамку на грелку (37 °C). Нанесите защитный гель для глаз и вводят лидокаин s.c. (0,2 мл, 2 %) под кожу головы с помощью иглы 26-го калибра и подождите несколько минут.
- Обращение и привыкание
- На 1 день после выздоровления (ПР) осторожно держите мышь в руке по 5-10 мин несколько раз в день.
- На 2-й день PR повторите обработку, как и в 1-й день, и оставьте животное на 5-10 минут, свободно исследуя MHC.
ПРИМЕЧАНИЕ: Воспроизведение фоновой музыки в комнате может помочь уменьшить стресс животного. - На 3 день PR дайте животному свободно исследовать MHC в течение 5-10 минут. После этого осторожно возьмите головную пластину и аккуратно поместите ее в зажим, вручную перемещая карбоновую клетку, чтобы сопровождать мышь. Приумоть животное в фиксированном положении головы в течение 5-10 мин. Очистите MHC в перерывах между тренировками 70% раствором этанола и промойте водопроводной водой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что MHC получает достаточный поток воздуха, как рекомендовано производителем. Высота головного зажима должна быть отрегулирована вручную, чтобы обеспечить удобное положение. - На 4 и 5 день ПР многократно зажимают мышь MHC и постепенно увеличивают время закрепления головы, начиная с 5 мин и до 30 мин. Нанесите немного физиологического раствора и ультразвукового геля на окно визуализации, чтобы привыкнуть.
- На 6-й день PR повторите протокол с 4/5 PR и расположите зонд над головой животного после шага 3.1.
- В день эксперимента действуйте так, как описано выше. Затем увлажните окно визуализации физиологическим раствором и нанесите ультразвуковой гель. Начните слежение за животным и перейдите к позиционированию зонда (см. ниже).
ПРИМЕЧАНИЕ: Зажим в MHC также может быть выполнен путем заворачивания мыши в тряпку. В этом случае мышей необходимо приужить к процедуре обертывания перед фиксацией головы. Описание полной экспериментальной установки для визуализации бодрствования приведено на рисунке 2B.
Рисунок 2:Экспериментальная настройка для экспериментов с fUS в состоянии бодрствования. A. Схематическая иллюстрация магнитной крышки головной панели, защищающая окно визуализации (создана с помощью BioRender.com). Во время сеансов визуализации (слева) крышка снимается для сканирования мозга в большой диафрагме, предлагаемой головной пластиной. В. Фотография экспериментальной установки для транскраниальной визуализации бодрствования у свободно ведющих себя мышей с фиксированной головой. 1. Система и программное обеспечение Iconeus One, позволяющее настраивать различные последовательности визуализации и управлять модулем двигателей. 2. Четырехосевой модуль двигателей (три трансляции и один поворот), контролируемый системой Iconeus One(1)и позволяющий проводить 3D-томографическое сканирование или 4D-захваты. 3. Воздухораздаточный стол. 4. Мобильная домашняя клетка (MHC). 5а,5б. Фотографии, показывающие более близкие виды окружающей среды животного внутри MHC. 6. Система фиксации головки, зажимающая головную пластину. 7. Держатель зонда, связывающий зонд с модулем двигателя (2). 8. 15 МГц ультразвуковой зонд. 9. Ультразвуковой гель помещается между головкой мыши и ультразвуковым зондом, обеспечивая акустическую связь между ними. 10. Сервомотор, приводящий в движение стимулятор усов. Серводвигатель управляется картой Arduino Uno, которая взаимодействует с системой Iconeus One через сигнал TTL (1) для синхронизации паттернов стимуляции с последовательностями изображений. С. Иллюстрация различных возможностей пространственной выборки (созданная с помощью BioRender.com): в каждом случае зонд шагирует от первого положения к последнему, и в каждом положении записывается доплеровская картинка для реконструкции сложенного объема. Этот процесс непрерывно повторяется в течение всего времени приобретения. Плотное сканирование (слева): шаг между срезами должен быть достаточно мал (обычно 400 мкм, что соответствует разрешению высоты), чтобы обеспечить объемную визуализацию. Разреженное сканирование (справа): если удаленные функциональные области нацелены (в разных положениях), также можно уменьшить пространственную выборку для изображения различных срезов, которые пересекают эти области, не ставя под угрозу временную выборку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
3. Позиционирование зонда
- Запустите программное обеспечение (например, IcoScan) и создайте сеанс эксперимента. Перейдите в меню Move Probe, чтобы настроить положение ультразвукового зонда с помощью навигационной клавиатуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Зонд должен расположен примерно на 1 мм выше головы животного. Крайне важно убедиться, что зонд находится в контакте с ультразвуковым гелем перед началом любой последовательности визуализации. - Запустите сбор Live View и при необходимости отрегулируйте положение зонда с помощью визуализации CBV животного в реальном времени (объем мозговой крови). Выровняют мозг в центре изображения. Оптимизируйте параметры изображения, чтобы получить самое высокое отношение сигнал/шум.
ПРИМЕЧАНИЕ: В экспериментах с бодрствующими мышами размер диафрагмы должен быть уменьшен, чтобы избежать артефактов, вызванных сокращением боковых мышц.
4. Регистрация ангиографического сканирования и атласа
- Откройте опцию Angio 3D в программном обеспечении для приобретения. На предустановленной панели отрегулируйте параметры сканирования (первый срез, последний срез и размер шага), чтобы сканировать весь мозг(рисунок 3A,B),и начните сбор.
ПРИМЕЧАНИЕ: При настройке параметров сканирования убедитесь, что сканирование будет охватывать заднюю часть мозга - Оставьте программное обеспечение для сбора данных открытым и запустите программное обеспечение для анализа и визуализации данных (например, IcoStudio) и загрузите 3D-сканирование angio. Перемещайтесь по объему сбора с помощью панели 3 видов и выберите направление корональной сканации:передне-заднее или задне-переднее.
- Перейдите на панель регистрации мозга. Загрузите шаблон ссылки на мышь, который потребуется для процесса регистрации. Зарегистрируйте сканирование на Allen Mouse Common Coordinates Framework, используя полностью автоматический или ручной режимы регистрации(рисунок 3C).
- Проверьте результат, посмотрев на суперпозицию 3D-сканирования ангио и эталонный шаблон или посмотрев на суперпозицию сканирования и справочного атласа Аллена с помощью панели Atlas Manager (рисунок 3D). Сохраните регистрацию в виде BPS-файла.
ПРИМЕЧАНИЕ: Регистрационный файл может быть повторно исполним для любого другого приобретения, выполненного во время того же сеанса эксперимента.
5. Система позиционирования мозга (BPS)
- В программном обеспечении IcoStudio убедитесь, что ангиографическое сканирование и его файл .bps (созданный на шаге 4.4)загружены.
- Перейдите на панель навигации мозга. На панели Atlas Manager перемещайтесь по атласу мозга Аллена с помощью навигатора родительского/дочернего дерева. Найдите анатомические целевые области и выберите их, чтобы наложить их на сканирование в 3-х представлениях.
- Визуализируйте целевые области на панели с 3 представлениями и выберите плоскость изображения, которая перекрывает целевые области для эксперимента. Для этого вручную установите два маркера на корональной позиции, которая включает в себя интересующие области.
- Нажмите на Систему позиционирования мозга (BPS), чтобы извлечь полученные координаты двигателя. Эти координаты соответствуют положению зонда, что позволяет получить изображение целевой плоскости. Проверьте предварительный просмотр изображения, которое вычисляется из ангиоскан.
- В программном обеспечении IcoScan войдите в панель позиционирования зонда и нажмите «Ввести координаты BPS». Примените координаты, приведенные на шаге 5.4. Зонд перемещается и выравнивается на целевой плоскости изображения.
- Выполните получение изображения в реальном времени и убедитесь, что текущая плоскость изображения соответствует прогнозу, приведенному в шаге 5.4.
ПРИМЕЧАНИЕ: Также можно выбрать парасагиттальные/неортогональные плоскости.
Рисунок 3:Быстрое транскраниальное ангиографическое сканирование и регистрация мозга для точного позиционирования зонда. A. Схематическое изображение мозга мыши, сканируемого транскраниально ультразвуковым зондом от первого коронального среза (зеленый) до последнего коронального среза (синий) во время быстрого ангиографического сканирования. Текущий изображенный срез (представленный красным цветом) шаг за шагом перемещается от задней (зеленой) к передней (синей) части мозга. Создано с помощью BioRender.com B. Скриншот программного обеспечения для сбора данных IcoScan на панели Angio 3D. Предустановленные параметры справа настраивают быстрое сканирование. Положения в мм первого среза, последнего среза и размер шага должны быть хорошо подобраны для линейного сканирования всего мозга. С. Снимок экрана: программное обеспечение для обработки IcoStudio. Быстрое 3D-сканирование Angio автоматически регистрируется в эталонном шаблоне мозга мыши. Три вида (слева) показывают суперпозицию сосудистой системы и атласа мозга мыши Аллена в корональном, сагиттальном и осевом видах. Д. Линейная планировка (монтаж) 16 срезов (из 31) из 3D-ангиоскантуры, с зарегистрированным эталонным атласом Аллена, наложенным на сосудистую систему. Э. Снимок экрана панели Brain Navigation, показывающей прогнозируемую плоскость визуализации, соответствующую двигательным координатам, вычисленным программным обеспечением благодаря двум маркерам, размещенным в центре левой и правой первичной соматосенсорной коры, области полей ствола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
6. Эксперимент, вызванный задачей: стимуляция усов
- Предопределите последовательность стимуляции, включая время стимуляции, время интерстимуляции и количество повторений.
- Запустите последовательность 3D fUS, определив общее время приобретения, количество позиций, а также мертвое время между позициями. В случае автоматической стимуляции, синхронизированной с системой сбора через TTL-вход, выберите опцию Trig-IN перед началом приобретения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для результатов, представленных в этой работе, стимуляция проводилась с использованием ватного тампона, расположенного таким образом, чтобы обеспечить отклонение большинства усов в дорсальном/вентральном направлении. Он был закреплен на серводвигателье, приводимом в действие картой Arduino UNO, подключенной к системе Iconeus One для обеспечения синхронизации. Рекомендуемые параметры для стимуляции: 30 с ВКЛ, 30 с ВЫКЛ, амплитуда 20° и частота 4 Гц. Альтернативно, стимуляция также может быть доставлена вручную путем отклонения усов в определенное время во время приобретения. - Откройте приобретение в программном обеспечении IcoStudio и войдите в меню Карта активации. Заполните поле шаблона активации временами начала и окончания и вычислите карту активации. Настройте параметры отображения для визуализации. Экспортируйте карту активации в виде файла .h5 для анализа в режиме off-line.
ПРИМЕЧАНИЕ: Активация оценивается с использованием подхода обобщенной линейной модели (GLM) со стимулом, вызванным гемодинамическим ответом мыши по умолчанию (HRF). Альтернативно, активация может быть визуализирована непосредственно путем оценки корреляции Пирсона между паттерном стимуляции и гемодинамическим сигналом от каждого вокселя.
7. Функциональные возможности подключения 4D
- Запустите последовательность 3D fUS, определив общее время захвата, количество позиций плоскости изображения, а также мертвое время между позициями.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для функциональной 4D-связи мы рекомендуем время захвата между каждым объемом < 2,5 с (частота дискретизации не менее 0,4 Гц) и общее время съемки не менее 10 мин (количество точек времени > 180). - Сохраните приобретение и загрузите его в программное обеспечение IcoStudio. При необходимости загрузите файл .bps и структуру координат мозга мыши Аллена. В менеджере Атласавыберите регионы атласа в качестве регионов, представляющих интерес (ROI).
- Войдите в меню «Функциональные подключения» и выберите нужные регионы в менеджере ROI. Визуализируйте результаты в виде матрицы связности (контролируемый анализ) или корреляционной карты на основе семян (без присмотра). Выберите и настройте фильтры полосы пропускания по желанию и экспортируйте результаты корреляции для статистического анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: В режиме 3D fUS визуализации относительные положения зонда устанавливаются вручную. Следовательно, возможны два типа сканирования, которые могут быть выбраны в зависимости от функционального приложения: плотное сканирование против разреженного сканирования(рисунок 2C).
Representative Results
Этот протокол описывает 3D-количественную оценку церебральных гемодинамических изменений транскраниально в мозге мыши, в состоянии покоя или в ответ на сенсорную стимуляцию. Стимуляция усов, стандартная парадигма для отображения функциональной активации мозга у грызунов, была выбрана в качестве примера сенсорной стимуляции, вызванной реакцией. На рисунке 4 показана репрезентативная карта активации в ответ на механическую стимуляцию усов у анестезированной мыши, полученная с помощью транскраниальной визуализации fUS. Общее время испытания составило 760 с, с исходным уровнем 60 с (до и после стимуляции), стимуляцией 80 с и временем восстановления 60 с, повторено 5 раз. Значительная активация определялась с разрешением общей линейной модели (GLM) с использованием функции гемодинамического отклика мыши по умолчанию (HRF). Активированные области (оценки Z с p-значением >0,0000006 после строгой коррекции Бонферрони для многократного сравнения) отображаются в виде значений цветовой кодировки, наложенных на шаблон общей координатной рамки Аллена. Воксель-мудрый временной ход контралатеральной первичной соматосенсорной коры, области бочкового поля (S1BF) выявил увеличение CBV на 15-20% по сравнению с исходным уровнем.
Рисунок 4:Карты транскраниальной активации и временной курс rCBV после стимуляции усов у мышей, обезболенной кетамином/ксилазином. A. Карта активации, показывающая значительно активированные воксели после механической стимуляции правых усов (80 с ON, 60 s OFF,5x) под кетаминовой/ксилазиновой анестезией. Карты были получены путем вычисления Z-баллов на основе анализа общей линейной модели (GLM) с поправкой Бонферрони для многократного сравнения. Z-баллы (с цветовой кодировкой) накладываются на 3D-шаблон мозга Аллена (после регистрации в системе позиционирования мозга) и отображаются в трех видах: корональном (слева), сагиттальном (посередине) и осевом (справа). Анатомические области из общей координатной структуры мозга мыши Аллена отображаются для справки. Активированные вокселы хорошо расположены внутри левой коры S1BF. Шкала: 1 мм. Каждый объем образца сканировали более 2,8 мм (что соответствует 7 срезам в направлении возвышения) за 3,85 с, что позволяло записывать 20 объемных образцов во время каждого функционального ответа. B. 3D-рендеринг увеличения относительного объема мозговой крови (rCBV), вызванного стимуляцией усов, по сравнению с исходным уровнем. Анатомическое очертания S1BF обозначено синим цветом. С. Временной ход вариаций CBV в левом S1BF (синий) и соответствующего применяемого стимула (красный). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Та же парадигма была применена к голове неподвижной мыши в мобильной домашней коляске с использованием предустановки бодрствования IcoScan. На рисунке 5 представлена карта активации после эксперимента по стимуляции нескольких усов с использованием экспериментальной установки, описанной на рисунке 2. Несколько задних и каудальных усов стимулировали следующим образом: 30 с исходного уровня, за которым последовали пять последовательных испытаний 30 с ON (4 Гц) и 30 s OFF(рисунок 5C). Стимуляция проводилась с помощью серводвигателя, приводимого в действие картой Arduino UNO, запускающей последовательность получения изображения для синхронизации. Значительная активация определялась с разрешением общей линейной модели (GLM) с использованием функции гемодинамического отклика мыши по умолчанию (HRF). Многократная коррекция сравнения проводилась методом Бонферрони. Обычный альфа-уровень 0,05 был нормализован общим количеством вокселей в объеме приобретения, в результате чего был установлен окончательный строгий порог 0,000003.
Рисунок 5:Карты активации и временной курс rCBV после стимуляции усов у бодрствующей мыши. A. Карта активации, показывающая значительно активированные воксели после механической стимуляции правых усов (30 с ON, 30 s OFF, 5x) в бодрствующей мыши в мобильной домашней колпакете. Карты были получены путем вычисления Z-баллов на основе анализа общей линейной модели (GLM) с поправкой Бонферрони для многократного сравнения (нормализация по общему числу вокселей). Z-баллы (с цветовой кодировкой) накладываются на 3D-шаблон мозга Аллена (после регистрации в системе позиционирования мозга) и отображаются в трех видах: корональном (слева), сагиттальном (посередине) и осевом (справа). Анатомические области из общей координатной структуры мозга мыши Аллена отображаются для справки. Активированные вокселы хорошо расположены внутри левой коры S1BF. Весы стержни, 1 мм. Каждый объем образца сканировали более 1,6 мм (что соответствует 3 срезам в направлении возвышения) за 3,85 с, что позволяло регистрировать 17 объемных образцов во время каждого функционального ответа. B. 3D-рендеринг увеличения относительного объема мозговой крови (rCBV), вызванного стимуляцией усов, по сравнению с исходным уровнем. Анатомическое очертания S1BF обозначено синим цветом. С. Иллюстрация мыши в подвижной домашней колпакете во время эксперимента по стимуляции правого усов, в ходе которого было проведено пять испытаний по 30 с при общем времени приобретения 330 с. д. Мгновенный относительный курс времени CBV извлекается внутри активированной области (синий), с наложенным соответствующим стимулом (красный). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
На рисунке 6 показаны временные корреляции нормализованных низкочастотных (<0,2 Гц) спонтанных флуктуаций CBV между 3D-областями мозга (идентифицированными с момента регистрации в общей координатной структуре Аллена) у мыши, обезболенной кетамином-ксилазином. Общее время захвата составило 20 мин (1200 с). Анализ под наблюдением Атласа выявил сильные межполушарные паттерны связности, в результате чего значения коэффициента корреляции выросли до 0,8. Анализ на основе семян в дорсальном гиппокампе показал значительную межполушарную связь между правым и левым гиппокампом, а также глубокими ретро-гиппокампальными областями и грушевидной корой. Посевная область, выбранная в S1BF, также привела к симметричной (кортико-кортикальной) корреляционной картине, как описано ранее.
Рисунок 6:Транскраниальная объемная функциональная связность мозга мыши под кетаминовой/ксилазиновой анестезией, оцениваемая при 20-минутном приобретении 3D fUS. A. Корреляционная матрица на основе 3D-областей общей координатной структуры Аллена, зарегистрированной на транскраниальном функциональном приобретении. Матрица получена путем вычисления нормализованной Пирсона корреляции спонтанных низкочастотных флуктуаций (<0,1 Гц) средних временных сигналов от всех вокселей, включенных в каждый идентифицированный ROI после коррекции тайминга среза. Каждый отобранный объем сканировали более 1,6 мм в направлении возвышения (соответствующем 4 срезам), полученному более 2,2 с. Б. Анализ на основе семян, проецируемый на 3D-шаблон. Семя отбирали в пределах правого дорсального гиппокампа при β — 2,1 мм. Корреляционная карта получена путем вычисления коэффициента корреляции Пирсона между временными сигналами семени и каждым вокселем всего приобретения после коррекции времени среза. C. 3D корреляционная карта, основанная на анализе семян с областью семян, выбранной в пределах S1BF при β - 2,1 мм. Шкала: 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Discussion
Методы визуализации всего мозга являются важнейшими инструментами для лучшего понимания физиологии и патологии мозга. Метод, описанный здесь, позволяет точно количественно определять гемодинамические сигналы в живом мозге непосредственно на скамейке запасных. Непревзойденная чувствительность и пространственно-временное разрешение функционального ультразвука особенно хорошо подходят для физиологии мыши. Функциональные ответы и сети состояния покоя могут быть отображены в течение короткого времени сбора, продольно и без необходимости усреднять испытания или субъектов для получения надежной меры. Соответствующая комбинация высокочувствительных ультразвуковых линейных зондов и быстрых моторизованных установок позволяет выполнять транскраниальную объемную fUS-визуализацию на мышах в разумные сроки приобретения. Этот протокол может быть выполнен как на анестезированных, так и на бодрствующих мышах с использованием мобильной домашней клетки.
Стимуляция усов, сенсорный стимул, используемый в качестве иллюстраторного примера в этой рукописи, является стандартной парадигмой функциональной активации у грызунов и надежным считыванием для изучения сенсорной обработки, нейрососудистой связи и их изменений5,6,10,11. В то время как грубая ручная чистка усов может быть предпочтительной из-за простоты использования, этому методу не хватает пространственной и временной точности. Использование автоматического стимулятора, такого как описанный здесь, запускаемый сканером изображения fUS, позволяет лучше контролировать несколько параметров, включая время начала, смещение амплитуды, частоту, а также угол Q-наконечника / гребня, что приводит к лучшей воспроизводимости между животными. Кроме того, более точное время стимуляции позволяет моделировать функцию гемодинамического ответа (HRF) путем определения времени до начала и времени до пиковых параметров12,13. Чтобы обеспечить лучшую точность количества усов, отклоненных во время стимуляции (и, следовательно, области активированной области), более сложные стимуляторы могут быть адаптированы к этому протоколу. Многие другие стимулы, такие как свет8,звук14 или представление запаха15, могут быть реализованы с использованием того же протокола.
Совместимость функционального ультразвука с бодрствующими и веющими себя животными является важным преимуществом по сравнению с другими методами нейровизуализации, позволяющими картировать функциональную активацию без смещения анестезии. Использование мобильной домашней колясы с воздушным подъемом является хорошей альтернативой другим существующим головным аппаратам, таким как линейные или сферические беговые дорожки. Будучи прочно зафиксированным головой, движение домашней камеры дает мыши иллюзию навигации по окружающей среде, позволяя сочетать широкий спектр поведенческих тестов с изображениями fUS16. Тем не менее, процедура привыкания к фиксации головы представляет собой важный шаг для снижения стресса, особенно для экспериментов, где его можно считать мешающим фактором. Процедура, описанная здесь (6-дневная обработка и привыкание к фиксации головы), дает надежные результаты для сенсорной стимуляции и функциональной связности состояния покоя. Тем не менее, возможно, потребуется продлить период привыкания для более совершенных поведенческих тестов17.
Disclosures
Джереми Феррье и Бруно-Феликс Османски являются сотрудниками Iconeus. Томас Деффье, Жолт Ленкей, Бруно-Феликс Османски и Микаэль Тантер являются соучредителями и акционерами Iconeus.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Расширенным грантом Европейского исследовательского совета (ERC) No 339244-FUSIMAGINE, Национальным агентством по финансированию исследований «Pinch» (ANR-18-CE37-005), Ускорителем исследовательских технологий Inserm в биомедицинском ультразвуке, техническим ядром ElfUS IPNP, Inserm U1266, европейской исследовательской программой FUSIMICE проекта «Человеческий мозг» и краткосрочной стипендией EMBO 8439 андреа Кливер.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Plastipak 1 mL syringes | Dutscher, France | 303172 | |
| BD Microlance 26 Gauge needles | Dutscher, France | 303800 | |
| Animal Temperature Controller (heating Plate coupled with a rectal probe) | Physitemp | TCAT-2DF | |
| Arduino | Arduino | Arduino Uno-Rev3 | |
| Atipamezole | Orion Pharma, France | Antisedan® | 5 mg/ml injectable solution |
| Dental Ciment | Sun Médical, Shiga, japan | Superbond C&B | |
| Depilatory cream | Klorane | N/A | |
| Eye Ointment | TVM, UK | Ocry-gel | |
| Hair trimmer | Wella Profesionnals | N/A | |
| Head plates | Neurotar, Finland | Model 14 | |
| Iconeus One standard package for fUS | Iconeus, France | Iconeus One | |
| IcoScan acquisition software (v1.0) | Iconeus, France | IcoScan | |
| IcoStudio analysis software (v1.0) | Iconeus, France | IcoStudio | |
| Isoflurane Anesthesia station | Minerve, Esternay, France | ||
| Ketamine | Virbac, France | Ketamine1000 | 100 mg/ml injectable solution |
| Lidocaine | Vetoquinol | Lurocaine® | 20 mg/ml injectable solution |
| Medetomidine | Orion Pharma, France | Domitor® | 1 mg/ml injectable solution |
| Meloxicam | Boehringer lingelheim | Metacam® | 0.5 mg/ml injectable solution |
| Mobile HomeCage Large with tracking capability | Neurotar, Finland | MHC-L-T-V4 | |
| Monitoring of ECG and breathing rate | AD Systems, (USA) and LabChart software | ||
| Servomotor | Feetech | FT90B | |
| Stereotaxic frame | David Kopf (Tujunga, USA) | 900-WA | Using Mouse Adaptor (Ref: 922) and Non-Rupture Ear Bars (ref: 922) |
| Surgical glue | 3M, USA | Vetbond | |
| Syringe Pump | KD Scientific, USA | Legato® 130, Cat# 788130 | |
| Ultrasound gel | DREXCO medical, France | Medi'Gel | |
| Xylazine 2% | Bayer, France | Rompun® | 20 mg/ml injectable solution |
References
- Hoyer, C., Gass, N., Weber-Fahr, W., Sartorius, A. Advantages and challenges of small animal magnetic resonance imaging as a translational tool. Neuropsychobiology. 69 (4), 187-201 (2014).
- Deffieux, T., Demene, C., Pernot, M., Tanter, M. Functional ultrasound neuroimaging: a review of the preclinical and clinical state of the art. Current Opinion in Neurobiology. 50, 128-135 (2018).
- Rabut, C., et al. Pharmaco-fUS: Quantification of pharmacologically-induced dynamic changes in brain perfusion and connectivity by functional ultrasound imaging in awake mice. NeuroImage. 222, 117231 (2020).
- Tiran, E., et al. Transcranial functional ultrasound imaging in freely moving awake mice and anesthetized young rats without contrast agent. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (8), 1679-1689 (2017).
- Ferrier, J., Tiran, E., Deffieux, T., Tanter, M., Lenkei, Z. Functional imaging evidence for task-induced deactivation and disconnection of a major default mode network hub in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (26), 15270-15280 (2020).
- Rabut, C., et al. 4D functional ultrasound imaging of whole-brain activity in rodents. Nature Methods. 16 (10), 994-997 (2019).
- Brunner, C., et al. A platform for brain-wide volumetric functional ultrasound imaging and of circuit dynamics in awake mice. Neuron. 108 (5), 861-875 (2020).
- Gesnik, M., et al. 3D functional ultrasound imaging of the cerebral visual system in rodents. NeuroImage. 149, 267-274 (2017).
- Macé, É, et al. Whole-brain functional ultrasound imaging reveals brain modules for visuomotor integration. Neuron. 100 (5), 1241-1251 (2018).
- Macé, E., Montaldo, G., Cohen, I., Baulac, M., Fink, M., Tanter, M.
- Tiran, E., et al. Transcranial functional ultrasound imaging in freely moving awake mice and anesthetized young rats without contrast agent. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (8), 1679-1689 (2017).
- Claron, J., et al. Large scale functional ultrasound imaging of the spinal cord reveals in depth spatiotemporal responses of spinal nociceptive circuits in both normal and inflammatory state. Pain. , (2020).
- Aydin, A. K., et al. Transfer functions linking neural calcium to single voxel functional ultrasound signal. Nature Communications. 11 (1), 2954 (2020).
- Bimbard, C., et al. Multi-scale mapping along the auditory hierarchy using high-resolution functional ultrasound in the awake ferret. eLife. 7, 35028 (2018).
- Boido, D., et al. Mesoscopic and microscopic imaging of sensory responses in the same animal. Nature Communications. 10 (1), 1110 (2019).
- Kislin, M., et al. Flat-floored air-lifted platform: A new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents. Journal of Visualized Experiments. (88), e51869 (2014).
- Juczewski, K., Koussa, J. A., Kesner, A. J., Lee, J. O., Lovinger, D. M. Stress and behavioral correlates in the head-fixed method: stress measurements, habituation dynamics, locomotion, and motor-skill learning in mice. Scientific Reports. 10 (1), 12245 (2020).
